JPH0231683A - Ｔ‐ｄｎａ７８０遺伝子の転写活性化要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は植物の分子生物学の分野に属し１組換えＤＮＡ
技術による植物の遺伝子光学に関する。本発明は特に組
換えＤＮＡを含む植物組織内における。

植物発現遺伝子の転写を活性化するかまたは増大させ得
るＤＮＡ部分の同定、特徴付け、および利用に関する。

（従来の技術） 真核細胞の遺伝子においては転写の開始をつかさどり、
遺伝子発現を制御または調節するＤＮＡ配列要素に関す
る理解が高まってきている。以下の考察は、　ＲＮＡポ
リメラーゼ■により転写される遺伝子に適用される。ｍ
ＲＮＡ合成の開始をつかさどる配列要素５周囲の刺激に
応答して転写を制御する配列要素、および転写の全レベ
ルを決定する配列要素が存在する。

プロモータは、遺伝子の発端にあるＤＮＡ配列の部分で
あり、　Ｉ’ｌＮＡポリメラーゼにｍＲＮＡの転写を開
始させるシグナルを含んでいる。次いで、　ｍＲＮＡは
この後行われ得るタンパク合成の鋳型として用いられる
。真核細胞のプロモータは複雑であり、そして、−３０
位付近にあるＴＡＴＡボックス共通配列。

およびしばしば＋１と定義される転写開始部位に対して
、５゛側に約−７５ｂｐにあるＣＡＡＴボックス共通配
列を含む構成成分から成る（ＲｏＢｒｅａｔｈｎａｃｈ
およびＰ、　Ｃｈａｍｂｏｎ　（１９８１）＋　Ａｎｎ
、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

５０：３４９；Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇら（１９８３）＋
　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ　１ｎｅｅｒｉｎｏｆ　Ｐｌａ
ｎｔｓ、　　ｌｉ　Ｔ、　Ｋｏｓｕｇｅ、　Ｃ，Ｍｅｒ
ｅｄｉｔｈ、およびＡ、　ｔ（ｏｌｌａｅｎｄｅｒ＋　
ｐ、　２１１　）　ａ植物では、ＣＡＡＴボ・ンクスの
代わりに、　Ｍｅｓｓ　ｉｎｇらが１９８３年にへＧＧ
へボ・ンクスと命名した。キャップ部位から同様の距離
だけ離れて位置する共通配列が用いられ得る。５゛側非
転写領域内の他のプロモータ関連配列は、下流にある遺
伝子の発現を調節または制御するものとして知られてい
る。照明または栄養物の利用可能性。

あるいは熱ショック、嫌気生活、または重金属の存在を
含む逆境などの環境の刺激に応答する配列が存在する。

成長の間に、言い換えれば組織特異的に、遺伝子発現を
制御するシグナルもまた存在する。他の配列は下流にあ
る遺伝子の発現の全レベルを上昇させるように働＜；こ
のような配列は動物系では「エンハンサ」と呼ばれてい
る。酵母では、［上流活性化配列ｊと呼ばれる同様の刺
激配列が公知であるが、これはしばしば制御のための情
報も持っているように思われる。プロモータは１通常、
対応する遺伝子のコード領域の開始点に対して５゛側、
すなわちその上流に位置する。

そして、転写を制御するが、あるいは転写の絶対的なレ
ヘルに影響を与える全ての補助的な要素を含むＤＮＡ　
６１域は、　１００　ｂｐ　　よりも小さいが１あるい
は１０００ｂｐ程度であり得る。

Ｇ、　Ｋｈｏｕｒｙおよび、　Ｐ、　Ｇｒｕｓｓが１９
８３年に、　Ｃｅ１１３３：３１３で定義しているよう
に、エンハンサは、近傍の遺伝子に対する位置および方
向とは比較的無関係に転写効率を上昇させると思われる
１組の真核細胞プロモータ関連要素の１つである。原型
のエンハンサは、　ＳＶ４０の７２ｂｐ繰り返し配列で
ある。

−ｉに、動物または動物ウィルスのエンハンサは。

いずれの方向にも５゛側１ｋｂ程度の距離にわたって機
能し、そして遺伝子の５”側また。は３”側のいずれで
も作用することができる。この配列のモチーフは一般に
数回繰り返される。動物系では。

エンハンサは発現の組織特異的制御に関連している。

ＳＶ４０動物由来のエンハンサの共通コア配列に対する
相同性が植物遺伝子の非転写領域内に見い出されている
。エントウ豆のレグミンの５°側隣接領域内において、
　ＳＶ４０動物由来の配列の相補鎖に対して約８０％の
相同性を有する配列５’−ＣＣＡＯＣＴＣＣ−３“は転
写の開始点に対して約−１８０位に見られる。

（Ｇ、　ＬｙｃｅｔＬ　ら（１９８４）　Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　［：４４９３）。

同様の配列のモチーフが光制御遺伝子、すなわちチャル
コンシンターゼの５′側制御領域（Ｈ，Ｋａｕｌｅｎら
（１９８６）　ＥＭＢＯＪ、互：１）、およびタバコ、
大豆、およびエントウ豆のｒｂｃＳ遺伝子を含有する数
個の霧遺転子（Ｒ，Ｆｌｕｈｒ　　ら（１９８６）　５
ｃｉｅｎｃｅ　２３２：１１０６）内に見い出されてい
る。

ＳＶ４０エンハンサに相同性を有する配列は、トウモロ
コシの倶頃１および復原２遺伝子の５”側隣接領域内に
おいても確認されている。いずれの場合も注目すべき配
列は、　５’−ＣＡＣＣＴＣＣ−３”であり。

Ａ　ｄ　ｈ　２Ｑ約−１７０位および担止１の約−２０
０位に見られる（Ｅ、　Ｄｅｎｎｉｓ　ら（１９８５）
　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

１３ニア２７；　Ｄ、　Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎら（１９８
５）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｆｏｒｍａｎｄ　Ｆｕｎｃ
ｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｇｅｎｏｍｅ、
編ｖａｎ　ＶｌｏｔｅｎＤｏｔｉｎｇ、　ＤｅＧｒｏｏ
ｔ、　　およびＴ、　Ｈａｌｌ、　Ｎｅｗ　ｖｏｒｋ。

しての赫半４機能的役割は、いまだ明らかにされていな
い。

熱シヨツク要素（ＨＳＥ　）と呼ばれる上流の配列モチ
ーフは、細菌、酵母、ヒトおよび植物などの様々な生物
において温度上昇のストレスに応答して熱シヨツク遺伝
子を誘導することが見い出されている。ショウジヨウバ
エにおいては、モチーフについての最小共通配列は５’
−ＣＧＡＡ　　ＴＴＣＧ−３゜である。（Ｈ，Ｐｅｌｈ
ａｍ　（１９８５）　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ、、　
Ｊａｎｕａｒｙ＋ρｐ、　３ｌ−３５）。ショウジヨウ
バエのＨＳＥもまた。

