KR102395185B1

KR102395185B1 - Pmt 유전자가 조작된 식물 세포 및 이의 이용 방법

Info

Publication number: KR102395185B1
Application number: KR1020190175479A
Authority: KR
Inventors: 서효석; 이영기; 이정헌; 김광철; 나웅현; 오경환; 전은영; 이장미
Original assignee: 주식회사 케이티앤지
Priority date: 2019-08-22
Filing date: 2019-12-26
Publication date: 2022-05-10
Also published as: KR102389358B1; KR20210023645A; KR20210023646A

Abstract

CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 모세포에 비해 PMT(putrescine N-methyltransferase) 유전자 또는 PMT 단백질의 발현 또는 활성이 감소되도록 유전적으로 조작된 식물 세포, 이를 포함하는 식물, 니코틴 생합성 억제용 조성물, PMT 유전자 조작용 조성물, 니코틴 생합성이 억제된 식물 세포 제조 방법 및 식물 세포의 PMT 유전자를 조작하는 방법에 관한 것이다.
일 양상에 따른 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하면 식물 세포 내 PMT 유전자가 조작되어 니코틴의 생합성이 억제될 수 있어, 국제 추세에 따른 저니코틴 담배 품종을 생산할 수 있어, 국내외 담배 업계에 이바지할 수 있다.

Description

PMT 유전자가 조작된 식물 세포 및 이의 이용 방법{GENETICALLY ENGINEERED PLANT CELL AND USING METHOD OF THE SAME}

PMT 유전자가 조작된 식물 세포 및 이의 이용 방법에 관한 것이다.

우리나라는 남성 흡연율이 1992년 68.9%에서 2006년 44.1%, 2016년 40.7% 등으로 감소하여 왔으나, 주요 선진국 및 OECD 국가 평균 23.9%를 크게 웃도는 수준을 유지하고 있다. 담뱃세 인상, 금연구역 확대 등 정부에서 적극적인 담배규제 정책을 펼치고 있으며, 미국 식품의약국(FDA)은 ‘담배의 니코틴 함량을 낮춰 중독성을 감소시키거나 없애는 것’을 골자로 한 사전 입법제안 예고를 2017년 공고하였으며, 2030년까지 유엔의 지속가능한 발전목표달성을 위한 건강 보장과 증진의 수단으로서 WHO담배규제기본협약의 관리방안을 반영하여 저니코틴 담배 품종의 개발이 필요한 실정이었다.

한편, 종래 기술에서는 담배 식물의 니코틴 생합성에 관련된 유전자의 기능을 GMO 기술(RNAi 등)을 통하여 억제시킴으로써 니코틴 함량을 낮추었다. 그러나 이전 기술의 한계로 인해 유전자의 기능을 100% 억제할 수 없었으며, 니코틴 함량이 미량 검출되는 한계가 있었다.

이에, CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 putrescine N-methyltransferase(이하 PMT) 유전자에 돌연변이를 유발시킴으로써 “외부 유전자가 도입되지 않은 non-GMO”이면서 “니코틴이 검출되지 않는 담배” 식물체를 개발하기에 이르렀다.

한국특허출원 제10-2013-7031875호

일 양상은 서열번호 13의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 서열번호 14의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 15의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인 제1 폴리뉴클레오티드; 또는

상기 제1 폴리뉴클레오티드가 전사된 제2 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 CRISPR/Cas9 시스템을 포함하며,

모세포에 비해 PMT(putrescine N-methyltransferase) 유전자 또는 PMT 단백질의 발현 또는 활성이 감소되도록 유전적으로 조작된 식물 세포를 제공한다.

다른 양상은 상기 식물 세포를 포함하는 식물을 제공한다.

또 다른 양상은 서열번호 13의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 서열번호 14의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 15의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인 제1 폴리뉴클레오티드; 또는

상기 제1 폴리뉴클레오티드가 전사된 제2 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 CRISPR/Cas9 시스템을 제공한다.

또 다른 양상은 상기 CRISPR/Cas9 시스템을 포함하는 니코틴 생합성 억제용 조성물을 제공한다.

또 다른 양상은 상기 CRISPR/Cas9 시스템을 포함하는 PMT 유전자 조작용 조성물을 제공한다.

상기 제1 폴리뉴클레오티드가 전사된 제2 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 CRISPR/Cas9 시스템을 포함하는 벡터를 식물 세포에 도입시키는 단계;를 포함하는 니코틴 생합성이 억제된 식물 세포의 제조 방법을 제공한다.

상기 제1 폴리뉴클레오티드가 전사된 제2 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 CRISPR/Cas9 시스템을 포함하는 벡터를 식물 세포에 도입시키는 단계;를 포함하는 식물 세포의 PMT 유전자를 조작하는 방법을 제공한다.

모세포에 비해 PMT(putrescine N-methyltransferase) 유전자 또는 PMT 단백질의 발현 또는 활성이 감소되도록 유전적으로 조작된 식물 세포에 관한 것이다.

상기 “모세포”는 일 양상에 따른 PMT 유전자 또는 PMT 단백질의 발현 또는 활성이 감소되도록 인위적인 조작을 수행하지 않은 세포로서, 인체에서 갓 분리된 세포 및 이를 배양한 세포를 의미한다.

담배의 대표적 알칼로이드인 니코틴은 트로판 알칼로이드(tropane alkaloid)와 같이 뿌리에서 오르니틴(ornithine)과 아르기닌(arginine)으로부터 생합성 되어진 푸트레신(putrescine)이 N-메틸푸트레신(N-methylputrescine)으로 전환되고 디아민 옥시다아제(diamine oxidase)에 의해 산화된 후 4-메틸아미노부타놀(4-methylaminobutanol)을 거쳐 1-메틸-Δ1-피롤리니움 양이온(1-methyl-Δ1-pyrrolinium cation)이 되고 니코틴산(nicotinic acid)을 거쳐 생합성된다(도 1 참조). 그 중에서 "푸트레신-N-메틸트랜스퍼라아제(putrescine-N-methyltransferase, 이하 PMT)"는 니코틴의 생합성과정에서 아주 중요한 효소로 니코틴의 생합성과정에서 속도제한효소(Rate limiting enzyme)라고 할 수 있다.

상기 PMT 유전자는 상기 PMT(putrescine N-methyltransferase) 유전자는 PMT1a 유전자, PMT1b 유전자, PMT2 유전자, PMT3 유전자 및 PMT4 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자일 수 있으며, 보다 구체적으로는 PMT1a, PMT1b, PMT2, PMT3 및 PMT4 유전자를 모두 포함하는 것일 수 있다.

상기 PMT1a 유전자는 서열번호 9의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 상기 PMT1b 유전자는 서열번호 19의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 잇고, 상기 PMT2 유전자는 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 상기 PMT3 유전자는 서열번호 11의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 상기 PMT4 유전자는 서열번호 12의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

또한, 본 명세서에서 용어 "유전적 조작(genetic engineering)" 또는 "유전적으로 조작된(genetically engineered)"은 세포에 대하여 하나 이상의 유전적 변형(genetic modification)을 도입하는 행위 또는 그에 의하여 만들어진 세포를 나타낸다. 상기 유전적 조작은 PMT 유전자의 핵산서열 내 변형으로 유도될 수 있으며, 상기 핵산 서열 내 변형은 상기 CRISPR/Cas9 시스템에 의하여 인위적으로 일어날 수 있다.

이에 일 양상에 따른 식물 세포는 CRISPR/Cas9 시스템을 상기 식물 세포에 전달하여 니코틴 생합성에 참여하는 PMT 유전자를 불활성화시켜 변형된 PMT 단백질이 발현되어, 니코틴 생합성을 억제할 수 있다.

용어 PMT 유전자 또는 PMT 단백질의 "발현 또는 활성이 감소" 또는 PMT 유전자의 "불활성화", PMT 단백질의 "발현 또는 활성이 감소" 또는 PMT 유전자의 "불활성화"된 유전적으로 조작된 식물 세포는 상기 PMT 유전자 또는 PMT 단백질이 비교 가능한 동일 종의 식물 세포 또는 그의 모세포에서 측정된 PMT 유전자 또는 PMT 단백질의 발현 또는 활성 수준보다 낮은 정도의 발현 또는 활성이 나타내거나 발현 또는 활성이 없는 것을 의미한다. 즉 식물 세포에 있어서 PMT 유전자 또는 PMT 단백질의 발현 또는 활성이 본래 조작되지 않은 식물 세포의 발현 또는 활성보다 약 20% 이 상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다. PMT 유전자 또는 PMT 단백질의 발현 또는 활성이 감소된 유전적으로 조작된 식물 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 용어 "불활성화 (inactivation)"는 전혀 발현이 되지 않는 유전자 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없는 단백질이 생성되는 것을 의미할 수 있다. 용어 "감소 (depression)"는 PMT 유전자가 조작되지 않은 식물 세포에 비하여 낮은 수준으로 발현되거나, 또는 단백질이 발현이 되더라도 그 활성이 낮은 것을 의미할 수 있다.

상기 PMT 유전자 또는 PMT 단백질의 발현 또는 활성이 감소되는 것은 상기 PMT를 코딩하는 유전자의 일부 또는 전부가 변이, 치환, 삭제되거나 상기 유전자에 하나 이상의 염기가 삽입되는 것에 의한 것일 수 있으며, PMT 유전자 교정 수단에 의할 수 있다.

상기 PMT 유전자가 PMT1a, PMT1b, PMT2, PMT3 및 PMT4 유전자를 모두 포함하는 경우, PMT1a, PMT1b, PMT2, PMT3 및 PMT4 유전자 모두 넉아웃되어 니코틴 생합성이 최대로 억제될 수 있다.

상기 식물은 재배담배(Nicotiana tabacum)일 수 있고, 구체적으로 황색종, 버어리종, 재래종, 흑담배 또는 오리엔트종일 수 있고, 보다 구체적으로는 버어리종 또는 황색종일 수 있다.

상기 CRISPR/Cas9 시스템에 포함되는 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(transactivating crRNA)를 포함하는 sgRNA(single guide RNA)일 수 있고, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 제2 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 유전자일 수 있다.

또한, 상기 CRISPR/Cas9 시스템은 Cas9(CRISPR associated protein 9) 단백질 또는 Cas9 단백질을 코딩하는 유전자 및 NLS(Nuclear Localization Signal) 단백질 또는 NLS 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 것일 수 있다.

