CN110643631A - 含双报告基因的菊花aco基因过表达载体及其构建方法 - Google Patents

含双报告基因的菊花aco基因过表达载体及其构建方法 Download PDF

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Abstract

一种含双报告基因的菊花ACO基因过表达载体，其碱基序列如SEQ ID NO.11所示，命名为PBI121‑CmACO‑GFP，是先获取表达载体pCAMBIA1304中报告基因GFP片段，与pBI121质粒连接，获得pBI121‑GFP质粒；再通过CmACO基因的同源克隆，获取CmACO基因的全长cDNA序列和CmACO基因ORF区全长序列；最后，获取CmACO基因全长ORF片段，与pBI121‑GFP质粒连接，得到。本发明的含双报告基因的菊花ACO基因过表达载体同时具有荧光特征和组织化学底物特征，能弥补单个GUS或GFP报告基因在研究应用上的缺陷。将本过表达载体转化至菊花中将致使菊花中ACO基因过量表达，从而提高菊花中乙烯的水平，促进菊花苗的生长发育，缩短其由营养生长转向生殖生长的时间，进而缩短菊花的种植周期，大大降低种植成本。

Description

含双报告基因的菊花ACO基因过表达载体及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域，具体涉及一种含双报告基因的菊花ACO基因过表达载体，同时涉及该过表达载体的构建方法。
背景技术
乙烯是一种气体激素，它的结构十分简单，能够任意出入细胞膜。对于植物生长、发育有重要作用。该激素能调节植物器官的老化与脱落，还能促进果实的成熟，并且在逆境胁迫和病原菌侵染条件下，植物中的乙烯合成量会增加，将植物自身的防卫反应激活，可见乙烯是植物逆境胁迫中的重要激素。
ACC氧化酶(ACC oxidase,ACO)，又称乙烯合成酶(ethylene-formingenzyme,EFE)，是催化乙烯生物合成途径的最后一步(即催化ACC生成乙烯)的关键酶，控制着乙烯的生成速率。近年来的研究表明，ACO基因家族的特异表达，不论是在果实成熟和花器官发育过程，还是在植物营养器官的生长发育过程，对乙烯生物合成的调节都是十分重要的，如：Picton等应用反义RNA技术转移ACO基因，转基因番茄植株果实中乙烯比对照组下降了90％，在转色期采收的果实3个星期才能变红，而对照组只用7d，并且转基因果实一旦变红后，并不像正常果实过熟那么快，在室温条件下可放130d。Ayub等将反ACC氧化酶基因转入甜瓜中，也获得了与番茄类似的结果，果实中乙烯合成减少99.5％，成熟明显被推迟，果实表现出较好的抗性和耐储性。Savin等利用ACC氧化酶基因的反义RNA技术抑制康乃馨乙烯释放，从而延缓花瓣的衰老取得成功。此外，植物中有时还需要提高乙烯的含量，一个ACO的过表达构建是最合适的。如：在红花中，ACO1过表达可刺激类黄酮的生物合成途径，对油籽的生产具有重要意义。ACO1在杨树中过表达会刺激形成层细胞分裂，进而导致木质部发育增加，抑制伸长生长，这是木材行业的理想特性。ACO基因是高度保守的，金勇丰等采用PCR和RT-PCR技术成功地从“玉露”桃基因组DNA、成熟果实、叶片伤诱导cDNA中扩增克隆出ACC氧化酶基因，该基因全长1288bp，编码319氨基酸，与番茄ACC氧化酶基因eth1、矮牵牛ACO1、康乃馨pSR120氨基酸序列同源性分别为83％、76.8％、74％。因此，ACO基因在不同物种中可能具有相似的功能。
绿色荧光蛋白(Gfp)基因和葡萄糖醛酸糖苷酶(Gus)基因是植物分子生物学研究最为常用的2个报告基因，广泛应用于转基因、启动子分析以及基因表达调控研究。它们在使用上各有特点，在定性和定量研究基因表达和启动子功能等方面各有优劣。报告基因的选择取决于实验研究目的、性质以及分析方法上的可行性，但单个报告基因往往存在不足，植物分子生物学目前已重视多个报告基因的联合使用。如，GUS一般用来做植物组织定位，比如说根、茎、叶部位；GFP可以用来做亚细胞定位，通过共聚焦显微镜可以观察基因在细胞内哪些位置表达，比如说定位在线粒体、叶绿体、或者核内等等。为建立一个简单快速、可定性定量检测植物启动子活性的报告基因表达系统，融合GUS::GFP报告基因在不同植物中高效表达，其融合蛋白同时具有荧光特征和组织化学底物特征，弥补了单个GUS或GFP报告基因在研究应用上的缺陷。
高效的多报告基因联用系统，可以整合不同报告基因手段的优势，获得更多生物信息量，在植物基因工程的研究中可实现较高的外植体再生和转化频率。GFP报告基因与GUS报告基因联合使用就具有实时性、非侵入性、可靠易检测、可重复、高敏感度，且可用于大规模检测。孔德真等构建了含有GFP-GUS融合基因的真菌表达载体，并通过农杆菌介导转入两株致病性不同的非落叶型黄萎病菌，阳性转化子的孢子和菌丝，通过GUS组织化学染色，都能表现出蓝色，表明GUS-GFP融合基因成功的整合到新疆棉花黄萎病菌的基因组中，并能稳定的遗传表达。GFP与GUS双元标记使用还可以促进基因的实时监测，背景蛋白表达相对稳定，监测背景的表达量增多；此外植株报告基因灵敏度增加，信号产生的时间缩短，检测方法多样，检测费用经济实惠等优点，使GFP与GUS双元标记在植物分子生物学应用上具有广阔的前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种含双报告基因的菊花ACO基因过表达载体及其构建方法。
为达上述目的，本发明采用的技术方案是：一种含双报告基因的菊花ACO基因过表达载体，其碱基序列如SEQ ID NO.11所示，命名为PBI121-CmACO-GFP。
本发明同时提供上述含双报告基因的菊花ACO基因过表达载体的构建方法，该方法步骤如下，结合参见图1：
(1)pBI121-GFP质粒的构建：获取表达载体pCAMBIA1304中报告基因GFP片段；将pBI121质粒双酶切、纯化后，与纯化的GFP片段进行连接；
(2)通过CmACO基因的同源克隆，获取CmACO基因的全长cDNA序列，再获取CmACO基因ORF区全长序列；
(3)构建pBI121-CmACO-GFP载体：获取CmACO基因全长ORF片段，将pBI121-GFP质粒进行单酶切、纯化后，与纯化的CmACO基因全长ORF片段进行连接。
具体地，pBI121-GFP质粒的构建时，利用如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物序列，PCR扩增得GFP片段，其中，扩增反应体系为：5×PrimeSTARBuffer4μl、2.5mMdNTPs1.5μl、cDNA1μl、10mM GFPXF1μl、10mM GFPBR1μl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase0.2μl、ddH2O补至20μl；反应条件为：(98℃10s，56℃10s，72℃2min)35个循环，72℃7min。并采用BamHI酶和XbaI酶对pBI121质粒进行双酶切；最后将纯化的GFP片段与pBI121质粒进行连接，连接反应体系为：5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2μl、pBI121线性质粒50-200ng、GFP片段50-100ng、ddH2O补至10μl。
CmACO基因的同源克隆时所用引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
pBI121-CmACO-GFP载体构建时，利用如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的引物序列PCR扩增获得获取CmACO基因全长ORF片段，其中，扩增反应体系为：5×PrimeSTARBuffer4μl、dNTPs(2.5mM)1.5μl、cDNA1μl、ACOXF(10mM)1μl、ACOXR(10mM)1μl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase0.2μl、ddH2O补至20μl；反应条件为：(98℃10s，62℃10s，72℃2min)35个循环，72℃7min；采用XbaI酶对pBI121-GFP质粒进行单酶切；最后将纯化的CmACO基因全长ORF片段和pBI121-GFP质粒进行连接，连接时的反应体系为：5×In-FusionHD Enzyme Premix 2μl、pBI121-GFP线性质粒50-200ng、CmACO片段50-100ng、ddH2O补至10μl。