エンハンサ要素のいくつかの特徴を示す（Ｍ、　Ｂｉｅ
ｎｚおよびＨ，Ｐｅ１ｈａａ＋　（１９８６）　（：ｅ
ｌｌ　４５ニア５３）　、　Ｗ、Ｇｕｒ、ｌｅｙらは、
大豆のム丸迂１７．５−Ｅ遺伝子の５゛末端にあるショ
ウジヨウバエＨ５Ｅ共通配列に対して部分的に相同性を
有する配列要素を見い出している（Ｗ、Ｇｕｒｌｅｙら
（１９８６）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　６
　：５５９）。

形質転換したヒマワリの腫瘍組織における該遺伝子の熱
シヨツク発現の研究によって、−９５位とキャップ部位
との間の配列情報は熱誘導転写を行なうのに充分である
が、更に上流（−９５位と一１１７５位との間）の配列
は誘導された転写レベルおよび基本的な転写レベルの両
方を劇的に上昇させ、エンハンサの活性を示唆している
ことが明らかになった。

エンハンサ様活性もまた組織に特異的な発現および光に
応答する発現の制御に関わると考えられている植物由来
の調節配列に関連している（Ｍ。

Ｔｉａ＋ｋｏ　　ら（１９８５）　Ｎａｔｕｒｅ　３１
８：　５７９；　Ｈ，Ｋａｕｌｅｎら（１９８６）　Ｅ
ＭＢＯＪ、　　５：ｌ；　Ｊ、　Ｓｉｍｐｓｏｎ　　ら
（１９８５）　ＥＭＢＯＪ、　　　４：２７２３；　　
Ｊ、　　Ｓｉｍｐｓｏｎ　　ら　（１９８６）　　Ｎａ
ｔｕｒｅ　　　３２３：　５５１；　Ｒ，Ｆｌｕｈｒ　
ら（１９８６）　　５ｃｉｅｎｃｅ　２３２：１１０６
　）。

場合によっては、　ＳＶ４０エンハンサまたはＴＶ酵母
エンハンサに相同性を有する配列および繰り返し配列要
素がエンハンサ活性を示す上流領域に見い出されたが、
これらのモチーフはエンハンサ活性とは相関がない。

植物で高度に発現するいくつかの遺伝子の５゛側にエン
ハンサ様配列が存在しているのではないかと考えられて
いる。このような報告の１つ（Ｊ。

０ｄｅｌｌ　ら（１９８５）、　Ｎａｔｕｒｅ　　３１
３：８１０）には、カリフラワーモザイクウィルス（Ｃ
ａＭＶ）の３５５遺伝子の５°側非翻訳領域の広がりが
、リポータ遺伝子の発現を増大させるのに必要であるこ
とが記載されている。−１０５位から一４６位の領域内
の配列を分析することによって、　ＣＡＡＴボンクス様
配列、逆位繰り返し配列、およびエンハンサのＳＶ４０
コア共通配列に類似した配列が明らかとなった。０←ら
は１６８位と一８９位との間のＣａＭＶ上流領域が３５
Ｓ　ＲＮＡ遺伝子およびある異種の植物発現遺伝子の転
写活性化において機能していると報告している（Ｏｗら
（１９８７）　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　八ｃａ
ｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ　　８４：４８７０−４８
７３）１４８　／−８９上流断片はりボーク遺伝子の５
゛側に位置する場合は、いずれのｅ方向でも機能するが
、該遺伝子の３″側に位置する場合には機能しないと報
告されている。ＣａＭＶ上流領域（−１４８／８９断片
または−３４３／−９０断片）の部分における多数の重
複が、この領域の単一コピーによる３１４よりも有意に
高いレヘルの発現を与えた（Ｄ、　ＯＷら（１９８７）
；　Ｒ，Ｋａｙら（１９８７）　５ｃｉｅｎｃｅ　　２
３６：１２９９　）。

ＣａＭＶの宿主範囲はアブラナ科の植物に限定されてい
るか、完全な３５Ｓプロモータはタバコで機能すること
が知られている（Ｊ、　０ｄｅｌｌら（１９８５）；　
Ｍ。

Ｂｅｖａｎら（１９８５）　ＥＭＢＯＪ、　　４：１９
２１　）。

酵母の上流活性化配列（ＵＡＳ　）は、動物由来のエン
ハンサ配列要素のそれと幾分界なる性質を有する。動物
由来のエンハンサ−のように、酵母のＵＡＳは、一般に
、いずれかの方向に挿入されると機能するが、転写開始
部位に対して３゛側に置かれた場合、転写を活性化でき
ないようである（Ｌ、　ＧｕａｒｅｎｔｅおよびＥ、　
Ｈｏａｒ　（１９８４）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、八ｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ、１１ＳＡ　　８１ニア８６０；に、　
５ｔｒｕｈｌ　（１９８４）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８１ニア８６５　）　、
いくつかの酵母由来のプロモータ要素の活性化領域の配
列が公知である。そして少なくとも２つの場合に、　　
ＳＶ４０エンハンサ共通コア配列に対する相同性が報告
されている（Ｂ、Ｅｒｒｅｄｅら（１９８５）　＋　Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　８２：５４２３；　Ｇ、　Ｒｏｅ
ｄｅｒら（１９８５）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　［ＪＳＡ　　８２：５４２８　）
　、これらの配列にはまた。細胞を、特定のＵＳＡに応
じて１交配型にまたは栄養状態などの刺激に応答させる
情報が関連している。

アグロバクテリウム株が有する腫瘍誘導（Ｔｉ）プラス
ミドは、植物ゲノムに移行して組み込まれるＴ−ＤＮＡ
　ｐｉ域を含んでいる。Ｔ−ＤＮＡにコードされる多く
の遺伝子は１例えば植物腫瘍を含むＴ−ＤＮＡ内のオビ
ンの生産を担う遺伝子を包含し、植物において発現する
。オクトビンシンターセをコードするＯＣＳ遺伝子は、
　ｐＴｉＡｃｈ５およびｐＴｉ１５９５５のようなオク
トピン型ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ内に保持されてい
る。ツバリンシンターゼ（ｎｏｓ　）に対する遺伝子は
、　ｐＴｉＣ５８およびｐＴｉＴ３７のようなツバリン
型ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ内に存在する。形質転換
された植物組織におけるｏｃｓ遺伝子およびｎｏｓ遺伝
子の発現は、構成的であって、明らかに組織特異的では
ない（Ｌ、０ｔｔｅｎら（１９８１）　Ｍｏ１．　Ｇｅ
ｎ、　Ｇｅｎｅｔ。