일반적으로, 널리 알려진 유전자 교정 수단인 "CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 시스템"은 집합적으로 Cas 유전자를 코딩하는 서열, tracr(트랜스-활성화 CRISPR) 서열(예를 들어, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-메이트 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "직접 반복부" 및 tracrRNA-가공 부분 직접 반복부 포함), 가이드 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "스페이서"로도 지칭), 가이드 RNA 또는 CRISPR 유전자좌로부터의 기타 서열 및 전사물을 포함하는 CRISPR-관련(CRISPR-associated; 이하 Cas) 유전자의 발현에 수반되거나, 그의 활성을 유도하는 전사물 및 다른 요소를 지칭한다. 일부 구현 예에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 I형, II형 또는 III형 CRISPR 시스템으로부터 유래된다. 일부 구현 예에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체, 예를 들어, 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes)로부터 유래된다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 증진시키는 요소(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 프로토스페이서로도 지칭)를 특징으로 한다. CRISPR 복합체의 형성의 맥락에서, "표적 서열" 또는 "표적 유전자"는 가이드 서열이 상보성을 갖도록 설계된 서열을 지칭하며, 여기서, 표적 서열과 가이드 서열 간의 혼성화는 CRISPR 복합체의 형성을 증진시킨다. 본질적으로 완전한 상보성이 필요하지 않지만, 혼성화를 야기하고, CRISPR 복합체의 형성을 증진시키는 충분한 상보성이 존재한다. 표적 서열은 임의의 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현 예에서, 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질 내에 위치한다. 일부 구현 예에서, 표적 서열은 진핵 세포의 세포기관, 예를 들어, 미토콘드리아 또는 엽록체 내에 존재할 수 있다.

상기 Cas 단백질은 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(trans-activating crRNA, tracrRNA)로 불리는 두 RNA와 복합체를 형성할 때, 활성 엔도뉴클레아제 또는 니카아제(nickase)를 형성한다. 상기 Cas 단백질의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9(Csn1 및 Csx12로도 알려짐), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 그의 상동체 또는 그의 변형된 버전을 포함한다. 이들 효소가 알려져 있으며; 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 단백질의 아미노산 서열은 수탁 번호 Q99ZW2 하에 스위스프로트(SwissProt) 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 일부 구현 예에서, 비변형 CRISPR 효소, 예를 들어, Cas9는 DNA 절단 활성을 갖는다.

일부 구현 예에서, CRISPR 효소는 Cas9 단백질이며, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래 Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 유래 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophiles) 유래 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 아우레우스(Streptocuccus aureus) 유래 Cas9 단백질 및 네이세리아 메닝기디티스(Neisseria meningitidis) 유래 Cas9 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 Cas9 단백질일 수 있고, 구체적으로 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래 Cas9 단백질일 수 있다. 일부 구현 예에서, Cas9 단백질은 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화되며, 상기 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래 Cas9 단백질을 사용하는 경우, PMT 유전자 또는 PMT 단백질의 발현 또는 활성이 최대로 감소될 수 있다.

일부 구현 예에서, Cas9 단백질은 진핵 세포 내의 핵 내에 위치하기 위하여 Cas9 단백질의 5'- 또는 3'-, 또는 양 말단 부분에 NLS(nuclear localization sequence or signal)를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 NLS는 하나 또는 그 이상일 수 있다.

본 명세서에서 용어 “핵 위치화 서열 또는 신호(Nuclear localization sequence or signal, NLS)"는 특정물질(예컨대, 단백질)을 세포 핵 내로 운반하는 역할을 하는 아미노산 서열을 의미하며, 대체적으로 핵공(Nuclear Pore)을 통하여 세포 핵 내로 운반하는 작용을 한다. 상기 핵 위치화 서열은 진핵생물에서 CRISPR 복합체 활성에 필요하지 않지만, 이러한 서열을 포함하여, 시스템의 활성을 증진시켜, 특히 핵 내의 핵산 분자를 표적화하는 것으로 여겨진다.

또한 RNA 유전자 가위(RNA-guided CRISPR)(clustered regularly interspaced short palindrome repeats)-연관된 뉴클레아제 Cas9는 표적 유전자의 넉아웃, 전사 활성화 및 single guide RNA(sgRNA)(즉, crRNA-tracrRNA 융합 전사체)를 이용한 억제에 대한 획기적인 기술을 제공하며, 이 기술은 수많은 유전자 위치를 타겟팅하는 것으로 알려져 있다.

Cas9 (또는 Cpf1) 단백질은 CRISPR/Cas9 시스템에서 필수적인 단백질 요소를 의미하고, 상기 Cas9 (또는 Cpf1) 유전자 및 단백질의 정보는 국립생명공학정보센터(national center for biotechnology information, NCBI)의 GenBank에서 구할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Cas (또는 Cpf1)단백질을 암호화하는 CRISPR-연관 유전자는 약 40 개 이상의 서로 다른 Cas (또는 Cpf1) 단백질 패밀리가 존재하는 것으로 알려져 있으며, cas 유전자 및 반복 구조(repeat structure)의 특정 조합에 따라 8개의 CRISPR 하위 유형 (Ecoli, Ypest, Nmeni, Dvulg, Tneap, Hmari, Apern, 및 Mtube)을 정의할 수 있다. 따라서 상기 각 CRISPR 하위 유형이 반복단위를 이루어 폴리리보뉴클레오티드-단백질 복합체를 형성할 수 있다.

일 양상에 따른 식물 세포는 PMT 유전자의 특정 타겟 부위가 절단되어 상기 유전자가 넉아웃된 식물 세포로서, 넉아웃에 의하면 식물 세포의 니코틴 생합성 경로에서 오르니틴(ornithine)과 아르기닌(arginine)으로부터 생합성 되어진 푸트레신(putrescine)이 N-메틸푸트레신(N-methylputrescine)으로 전환되지 않아, 니코틴의 생합성이 억제될 수 있다. 일 양상에 따른 PMT 넉아웃 식물 세포를 제조하기 위하여 유전체 교정 기술로서 유전체 중 존재 비율이 매우 낮은 희귀 유전자 서열을 절단하는 희귀 절단 엔도뉴클레아제(rare-cutting endonuclease)를 사용하는 기술이 채용될 수 있다.

상기 유전자 넉아웃은 유전자의 전부 또는 일부 (예컨대, 하나 이상의 뉴클레오티드)의 결실, 치환, 및/또는 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입에 의한 유전자의 활성 조절, 예컨대, 불활성화를 의미하는 것일 수 있다. 상기 유전자 불활성화는 유전자의 발현 억제 또는 발현 감소 (downregulation) 또는 본래의 기능을 상실한 단백질을 코딩하도록 변형된 것을 의미한다. 또한 유전자 조절은 타겟 유전자의 하나 이상의 Exon을 둘러싸고 있는 양쪽 intron 부위를 동시에 targeting함으로 인한 Exon 부위의 결실로 인해 얻어지는 단백질의 구조 변형, Dominant negative 형태의 단백질 발현, soluble 형태로 분비되는 경쟁적 저해제 발현 등의 결과에 의한 유전자의 기능 변화를 의미하는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 상기 PMT 유전자의 Exon 1 내지 3으로 이루어진 부위에서 적어도 하나의 부위에 결합되는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 상기 PMT 유전자의 Exon 1의 부위에 결합되는 것일 수 있다.

상기 PMT 유전자 또는 PMT 단백질 발현 또는 활성이 감소되도록 인위적으로 수행하는 유전자 조작은 Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질에 의하여 유도될 수 있다. 상기 유전자 조작에 사용될 수 있는 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래 Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 유래 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophiles) 유래 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 아우레우스(Streptocuccus aureus) 유래 Cas9 단백질 및 네이세리아 메닝기디티스(Neisseria meningitidis) 유래 Cas9 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 Cas9 단백질을 사용하여 유도될 수 있으며, 보다 구체적으로 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래 Cas9 단백질을 사용하여 유도될 수 있다.

상기 Cas9가 DNA로 암호화되어 개체 또는 세포로 전달되는 경우, 상기 DNA는 일반적으로 (그러나 필수적이지는 않음) 타겟 세포에서 작동 가능한 조절 요소 (예컨대, 프로모터)를 포함할 수 있다. 상기 Cas9 발현을 위한 프로모터는, 예컨대, CMV, EF-l a, EFS, MSCV, PGK, 또는 CAG 프로모터일 수 있다. gRNA 발현을 위한 프로모터는, 예컨대, HI, EF-la, tRNA 또는 U6 프로모터일 수 있다. Cas9를 코딩하는 유전자의 서열은 nuclear localization signal(NLS) (e.g., SV40 NLS)를 포함할 수 있다. 일 예에서, 상기 프로모터는 조직 특이성 또는 세포 특이성을 갖는 것일 수 있다.

상기 PMT 유전자 또는 PMT 단백질 발현 또는 활성이 감소되도록 인위적으로 수행하는 유전자 조작은 PMT 유전자를 구성하는 핵산서열 내 PAM(protospacer-adjacent Motif) 서열 중 또는 이의 5' 말단 또는 3'말단에 인접하여 위치하는 연속하는 1bp 내지 50bp의 염기 서열 부위 내의 유전자의 전부 또는 연속하는 염기 서열 부위의 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 야생형 유전자와 상이한 뉴클레오티드로의 치환, 각각 독립적으로 A, T, C 및 G 중에서 선택된 1 내지 23개의 뉴클레오티드의 삽입, 또는 상기 변형의 조합에 의한 것일 수 있다.

일 구현 예에서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 상기 식물 세포 내 적어도 하나의 대립유전자의 PMT 유전자에 결합되는 것일 수 있으며, 구체적으로 모든 대립유전자의 PMT 유전자에 결합되는 것일 수 있다. 모든 대립유전자의 PMT 유전자에 제2 폴리뉴클레오티드가 결합하여 PMT 유전자를 넉아웃시키는 경우, 동일 세대 뿐만 아니라 후 세대의 식물 세포에서도 니코틴 생합성이 최대로 억제될 수 있다.