本发明的含双报告基因的菊花ACO基因过表达载体同时具有荧光特征和组织化学底物特征，是一个简单快速、可定性定量检测植物基因表达的报告基因表达系统，能弥补单个GUS或GFP报告基因在研究应用上的缺陷。此外，其还具备检测方法多样，检测费用经济实惠等优点。
将本发明的过表达载体转化至菊花中将致使菊花中ACO基因过量表达，从而提高菊花中乙烯的水平，促进菊花苗的生长发育，缩短其由营养生长转向生殖生长的时间，进而缩短菊花的种植周期，大大降低种植成本。同时，乙烯水平的提高将增强其对生物和非生物胁迫的耐受性，使其更能适应恶劣的生长环境，这将大大减少农户的种植损失，增产增益，同时也有利于绿色产业的发展。
附图说明
图1是本发明的载体构建过程图。
具体实施方式
本发明实施例中所用到的实验材料和试剂：
实验材料：大黄菊
菌株：Ecoli.HST08感受态细胞，购自TAKARA公司；Ecoli.DH5α感受态细胞，来自宜春学院实验室。
载体：含报告基因GFP的表达载体pCAMBIA1304；GUS表达载体pBI121。
试剂：RNA提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒、质粒小提试剂盒和限制性内切酶购自thermo scientific公司；DNA Marker购自于全式金生物有限公司；反转录试剂盒、PrimeSTAR HS DNA Polymerase、In-Fusion HD Cloning Kit购自宝生物工程(大连)有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
实施例1pBI121-GFP载体构建
1.引物设计
依据表达载体pCAMBIA1304中报告基因GFP的序列信息，并参照In-Fusion HDCloning Kit说明书设计带载体端接头的GFP基因引物，引物序列如下：
GFPXF：5’-acgggggactctagagtagatctgactagtaaaggag-3’(SEQ ID NO.1)，
GFPBR：5’-accacccggggatccctagctttgtatagttcatcca-3’(SEQ ID NO.2)。
2.PCR获得预插入GFP片段
插入GFP片段扩增反应体系：5×PrimeSTARBuffer4μl、dNTPs(2.5mM)1.5μl、cDNA1μl、GFPXF(10mM)1μl、GFPBR(10mM)1μl、PrimeSTAR HS DNAPolymerase0.2μl、ddH2O补至20μl。
反应条件：(98℃10s，56℃10s，72℃2min)35个循环，72℃7min。
3.预插入片段的纯化回收
按照Thermo胶回收试剂盒操作说明，将目的片段进行切胶回收。
4.pBI121质粒的酶切及纯化回收
参照Thermo的快酶使用手册，用BamHI酶和XbaI酶对pBI121质粒进行双酶切，然后切胶回收线性的pBI121质粒，按照Thermo胶回收试剂盒操作说明进行。酶切反应体系：10×FD Green Buffer 2μl、pBI121质粒～1μg、Fast XbaI酶1μl、Fast BamHI酶1μl、ddH2O补至20μl，反应条件：37℃20min，80℃5min。
5.插入GFP片段与pBI121线性质粒连接
按照In-Fusion HD Cloning Kit操作手册，将步骤3回收的目的片段与pBI121线性质粒按相应的比例加入反应体系，于50℃进行融合反应15min。反应体系为：5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2μl、pBI121线性质粒50-200ng、GFP片段50-100ng、ddH2O补至10μl。
6.连接产物转化筛选
按照In-Fusion HD Cloning Kit进行连接，分别取5μl连接产物加到100μl的Ecoli.HST08感受态细胞中，冰上放置30min后42℃加热45s，再在冰中放置1min，加入800μlSOC液体培养基，37℃震荡培养60min后6000rpm/min离心5min，弃去上清，用100μl新鲜的SOC液体培养基重悬菌体，涂布于含有100μg/ml卡那的LB平板培养基上，37℃培养16～20h后挑取单克隆做菌斑PCR，确认载体中插入片段的长度大小。菌斑PCR反应体系：10×TaqBuffer2μl、dNTPs(2.5mM)1.5μl、cDNA1μl、GFPXF(10mM)1μl、GFPBR(10mM)1μl、Taq DNAPolymerase0.2μl、ddH2O补至20μl；反应条件：95℃1min，(95℃30s，62℃30s，72℃2min)30个循环，72℃7min。
7.重组质粒酶切鉴定与测序
将筛选的阳性菌斑进行摇菌，然后提取重组质粒，用BamHI酶和XbaI酶进行双酶切鉴定，同时将菌液样品送至上海生物工程有限公司进行测序。测序结果显示GFP插入成功，命名为pBI121-GFP。
实施例2 CmACO基因的同源克隆
1.CmACO基因的同源比对及引物设计
依据拟南芥ACO氨基酸序列比对NCBI protein非冗余蛋白库，然后利用clustal X软件进行蛋白同源比对，利用MEGA6.0构建物种进化系统发育树，选定保守区设计CmACO引物，引物序列如下：
CmACO F：5’-CTTGTGAGAATTGGGGCTTC-3’(SEQ ID NO.3)，
CmACO R：5’-GCTTCAAATCTTGGCTCTTT-3’(SEQ ID NO.4)。
2.菊花总RNA提取及cDNA链的合成
叶片总RNA提取：按照Trizol试剂说明书进行提取，提取后进行电泳检测和纯度及浓度测定；并于-80℃保存备用。
cDNA链的合成：按照TOYOBO的First Strand cDNA Syn thesis Kit进行。反应体系(共20μl)：先加入RNA4μl、Oligo(dT)20(10pmol/μl)1μl及RNase free H2O7μl，65℃5min后置于冰上，再加入5×RT Buffer4μl、dNTP Mixture(各10mM)2μl、RNase Inhibitor(10U/μl)1μl、ReverTra Ace1μl。反应条件：42℃90min，99℃5min，冰上5min，-20℃冻存备用。
3.CmACO基因的同源片段扩增
PCR扩增反应体系：10×Taq Buffer2μl、dNTPs(2.5mM)1.5μl、cDNA1μl、CmACO F(10mM)1μl、CmACO R(10mM)1μl、Taq DNA Polymerase0.2μl、ddH2O被至20μl。反应条件：95℃1min，(95℃30s，52℃30s，72℃2min)35个循环，72℃7min。
4.目的片段的回收及测序
按照Thermo胶回收试剂盒操作说明，将目的片段进行切胶回收。然后按照TakarapMD19-T载体连接说明，取一定量的回收产物与pMD19-T载体进行连接，然后将连接产物共10μl全量加入至100μlDH5α感受态细胞中，冰中放置30min后42℃热激45s，再在冰中放置1min，然后加入800μlLB液体培养基，37℃震荡培养60min，之后在含有X-gal、IPTG和Amp的LB平板培养基上培养16～24h后挑取白色菌落，用菌落PCR确认载体中插入片段的长度大小，选取阳性克隆送至上海生工进行测序。测序结果显示：目的片段序列与NCI数据库中其它物种的ACO基因序列同源性很高，表明该片段为预期的ACO基因片段。
实施例3 CmACO基因的全长cDNA序列获取
1.菊花Total RNA提取
按照Trizol试剂说明书进行，提取后进行电泳检测和纯度及浓度测定；并于-80℃保存备用。
2.第一链cDNA的合成
按照
Figure BDA0002244128080000061
RACE 5’/3’Kit user Manual进行。
3.CmACO基因5’和3’RACE扩增
按照
Figure BDA0002244128080000062
RACE 5’/3’Kit user Manual进行，设计的GSP引物序列如下：
5’-RACE GSP：ARP1-1：
5’-GATTACGCCAAGCTTAAGCTAAGGACATCCGTGTTCCGTCT-3’(SEQ ID NO.5)
3’-RACE GSP：ARP2-2：
5’-GATTACGCCAAGCTTCGATCAAGGGTCTTAGAGCACATACCGA-3’(SEQ ID NO.6)。
4.RACE扩增产物的回收与测序