は、アグロバクテリウムの宿主範囲が非常に広いため（
Ｍ、　ＤｅＣｌｅｅｎｅおよびＪ、　ＤｅＬｅｙ　（１
９７６）　Ｂｏｔ、　Ｒｅｖ。

４２：８９；　Ｇ、　　Ｈｏｏｙｋａａｓ−ｖａｎ　Ｓ
ｌｏｇｔｅｒｎ、ら（１９８４）　　Ｎａｔｕｒｅ３１
１ニア６３）　、植物内で機能を最大限に保存している
と提唱している（Ｗ、　Ｂｒｕｃｅおよび−、　Ｇｕｒ
ｌｅｙ（１９８７）Ｍｏ１．Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　
　ヱ：５９　）　。Ｔ−ＤＮＡの植物発現遺伝子の調節
領域は、植物における構成的な遺伝子発現の機構を研究
するためのモデル系として興味深い。

止り−遺転子および一部胆　遺伝子の両方の上流領域は
、詳細に分析されている。ｏｃｓおよびｎｏｓの両方、
およびこれらの遺伝子の５′側隣接領域は配列決定され
ている（ｔｌ、　ＤｅＧｒｅｖｅら（１９８２）　　Ｊ
、Ｍｏｌ。

Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　　↓：４９９ＨＭ、　Ｂｅ
ｖａｎ　ら（１９８３）〜ｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒ
ｅｓ、１１：３６９．　Ａ、　Ｄｅｐｉｃｋｅｒ　ら（
１９８２）　Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、１：５６１）。

ｎｏｓ遺伝子を最大限に発現させるのに必要な５゛側配
の範囲に関して１文献中には相反するデータが見られる
。Ｃ，Ｋｏｎｃｚらは、肚遺転子を最大限に発現させる
のに必要な全てのシグナルは転写開始部位に先立つ２６
１　ｂｐの配列内にあると報告した（Ｃ，Ｋｏｎｃｚら
（１９８３）　ＥＭＢＯＪ、　　２：１５９７−１６０
３）。

これに対して、　Ｃ，Ｓｈａｗ　らは、−８８位よりさ
らに上流の配列はカランコニ（Ｋａｌａｎｃｈｏｅ　）
の葉および茎テスト系における発現に必須ではないと報
告した（Ｃ，Ｓｈａｗら（１９８４）　Ｎｕｃｌｅｉｃ
　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２ニア８３１　）。さらに
最近、Ｇ、Ａｎらは、　ＴＡＴ八ボへクス（−２６位か
ら一１９位）、おそら（ＣＣＡＡＴボックス（−７８位
から一７０位）１および一１３０位と一１０１位との間
の配列を含む上流ＤＮＡ　ｉＩ域が、　ｎｏｓの効率の
良い転写に必要であると報告した（Ｇ、　Ａｎら（１９
８６）Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　　２０３：
２４５）　ｎｏｓ上流領域にお１４８位から一１４１位
および一１１４位から一１０６位）の存在が見い出され
、そして欠失分析によって、これらの繰り返し配列が下
流の遺伝子発現のレヘルの調節に関係していることが示
唆された。

ｏｃｓ遺伝子の配列が公表された際には（Ｈ，ひｅＧｒ
ｅｖｅら（１９８２）前出）、遺伝子の５”側にＴＡＴ
Ａボックス様配列および遺伝子の３°側にポリアデニル
化シグナルが見い出されたが、潜在的に調節に有意な他
の配列は指摘されなかった。おそら＜１匹トプロモータ
はＴ−ＤＮＡの末端に接近して位置するため、隣接する
植物配列がｏｃｓの転写レベルに影響を及ぼすことが示
唆された。

Ｃ，Ｋｏｎｃｚ　らは、　　−２９５位と一１７０位と
の間の領域内の配列情報が１匹との完全な発現のために
必須であることを示したが（Ｃ，Ｋｏｎｃｚら（１９８
３）　、前出）、最大限の遺伝子発現の担う特異的な配
列は同定されなかった。最近では、　ｏｃｓの上流領域
が再吟味され、そして−２９２位と一１１６位との間の
領域内に含まれる調節配列要素が存在し２匹シ遺伝子発
現を促進または活性化することが見い出されてた（Ｊ、
　Ｅｌｌｉｓら（１９８７）ＥＭＢＯＪ、旦：１１．米
国特許出願筒０１１，６１４号）。植物上流活性化配列
と名づけられた要素は、植物発現プロモータにより駆動
される下流遺伝子の発現を活性化する１６塩基対のパリ
ンドローム配列（５“−ＡＣＧＴＡＡＧＣＧＣＴＴＡＣ
Ｇ＋７−３’　）である。前述の配列を含むか、あるい
はｏｃｓ上流領域の適当な断片を有する合成オリゴヌク
レオチドを、細菌由来のクロラムフェニコールアセチル
トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）　　リポータ遺伝子を有
するトウモロコシ由来の嫌気的に調節されたアルコール
デヒドロゲナーゼ（Ａｄｈｌ　）プロモータの５”側に
配置した；両方の例において、　ＣＡＴ酵素活性の嫌気
性誘導が、安定に形質転換されたタバコ植物で得られた
。転写活性化要素を有さない同様の構築物では、　ＣＡ
ＴまたはＡｄｈｌがリポータ遺伝子として機能する場合
には、タバコにおいて検出し得る発現が得られなかった
。また、　ｏｃｓ遺伝子転写活性化要素の機能は培養し
たトウモロコシ細胞における一過性発現分析を用いて決
定した。従って、単子葉植物および双子葉植物の両方で
機能する竺転写活性化要素の能力が確証された（Ｊ。

１ｌ−１１ｉｓら（１９８７）　；米国特許出願筒０１
１，６１４号）。

他のＴ−ＤＮＡ遺伝子、すなわちマンノピンシンターゼ
遺伝子（監）の上流領域内の転写活性化要素の存在が欠
失分析により示唆されている（ν、　ＤｉＲ４ｔａおよ
びＳ、　Ｇｅ１ｖｉｎ　（１９８７）　Ｍｏ１．　Ｇｅ
ｎ、Ｇｅｎｅｔ、　２０７：２３３）。転写活性化と関
連している特異的な配列モチーフは存在しなかった。

オクトピン型Ｔｉプラスミド、ｐＴｉ１５９５５の完全
なＴ−ＤＮＡ　Ｓｆｉ域が配列決定され、そしてその配
列がオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、推定上
の真核細胞プロモータ、リポソーム結合部位、および調
節上有意である可能性を有する潜在的な２次構造を持っ
た領域の位置について分析された。（Ｉ？。