일 구현 예에서 상기 식물 세포에서 PMT 유전자를 넉아웃 시키기 위하여 사용한 타겟 시퀀스는 예컨대 PMT 유전자의 Exon 1 내지 3으로 이루어진 부위에서 적어도 하나의 부위일 수 있고, 보다 구체적으로 PMT 유전자의 Exon 1의 부위일 수 있다.

상기 PMT 유전자 또는 PMT 단백질 발현 또는 활성이 감소되도록 인위적으로 수행하는 유전자 조작은 PMT 유전자로부터 코딩되는 단백질이 본래의 기능을 갖는 단백질 형태로 발현되지 않도록 하는 것일 수 있다. 상기 유전자의 조작은 다음 중 하나 이상에 의하여 유도된 것일 수 있다:

1) PMT 유전자의 전부 또는 일부 결실, 예컨대, PMT 유전자의 1bp 이상의 뉴클레오티드, 예컨대, 1 내지 30개, 1 내지 27개, 1 내지 25개, 1 내지 23개, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 3개, 또는 1개의 뉴클레오티드의 결실,

2) PMT 유전자의 1bp 이상의 뉴클레오티드, 예컨대, 1 내지 30개, 1 내지 27개, 1 내지 25개, 1 내지 23개, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 3개, 또는 1개의 뉴클레오티드의 원래(야생형)와 상이한 뉴클레오티드로의 치환, 및

3) 하나 이상의 뉴클레오티드, 예컨대, 1 내지 30개, 1 내지 27개, 1 내지 25개, 1 내지 23개, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 3개, 또는 1개의 뉴클레오티드 (각각 독립적으로 A, T, C 및 G 중에서 선택됨)의 타겟 유전자의 임의의 위치에의 삽입

4) 상기 1) 내지 3) 중에서 선택된 2 가지 이상의 조합.

상기 PMT 유전자의 변형되는 일부 ('타겟 부위')는 상기 유전자 중의 1bp 이상, 3bp 이상, 5bp 이상, 7bp 이상, 10bp 이상, 12bp 이상, 15bp 이상, 17bp 이상, 20bp 이상, 예컨대, 1bp 내지 30bp, 3bp 내지 30bp, 5bp 내지 30bp, 7bp 내지 30bp, 10bp 내지 30bp, 12bp 내지 30bp, 15bp 내지 30bp, 17bp 내지 30bp, 20bp 내지 30bp, 1bp 내지 27bp, 3bp 내지 27bp, 5bp 내지 27bp, 7bp 내지 27bp, 10bp 내지 27bp, 12bp 내지 27bp, 15bp 내지 27bp, 17bp 내지 27bp, 20bp 내지 27bp, 1bp 내지 25bp, 3bp 내지 25bp, 5bp 내지 25bp, 7bp 내지 25bp, 10bp 내지 25bp, 12bp 내지 25bp, 15bp 내지 25bp, 17bp 내지 25bp, 20bp 내지 25bp, 1bp 내지 23bp, 3bp 내지 23bp, 5bp 내지 23bp, 7bp 내지 23bp, 10bp 내지 23bp, 12bp 내지 23bp, 15bp 내지 23bp, 17bp 내지 23bp, 20bp 내지 23bp, 1bp 내지 20bp, 3bp 내지 20bp, 5bp 내지 20bp, 7bp 내지 20bp, 10bp 내지 20bp, 12bp 내지 20bp, 15bp 내지 20bp, 17bp 내지 20bp, 21bp 내지 25bp, 18bp 내지 22bp, 또는 21bp 내지 23bp의 연속하는 염기 서열 부위일 수 있다.

일 예에서, 상기 유전자 넉아웃은 희귀 절단 엔도뉴클레아제를 포함하는 유전체 교정 시스템에 의하여 타겟된 유전자 내의 특정 부위의 단일가닥 또는 이중가닥 절단(cleavage)을 촉매화하여 타겟된 유전자인 PMT 유전자를 발현을 감소시키는 것일 수 있다. 상기 희귀 절단 엔도뉴클레아제에 의하여 촉매되는 핵산가닥 손상(breaks)은 상동(homologous) 재조합(recombination) 또는 비상동 말단 연결 (non-homologous end joining; NHEJ) 등의 메커니즘들을 통하여 수선될 수 있다. 이 경우, NHEJ 메커니즘이 일어나면, 절단 위치(cleavage site)에서 DNA 서열에 변화가 유발되고, 이에 의하여 유전자가 불활성화될 수 있다. NHEJ을 통한 수선은 짧은 유전자 단편의 치환들, 삽입들 또는 결실을 야기하고, 해당 유전자 넉아웃(knockouts)의 유도에 사용될 수 있다. 상기 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드, 예컨대, 1 내지 30bp, 1 내지 27bp, 1 내지 25bp, 1 내지 23bp, 1 내지 20bp, 1 내지 15bp, 1 내지 10bp, 1 내지 5bp, 1 내지 3bp, 또는 1bp의 뉴클레오티드의 치환, 결실, 및/또는 삽입일 수 있다.

상기 희귀 절단 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제(meganuclease), 징크핑거(Zinc finger) 뉴클레아제,　CRISPR/Cas9 (Cas9 단백질), CRISPR-Cpf1 (Cpf1 단백질) 및 TALE-뉴클레아제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 희귀 절단 엔도뉴클레아제는 Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질일 수 있다.

용어 "키메라 RNA", "키메라 가이드 RNA", "가이드 RNA", "단일의 가이드 RNA(single guide RNA, sgRNA)" 및 "합성 가이드 RNA"는 상호교환가능하게 사용되며, 가이드 서열, tracr 서열 및/또는 tracr 메이트 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 용어 "가이드 서열"은 표적 부위를 지정하는 가이드 RNA 내의 약 20bp 서열을 지칭하며, 용어 "가이드" 또는 "스페이서"와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 또한, 용어 "tracr 메이트 서열"은 용어 "직접 반복부(들)"와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 상기 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, CRISPR RNA (crRNA) 및 트랜스 활성화 crRNA (transactivating crRNA, tracrRNA)로 이루어져 있는 것일 수 있으며, 또는 crRNA 및 tracrRNA의 부분을 포함하고 상기 표적 DNA와 혼성화하는 단일 사슬 RNA (single-chain RNA, sgRNA)일 수 있다.

일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 혼성화하고, 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하기에 충분한, 표적 폴리뉴클레오티드 서열과의 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 또한 PMT 유전자 또는 PMT 단백질의 발현 또는 활성을 감소시키기 위한 유전자 조작에 이용할 수 있는 염기 서열이라면 제한 없이 가이드 RNA로 이용할 수 있으며, 예컨대 상기 염기 서열은 PMT 유전자와 혼성화할 수 있는 서열일 수 있다. 또한 상기 가이드 RNA의 기능을 변형/증진시키기 위하여 가이드 RNA 염기 서열의 일부분을 변형할 수 있다. 또한 일부 구현 예에서, 가이드 서열과 그의 상응하는 표적 서열 간의 상보성의 정도는 적절한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬되는 경우, 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상이다. 최적의 정렬은 서열을 정렬하기에 적절한 임의의 알고리즘의 사용으로 결정될 수 있으며, 그의 비제한적인 예는 스미스-워터만(Smith-Waterman) 알고리즘, 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘, 버로우즈-휠러 트랜스폼(Burrows-Wheeler Transform)에 기초한 알고리즘(예를 들어, 버로우즈 휠러 얼라이너(Burrows Wheeler Aligner)), ClustalW, Clustal X, BLAT, 노보얼라인(Novoalign)(노보크라프트 테크놀로지즈(Novocraft Technologies), ELAND(일루미나(Illumina), 미국 캘리포니아주 샌디에고), SOAP(soap.genomics.org.cn에서 이용가능) 및 Maq(maq.sourceforge.net에서 이용가능)를 포함한다. 일부 구현 예에서, 가이드 서열은 예컨대 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현 예에서, 가이드 서열은 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12개 이하의 뉴클레오티드 길이이다. 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하는 가이드 서열의 능력은 임의의 적절한 검정에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 시험되는 가이드 서열을 포함하는 CRISPR 복합체를 형성하기에 충분한 CRISPR 시스템의 성분은 예를 들어, CRISPR 서열의 성분을 인코딩하는 벡터로의 트랜스펙션 후에, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 서베이어 검정에 의한 표적 서열 내의 우선적인 절단의 평가에 의해서와 같이, 상응하는 표적 서열을 갖는 숙주 세포로 제공될 수 있다. 유사하게, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 절단은 표적 서열, 시험되는 가이드 서열 및 시험 가이드 서열과 상이한 대조군 가이드 서열을 포함하는 CRISPR 복합체의 성분을 제공하고, 표적 서열에서 시험 및 대조군 가이드 서열 반응 간의 결합 또는 절단 비율을 비교함으로써 시험관에서 평가될 수 있다. 다른 검정이 가능하며, 당업자에게 용이하게 사용될 수 있을 것이다.

가이드 서열은 임의의 표적 서열을 표적화하도록 선택될 수 있다. 일부 구현 예에서, 표적 서열은 세포의 게놈 내의 서열이다. 예시적인 표적 서열은 표적 게놈에서 독특한 것들을 포함한다. 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 유래 Cas9에 대하여, 게놈 내의 독특한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG의 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서, NNNNNNNNNNNNXGG (N은 A, G, T 또는 C이며; X는 임의의 것일 수 있음)는 게놈 내에 단일의 존재를 갖는다. 게놈 내의 독특한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGG의 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서, NNNNNNNNNNNXGG (N은 A, G, T 또는 C 이며; X는 임의의 것일 수 있음)는 게놈 내에 단일의 존재를 갖는다. 스트렙토코커스 써모필러스 CRISPR1 Cas9에 대하여, 게놈 내의 독특한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXXAGAAW의 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서, NNNNNNNNNNNNXXAGAAW (N은 A, G, T 또는 C이고; X는 임의의 것일 수 있으며; W는 A 또는 T임)는 게놈 내에 단일의 존재를 갖는다. 게놈 내의 독특한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXXAGAAW의 스트렙토코커스 써모필러스 CRISPR1 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서, NNNNNNNNNNNXXAGAAW(N은 A, G, T 또는 C이고; X는 임의의 것일 수 있으며; W는 A 또는 T임)는 게놈 내에 단일의 존재를 갖는다. 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9에 대하여, 게놈 내의 독특한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGGXG의 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서, NNNNNNNNNNNNXGGXG (N은 A, G, T 또는 C이고; X는 임의의 것일 수 있음)는 게놈 내에 단일의 존재를 갖는다. 게놈 내의 독특한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGGXG의 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서, NNNNNNNNNNNXGGXG (N은 A, G, T 또는 C이고; X는 임의의 것일 수 있음)는 게놈 내에 단일의 존재를 갖는다. 이들 서열 각각에서, "M"은 A, G, T 또는 C일 수 있다.