按照NuceloSpin Gel PCR Clean-up Kit进行切胶回收，再按照In-Fusion HDCloning Kit进行连接，分别取5μl连接产物加到100μl的Ecoli.HST08感受态细胞中，冰上放置30min后42℃加热45s，再在冰中放置1min，加入800μl SOC液体培养基，37℃震荡培养60min后6000rpm离心5min，弃去上清，用100μl新鲜的SOC液体培养基重悬菌体，涂布于含有100μg/ml Ampicillin的LB平板培养基上，37℃培养16～20h后挑取单克隆做PCR，确认载体中插入片段的长度大小，选择阳性克隆送上海生工进行测序，将测序结果进行拼接即得全长cDNA序列。
5.CmACOORF区全长扩增
先将拼接得到的CmACO全长cDNA序列用DNAStar软件预测ORF区，并设计引物PCR扩增其ORF区全长序列。扩增CmACO基因ORF区全长的引物序列如下：
ACO F：5’-ATGGCCAACTTCCCTATAATCAACTTGG-3’(SEQ ID NO.7)，
ACO R：5’-CTAAGCAGTGACATTAGCTTCAACTGC-3’(SEQ ID NO.8)。
PCR扩增反应体系为：5×PrimeSTAR Buffer4μl、dNTPs(2.5mM)1.5μl、cDNA1μl、ACOF(10mM)1μl、ACOR(10mM)1μl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase0.2μl、ddH2O补至20μl；反应条件：(98℃10s，60℃10s，72℃2min)35个循环，72℃7min。
实施例4 pBI121-CmACO-GFP载体构建
1.引物设计
参照In-Fusion HD Cloning Kit设计带载体端接头的引物，将CmACO全长ORF构建至含有双报告基因的pBI121双元载体中。引物序列如下：
ACOXF：5’-acgggggactctagaATGGCCAACTTCCCTATAATCAACTTG-3’(SEQ ID NO.9)，
ACOXR：5’-cagatctactctagaAGCAGTGACATTAGCTTCAACTGCTTTC-3’(SEQ IDNO.10)。
2.菊花总RNA的提取及反转录反应
参见实施例2步骤2。
3.PCR扩增获得预插入片段
CmACO插入片段扩增反应体系：5×PrimeSTARBuffer4μl、dNTPs(2.5mM)1.5μl、cDNA1μl、ACOXF(10mM)1μl、ACOXR(10mM)1μl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase0.2μl、ddH2O补至20μl；反应条件：(98℃10s，62℃10s，72℃2min)35个循环，72℃7min。
4.插入片段的纯化回收
按照Thermo胶回收试剂盒操作说明，将目的片段进行切胶回收。
5.pBI121-GFP质粒的酶切及纯化回收
参照Thermo的快酶使用手册，用XbaI酶对pBI121-GFP质粒进行单酶切，然后切胶回收线性的pBI121-GFP质粒，按照Thermo胶回收试剂盒操作说明进行。酶切反应体系为：10×FD Green Buffer 2μl、pBI121-GFP质粒～1μg、Fast XbaI酶1μl、ddH2O补至20μl。反应条件：37℃20min，80℃5min。
6.插入片段与pBI121-GFP线性质粒连接
按照In-Fusion HD Cloning Kit操作手册，将回收的目的片段与pBI121-GFP线性质粒按相应的比例加入反应体系，于50℃进行融合反应15min。反应体系为：5×In-FusionHD Enzyme Premix 2μl、pBI121-GFP线性质粒50-200ng、CmACO片段50-100ng、ddH2O补至10μl。
7.连接产物转化筛选
按照In-Fusion HD Cloning Kit进行连接，分别取5μl连接产物加到100μl的Ecoli.HST08感受态细胞中，冰上放置30min后42℃加热45s，再在冰中放置1min，加入800μlSOC液体培养基，37℃震荡培养60min后6000rpm/min离心5min，弃去上清，用100μl新鲜的SOC液体培养基重悬菌体，涂布于含有100μg/ml卡那的LB平板培养基上，37℃培养16～20h后挑取单克隆做菌斑PCR，确认载体中插入片段的长度大小。菌斑PCR反应体系为：10×TaqBuffer2μl、dNTPs(2.5mM)1.5μl、cDNA1μl、ACO XF(10mM)1μl、ACO XR(10mM)1μl、Taq DNAPolymerase0.2μl、ddH2O补至20μl；反应条件：95℃1min，(95℃30s，62℃30s，72℃2min)30个循环，72℃7min。
8.重组质粒酶切鉴定与测序
将筛选的阳性菌斑进行摇菌，然后提取重组质粒，用XbaI酶进行酶切鉴定，同时将菌液样品送至上海生物工程有限公司进行测序。测序结果显示，CmACO全长ORF已成功插入pBI121-GFP载体中，命名为PBI121-CmACO-GFP，序列如SEQ ID NO.11所示，其中，第5821bp-第6759bp是CmACO基因全长ORF区序列，第6766bp-第7490bp是GFP序列，其余为pBI121载体序列。
序列表
<110> 宜春学院
<120> 含双报告基因的菊花ACO基因过表达载体及其构建方法
<130> 008
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> 合成()
<400> 1
acgggggact ctagagtaga tctgactagt aaaggag 37
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 合成()
<400> 2
accacccggg gatccctagc tttgtatagt tcatcca 37
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成()
<400> 3
cttgtgagaa ttggggcttc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成()
<400> 4
gcttcaaatc ttggctcttt 20
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 合成()
<400> 5
gattacgcca agcttaagct aaggacatcc gtgttccgtc t 41
<210> 6
<211> 43
<212> DNA
<213> 合成()
<400> 6
gattacgcca agcttcgatc aagggtctta gagcacatac cga 43
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 合成()
<400> 7
atggccaact tccctataat caacttgg 28
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 合成()
<400> 8
ctaagcagtg acattagctt caactgc 27
<210> 9
<211> 42
<212> DNA
<213> 合成()
<400> 9
acgggggact ctagaatggc caacttccct ataatcaact tg 42
<210> 10
<211> 43
<212> DNA
<213> 合成()
<400> 10
cagatctact ctagaagcag tgacattagc ttcaactgct ttc 43
<210> 11
<211> 16427
<212> DNA
<213> 合成()
<400> 11
tgagcgtcgc aaaggcgctc ggtcttgcct tgctcgtcgg tgatgtactt caccagctcc 60
gcgaagtcgc tcttcttgat ggagcgcatg gggacgtgct tggcaatcac gcgcaccccc 120
cggccgtttt agcggctaaa aaagtcatgg ctctgccctc gggcggacca cgcccatcat 180
gaccttgcca agctcgtcct gcttctcttc gatcttcgcc agcagggcga ggatcgtggc 240