Ｂａｒｋｅｒら（１９８３）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　
Ｂｉｏｌ、　２：３３５）　、配列分析により同定され
たオクトピンＴ−ＤＮＡ　ＯＲＦには、　Ｂａｒｋｅｒ
らのＴ−ライト（丁−ｒｉｇｈｔまたはＴ−Ｒ）の中の
０ＲＦ１８に対応する７８０遺伝子が存在する。このＯ
ＲＦは、植物内で転写されることが見い出され。

その約７８０塩基の転写物の大きさにちなんで名づけら
れている。毒性に必須でない７８０遺伝子産物は同定さ
れておらず、そしてその機能は不明である（Ｊ、　Ｗｉ
ｎｔｅｒ　ら（１９８４）　Ｎｕｃｌｅｃｉｃ　Ａｃ１
ｄｓ　Ｒｅｓ、１２：２３９；　Ｓ、Ｋａｒｃｈｅｒら
（１９８４）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　ＧｅｎｅＬ、　１
９４：１５９）。１遺伝子の上流領域は、　Ｂａｒｋｅ
ｒらにより、　ＴＡＴＡ−およびＣＡＡＴ−相同配列を
有することが見い出されたが、潜在的な機能上の有意性
を持つ配列は見い出されなかった。

本発明は、　Ｗ、　Ｂｒｕｃｅ　　および−、　Ｇｕｒ
ｌｅｙ（１９８７）Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　
７：５９に一部記載されている。

到り遺伝子の上流調節領域の詳細な分析に基づいている
。

（以下余白） （発明の要旨） 本発明は、邦仮遺伝子として知られているアグロバクテ
リウムのオクトピン型Ｔ−ＤＮＡ遺伝子の５”側非転写
領域に存在する植物転写活性化要素の同定および特性付
けに基づいている。１遺転子転写活性化配列要素は、植
物において、その調節制御下に置かれた植物発現遺伝子
の発現を活性化したり、あるいは促進したりする機能を
果たす。特に、邦虹遺伝子転写活性化要素は、植物発現
遺伝子の転写開始部位の５゛（上流）側に位置する場合
に機能的である。一般に、植物発現遺伝子の上流に位置
する場合１皿遺伝子転写活性化要素は。

機能的なｒ　ＴＡＴＡ　Ｊボックスが植物発現遺伝子の
転写開始部位から適当な距離をおいて存在し′ていると
いう条件の下で転写を活性化することができる。

欠失変異によるＩ遺伝子の上流領域の機能分析によって
、完全な転写活性化に必要な全てのＤＮＡ配列は７８０
遺伝子転写（主要な転写毒物）の開始点に対して一４７
６位にまで及ぶ領域内に含まれていること明らかにされ
ている。植物転写活性化要素は、約−４７６位から約−
２２９位に及ぶ邦し上流ＤＮＡ配列の範囲内に含まれて
いる。この配列を欠失させると、　７８０構造遺伝子の
転写が最小となる（野生型転写の約０．５％）。転写活
性化能の大部分は約−４２７位と一２７１位の間の配列
、すなわち＝４２７位と一３９６位の間に位置した有意
な機能的要素に関連している。−４７６位と一４２７位
との間の配列、および−２７１位と一２２９位との間の
配列はこれほどではないが、それでもかなり完全な転写
の活性化に貢献している。４つの直接繰り返し配列（第
１図のａ、　ｂ、　ｃ、　　およびｄ）は！上流領域に
見られる。これらの繰り返し配列のうち３つ（ａ、ｂ。

およびＣ）は−４２９位と一４０１位の間で集団となっ
おり、これらの繰り返し配列の１つまたはそれ以上の配
列が転写活性化機能に貢献していることを示している。

機能的な７８０転写活性要素の例としては、特に（表１
に示すような）　−４２７位〜４７６　　位〜−１１２
位のヌクレオチド配列を含む配列が挙げられる。ここに
記載したような遺伝子の転写を活性化し、かつ本発明の
機能的な１遺転子転写活性化要素に少なくとも約９０％
の配列相同性を有するＤＮＡ分子は、　７８０転写活性
化要素と機能的に同等であるとみなされる。

ここに記載した植物転写活性化要素は、植物の遺伝子工
学の分野において、その活性化要素の調節制御下に置か
れた植物発現遺伝子の発現を活性化するのに有用である
。本発明の植物転写活性化要素は植物発現キメラ遺伝子
の一構成成分として有用であり、構造遺伝子が発現され
る植物細胞または植物組織へ導入され得る。

本発明の第１の目的は、植物組織で機能する新規な転写
活性化要素、すなわち７８０遺伝子転写活性化要素を提
供することにある。この配列要素は。

その調節制御下に置かれた植物発現遺伝子の転写および
発現のレヘルを制御する。表１に示すように、約−４７
６位から約−２２９位のヌクレオチドに及ぶ配列を有す
るＤＮＡ断片は、植物における遺伝子発現を活性化する
機能を果たす。この転写活性要素は、いずれの方向にお
いても機能的である。

ら、転写開始部位５゛側の約２０００ｂｐまでの転写開
始部位の上流に配置される。理想的には、該転写活性化
要素は、その存在によって構造遺伝子の発す 現レベルが上昇←義るように、　ＴＡＴＡ配列の直ぐ５
゛側から、５゛側約６００　ｂｐまでに配置されるべき
である。野生型理遺伝子においては、この活性化要素は
、　ＴＡＴＡ配列の約２００　ｂｐ上流に位置している
。

遺伝子発現のレベルは、転写活性化要素と、そのプロモ
ータ配列との距離を制御することによって調節され得る
。転写活性化要素は、調節されるべき遺伝子の上流に配
置されることが好ましい。植物発現遺伝子の上流に、転
写活性化要素のコピーを１つより多くも配置すると、植
物組繊内における転写の活性化がさらに高められる。Ｔ
−ＤＮＡの７８０遺伝子由来の転写活性化要素は、任意
の植物発現遺伝子の５″側に配置された場合に１機能的
となる。本発明の転写活性化要素は、一般に双子葉植物
および単子葉植物の両方を含む全ての植物内で機能する
。