일 구현 예에서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 5'-말단에 서열번호 18의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드가 결합되어 있고, 3'-말단에 5개의 연속된 티민(Thymine)이 결합되어 있는 것일 수 있고, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 5'-말단에 서열번호 18의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드가 전사된 폴리뉴클레오티드가 결합되어 있고, 3'-말단에 5개의 연속된 우라실(Uracil)가 결합되어 있는 것일 수 있다. 상기 제1 폴리뉴클레오티드의 5'-말단에 서열번호 18의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 3'-말단에 5개의 연속된 티민이 결합되어 있거나, 상기 제2 폴리뉴클레오티드 5'-말단에 서열번호 18의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드가 전사된 폴리뉴클레오티드 또는 3'-말단에 5개의 연속된 우라실이 결합되어 있는 경우, 불안정한 가이드 RNA가 안정화될 수 있다.

상기 서열번호 18의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드가 전사된 폴리뉴클레오티드는 U6 프로모터(P_U6)에 해당한다.

일 구현 예에서, 상기 조작은 상기 제1 폴리뉴클레오티드, 상기 Cas9 단백질을 코딩하는 유전자 및 상기 NLS를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 형질전환시켜 이루어지는 것일 수 있다.

용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, V1k_GE, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

상기 벡터에서 상기 1 폴리뉴클레오티드, 상기 Cas9 단백질을 코딩하는 유전자 및 상기 NLS를 코딩하는 유전자는 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오타이드 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 "작동 가능하게 연결(operatively linked)"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.

상기 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.

상기 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

상기 형질전환에 있어서, 당업계에 주지된 형질전환 방법으로서 벼의 유전자의 형질전환이 가능한 방법이라면 특별히 제한되지는 아니하나, 구체적인 예를 들자면, 아그로박테리움-매개 형질전환법, 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol; PEG)-매개 프로토플라스트 형질전환법, 유전자총법, 전극(electrode) 형질전환법, 진공 침윤(Vacuum infiltration) 형질전환법 및 탄화규소 섬유-매개 형질전환법으로 이루어진 군에서 선택된 하나에 의해 수행되는 것일 수 있고, 벼의 특성과 형질전환율을 고려할 때 아그로박테리움-매개 형질전환법을 사용할 수 있다.

다른 양상은 상기 식물 세포를 포함하는 식물에 관한 것이다.

상기 식물은 동일 세대 뿐만 아니라 후 세대에서도 니코틴 생합성이 억제된 식물일 수 있고, 이에 따라 계속해서 니코틴 생산이 저감화된 식물을 얻을 수 있다.

상기 제1 폴리뉴클레오티드가 전사된 제2 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 CRISPR/Cas9 시스템에 관한 것이다.

상기 CRISPR/Cas9 시스템은 Cas9(CRISPR associated protein 9) 단백질 또는 Cas9 단백질을 코딩하는 유전자; 및

NLS(Nuclear Localization Signal) 단백질 또는 NLS 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함할 수 있다.

또 다른 양상은 상기 CRISPR/Cas9 시스템을 포함하는 니코틴 생합성 억제용 조성물에 관한 것이다.

또 다른 양상은 상기 CRISPR/Cas9 시스템을 포함하는 PMT 유전자 조작용 조성물에 관한 것이다.

상기 제1 폴리뉴클레오티드가 전사된 제2 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 CRISPR/Cas9 시스템을 포함하는 벡터를 식물 세포에 도입시키는 단계;를 포함하는 니코틴 생합성이 억제된 식물 세포의 제조 방법에 관한 것이다.

상기 제1 폴리뉴클레오티드가 전사된 제2 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 CRISPR/Cas9 시스템을 포함하는 벡터를 식물 세포에 도입시키는 단계;를 포함하는 식물 세포의 PMT 유전자를 조작하는 방법에 관한 것이다.

또 다른 양상은 서열번호 19의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

상기 폴리뉴클레오티드는 재배담배(Nicotiana tabacum)의 PMT 유전자 중 일부에 해당하는 것일 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 PMT1a(서열번호 9), PMT2(서열번호 10), PMT3(서열번호 11) 또는 PMT4(서열번호 12)의 염기 서열과 상이할 수 있다.

상기 폴리뉴클레이티드는 오르니틴(ornithine)과 아르기닌(arginine)으로부터 생합성 되어진 푸트레신(putrescine)이 N-메틸푸트레신(N-methylputrescine)으로 전환을 수행하는 단백질의 일부 또는 전부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 N.tomentosiformis 또는 N.otophora로부터 유래되는 것일 수 있다.

또 다른 양상은 모세포에 비해 상기 폴리뉴클레오티드의 발현 또는 활성이 감소되도록 유전적으로 조작하여 니코틴의 생산을 억제하는 방법에 관한 것이다.

중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는다.

일 양상에 따른 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하면 식물 세포 내 PMT 유전자가 조작되어 니코틴의 생합성이 효율적으로 억제될 수 있으며, 국제 추세에 따라 저니코틴 담배 품종을 생산할 수 있어, 국내외 담배 업계에 이바지할 수 있다.

도 1은 담배 식물체에서 일어나는 니코틴 생합성 경로이다.
도 2는 NtPMT1, NtPMT2, NtPMT3, NtPMT4 유전자 CDS 부위 염기 서열 중 절단 위치로 선정한 (A) sg1, (B) sg2, (C) sg3 부위 염기 서열 비교도이다.
도 3 내지 5는 유전자 운반체 제작에 사용한 운반체 및 발현 블록으로서, 도 3(A)는 GE_block, 도 3(B)는 벡터인 V1k_GE, 도 4(A)는 Cas9_block을, 도 4(B)는 sgRNA_PMT 블록을, 도 5는 최종 유전자 가위 발현 블록을 나타낸다.
도 6은 단계별 식물 조직배양 사진으로서, (A)는 잎 조직을 잘라 agrobacterium과 함께 배양하여 형질전환 시키는 단계, (B)는 callus 분화 및 shoot 분화를 유도하는 단계, (C)는 root 분화를 유도하는 단계, (D)는 분화가 완료된 소식물체 상태를 나타낸다.
도 7은 돌연변이 여부 및 양상을 확인하기 위하여 조직배양체 4 개체의 gDNA 내 PMT 유전자를 증폭하여 전기영동한 사진으로서, Lane M1: 100 bp DNA marker, Lane 1~4: NtPMT1 부위 증폭 결과, Lane 5~8: NtPMT2 부위 증폭 결과, Lane 9~12: NtPMT3 부위 증폭 결과, Lane 13~16: NtPMT4 부위 증폭 결과, Lane M2: 1 kb DNA marker를 나타낸다.
도 8은 Wild type (A)과 21번 mutant (B)의 PMT1 유전자 염기 서열 분석 프로파일을 나타낸 도로서, 단일 염기가 insertion 된 부분은 빨간색 사각형으로 표시되었다.
도 9 내지 12는 CRISPR/Cas9 시스템을 통해 돌연변이가 확인된 조직배양체로부터 CRISPR/Cas9 시스템이 포함된 유전자블록이 제거된 최종 선별된 F₁ 식물(108_PMTm_F₁)과 야생형(wild-type) 담배의 PMT 아미노산 서열을 비교한 도로서, 각각 도 9는 PMT1, 도 10은 PMT2, 도 11은 PMT3, 도 12는 PMT4의 아미노산 서열을 비교한 도이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

1. CRISPR/Cas9 System 이용한 저니코틴 담배 생산

(1) 유전자 운반체 제작

1) PMT(putrescine N-methyltransferase) 유전자의 선정

재배담배(Nicotiana tabacum)의 니코틴 생합성 경로(도 1)로부터 니코틴 생합성 유전자 중 PMT를 선정하였다.

2) 니코틴 생합성 관련 유전자 (NtPMT) 염기 서열 확인

버어리종(KB108) 대상으로 하기 표 1의 프라이머를 이용해 유전자 증폭 반응(PCR, Polymerase Chain Reaction) 수행하였고, 염기 서열 분석 서비스를 의뢰하였다.

프라이머 명칭	프라이머 염기 서열	증폭 크기 (bp)	유전자 증폭 조건			서열번호
			Annealing Tmp (℃)	Elongation time (sec)	Cycles
F_PMT1a	GCATAGATGTTTATTGGGAGTGTACAGCAA	724	74~68 (Step down)	30	40	1
R_PMT1a	AGTTGCTGACTGTACGTGCACA					2
F_PMT2	CATATGTGTCTATTGGGAGTGTACATCAA	685	68 (2 step)	30	40	3
R_PMT2	AAGTTGCTGACTGTACGTACACAT					4
F_PMT3	CATAGATATGTTTATTGGGAGTGTACATCAA	783	62 (3 step)	30	40	5
R_PMT3	CCACTTTAAATATAATCATACATGAGCTTGAC					6
F_PMT4	GCGAGCTTTCATAAAGTACAAATCA	812	62 (3 step)	30	40	7
R_PMT4	AGTATTTATTCATATTAAAGCATGTGTATTAGA					8

KB108 품종의 exon 1 ~ exon 3를 포함하는 gDNA 영역을 증폭하여 염기 서열 분석한 결과, NCBI (National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스에 공개된 재배담배(Nicotiana tabacum)의 PMT 유전자 염기 서열(표 2)과 100% 일치하였다.