atcaccgaac cgcgccgtgc gcgggtcgtc ggtgagccag agtttcagca ggccgcccag 300
gcggcccagg tcgccattga tgcgggccag ctcgcggacg tgctcatagt ccacgacgcc 360
cgtgattttg tagccctggc cgacggccag caggtaggcc gacaggctca tgccggccgc 420
cgccgccttt tcctcaatcg ctcttcgttc gtctggaagg cagtacacct tgataggtgg 480
gctgcccttc ctggttggct tggtttcatc agccatccgc ttgccctcat ctgttacgcc 540
ggcggtagcc ggccagcctc gcagagcagg attcccgttg agcaccgcca ggtgcgaata 600
agggacagtg aagaaggaac acccgctcgc gggtgggcct acttcaccta tcctgcccgg 660
ctgacgccgt tggatacacc aaggaaagtc tacacgaacc ctttggcaaa atcctgtata 720
tcgtgcgaaa aaggatggat ataccgaaaa aatcgctata atgaccccga agcagggtta 780
tgcagcggaa aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 840
gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 900
atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 960
gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1020
gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1080
ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1140
cagtgagcga ggaagcggaa gagcgccaga aggccgccag agaggccgag cgcggccgtg 1200
aggcttggac gctagggcag ggcatgaaaa agcccgtagc gggctgctac gggcgtctga 1260
cgcggtggaa agggggaggg gatgttgtct acatggctct gctgtagtga gtgggttgcg 1320
ctccggcagc ggtcctgatc aatcgtcacc ctttctcggt ccttcaacgt tcctgacaac 1380
gagcctcctt ttcgccaatc catcgacaat caccgcgagt ccctgctcga acgctgcgtc 1440
cggaccggct tcgtcgaagg cgtctatcgc ggcccgcaac agcggcgaga gcggagcctg 1500
ttcaacggtg ccgccgcgct cgccggcatc gctgtcgccg gcctgctcct caagcacggc 1560
cccaacagtg aagtagctga ttgtcatcag cgcattgacg gcgtccccgg ccgaaaaacc 1620
cgcctcgcag aggaagcgaa gctgcgcgtc ggccgtttcc atctgcggtg cgcccggtcg 1680
cgtgccggca tggatgcgcg cgccatcgcg gtaggcgagc agcgcctgcc tgaagctgcg 1740
ggcattcccg atcagaaatg agcgccagtc gtcgtcggct ctcggcaccg aatgcgtatg 1800
attctccgcc agcatggctt cggccagtgc gtcgagcagc gcccgcttgt tcctgaagtg 1860
ccagtaaagc gccggctgct gaacccccaa ccgttccgcc agtttgcgtg tcgtcagacc 1920
gtctacgccg acctcgttca acaggtccag ggcggcacgg atcactgtat tcggctgcaa 1980
ctttgtcatg cttgacactt tatcactgat aaacataata tgtccaccaa cttatcagtg 2040
ataaagaatc cgcgcgttca atcggaccag cggaggctgg tccggaggcc agacgtgaaa 2100
cccaacatac ccctgatcgt aattctgagc actgtcgcgc tcgacgctgt cggcatcggc 2160
ctgattatgc cggtgctgcc gggcctcctg cgcgatctgg ttcactcgaa cgacgtcacc 2220
gcccactatg gcattctgct ggcgctgtat gcgttggtgc aatttgcctg cgcacctgtg 2280
ctgggcgcgc tgtcggatcg tttcgggcgg cggccaatct tgctcgtctc gctggccggc 2340
gccagatctg gggaaccctg tggttggcat gcacatacaa atggacgaac ggataaacct 2400
tttcacgccc ttttaaatat ccgattattc taataaacgc tcttttctct taggtttacc 2460
cgccaatata tcctgtcaaa cactgatagt ttaaactgaa ggcgggaaac gacaatctga 2520
tcatgagcgg agaattaagg gagtcacgtt atgacccccg ccgatgacgc gggacaagcc 2580
gttttacgtt tggaactgac agaaccgcaa cgttgaagga gccactcagc cgcgggtttc 2640
tggagtttaa tgagctaagc acatacgtca gaaaccatta ttgcgcgttc aaaagtcgcc 2700
taaggtcact atcagctagc aaatatttct tgtcaaaaat gctccactga cgttccataa 2760
attcccctcg gtatccaatt agagtctcat attcactctc aatccaaata atctgcaccg 2820
gatctggatc gtttcgcatg attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt 2880
gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg 2940
ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg 3000
gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg 3060
ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg 3120
gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca 3180
tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc 3240
accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc 3300
aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca 3360
aggcgcgcat gcccgacggc gatgatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga 3420
atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg 3480
cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg 3540
aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg 3600
ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gagcgggact ctggggttcg aaatgaccga 3660
ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag 3720
gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc gcggggatct 3780
catgctggag ttcttcgccc acgggatctc tgcggaacag gcggtcgaag gtgccgatat 3840
cattacgaca gcaacggccg acaagcacaa cgccacgatc ctgagcgaca atatgatcgg 3900
gcccggcgtc cacatcaacg gcgtcggcgg cgactgccca ggcaagaccg agatgcaccg 3960
cgatatcttg ctgcgttcgg atattttcgt ggagttcccg ccacagaccc ggatgatccc 4020
cgatcgttca aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc 4080
gatgattatc atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg 4140
catgacgtta tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata 4200
cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc 4260
tatgttacta gatcgggcct cctgtcaatg ctggcggcgg ctctggtggt ggttctggtg 4320
gcggctctga gggtggtggc tctgagggtg gcggttctga gggtggcggc tctgagggag 4380
gcggttccgg tggtggctct ggttccggtg attttgatta tgaaaagatg gcaaacgcta 4440
ataagggggc tatgaccgaa aatgccgatg aaaacgcgct acagtctgac gctaaaggca 4500
aacttgattc tgtcgctact gattacggtg ctgctatcga tggtttcatt ggtgacgttt 4560
ccggccttgc taatggtaat ggtgctactg gtgattttgc tggctctaat tcccaaatgg 4620
ctcaagtcgg tgacggtgat aattcacctt taatgaataa tttccgtcaa tatttacctt 4680
ccctccctca atcggttgaa tgtcgccctt ttgtctttgg cccaatacgc aaaccgcctc 4740
tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag 4800
cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt 4860
tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca 4920
caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agcttgcatg cctgcaggtc cccagattag 4980
ccttttcaat ttcagaaaga atgctaaccc acagatggtt agagaggctt acgcagcagg 5040
tctcatcaag acgatctacc cgagcaataa tctccaggaa atcaaatacc ttcccaagaa 5100
ggttaaagat gcagtcaaaa gattcaggac taactgcatc aagaacacag agaaagatat 5160
atttctcaag atcagaagta ctattccagt atggacgatt caaggcttgc ttcacaaacc 5220
aaggcaagta atagagattg gagtctctaa aaaggtagtt cccactgaat caaaggccat 5280
ggagtcaaag attcaaatag aggacctaac agaactcgcc gtaaagactg gcgaacagtt 5340
catacagagt ctcttacgac tcaatgacaa gaagaaaatc ttcgtcaaca tggtggagca 5400
cgacacactt gtctactcca aaaatatcaa agatacagtc tcagaagacc aaagggcaat 5460
tgagactttt caacaaaggg taatatccgg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat 5520
ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg 5580
cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc 5640
cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt 5700
ggattgatgt gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcccact atccttcgca 5760
agacccttcc tctatataag gaagttcatt tcatttggag agaacacggg ggactctaga 5820
atggccaact tccctataat caacttggag acactcaatg gcgacgagag atgtgctacc 5880
atggcgaaga ttcaagatgc ttgcgaaaac tggggattct ttgagcttgt gaaccatggg 5940
atatcacatg agttacttga caaagtggag gccatgacaa agggacatta caagaaatgt 6000
atggagcaga ggtttaagga aatggtggca gaaaaagcgt tagaaggcgt gaaggcggaa 6060
gttactgata tcgattggga gagcactttt ttcttgcgcc atctcccgac ctccaacatc 6120
tctgaagtcc ctgatcttga ggatgaatac agggagttaa tgaaggactt tgctgctaaa 6180
ctagagaagt tagcagagga acttttggat ttattgtgtg agaatcttgg attggagaaa 6240
ggttacctaa aaaaggcctt ttatggatca aagggtccaa attttggaac aaaggttagc 6300
aactacccac catgtcctac tcctgacttg atcaagggtc ttagagcaca taccgatgct 6360
ggtggcatta ttttgctatt ccaagacgac aaagttagcg gtctccagct tcttaaggac 6420
ggtgaatggg tcgacgtccc acccatgagg cattccattg tcatcaatct tggtgaccaa 6480
attgaggtga tcactaatgg aaagtatgag agtgtgatgc acagagttat tgctcaaaca 6540