本発明は、　Ｔ−ＤＮＡ　７８０遺伝子の転写活性化要
素と発現が該転写活性化要素によって調節されるような
位置に配置された植物発現遺伝子とを有する組換えＤＮ
Ａ分子を提供する。当該分野でよく知られているように
、　　ｒ　ＴＡＴＡ　Ｊボックスモチーフおよびおそら
＜　ｒｃｃＡＡＴ　Ｊボックスモチーフを含むプロモー
タと、植物内における所定の構造遺伝子の発現に必要な
転写終結シグナルとを包含する他の調節制御配列が必要
とされ得る。工転写活性化要素は、その制御下に置かれ
る遺伝子の転写開始部位の５゛側約２０００ｂｐ上流に
配置されることが好ましい、より好ましくは、！遺伝子
転写活性化要素は、遺伝子転写開始部位の５°側、＋ｈ
＝４９約６５０　ｂｐ上流に配置される。本発明のＤＮ
Ａ分子の構築は、上記の転写活性化要素を用いた従来の
技術によって行われる。任意の植物発現プロモータおよ
び任意の植物発現構造遺伝子が本発明０組換え分子中に
用いられ得ることが予期される。

本発明の他の目的は、Ｔ−ＤＮＡの１遺伝子の転写活性
化要素および植物発現プローモータの転写制御下で、植
物の構造遺伝子を発現させるのに、ここに記載した組換
えＤＮＡ分子を使用する方法を提供することにある。転
写活性化要素およびその制御下にある遺伝子を含む組換
えＤＮＡ分子を当該分野で周知の任意の手段によって植
物組織または植物細胞に導入することによって行われる
。本発明の手ある実施態様では、該組み換えＤＮＡ分子
は。

Ｔ−ＤＮＡが仲介する移入によって植物組織に導入され
る。

本発明の他の目的は、転写活性化要素、適当なプロモー
タ、および他の調節配列から成る植物発現遺伝子複合体
と、ここに記載され、そしてここに記載する方法によっ
て調製された構造遺伝子とを導入することにより遺伝学
的に修飾された植物と植物細胞と植物組織とを提供する
ことにある。

本発明の方法は、単子葉植物および双子葉植物の両方に
おける構造遺伝子の発現に一般に適用可能である。

（発明の構成） 本明細書および特許請求の範囲において９次に示す語句
を用いる際に、その意図および範囲から曖昧さを除くた
めに、これらの語句に次の定義を与える。

組換えＤＮＡ分子とは、異種の起源由来の部分から自然
にまたは人為的に生産されるものであり。

該部分は自然に存在するかまたは、化学的に合成された
分子であり、これらの部分はライゲーションまたは当該
分野に周知の他の手段によって結合されている。

発現とは、タンパクを生成するために構造遺伝子を転写
および翻訳することを意味する。遺伝子発現は１例えば
、タンパク産物を直接検出することによって、あるいは
タンパクのゲル電気泳動または免疫学的な方法によって
評価され得る。しばしば５発現は転写のｏ＋ＲＮＡ産物
の検出によって評価される。この方法は、非転写要素の
効果（例えば。

タンパク分解）が排除されるので、転写活性化要素のよ
うな転写制御Ｂ因子を評価するのに特に適している。

植物転写活性化要素という用語は、ここではｐＴｉ１５
９５５のＴ−ＤＮＡの７８０遺伝子の５°側非転写領域
内で同定された機能的なりＮＡ配列を意味する。このＤ
ＮＡ配列は、方向には関係なく、植物細胞また植物組織
中の遺伝子の転写を活性化し、促進することができる。

ここに記載した転写活性化要素は植物の発現遺伝子の５
゛側に位置した場合に機能する。

７８０遺伝子の転写活性化要素を含むＤＮＡ断片の機能
性は、切断された！遺伝子の発現、特に−３７位の位置
で切断された７８０−遺伝子の発現を活性化する能力に
よって評価されている。７８０遺伝子活性化要素と機能
的に等価なりＮＡ断片は類似の分析法を用いることによ
って同定され得る。７８０−遺伝子転写活性化要素は、
オクトピンプラスミドのＴＤＮへのような自然に存在す
るＤＮＡから単離されるか、あるいは例えば、自然存在
するＤＮＡ切片の組み合わせによって、または機能的な
りＮＡ配列の化学的合成によって人為的に調製され得る
。当該分野で知られているように、特定のＤＮＡ分子の
機能は、その構造、すなわちその配列と、しばしば相い
こともある０本研究では１本発明の断片を含む１遺伝子
活性化要素番こ少なくとも約９０％のＤＮＡ相同性を存
するＤＮＡ分子および断片は９機能的に等価なものとし
て定義される。

プロモータとは、転写の開始をつかさどる構造遺伝子の
５°末端にある配列を意味する。プロモータ配列は下流
にある構造遺伝子の発現を駆動するために必要ではある
が、いつも十分であるとは限らない。プロモータ自体は
、自然に存在するが。

または合成による１つ以上の起源に由来する切片の複合
体であり得る。真核細胞由来のプロモータは１通常５Ｒ
ＮＡの５゛末端の位置（キャップ部位、＋１）に対して
、約２０〜３５ｂｐ　５°側にある標準形の５°−ＴＡ
ＴＡＡ−３’　（「ＴＡＴＡ」ボックス）に相同性を有
するＤＮＡ配列の存在によって認識される。

ｒ　ＴＡＴＡ　Ｊボックスの約３０ｂ、　５　’側に、
他のプロモータ要素配列が、常にとは限らないが、しば
しば見い出され、それは標準形の５°−ＣＣＡＡＴ−３
”に相同性を有するＤＮＡ配列の存在によって認識され
る。

ここでは、プロモータは転写開始部位の約−１５０ｂｐ
５゛側（１５０位）に及ぶＤＮＡ配列を含むと定義され
る。−１５０位の５゛側に位置し、転写活性化要素の機
能性を包含するが、それには限定されない機能−着する
任意の補助配列、または環境の刺激に反応して調節を行
う配列は、プロモータ関連要素と見なされる。ここでは
、一貫性を保つために、７８０遺伝子転写活性化要素の
位置は、７８０遺伝子の主要転写産物転写開始部位に関
して定められている。プロモータは、それが引き起こす
転写による特定の転写産−物に関して配置されることに
留意すべきである。７８０遺伝子は、それぞれ主要転写
産物および副次的転写産物に対応する２つの重複してい
るプロモータを含んでいるようである。

（ｐ−Ａ１へ≧旬） 植物発現遺伝子とは、構造遺伝子と、植物細胞または組
織中で該構造遺伝子を発現させるのに必要な調節ＤＮＡ
配列との組み合わせを意味する。植物発現遺伝子は、構
造遺伝子と、プロモータを含む相同調節配列とから構成
されるか；あるいは調節配列と、異なる遺伝子起源由来
の構造遺伝子コード配列とから構成されるキメラ構築物
であり得る。

構造遺伝子という用語は、タンパク、ポリペプチド、ま
たはその一部をコードするＤＮＡ　ｅＭ域を有し、おそ
らくリポソーム結合部位および／または翻訳開始コドン
を含む遺伝子部分を意味する。この用語は、また、細胞
内で自然に見い出されるが。