유전자	GeneBank Accession No.	서열번호
NtPMT1a	AF126810 (gDNA, CDS)	9
NtPMT2	AF126809 (gDNA, CDS)	10
NtPMT3	AF126811 (gDNA, CDS)	11
NtPMT4	AF126812 (gDNA, CDS)	12

3) 유전자 가위 블록 디자인 및 운반체 재조합

PMT 유전자로부터 폴리펩타이드가 만들어지는 번역(translation) 단계의 초기에 중단될 수 있도록 exon 1 ~ exon 3 부분에 절단 위치를 선정하였고, PMT1a, PMT2, PMT3 및 PMT4 유전자 모두를 절단할 수 있는 공통된 부위를 선정하였다(표 3 및 도 2).

sgRNA	염기 서열	PMT 유전자 내 결합 위치				서열번호
sgRNA	염기 서열	PMT1a	PMT2	PMT3	PMT4	서열번호
sg1	AAGTCATATCTACCAACACAAATGG	Exon 1				13
sg2	TTTTCAGAGTTTAGCGCATTATGG	Exon 2	Exon 1	Exon 1	Exon 1	14
sg3	CTCAAAGAGCATGACATCTTGG	Exon 3	Exon 2	Exon 2	Exon 2	15

또한, 식물 발현 유전자 운반체(V1k_GE, 서열번호 16) 내에 유전자 가위 운반체 클로닝하여 최종 유전자 운반체(V1k_GE_PMT, 서열번호 17)를 완성하였다(도 3 내지 5).

pBI121은 E. coli와 agrobacterium에서 복제 가능한 binary vector이며 식물 형질전환에 널리 쓰이고 있다. 따라서, 구체적으로 pBI121을 HindIII와 EcoRI으로 절단하여 CRISPR/Cas9 시스템에 필요한 GE_block을 클로닝할 수 있도록 준비하였다(도 3A). GE_block은 차례대로 CaMV 35S promoter with dual enhancer, TEV leader sequence, Cas9 블록을 클로닝하기 위한 multi cloning site (MCS), CaMV 35S terminator, linker sequence, 그리고 sgRNA 블록을 클로닝하기 위한 multi cloning site (MCS)로 구성되어 있으며 양 끝에는 HindIII와 EcoRI의 인식 염기서열이 추가되어 있다. GE_block의 각 블록들은 DNA 합성으로 준비되었으며 순차적으로 클로닝하여 완성하였다. HindIII와 EcoRI으로 절단된 pBI121과 GE_block을 ligation하여 V1k_GE를 제작하였다(도 3B).

Cas9_block은 N-terminus nuclear localization sequence (NLS), Cas9 coding sequence (CDS), C-terminus nuclear localization sequence (NLS)로 구성된다. 양 말단에는 BamHI과 SacI 인식 염기서열이 추가되어 있다(도 4A).

sgRNA가 발현될 수 있는 블록은 U6 promoter(P_U6, 서열번호 18)와 sgRNA, 그리고 poly T로 구성된다. PMT 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 세 종류의 sgRNA 블록을 overlap extension PCR 기법을 통해 하나의 연속된 DNA로 연결하여 sgRNA_PMT를 완성하였다. sgRNA_PMT의 양 끝에는 SalI, SpeI의 인식 염기서열이 존재한다(도 4B).

BamHI과 SacI으로 절단된 V1k_GE와 Cas9_block을 ligation 반응을 통해 이어 붙인 후, SalI과 SpeI으로 절단하여 sgRNA_PMT를 삽입하여 V1k_GE_PMT를 제작하였다(도 5).

4) 유전자 전달 미생물 (Agrobacterium) 내 재조합 운반체 도입

Freeze-thaw method 실험법으로 식물용 운반체를 Agrobacterium LBA4404 strain에 형질전환시켰다.

구체적으로, Agrobacterium을 YEP 액체 배지 (yeast extract 10 g, bacto peptone 10 g, NacCl 5g)에 접종한 후, 16시간 동안 28℃, 250 rpm 조건으로 진탕 배양하였다. 배양액을 3,000 g의 속도 및 4℃ 조건으로 20분간 원심분리하여 세포를 분리하고, 20 mM CaCl₂에 부유시켜서 competent cell을 만들었다. Competent cell 100μL에 plasmid DNA (식물용 운반체) 5 μL를 첨가한 후, 액체질소에서 5분간, 37℃ 온도에서 5분간 배양하였다. YEP 액체배지 1 mL를 첨가하여 28℃, 250 rpm 조건으로 2시간 동안 진탕 배양하였다. 100 μL 배양액을 kanamycin 100mg/L가 포함된 YEP 고체배지에 spreading 한 후, 28℃ 온도에서 3일 동안 배양하였다. Single colony들을 각각 계대배양한 후, plasmid DNA가 형질전환되었는지 PCR을 통해 확인하였다.

(2) 식물 조직배양

1) 식물 형질전환

Agrobacterium를 YEP liquid media (70 mg/L kanamycin, 70 mg/L streptomycin 포함), 28℃ 조건에서 24시간 배양하였다.

또한, 발아된지 한 달된 식물체의 잎을 70% 에탄올과 락스로 멸균한 후, 3 mm X 3 mm 크기의 절편으로 자르고, MS liquid 배지가 5 ml 담겨 있는 petri-dish에 절편을 올려 놓은 뒤, Agrobacterium 배양액 1 mL을 골고루 뿌려줌으로써 담배 잎 절편을 준비하였다. 이후 25℃, 암조건에서 48 시간 배양시켰다.

2) 식물 조직배양

잎 절편을 멸균 증류수(200 ug/ml cefotaxim 포함)에 4 회 세척한 후, shooting 배지(MS 배지, 2 mg/L BA, 0.1 mg/L NAA, 200 mg/L cefotaxim, 100 mg/L kanamycin 포함)에 치상하여 25℃, 16시간/8시간 광주기 조건에서 배양하며, 2주 마다 새로운 배지로 계대배양함으로써 Washing 및 selection 배지 치상을 수행하였다.

또한, 잎 절편에서 분화된 shoot을 절단하여 rooting 배지(MS 배지, 200 mg/L cefotaxim 포함)에 치상하여 25℃, 16시간/8시간 광주기 조건에서 배양함으로써 Rooting 배지 치상을 수행하였다.

Agrobacterium mediated transformation 방법으로 담배 잎 조직에 형질전환 시킨 후, 캘러스 분화, 잎 분화, 뿌리 분화가 차례로 잘 이루어졌음을 확인하였으며, 조직배양을 통해 잎, 줄기, 뿌리를 갖춘 조직배양 소식물체 50 개체를 확보하였다(도 6).

(3) 돌연변이체 선별

1) 목표 유전자 내 돌연변이 발생 여부 및 양상 확인

건강한 잎 조직 100 mg을 샘플링하여 균일하게 분쇄한 후, silica column을 이용하는 상용화 키트 (예: Nucleospin 96 plant II, Macherey Nagel, 독일)를 이용하여 genomic DNA를 추출 및 정제하였다.

잎 조직에서 gDNA를 추출/정제한 후, PCR을 통해 목표 유전자 부위를 증폭하여 염기 서열 분석을 수행하였다.

조직 배양체들의 PMT1a, PMT2, PMT3, PMT4 유전자를 각각 증폭하여 염기 서열을 분석한 결과, sg3 sgRNA 결합 부위의 염기 서열에서 돌연변이가 자주 유발됨을 확인하였다(도 7).

또한, 총 세 개의 sgRNA (sg1, sg2, sg3) 중 sg3가 결합하는 위치에서 돌연변이가 유발된 확률은 50.25%에 이르며, sg1 결합 위치에는 2.75% 발생률을 보였음을 알 수 있었다(표 4).

sgRNA	돌연변이 발생 횟수	목표 유전자 개수	돌연변이 발생율 (%)
sg1	11	400	2.75
sg2	0	400	0
sg3	201	400	50.25

또한, sg3 sgRNA 결합 위치에만 dual mutation 양상을 확인할 수 있었으며 dual mutation이 발생한 확률은 31%이었음을 확인하였다(표 5).

sgRNA	Dual mutation (M + M)		Half mutation (M +W)		Wild type (W)		합계
sgRNA	개수	비율(%)	개수	비율(%)	개수	비율(%)	개수	비율(%)
sg1	0	0	11	5.5	189	94.5	200	100
sg2	0	0	0	0	200	100	200	100
sg3	62	31	77	38.5	61	30.5	200	100

이 후, PMT1a, PMT2, PMT3, PMT4, 네 유전자의 allele 모두에 돌연변이가 유발된 조직배양체 12 개체를 선별하였다(표 6 및 도 8).

번호	개체 번호	PMT1a	PMT2	PMT3	PMT4
1	1	Dual	Dual	Dual	Dual
2	2	Dual	Dual (T ins, G ins)	Dual	Dual
3	3	Dual(G ins, A ins)	Dual	Homo (T ins)	Dual
4	4	Dual(G ins, A ins)	Homo (T del)	Homo (A ins)	Homo (T del)
5	5	Dual	Homo(T ins)	Homo (Tins)	Homo (35bp del)
6	8	Dual	Homo (23bp del)	Dual	Homo (TGACTACCAAGATGTC del)
7	10	Dual	Homo (TG del)	Homo (Ains)	Homo (TG del)
8	11	Dual	Dual	Homo(Ains)	Homo (T del)
9	13	Homo(GA del)	Dual	Dual	Homo (T del)
10	18	Dual	Homo(T del)	Dual	Homo (T ins)
11	21	Dual(G ins, A ins)	Homo (T del)	Homo (T del)	Homo (T del)
12	24	Dual(G ins, A ins)	Homo (T del)	Homo (T del)	Homo (T del)

※ Dual은 두 개의 대립 유전자(allele)에 각기 다른 유형의 돌연변이가 생성된 것을 나타낸다(예를 들어, 개체번호 24번의 PMT1a 유전자의 경우, A allele에는 G insertion 돌연변이가 일어났고, B allele에는 A insertion 돌연변이가 유도됨).

※※ Homo는 두 개의 대립 유전자(allele)에 같은 유형의 돌연변이가 생성된 것을 나타낸다(예를 들어, 개체번호 24번의 PMT2 유전자의 경우, A allele과 B allel에 똑같이 A deletion이 일어났음)

2) 식물체 순화

돌연변이가 확인된 조직배양체 12 개체를 상토가 담긴 화분으로 이식하여 온실에서 재배하였다.

3) F ₁ 세대 종자 확보 및 도입 유전자 제거 확인

CRISPR/Cas9 발현을 위해 도입된 유전자 블록을 제거하기 위하여 자가 수정을 통해 F₁ 세대 종자를 확보하였다. F₁ 세대 종자를 128구 트레이에 파종하여 30일 동안 기른 후, 잎을 채취하여 균일하게 분쇄한 후, silica column을 이용하는 상용화 키트 (예: Nucleospin 96 plant II, Macherey Nagel, 독일)를 이용하여 genomic DNA를 추출 및 정제하였다. 35S 프로모터와 Cas9 DNA 블록을 특이적으로 증폭하는 프라이머(하기 표 7)를 이용하여 PCR을 진행하였다. 35S 프로모터와 Cas9 DNA 블록이 검출되지 않는 식물체를 선별하였다.