gacggaacac ggatgtcctt agcttctttt tacaaccccg ggaatgatgc tgttatctat 6600
ccagcaccag cattgttgga aaaggagcca aaagagaatg agcaatcgta cccaaaattc 6660
gtgtttgacg attacatgaa actctatgca ggcttgaagt tccaggcaaa ggagccgaga 6720
tttgaagcca tgaaagcagt tgaagctaat gttactgctt ctagagtaga tctgactagt 6780
aaaggagaag aacttttcac tggagttgtc ccaattcttg ttgaattaga tggtgatgtt 6840
aatgggcaca aattttctgt cagtggagag ggtgaaggtg atgcaacata cggaaaactt 6900
acccttaaat ttatttgcac tactggaaaa ctacctgttc cgtggccaac acttgtcact 6960
actttctctt atggtgttca atgcttttca agatacccag atcatatgaa gcggcacgac 7020
ttcttcaaga gcgccatgcc tgagggatac gtgcaggaga ggaccatctt cttcaaggac 7080
gacgggaact acaagacacg tgctgaagtc aagtttgagg gagacaccct cgtcaacagg 7140
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tacaactaca actcccacaa cgtatacatc atggccgaca agcaaaagaa cggcatcaaa 7260
gccaacttca agacccgcca caacatcgaa gacggcggcg tgcaactcgc tgatcattat 7320
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gtggtcagtc ccttatgtta cgtcctgtag aaaccccaac ccgtgaaatc aaaaaactcg 7560
acggcctgtg ggcattcagt ctggatcgcg aaaactgtgg aattgatcag cgttggtggg 7620
aaagcgcgtt acaagaaagc cgggcaattg ctgtgccagg cagttttaac gatcagttcg 7680
ccgatgcaga tattcgtaat tatgcgggca acgtctggta tcagcgcgaa gtctttatac 7740
cgaaaggttg ggcaggccag cgtatcgtgc tgcgtttcga tgcggtcact cattacggca 7800
aagtgtgggt caataatcag gaagtgatgg agcatcaggg cggctatacg ccatttgaag 7860
ccgatgtcac gccgtatgtt attgccggga aaagtgtacg tatcaccgtt tgtgtgaaca 7920
acgaactgaa ctggcagact atcccgccgg gaatggtgat taccgacgaa aacggcaaga 7980
aaaagcagtc ttacttccat gatttcttta actatgccgg aatccatcgc agcgtaatgc 8040
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ccaaaagcca gacagagtgt gatatctacc cgcttcgcgt cggcatccgg tcagtggcag 8340
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atgaagatgc ggacttgcgt ggcaaaggat tcgataacgt gctgatggtg cacgaccacg 8460
cattaatgga ctggattggg gccaactcct accgtacctc gcattaccct tacgctgaag 8520
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gctttaacct ctctttaggc attggtttcg aagcgggcaa caagccgaaa gaactgtaca 8640
gcgaagaggc agtcaacggg gaaactcagc aagcgcactt acaggcgatt aaagagctga 8700
tagcgcgtga caaaaaccac ccaagcgtgg tgatgtggag tattgccaac gaaccggata 8760
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acccgacgcg tccgatcacc tgcgtcaatg taatgttctg cgacgctcac accgatacca 8880
tcagcgatct ctttgatgtg ctgtgcctga accgttatta cggatggtat gtccaaagcg 8940
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tgcatcagcc gattatcatc accgaatacg gcgtggatac gttagccggg ctgcactcaa 9060
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agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata atttctgttg 9480
aattacgtta agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat gagatgggtt 9540
tttatgatta gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc 9600
gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt tactagatcg ggaattcact 9660
ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct 9720
tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc 9780
ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc 9840
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gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga tttgggtgat ggttcacgta 9960
gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta 10020
atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc tatctcgggc tattcttttg 10080
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catcagtccg ggacggcgtc agcgggagag ccgttgtaag gcggcagact ttgctcatgt 10440
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aaagctactg gaacgagcag aagtcctccg gccgccagtt gccaggcggt aaaggtgagc 11040
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cctcgctgtt cgggctccac gaaaacgccg gacagatgcg ccttgtgagc gtccttgggg 11520