人為的に導入された構造遺伝子のコピーを意味する。こ
の場合、細胞内で自然に存在する構造遺伝子は、非自然
の調節制御配列を有するキメラ遺伝子の一部として細胞
内に１例えば１遺転子転写活性化要素の制御下に再導入
される。構造遺伝子は、該遺伝子が導入された植物細胞
内で２通常は見い出されないタンパクをコードし、外来
構造遺転子と呼ばれる。外来構造遺伝子は、細菌の染色
体またはエピゾーム、真核生物の核ＤＮＡまたはプラス
ミドＤＮＡ、　ｃＤＮＡ、ウィルスＤＮＡ、あるいは化
学的に合成されたＤＮＡから、その全体または一部が誘
導される得る。構造遺伝子は、コード領域内において、
あるいは発現産物の生物学的活性または化学的構造や発
現の割合または発現の制御方法に影響を与えうる非翻訳
領域内において、１つまたはそれ以上の修飾を含むこと
がさらに考えられる。

このような修飾としては、突然変異、挿入、欠失。

１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換などがあげら
れるが、これらに限定されない。構造遺伝子は、イント
ロンを含まないコード配列を構成するか、あるいは適切
な植物機能性スプライシング部位で分けられる１つまた
はそれ以上のイントロンを含みうる。構造遺伝子は、自
然に存在するかまたは合成された複数の起源に由来する
部分の複合体であり得る。構造遺伝子はまた。融合タン
パクを生産する。本研究では、構造遺伝子は、翻訳終止
コドンより下流にポリアデニル化シグナルを含むと考え
られる。ポリアデニル化シグナル配列は、使用される構
造遺伝子のものであるか、あるいは他の起源から得られ
るものであり９例えば化学的に合成されたＤＮＡ配列を
包含する。ポリアデニル化シグナルは２通常、　ＲＮＡ
前駆体の３°末端にポリアデニル酸部分を添加すること
により、　ｍＲＮＡプロセッシングを行う。標準形のポ
リアデニル化配列は、転写産物を開裂するが、ホリアデ
ニル化自体は行われないことが知られている。、（Ｃ，
Ｍｏｎｔｅｌｌら（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ３０５：６
００）　、転写活性化要素／プロモータ／構造遺伝子／
ポリアデニル化シグナル植物発現複合体を含む組換えＤ
ＮＡ分子を植物組織内へ導入することは、構成部分のい
くつかまたは全てが同一の遺伝子起源から誘導されると
は限らない構築を包含すると考えられる。

植物組織は、植物の分化組織および未分化組織を包含し
、根、若枝９葉、花粉１種子、腫瘍組織。

（例えば、クラウンゴール）、培養植物細胞の様々な形
態の集合体（例えば、胚やカルス）を含むが、これらに
限定されない。

「化学的に合成された」という用語は、　ＤＮＡ配列に
関するものであるが、構成ヌクレオチドが。

インビトロで非酵素的手段を用いて組み立てられること
を意味する。手動によるＤＮＡの化学合成は。

良く確立された手法（Ｍ、　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　（１
９８３）　Ｍｅｔｈｏｄｏｌ。

ｏｆ　　ＤＮＡ　　ａｎｄ　　ＲＮＡ　　Ｓｅ　ｕｅｎ
ｃｉｎ　、　Ｗｅｉｓｓｍａｎ　　（編）Ｐｒａｅｇｅ
ｒ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　にューヨーク）第１章）で
達成されるし、自動合成は数多くの市販の機械を用いて
実施することが可能である。

調節制御とは、遺伝子の転写開始部位に対して適切な位
置に存在する配列要素による遺伝子発現の調節を意味す
る。この用語は、プロモータ領域および他の調節配列（
すなわち、刺激に応答する配列）を、たいていの場合、
調節行うべき遺伝子の上流に配置することを意味する。

ある種の調節配列（例えば、エンハンサ）は、遺伝子に
近接している（すなわち、該遺伝子から約１〜２ｋｂ以
内にある）限り、該遺伝子の３”側または５゛側に配置
された場合に機能し得る。調節により、転写のスイッチ
がオンオフされるか、あるいは遺伝子の発現レベルが変
化する。遺伝子を配列要素の調節制御下に配置するとい
うことは、当業者によく知られているように、該遺伝子
を、該配列要素に対して充分に近傍の位置であって、該
遺伝子の転写をスイッチオンまたはオフするか、あるい
はその発現レベルを測定可能な程度に変化させるように
位置に配置することを意味する。本発明では。

転写活性化要素配列は、転写開始点部位の５′側であっ
て、該転写開始部位から約２０００ｂｐ以内に配置され
た場合に機能する。

ここで用いられている相同性は、ヌクレオチド配列の同
一性を意味する。ＤＮＡ配列間の相同性の程度は、塩基
配列を直接決定することにより確かめるか、あるいは（
Ｂ、　Ｄ、ＨａｍｅｓおよびＳ、　Ｊ、　Ｈｉｇｇｉｎ
ｓ（１９８５）　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　　Ａｃ１ｄ　　
　Ｊａｔｉｏｎ、ｒＲＬ　　Ｐｒｅｓｓ。

０ｘｆｏｒｄ　ＵＫ、）に記載されているようなりＮＡ
ハイブリダイゼーション実験により経験的に決定するこ
とができる。

Ｔ−ＤＮＡの工遺転子は、プロモータおよび転写活性化
要素を含む約５００ｂρの５゛側非転写隣接配列と、約
４１４個の塩基対のオーブンリーディングフレームと、
ポリアデニル化シグナルを含む約１５０ｂｐの３゛側隣
接配列とを有する。７８０遺伝子は。

（Ｒ，Ｂａｒｋｅｒら（１９８３）、　Ｐｌａｎｔ　Ｍ
ｏ１．　Ｂｉｏｌ、　　２：３３５）らが記述している
ように、　ｐＴｉ１５９５５のＴ−ＤＮＡのオープンリ
ーディングフレーム１８　（１６，６９８位のＡＴＧカ
ラ１７，１１１位のＴＡＡ翻訳終止コドンまだに及んで
いる）に対応する。この遺伝子は、約７８０塩基対の長
さの転写産物を与えることから命名されている（Ｓ、　
Ｋａｒｃｈｅｒ　ら（１９８４）Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　
Ｇｅｎｅｔ、　　１９４：１５９；　Ｊ、　Ｗｉｎｔｅ
ｒ　ら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
ｓ、　　１２：２３９１）。

この遺伝子は、ある種のオクトピン型Ｔｉプラスミド（
ｐＴｉ１５９５５およびｐＴｉＡｃｈ５を包含するが、
これらに限定されない）のＴ−ＤＮＡのＴ−ライト領域
内に存在する。工遺転子産物は、必ずしも感染に必要で
はなく、″７８０遺伝子産物の機能はまだ知られていな
い。