Name	Sequence	PCR length	Note	서열번호
F_C9	GACCATCCTGGACTTCCTGAAGAGC	420 bp	Cas9 검출	20
R_C9	TGCAGGTAGTACAGGTACAGCTTCTCG	420 bp	Cas9 검출	21
F_35S	GCTCCTACAAATGCCATCA	195 bp	35S 프로모터 검출	22
R_35S	GATAGTGGGATTGTGCGTCA	195 bp	35S 프로모터 검출	23

4) 최종 선별 식물체의 PMT 유전자 유전형

최종 선별한 F₁ 식물(108_PMTm_F₁)은 도입 유전자를 포함하지 않으며, PMT 유전자들에 각각 동형접합 돌연변이(homozygous mutation)가 일어난 식물이었다. 108_PMTm_F₁의 네 가지 PMT 유전자의 DNA 염기서열을 아미노산 서열로 변환하여 야생형(wild-type) 담배의 PMT 아미노산 서열과 비교해 본 결과, 비정상적으로 종결코돈(stop codon)이 일찍 생성됨을 확인하였다(표 8 및 도 9 내지 12).

유전자	PMT1	PMT2	PMT3	PMT4
돌연변이 양상108_PMTm_F₁	A ins	T del	T del	T del

(4) F ₁ 세대 니코틴 함량 분석

1) 니코틴 분석용 샘플 준비

온실 환경에서 60일 동안 재배한 식물체의 꽃대를 자른 뒤, 2주 후에 식물체의 모든 잎을 수확하였고, 수확한 잎을 65℃ 드라이 오븐에서 48 시간 동안 건조 시킨 후, glass bead가 담긴 용기에 담아 gyro-shaker를 이용하여 분쇄하였다.

2) 니코틴 함량 분석

GC/MS 분석을 통한 니코틴 함량 분석을 수행하였다.

GC/MS 분석기법으로 KB108 (wild type)과 돌연변이체의 니코틴 함량을 정량 분석한 결과, KB108 모든 잎의 니코틴 함량은 건조엽 중량 기준 평균 7.1 mg/g이며, 돌연변이체 시료에서는 니코틴이 검출되지 않았다.

또한, 돌연변이체의 Nornicotine과 Anatabine의 함량을 대조군의 함량과 상대 비교하려 하였으나, 돌연변이체에서 두 가지 성분 또한 검출이 되지 않았다(표 9).

실험군	개체 수	Nicotine (mg/g) ¹⁾	Nornicotine (ratio)	Anatabine (ratio)
KB108(대조군)	10	7.1	0.024	0.022
108_PMTm	12	ND ²⁾	ND	ND

1) 잎의 건조중량 (g) 당 니코틴 함량 (mg)2) ND (Not Detected) : 검출 한계값 (0.0002 mg/g) 미만

결과적으로, 니코틴 생합성에 중요한 역할을 하는 PMT 유전자에 특이적으로 돌연변이를 유발하는 것을 목적으로 CRISPR/Cas9 시스템을 디자인하였다.

재배담배(Nicotiana tabacum)에 존재하는 4가지 종류의 PMT 유전자에만 특이적으로 결합할 수 있는 sgRNA 결합 부위를 세 곳 선정하였으며 실험 결과, sgRNA3의 절단 효율이 나머지 두 개보다 현저히 높았다.

PMT1 내지 PMT4 유전자 모두에 돌연변이가 유발되었고, 이 돌연변이로 인해 PMT 효소가 정상적으로 만들어지지 않을 것으로 생각되는 식물체를 선별하였다.

돌연변이 담배 식물체(108_PMTm) 및 대조군(KB108)의 잎 샘플에서 니코틴, 노르니코틴, 아나타빈의 함량(평균)을 확인한 결과, 상기 표 9와 같이, 니코틴이 검출되지 않았다.

2. 새로운 PMT 유전자 PMT1b을 타겟으로 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 저니코틴 담배의 생산

(1) NtPMT1b 유전자의 중요성

PMT 유전자 편집을 통한 NtPMT1a, NtPMT2, NtPMT3, NtPMT4 유전자 뿐 아니라 NtPMT1b 유전자(서열번호 19)까지 비활성화 시켜야 제로 니코틴이 가능한 것을 알 수 있었고, 최초로 NtPMT1b 유전자의 완성된 CDS를 포함하는 gDNA 염기 서열을 밝혀내었다.

현재까지 Genbank에 NtPMT1b로 명명한 nucleotide는 없었다. 또한, 이 후 PMT 유전자 관련 연구에서 PMT1b 유전자를 대상으로 한 연구가 없었다. 이번 실험에서 밝혀 낸 염기 서열은 전체 CDS를 포함하는 gDNA의 염기 서열이었다.

(2) NtPMT1b 유전자의 비활성화 여부에 따른 니코틴 함량 변화

CRISPR/Cas9 기술을 이용하여 NtPMT 유전자의 exon 2 부위에 돌연변이를 유도 시킨 결과, NtPMT1a, NtPMT2, NtPMT3, NtPMT4 유전자에는 공통적으로 돌연변이가 유발되었으면서, NtPMT1b에도 돌연변이가 유발된 식물체 (7_23_1S)와 NtPMT1b에만 돌연변이가 유발되지 않은 식물체 (7_23_4S)를 선별하였다. 7_23_1S 식물체의 잎에서는 니코틴이 검출되지 않는 반면, 7_23_4S 식물체에서는 니코틴이 0.5 mg/g 검출되었다(표 10).

식물체	7_23_1S	7_23_4S
NtPMT1a	T del	AGAT del
NtPMT1b	T del	Wild type
NtPMT2	T del	T del
NtPMT3	T del	T del
NtPMT4	T ins	T ins
건조엽 내 니코틴 함량	미검출 (검출 한계 : 0.0002 mg/g)	0.5 mg/g

(3) PMT (putrescine N-methyltransferase) 유전자

PMT 유전자는 S-adenosylmethionine-dependent N-methylation of putrescine 반응의 촉매 역할을 하여 nicotine과 tropane alkaloids가 생성되도록 한다.

한편, 재배담배(Nicotiana tabacum)에는 다섯 개의 PMT 기능을 하는 유전자가 존재한다(NtPMT1a, NtPMT1b, NtPMT2, NtPMT3, NtPMT4).

이 중 NtPMT2, NtPMT3, NtPMT4 유전자는 각각 N.sysvestris의 NsPMT1, NsPMT2, NsPMT3 유전자로부터 유래된 것으로 예상되었다(exon 1 내의 반복서열 개수 및 intron 염기서열 비교 결과).

NtPMT1은 NtPMT1a와 NtPMT1b로 구분되는데, 일반적으로 NtPMT1이라 하면 NtPMT1a를 지칭한다.

NtPMT1a는 N.tomentosiformis에서 유래된 것으로 예상하며, NtPMT1b는 N.tomentosiformis 및 N.otophora에서 유래되었을 것으로 예상된다.