ccgtcctcct gtttgaagac cgacagccca atgatctcgc cgtcgatgta ggcgccgaat 11580
gccacggcat ctcgcaaccg ttcagcgaac gcctccatgg gctttttctc ctcgtgctcg 11640
taaacggacc cgaacatctc tggagctttc ttcagggccg acaatcggat ctcgcggaaa 11700
tcctgcacgt cggccgctcc aagccgtcga atctgagcct taatcacaat tgtcaatttt 11760
aatcctctgt ttatcggcag ttcgtagagc gcgccgtgcg tcccgagcga tactgagcga 11820
agcaagtgcg tcgagcagtg cccgcttgtt cctgaaatgc cagtaaagcg ctggctgctg 11880
aacccccagc cggaactgac cccacaaggc cctagcgttt gcaatgcacc aggtcatcat 11940
tgacccaggc gtgttccacc aggccgctgc ctcgcaactc ttcgcaggct tcgccgacct 12000
gctcgcgcca cttcttcacg cgggtggaat ccgatccgca catgaggcgg aaggtttcca 12060
gcttgagcgg gtacggctcc cggtgcgagc tgaaatagtc gaacatccgt cgggccgtcg 12120
gcgacagctt gcggtacttc tcccatatga atttcgtgta gtggtcgcca gcaaacagca 12180
cgacgatttc ctcgtcgatc aggacctggc aacgggacgt tttcttgcca cggtccagga 12240
cgcggaagcg gtgcagcagc gacaccgatt ccaggtgccc aacgcggtcg gacgtgaagc 12300
ccatcgccgt cgcctgtagg cgcgacaggc attcctcggc cttcgtgtaa taccggccat 12360
tgatcgacca gcccaggtcc tggcaaagct cgtagaacgt gaaggtgatc ggctcgccga 12420
taggggtgcg cttcgcgtac tccaacacct gctgccacac cagttcgtca tcgtcggccc 12480
gcagctcgac gccggtgtag gtgatcttca cgtccttgtt gacgtggaaa atgaccttgt 12540
tttgcagcgc ctcgcgcggg attttcttgt tgcgcgtggt gaacagggca gagcgggccg 12600
tgtcgtttgg catcgctcgc atcgtgtccg gccacggcgc aatatcgaac aaggaaagct 12660
gcatttcctt gatctgctgc ttcgtgtgtt tcagcaacgc ggcctgcttg gcctcgctga 12720
cctgttttgc caggtcctcg ccggcggttt ttcgcttctt ggtcgtcata gttcctcgcg 12780
tgtcgatggt catcgacttc gccaaacctg ccgcctcctg ttcgagacga cgcgaacgct 12840
ccacggcggc cgatggcgcg ggcagggcag ggggagccag ttgcacgctg tcgcgctcga 12900
tcttggccgt agcttgctgg accatcgagc cgacggactg gaaggtttcg cggggcgcac 12960
gcatgacggt gcggcttgcg atggtttcgg catcctcggc ggaaaacccc gcgtcgatca 13020
gttcttgcct gtatgccttc cggtcaaacg tccgattcat tcaccctcct tgcgggattg 13080
ccccgactca cgccggggca atgtgccctt attcctgatt tgacccgcct ggtgccttgg 13140
tgtccagata atccacctta tcggcaatga agtcggtccc gtagaccgtc tggccgtcct 13200
tctcgtactt ggtattccga atcttgccct gcacgaatac cagcgacccc ttgcccaaat 13260
acttgccgtg ggcctcggcc tgagagccaa aacacttgat gcggaagaag tcggtgcgct 13320
cctgcttgtc gccggcatcg ttgcgccaca tctaggtact aaaacaattc atccagtaaa 13380
atataatatt ttattttctc ccaatcaggc ttgatcccca gtaagtcaaa aaatagctcg 13440
acatactgtt cttccccgat atcctccctg atcgaccgga cgcagaaggc aatgtcatac 13500
cacttgtccg ccctgccgct tctcccaaga tcaataaagc cacttacttt gccatctttc 13560
caaagatgtt gctgtctccc aggtcgccgt gggaaaagac aagttcctct tcgggctttt 13620
ccgtctttaa aaaatcatac agctcgcgcg gatctttaaa tggagtgtct tcttcccagt 13680
tttcgcaatc cacatcggcc agatcgttat tcagtaagta atccaattcg gctaagcggc 13740
tgtctaagct attcgtatag ggacaatccg atatgtcgat ggagtgaaag agcctgatgc 13800
actccgcata cagctcgata atcttttcag ggctttgttc atcttcatac tcttccgagc 13860
aaaggacgcc atcggcctca ctcatgagca gattgctcca gccatcatgc cgttcaaagt 13920
gcaggacctt tggaacaggc agctttcctt ccagccatag catcatgtcc ttttcccgtt 13980
ccacatcata ggtggtccct ttataccggc tgtccgtcat ttttaaatat aggttttcat 14040
tttctcccac cagcttatat accttagcag gagacattcc ttccgtatct tttacgcagc 14100
ggtatttttc gatcagtttt ttcaattccg gtgatattct cattttagcc atttattatt 14160
tccttcctct tttctacagt atttaaagat accccaagaa gctaattata acaagacgaa 14220
ctccaattca ctgttccttg cattctaaaa ccttaaatac cagaaaacag ctttttcaaa 14280
gttgttttca aagttggcgt ataacatagt atcgacggag ccgattttga aaccacaatt 14340
atgggtgatg ctgccaactt actgatttag tgtatgatgg tgtttttgag gtgctccagt 14400
ggcttctgtg tctatcagct gtccctcctg ttcagctact gacggggtgg tgcgtaacgg 14460
caaaagcacc gccggacatc agcgctatct ctgctctcac tgccgtaaaa catggcaact 14520
gcagttcact tacaccgctt ctcaacccgg tacgcaccag aaaatcattg atatggccat 14580