７８０遺伝子の上流領域におけるＤＮＡ配列の機能性は
、ヒマワリの腫瘍中の転写活性に対する一連の５”側お
よび内部欠失変異の影響を調べることにより分析した。

これら変異体の相対的な活性は。

相同性を有する７８０参照遺伝子を、内部標準として作
用する変異体試験遺伝子と共に、同じ移入ベクター内に
導入することによって定量した。参照遺伝子のコード配
列由来のＲＮＡを、　Ｓｔヌクレアーゼハイブリッド保
護マツピングを用いて、試験遺伝子のコード配列由来の
ＲＮＡと区別し得るように。

７８０参照遺伝子のリーダー配列の小さな部分を欠失さ
せた。試験遺伝子および里参照遺伝子は。

相対的な転写活性が測定される植物組織に移入した。

野生型７８０遺伝子コ一ド配列を用いたＳ１マツピング
実験により２表１に示したように、それぞれｒ　ＴＡＴ
Ａ　Ｊ要素およびｒ　ＣＣＡＡＴ　Ｊ要素を有する主要
転写開始部位および副次的転写開始部位の存在が判明し
た。主要転写産物および副次的７８０転写産物の転写に
対する上流配列変異の影響を調べた。

結果を表２に示す。調べた変異は両方の転写産物の発現
に対して同じように影響を与えたので、ここでは主要転
写産物に関する上流活性化配列の分析を考察する。上流
配列は主要転写開始点に関して番号付けを行った。

（以下余白） 娼 ５゛側欠失変異体の転写活性に関する分析により、プロ
モータおよびプロモータ関連要素の５゛側境界域が同定
され、そして上流の配列情報が■遺伝子の充分な発現に
必要であることが示された。

Ｓ１ヌクレアーゼハイブリツド保護マツピングの結果よ
り、５゛側欠失の程度が増加するにつれて。

相対的な転写活性が減少することが示された（表２）。

この分析により、−４７６位と一４７６位との間に７８
０遺伝子側の５゛境界領域が存在しく約８％低下）、こ
の領域の近くには機能的に重要な別々の副構成成分が位
置していることがわかった。上流に転写活性化要素が存
在することは、　−４２７位と一３９６位との間の３１
ｂｐを欠失させた場合に、相対的転写レベルが劇的に減
少（約５０％のプロモータ活性の減少）することから明
らかとなった。また、　−３９６位と一２７１位との間
に他の活性化要素構成成分が存在することは、−２７１
位までの欠失により、相対的な転写レベルが野生型のレ
ベルの約６％にまで減少することから明らかになった。

−４７６位から一４２８位までの領域、および−２７１
位から一２２９位までの領域は、少量ではあるが有意な
量で転写の活性イヒに寄与している。該プロモータ（−
３０位のｒ　ＴＡＴＡ　Ｊボックス領域およびＴＡＴＡ
−近接要素）のみが存在する場合、転写量は、全長活性
化要素断片を用いて得られる活性のわずか０．５〜１％
であった。

転写に対する内部欠失の影響についても調べた（表２）
。１３個の欠失変異体と、１個のＬ８ｂｐ重複変異体と
を分析した。２つの内部欠失体（すなわち、　１Ｄ−３
８４／−２９０およびＩＤ−３２０／−２９０）は、５
゛側欠失によって定められるように、活性化要素内に局
在している。これと一致して、これらの変異体の転写活
性は、それぞれ５２％および６５％であり。

３６８位５゛側欠失変異体の活性５２％に類似している
。内部欠失体ＩＤ−２５２／−１７１および１０−２４
９／−９８で観察された転写活性の減少は、５゛側欠失
によって決められた転写活性化要素の位置付けと一致し
ている。

中間上流領域から配列を除去した内部欠失体（すなわち
、　１０−１５３／−３７，ＩＤ−１１２／−３７，お
よびＩＤ−７６／−３７）のいずれもが、転写活性に敏
感であるか。

あるいは全く影響がなかった。これらの結果により、−
１５３位と一３７位との間の特定配列は、　７８０遺伝
子の主要転写産物の転写に必須のものではないことが示
唆された。しがし、副次的転写産物ｒ　ＴＡＴＡ　Ｊ配
列およびｒＣＣＡＡＴ　Ｊ配列は、これらの内部欠失体
の中から取り除いた。−７６／−３７間の特定的配列は
、いずれの転写産物の転写にも必須ではないようである
。２つの小さい内部欠失体（すなわち。

１０−７６／−７４および１０−１１２／−９８）は、
転写活性の有、意な低下がみられたが、これらのより小
さい欠失を包含するより大きな領域を除去すると、転写
が増大した（Ｉ　Ｄ−１１２／−３７）。内部欠失変異
体は、配列を除去しただけでな（、あらゆる上流要素と
ｒ　ＴＡＴＡ　Ｊボックスまたは転写開始部位との間隔
をも変化させた。従って、内部欠失変異体で観察された
転写活性は、各因子の組み合わせから生じるものである
。内部上流領域における小規模の分断は　ｒ７＾ＴＡＪ
ボックスと活性化要素との間隔の減少を伴った場合、こ
の領域の完全除去よりも１転写に対してより存置なもの
である。

内部欠失体（すなわち、　１０−７６／−１２および［
Ｄ−１１２／−１２）は、主要転写産物の転写活性をほ
ぼ完全に消失させる（＜０．５％および０．１％の活性
）。これらの欠失体は、主要転写産物のｒ　ＴＡＴＡ　
Ｊ配列が除去されている。

このように、ＣＡＡＴ相同領域を包含するＤＮ＾配列領
域は、７８０遺伝子の充分な転写に必須ではないが、　
　ｒＴＡＴＡｊボックスおよびその近傍配列を包含する
領域は転写を行うのに必要なようである。

欠失変異体を用いた実験結果より、１ｗ５°側隣接領域
には、上流活性化要素の少なくとも３つの構成成分が存
在することが示唆された：これらの３つの構成成分とは
、活性化要素、中間上流領域、およびｒ　ＴＡＴＡ　Ｊ
領域である。最も遠い位置にあるの構成成分は、その機
能性および位置特性から転写活性化要素と呼ばれる。大
部分の転写活性化活性は、約−４２７位と約−２７１位
との間のＤＮＡ配列と関連しており、　−４７０位の上
流から一２２９位の下流までに及ぶ配列と関連した大き
な活性を有していた。中間上？ＪＬ領域は、約−２２９
位とｒＴＡＴＪｉｌ域の約−３７位との間に位置してい
る。「ＴＡＴＡ」ｓＩ域は。