<110> KT&G CORPORATION <120> GENETICALLY ENGINEERED PLANT CELL AND USING METHOD OF THE SAME <130> P2019-0163(PN128959KR) <150> KR 10-2019-0103310 <151> 2019-08-22 <160> 23 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F_PMT1a <400> 1 gcatagatgt ttattgggag tgtacagcaa 30 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R_PMT1a <400> 2 agttgctgac tgtacgtgca ca 22 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F_PMT2 <400> 3 catatgtgtc tattgggagt gtacatcaa 29 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R_PMT2 <400> 4 aagttgctga ctgtacgtac acat 24 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F_PMT3 <400> 5 catagatatg tttattggga gtgtacatca a 31 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R_PMT3 <400> 6 ccactttaaa tataatcata catgagcttg ac 32 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F_PMT4 <400> 7 gcgagctttc ataaagtaca aatca 25 <210> 8 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aatactttct cttcttcaat ttgtttagtt taattttgaa aatggaagtc 720 atatctacca acacaaatgg ctctaccatc ttcaagaatg gtgccattcc catgaacggc 780 caccaaaatg gcacttctga acacctcaac ggctaccaga atggcacttc caaacaccaa 840 aacgggcacc agaatggcac tttcgaacat cggaacggcc accagaatgg gacatccgaa 900 caacagaacg ggacaatcag ccatgacaat ggcaacgagc tactgggaag ctccgactct 960 attaagcctg gctggttttc agagtttagc gcattatggc caggttagta ctaagaaagc 1020 aactcaaatg catcggcctc ttgttgctac taaatataga gagctatcat acttttaggg 1080 actaactaaa aaggaaagat tatcacaggg acgaagtgag cagttaactt cgcatattat 1140 cagacgcatt aatttgaaat aatcgaattt tgcaggtgaa gcattctcac ttaaggttga 1200 gaagttacta ttccagggga agtctgatta ccaagatgtc atgctctttg aggtaattaa 1260 tattctaata cacatgcttt aatttaaagt gatactttta atttactttt agtttattgc 1320 atgtgcacgt acagtcagca acttatggga aggttctgac tttggatgga gcaattcaac 1380 atacagagaa tggtggattt ccatacactg aaatgattgt tcatctacca cttggttcca 1440 tcccaaaccc aaaaaaggtt ttgatcatcg gcggaggaat tggttttaca ttattcgaaa 1500 tgcttcgtta tccttcaatc 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tttctttaga agtgaacgtt gacgatatca actcccctat ccattgctca 13020 ccgaatggta caggtcgggg acccgaagtt ccgactgtcg gcctgatgca tccccggctg 13080 atcgacccca gatctggggc tgagaaagcc cagtaaggaa acaactgtag gttcgagtcg 13140 cgagatcccc cggaaccaaa ggaagtaggt taaacccgct ccgatcaggc cgagccacgc 13200 caggccgaga acattggttc ctgtaggcat cgggattggc ggatcaaaca ctaaagctac 13260 tggaacgagc agaagtcctc cggccgccag ttgccaggcg gtaaaggtga gcagaggcac 13320 gggaggttgc cacttgcggg tcagcacggt tccgaacgcc atggaaaccg cccccgccag 13380 gcccgctgcg acgccgacag gatctagcgc tgcgtttggt gtcaacacca acagcgccac 13440 gcccgcagtt ccgcaaatag cccccaggac cgccatcaat cgtatcgggc tacctagcag 13500 agcggcagag atgaacacga ccatcagcgg ctgcacagcg cctaccgtcg ccgcgacccc 13560 gcccggcagg cggtagaccg aaataaacaa caagctccag aatagcgaaa tattaagtgc 13620 gccgaggatg aagatgcgca tccaccagat tcccgttgga atctgtcgga cgatcatcac 13680 gagcaataaa cccgccggca acgcccgcag cagcataccg gcgacccctc ggcctcgctg 13740 ttcgggctcc acgaaaacgc cggacagatg cgccttgtga gcgtccttgg ggccgtcctc 13800 ctgtttgaag accgacagcc caatgatctc gccgtcgatg taggcgccga atgccacggc 13860 atctcgcaac cgttcagcga acgcctccat gggctttttc tcctcgtgct cgtaaacgga 13920 cccgaacatc tctggagctt tcttcagggc cgacaatcgg atctcgcgga aatcctgcac 13980 gtcggccgct ccaagccgtc gaatctgagc cttaatcaca attgtcaatt ttaatcctct 14040 gtttatcggc agttcgtaga gcgcgccgtg cgtcccgagc gatactgagc gaagcaagtg 14100 cgtcgagcag tgcccgcttg ttcctgaaat gccagtaaag cgctggctgc tgaaccccca 14160 gccggaactg accccacaag gccctagcgt ttgcaatgca ccaggtcatc attgacccag 14220 gcgtgttcca ccaggccgct gcctcgcaac tcttcgcagg cttcgccgac ctgctcgcgc 14280 cacttcttca cgcgggtgga atccgatccg cacatgaggc ggaaggtttc cagcttgagc 14340 gggtacggct cccggtgcga gctgaaatag tcgaacatcc gtcgggccgt cggcgacagc 14400 ttgcggtact tctcccatat gaatttcgtg tagtggtcgc cagcaaacag cacgacgatt 14460 tcctcgtcga tcaggacctg gcaacgggac gttttcttgc cacggtccag gacgcggaag 14520 cggtgcagca gcgacaccga ttccaggtgc ccaacgcggt cggacgtgaa gcccatcgcc 14580 gtcgcctgta ggcgcgacag gcattcctcg gccttcgtgt aataccggcc attgatcgac 14640 cagcccaggt cctggcaaag ctcgtagaac gtgaaggtga tcggctcgcc gataggggtg 14700 cgcttcgcgt actccaacac ctgctgccac accagttcgt catcgtcggc ccgcagctcg 14760 acgccggtgt aggtgatctt cacgtccttg ttgacgtgga aaatgacctt gttttgcagc 14820 gcctcgcgcg ggattttctt gttgcgcgtg gtgaacaggg cagagcgggc cgtgtcgttt 14880 ggcatcgctc gcatcgtgtc cggccacggc gcaatatcga acaaggaaag ctgcatttcc 14940 ttgatctgct gcttcgtgtg tttcagcaac gcggcctgct tggcctcgct gacctgtttt 15000 gccaggtcct cgccggcggt ttttcgcttc ttggtcgtca tagttcctcg cgtgtcgatg 15060 gtcatcgact tcgccaaacc tgccgcctcc tgttcgagac gacgcgaacg ctccacggcg 15120 gccgatggcg cgggcagggc agggggagcc agttgcacgc tgtcgcgctc gatcttggcc 15180 gtagcttgct ggaccatcga gccgacggac tggaaggttt cgcggggcgc acgcatgacg 15240 gtgcggcttg cgatggtttc ggcatcctcg gcggaaaacc ccgcgtcgat cagttcttgc 15300 ctgtatgcct tccggtcaaa cgtccgattc attcaccctc cttgcgggat tgccccgact 15360 cacgccgggg caatgtgccc ttattcctga tttgacccgc ctggtgcctt ggtgtccaga 15420 taatccacct tatcggcaat gaagtcggtc ccgtagaccg tctggccgtc cttctcgtac 15480 ttggtattcc gaatcttgcc ctgcacgaat accagcgacc ccttgcccaa atacttgccg 15540 tgggcctcgg cctgagagcc aaaacacttg atgcggaaga agtcggtgcg ctcctgcttg 15600 tcgccggcat cgttgcgcca catctaggta ctaaaacaat tcatccagta aaatataata 15660 ttttattttc tcccaatcag gcttgatccc cagtaagtca aaaaatagct cgacatactg 15720 ttcttccccg atatcctccc tgatcgaccg gacgcagaag gcaatgtcat accacttgtc 15780 cgccctgccg cttctcccaa gatcaataaa gccacttact ttgccatctt tcacaaagat 15840 gttgctgtct cccaggtcgc cgtgggaaaa gacaagttcc tcttcgggct tttccgtctt 15900 taaaaaatca tacagctcgc gcggatcttt aaatggagtg tcttcttccc agttttcgca 15960 atccacatcg gccagatcgt tattcagtaa gtaatccaat tcggctaagc ggctgtctaa 16020 gctattcgta tagggacaat ccgatatgtc gatggagtga aagagcctga tgcactccgc 16080 atacagctcg ataatctttt cagggctttg ttcatcttca tactcttccg agcaaaggac 16140 gccatcggcc tcactcatga gcagattgct ccagccatca tgccgttcaa agtgcaggac 16200 ctttggaaca ggcagctttc cttccagcca tagcatcatg tccttttccc gttccacatc 16260 ataggtggtc cctttatacc ggctgtccgt catttttaaa tataggtttt cattttctcc 16320 caccagctta tataccttag caggagacat tccttccgta tcttttacgc agcggtattt 16380 ttcgatcagt tttttcaatt ccggtgatat tctcatttta gccatttatt atttccttcc 16440 tcttttctac agtatttaaa gataccccaa gaagctaatt ataacaagac gaactccaat 16500 tcactgttcc ttgcattcta aaaccttaaa taccagaaaa cagctttttc aaagttgttt 16560 tcaaagttgg cgtataacat agtatcgacg gagccgattt tgaaaccaca attatgggtg 16620 atgctgccaa cttactgatt tagtgtatga tggtgttttt gaggtgctcc agtggcttct 16680 gtgtctatca gctgtccctc ctgttcagct actgacgggg tggtgcgtaa cggcaaaagc 16740 accgccggac atcagcgcta tctctgctct cactgccgta aaacatggca actgcagttc 16800 acttacaccg cttctcaacc cggtacgcac cagaaaatca ttgatatggc catgaatggc 16860 gttggatgcc gggcaacagc ccgcattatg ggcgttggcc tcaacacgat tttacgtcac 16920 ttaaaaaact caggccgcag tcggtaacct cgcgcataca gccgggcagt gacgtcatcg 16980 tctgcgcgga aatggacgaa cagtggggct atgtcggggc taaatcgcgc cagcgctggc 17040 tgttttacgc gtatgacagt ctccggaaga cggttgttgc gcacgtattc ggtgaacgca 17100 ctatggcgac gctggggcgt cttatgagcc tgctgtcacc ctttgacgtg gtgatatgga 17160 tgacggatgg ctggccgctg tatgaatccc gcctgaaggg aaagctgcac gtaatcagca 17220 agcgatatac gcagcgaatt gagcggcata acctgaatct gaggcagcac ctggcacggc 17280 tgggacggaa gtcgctgtcg ttctcaaaat cggtggagct gcatgacaaa gtcatcgggc 17340 attatctgaa cataaaacac tatcaataag ttggagtcat tacccaatta tgatagaatt 17400 tacaagctat aaggttattg tcctgggttt caagcattag tccatgcaag tttttatgct 17460 ttgcccattc tatagatata ttgataagcg cgctgcctat gccttgcccc ctgaaatcct 17520 tacatacggc gatatcttct atataaaaga tatattatct tatcagtatt gtcaatatat 17580 tcaaggcaat ctgcctcctc atcctcttca tcctcttcgt cttggtagct ttttaaatat 17640 ggcgcttcat agagtaattc tgtaaaggtc caattctcgt tttcatacct cggtataatc 17700 ttacctatca cctcaaatgg ttcgctgggt ttatcgcacc cccgaacacg agcacggcac 17760 ccgcgaccac tatgccaaga atgcccaagg taaaaattgc cggccccgcc atgaagtccg 17820 tgaatgcccc gacggccgaa gtgaagggca ggccgccacc caggccgccg ccctcactgc 17880 ccggcacctg gtcgctgaat gtcgatgcca gcacctgcgg cacgtcaatg cttccgggcg 17940 tcgcgctcgg gctgatcgcc catcccgtta ctgccccgat cccggcaatg gcaaggactg 18000 ccagcgctgc catttttggg gtgaggccgt tcgcggccga ggggcgcagc ccctgggggg 18060 atgggaggcc cgcgttagcg ggccgggagg gttcgagaag ggggggcacc ccccttcggc 18120 gtgcgcggtc acgcgcacag ggcgcagccc tggttaaaaa caaggtttat aaatattggt 18180 ttaaaagcag gttaaaagac aggttagcgg tggccgaaaa acgggcggaa acccttgcaa 18240 atgctggatt ttctgcctgt ggacagcccc tcaaatgtca ataggtgcgc ccctcatctg 18300 tcagcactct gcccctcaag tgtcaaggat cgcgcccctc atctgtcagt agtcgcgccc 18360 ctcaagtgtc aataccgcag ggcacttatc cccaggcttg tccacatcat ctgtgggaaa 18420 ctcgcgtaaa atcaggcgtt ttcgccgatt tgcgaggctg gccagctcca cgtcgccggc 18480 cgaaatcgag cctgcccctc atctgtcaac gccgcgccgg gtgagtcggc ccctcaagtg 18540 tcaacgtccg cccctcatct gtcagtgagg gccaagtttt ccgcgaggta tccacaacgc 18600 cggcggccgc ggtgtctcgc acacggcttc gacggcgttt ctggcgcgtt tgcagggcca 18660 tagacggccg ccagcccagc ggcgagggca accagcccgg 18700 <210> 18 <211> 304 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P_U6 <400> 18 agaaatctca aaattccggc agaacaattt tgaatctcga tccgtagaaa cgagacggtc 60 attgttttag ttccaccacg attatatttg aaatttacgt gagtgtgagt gagacttgca 120 taagaaaata aaatctttag ttgggaaaaa attcaataat ataaatgggc ttgagaagga 180 agcgagggat aggccttttt ctaaaatagg cccatttaag ctattaacaa tcttcaaaag 240 taccacagcg cttaggtaaa gaaagcagct gagtttatat atggttagag acgaagtagt 300 gatt 304 <210> 19 <211> 2211 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <220> <221> gene <222> (1)..(2211) <223> PMT1b <400> 19 atggaagtca tatctaccaa cacaaatggc tctaccatct tcaagaatgg taccattccc 60 atgaacggcc accaaaatgg ctcttccgaa cacctcaacg gctaccagaa tggcatttcc 120 aaacaccaaa acgggcacca gaatggcact tccgaacatc ggaacggcca ccagaatggg 180 acatccgaac aacagaacgg gacaatcagc catgacaatg gcaacgagct actgggaagc 240 tccaactcta ttaagcctgg ttggttttca gagtttagcg cattatggcc aggttagtat 300 taagaaagaa actcaaatgc atcgtactct tgtattttgg tttgtgtata atttataata 360 tggataaatt atgacgaagt aaactcgcat acattaattt gaaataatct aattttgcag 420 gtgaagcatt ctcacttaag gtcgagaagt tactattcca ggggaaatct gattaccaag 480 atgtcatgct ctttgaggta attaatattc tgatacacat gctttaatct aaagtgatac 540 ttttaattta cttttagttt attgcatgtg cacgtacagt cagcaactta tgggaaggtt 600 ctgactttgg atggagcaat tcaacataca gagaatggtg gatttccata cactgaaatg 660 attgttcatc taccacttgg ttccatccca aacccaaaaa aggttttgat catcggcgga 720 ggaattggtt ttacattatt cgaaatgctt cgttatcctt caatcgaaaa aattgacatt 780 gttgagatcg atgacgtggt agttgatgta agtcaaactt cttttaccca cataaagaaa 840 atgatttaga ttgcaattct ttttattttt ctaaaagaat aaatatattc tctctttttt 900 ttttttaaaa caaaattctc tttcttacag gtatccagaa aatttttccc ttatctggca 960 gctaatttta acgatcctcg tgtaacccta gttctcggag atggtgcgta tatgatagtc 1020 tcgttttata ttttatttca cttgattttt accttttttt gtggttaatt aatcatctac 1080 cattggttct ctttaccttc aggagctgca tttgtaaagg ctgcacaagc gggatattat 1140 gatgctatta tagtggactc ttctgatccc attggtacgc tattactatt taataccaag 1200 actattctta ttatataagc tactaagaaa ctaattgaat aattaataaa cgtaactgta 1260 attgatttct aaaataatat atataatttc aggtccagca aaagatttgt ttgagaggcc 1320 attctttgag gcagtagcca aagcccttag gccaggagga gttgtatgca cacaggctga 1380 aagcatttgg cttcatatgc atattattaa gcaaatcatt gctaactgtc gtcaagtctt 1440 taagggttct gtcaactatg cttggacaac cgttccaaca tatcccacgt attctttttc 1500 tctctctctt cctgtctttt tcgatgcaat gtaaatttat aaaattggaa gtccgtttta 1560 cttttctata gacgtagatc ctaaaattgt caagaaatgg agaattgact tacaagaaaa 1620 atcaacttct tttcatttac tattcttttt ggtgacaaac tttacttatt atttcgttct 1680 aaaatgaaaa tttattttta tattttaaaa taatttagct ttaaactttt aattttactt 1740 gttatatttt taataaaaaa gatttattgt caaataaatg ttgtggccat acaataagtt 1800 tcaaattatg tcacaaaaat tgaaacagag tgagcaaatt tttatttcaa gtaaactttc 1860 aaggaattgt gtttaagttt tctcaactga tactgatcaa tgatgtctta aatattttga 1920 tttcagcggt gtgattggtt atatgctctg ctctactgaa gggccagaag ttaacttcaa 1980 gaatccagta aatccaattg acaaagagac aactcaagtc aagtccaaat taggacctct 2040 caagttctac aactctgatg taacttcata tctcacaatt tctttttccg ttttactgta 2100 tgttcttcat caaattttat aactaactct tttcatattg tctttttttt tcagattcac 2160 aaagcagcat tcattttgcc atctttcgcc cgaagtatga tcgagtctta a 2211 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F_C9 <400> 20 gaccatcctg gacttcctga agagc 25 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R_C9 <400> 21 tgcaggtagt acaggtacag cttctcg 27 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F_35S <400> 22 gctcctacaa atgccatca 19 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R_35S <400> 23 gatagtggga ttgtgcgtca 20