gaatggcgtt ggatgccggg caacagcccg cattatgggc gttggcctca acacgatttt 14640
acgtcactta aaaaactcag gccgcagtcg gtaacctcgc gcatacagcc gggcagtgac 14700
gtcatcgtct gcgcggaaat ggacgaacag tggggctatg tcggggctaa atcgcgccag 14760
cgctggctgt tttacgcgta tgacagtctc cggaagacgg ttgttgcgca cgtattcggt 14820
gaacgcacta tggcgacgct ggggcgtctt atgagcctgc tgtcaccctt tgacgtggtg 14880
atatggatga cggatggctg gccgctgtat gaatcccgcc tgaagggaaa gctgcacgta 14940
atcagcaagc gatatacgca gcgaattgag cggcataacc tgaatctgag gcagcacctg 15000
gcacggctgg gacggaagtc gctgtcgttc tcaaaatcgg tggagctgca tgacaaagtc 15060
atcgggcatt atctgaacat aaaacactat caataagttg gagtcattac ccaattatga 15120
tagaatttac aagctataag gttattgtcc tgggtttcaa gcattagtcc atgcaagttt 15180
ttatgctttg cccattctat agatatattg ataagcgcgc tgcctatgcc ttgccccctg 15240
aaatccttac atacggcgat atcttctata taaaagatat attatcttat cagtattgtc 15300
aatatattca aggcaatctg cctcctcatc ctcttcatcc tcttcgtctt ggtagctttt 15360
taaatatggc gcttcataga gtaattctgt aaaggtccaa ttctcgtttt catacctcgg 15420
tataatctta cctatcacct caaatggttc gctgggttta tcgcaccccc gaacacgagc 15480
acggcacccg cgaccactat gccaagaatg cccaaggtaa aaattgccgg ccccgccatg 15540
aagtccgtga atgccccgac ggccgaagtg aagggcaggc cgccacccag gccgccgccc 15600
tcactgcccg gcacctggtc gctgaatgtc gatgccagca cctgcggcac gtcaatgctt 15660
ccgggcgtcg cgctcgggct gatcgcccat cccgttactg ccccgatccc ggcaatggca 15720
aggactgcca gcgctgccat ttttggggtg aggccgttcg cggccgaggg gcgcagcccc 15780
tggggggatg ggaggcccgc gttagcgggc cgggagggtt cgagaagggg gggcaccccc 15840
cttcggcgtg cgcggtcacg cgcacagggc gcagccctgg ttaaaaacaa ggtttataaa 15900
tattggttta aaagcaggtt aaaagacagg ttagcggtgg ccgaaaaacg ggcggaaacc 15960
cttgcaaatg ctggattttc tgcctgtgga cagcccctca aatgtcaata ggtgcgcccc 16020
tcatctgtca gcactctgcc cctcaagtgt caaggatcgc gcccctcatc tgtcagtagt 16080
cgcgcccctc aagtgtcaat accgcagggc acttatcccc aggcttgtcc acatcatctg 16140
tgggaaactc gcgtaaaatc aggcgttttc gccgatttgc gaggctggcc agctccacgt 16200
cgccggccga aatcgagcct gcccctcatc tgtcaacgcc gcgccgggtg agtcggcccc 16260
tcaagtgtca acgtccgccc ctcatctgtc agtgagggcc aagttttccg cgaggtatcc 16320
acaacgccgg cggccgcggt gtctcgcaca cggcttcgac ggcgtttctg gcgcgtttgc 16380
agggccatag acggccgcca gcccagcggc gagggcaacc agcccgg 16427

Claims (10)

1.一种含双报告基因的菊花ACO基因过表达载体，其碱基序列如SEQ ID NO.11所示，命名为PBI121-CmACO-GFP。
2.权利要求1所述载体的构建方法，其中，该方法步骤如下：
(1)pBI121-GFP质粒的构建：获取表达载体pCAMBIA1304中报告基因GFP片段；将pBI121质粒双酶切、纯化后，与纯化的GFP片段进行连接；
(2)通过CmACO基因的同源克隆，获取CmACO基因的全长cDNA序列和CmACO基因ORF区全长序列；
(3)构建pBI121-CmACO-GFP载体：获取CmACO基因全长ORF片段，将pBI121-GFP质粒进行单酶切、纯化后，与纯化的CmACO基因全长ORF片段进行连接。
3.如权利要求2所述的构建方法，其中，所述步骤(1)获取GFP片段时所用引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
4.如权利要求2所述的构建方法，其中，所述步骤(1)中获取GFP片段时PCR扩增反应体系为：5×PrimeSTARBuffer4μl、2.5mM dNTPs1.5μl、cDNA1μl、10mM GFPXF1μl、10mM GFPBR1μl、PrimeSTAR HSDNA Polymerase0.2μl、ddH2O补至20μl；反应条件为：(98℃10s，56℃10s，72℃2min)35个循环，72℃7min。
5.如权利要求2所述的构建方法，其中，所述步骤(1)采用BamHI酶和XbaI酶对pBI121质粒进行双酶切。
6.如权利要求2所述的构建方法，其中，所述步骤(1)连接时的反应体系为：5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2μl、pBI121线性质粒50-200ng、GFP片段50-100ng、ddH2O补至10μl。
7.如权利要求2所述的构建方法，其中，所述步骤(2)中CmACO基因的同源克隆时所用引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
8.如权利要求2所述的构建方法，其中，所述步骤(3)中获取CmACO基因全长ORF片段时所用引物序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
9.如权利要求2所述的构建方法，其中，所述步骤(3)中获取CmACO基因全长ORF片段时PCR扩增反应体系为：5×PrimeSTARBuffer4μl、dNTPs(2.5mM)1.5μl、cDNA1μl、ACOXF(10mM)1μl、ACOXR(10mM)1μl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase0.2μl、ddH2O补至20μl；反应条件为：(98℃10s，62℃10s，72℃2min)35个循环，72℃7min。
10.如权利要求2所述的构建方法，其中，所述步骤(3)中连接时的反应体系为：5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2μl、pBI121-GFP线性质粒50-200ng、CmACO片段50-100ng、ddH2O补至10μl。
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