Claims

서열번호 15의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드; 또는
상기 제1 폴리뉴클레오티드가 전사된 제2 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 CRISPR/Cas9 시스템을 포함하며,
모세포에 비해 PMT(putrescine N-methyltransferase) 유전자 또는 PMT 단백질의 발현 또는 활성이 감소되도록 유전적으로 조작된 식물 세포로서,
상기 PMT 유전자는 PMT1a 유전자, PMT2 유전자, PMT3 유전자 및 PMT4 유전자; 또는
PMT1b 유전자, PMT2 유전자, PMT3 유전자 및 PMT4 유전자를 포함하는 것인 식물 세포.
청구항 1에 있어서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(transactivating crRNA)를 포함하는 sgRNA(single guide RNA)인, 식물 세포.
청구항 1에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 5'-말단에 서열번호 18의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드가 결합되어 있고, 3'-말단에 5개의 연속된 티민(Thymine)이 결합되어 있는 것인, 식물 세포.
청구항 1에 있어서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 5'-말단에 서열번호 18의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드가 전사된 폴리뉴클레오티드가 결합되어 있고, 3'-말단에 5개의 연속된 우라실(Uracil)가 결합되어 있는 것인, 식물 세포.
청구항 1에 있어서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 상기 식물 세포 내 적어도 하나의 대립유전자의 PMT 유전자에 결합되는 것인, 식물 세포.
청구항 1에 있어서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 상기 PMT 유전자의 Exon 2 내지 3으로 이루어진 부위에서 적어도 하나의 부위에 결합되는 것인, 식물 세포.
청구항 1에 있어서, 상기 CRISPR/Cas9 시스템은 Cas9(CRISPR associated protein 9) 단백질 또는 Cas9 단백질을 코딩하는 유전자 및 NLS(Nuclear Localization Signal) 단백질 또는 NLS 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 것인, 식물 세포.
청구항 7에 있어서, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래 Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 유래 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophiles) 유래 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 아우레우스(Streptocuccus aureus) 유래 Cas9 단백질 및 네이세리아 메닝기디티스(Neisseria meningitidis) 유래 Cas9 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 Cas9 단백질인, 식물 세포.
삭제
청구항 7에 있어서, 상기 조작은 상기 제1 폴리뉴클레오티드, 상기 Cas9 단백질을 코딩하는 유전자 및 상기 NLS를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 형질전환시켜 이루어지는 것인, 식물 세포.
청구항 10에 있어서, 상기 형질전환은 Agrobacterium-매개 형질전환법, 폴리에틸렌글리콜-매개 프로토플라스트 형질전환법, 유전자총법, 전극 형질전환법, 진공 침윤 형질전환법 및 탄화규소 섬유-매개 형질전환법으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 방법으로 이루어지는 것인, 식물 세포.
청구항 1에 있어서, 상기 식물은 재배담배(Nicotiana tabacum)인, 식물 세포.
청구항 1 내지 8 및 10 내지 12 중 어느 한 항의 식물 세포를 포함하는 식물.
서열번호 15의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드; 또는
상기 제1 폴리뉴클레오티드가 전사된 제2 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 CRISPR/Cas9 시스템으로서,
상기 시스템은 식물 세포의 PMT 유전자 또는 PMT 단백질의 발현 또는 활성이 감소되도록 유전적으로 조작하는 것으로, 상기 PMT 유전자는 PMT1a 유전자, PMT2 유전자, PMT3 유전자 및 PMT4 유전자; 또는 PMT1b 유전자, PMT2 유전자, PMT3 유전자 및 PMT4 유전자를 포함하는 것인 CRISPR/Cas9 시스템.
청구항 14에 있어서, 상기 CRISPR/Cas9 시스템은 Cas9(CRISPR associated protein 9) 단백질 또는 Cas9 단백질을 코딩하는 유전자; 및
NLS(Nuclear Localization Signal) 단백질 또는 NLS 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함하는 CRISPR/Cas9 시스템.
청구항 14 또는 15의 CRISPR/Cas9 시스템을 포함하는 니코틴 생합성 억제용 조성물.
청구항 14 또는 15의 CRISPR/Cas9 시스템을 포함하는 PMT 유전자 조작용 조성물.
서열번호 15의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드; 또는
상기 제1 폴리뉴클레오티드가 전사된 제2 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 CRISPR/Cas9 시스템을 포함하는 벡터를 식물 세포에 도입시키는 단계;를 포함하는 니코틴 생합성이 억제된 식물 세포의 제조 방법으로서,
상기 방법은 식물 세포의 PMT 유전자 또는 PMT 단백질의 발현 또는 활성이 감소되도록 유전적으로 조작하는 것으로, 상기 PMT 유전자는 PMT1a 유전자, PMT2 유전자, PMT3 유전자 및 PMT4 유전자; 또는 PMT1b 유전자, PMT2 유전자, PMT3 유전자 및 PMT4 유전자를 포함하는 것인 방법.
서열번호 15의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드; 또는
상기 제1 폴리뉴클레오티드가 전사된 제2 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 CRISPR/Cas9 시스템을 포함하는 벡터를 식물 세포에 도입시키는 단계;를 포함하는 식물 세포의 PMT 유전자 조작 방법으로서,
상기 PMT 유전자는 PMT1a 유전자, PMT2 유전자, PMT3 유전자 및 PMT4 유전자; 또는 PMT1b 유전자, PMT2 유전자, PMT3 유전자 및 PMT4 유전자를 포함하는 것인 방법.