ＴＡＴＡ相同配列と、転写開始点近傍の配列とを有して
いる。

（以下余白） 内部欠失実験のデータもまた。　　ｒＴａＴＡＪｊＩ域
に対する転写活性化要素の距離に融通性があることを示
している。例えば、活性化要素領域をｒ　ＴＡＴＡ　Ｊ
領域に３１ｂｐから１０８　ｂｐにまで接近させるよう
な内部欠失体（すなわち、　ＩＤ−１５３／−３７，１
０−１１２／−３７゜および１０−７６／−３７）は、
転写活性化を高めるか、あるいはほとんど影響を与えな
い。

っている。これらの配列の一４２７位から一３９６位ま
での欠失体は、転写活性が象、激に低下し、これらの繰
り返し配列が活性化要素の機能にとって重要であること
を示している。各繰り返し配列ａ、繰り返し配列す、お
よび繰り返し配列Ｃの各々の２つのコピーは、　−４７
６位から一２２０位に及ぶ領域内に見い出される。繰り
返し配列Ｃの３番目のコピーは。

活性化要素の３゛側境界域に存在する。繰り返し配列ｄ
の１つのコピーは、活性化要素領域内にあり、２番目の
コピーは中間上流領域内に存在する。

繰り返し配列Ｃはまた。オクトビン型ＤＮＡの１３個の
既知遺伝子のうち７個の上流領域内にも存在し。

繰り返し配列Ｃに類似した配列は、ツバリン型ＴＤＮＡ
遺伝子の５°側隣接領域内に見い出された。

このような繰り返し配列は、遺伝子発現の制御に機能す
るタンパク−ＤＮＡ相互作用の部位を表し得る。

７８０遺伝子活性化要素の方向特性および位置特性を決
定するために、　−４７６位から一１１２位までに及び
、該活性化要素を含む７８０遺伝子上流領域（表１）の
制限酵素断片を単離し、第１図のシャトルベクター（ｐ
Ｗ９−ＴＤ：Δ−３７）内に挿入した。奥遺転子の欠失
変異体の上流及び下流だけでなく１両方向における該断
片の位置付けが転写活性へ及ぼす影響を調べた（第２図
）。工遺転子欠失変異体。

３７は、■遺伝子の全コード領域を含むが、５゛側隣接
領域は一３７位まで欠失していた。この変異体、−３７
は、野生型■遺伝子の約２％レベルまでしか発現されな
い主要転写産物の「ＴＡＴＡ」ｓＮ域を保持している。

−４７６位から一２００位に及び、活性化要素を有する
少し小さな断片で得られた結果は。

４７６／−１１２断片で得られたデータに類似していた
。

第２図に示すように、′７ｗ活性化要素は、遺伝子から
５°側へ転写開始部位から少なくとも約６５０ｂｐまで
の比較的大きな距離にわたって、いずれの方向にあって
も、転写を誘導した。活性化要素とｒ　ＴＡＴＡ　Ｊ領
域との間の距離は、Φχ１７４　ＯＮＡ断片の挿入によ
って変化させた。１遺転子転写活性化要素は、転写開始
部位から約２ｋｂまでに配置された場合に機能する。

試験される特定の構築物において、工部性化要素は、減
衰された一３７珊遺伝子の３″側に配置された場合、　
　ｒＣＣＡＡＴ　、相同領域を有する中間上流領域が除
去されていると、転写を誘導しなかった。

この結果は、ある遺伝子の３′側に配置された場合活性
化要素機能の欠如のためよりもむしろ７８０遺伝子プロ
モータ領域の切除のためであり得る。７８０活性化要素
は、それほど著しく減衰されていないプロモータの３”
側に配置された場合には、転写を高め得る。

構造遺伝子を含有し、植物の転写活性化要素およびプロ
モータ配列の転写制御下で、該遺伝子を発現する遺伝学
的に修飾された植物組繊の生産は本発明の特定の教示を
、当該分野でよく知られている種々の技術および手段と
組み合わせることによって行なわれる。たいていの場合
、全工程の各段階には別の手段が存在する。手段の選υ
くは２発現複合体を導入して安定に維持するためのヘク
ター系、修飾されるべき植物種および所望の再４１．方
法、そして用いるべき特定の構造遺伝子の選択のような
種々の因子に依存する。これらの因子の全てには、当業
者が選択して使用し、所望の結果を達成し得る別の工程
段階が存在する。例えば、植物の上流活性化要素を得る
ための根本的な開始点は１本出願においては、　ｐＴｉ
　１５９５５によって例示されているが、転写活性化要
素を有するＤＮＡを操作する方法に適当な改変がなされ
る限りは、他のオクトピン型Ｔｉプラスミドまたは種々
の起源からの相同ＤＮＡ配列を代用し得る。同様に、　
７８０構造遺伝子は、やはり適当な方法の改変により、
他の起源に由来する植物発現構造遺伝子により置換され
得る。構造遺伝子または他の配列の類似物は、当該分野
でよく理解されているように、適当な激しさの条件下に
おいて、核酸が交差ハイブリダイゼーションを行なう能
力によって同定され得る。本出願で利用または開示され
る配列内にば５わずかの配列の変更があり得ることが理
解される。広い範囲内におけるいくつかのＤＮＡ配列が
、Ｆｓ能性を決定する際に、他の配列よりも重要である
ことは。

当該分野においてよく知られている。当業者は以下の方
法により、多くの実験による出費を必要とせずに、配列
の許容し得る変更について試験し得る：よく知られてい
る変異技術（Ｄ、　５ｈｏｒｔｌｅら（１９８１）　　
八ｎｎ、　　Ｒｅｖ、　　Ｇｅｎｅｔ、　　１５　　：
　　２６５　　；　　Ｍ、　　Ｓｍ１ｔｈ（１９８５）
同上、　１９：４２３；Ｄ、　Ｂｏｔｓｔｅｉｎおよび
り、５ｈｏｒｔｌｅ　（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２
２９：１１９３により考察されている変異技術を包含す
るが、これらに限定されない）；リンカ−走査変異法（
Ｓ６ＭｃｋｎｉｇｈｔおよびＲ，Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ（
１９８２）　５ｃｉｅｎｃｅ　　２１７　：　３１６）
　；あるいは飽和変異法（Ｒ，Ｍｙｅｒｓら（１９８６
）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３２　：　６１３）。これらの変
更は、当業者が、上流転写活性化配列、プロモータ要素
、構造遺伝子、およびポリアデニル化シグナルの機能単
位を操作して実用化し得るように、標準的な技術をここ
に記載されている分析法と組み合せることによって決定
され得る。当業者は、ここに記載されている方法を用い
て充分な実験を行なうことにより、上流活性化要素の変
更された配列を機能保持について試験し得る。ここに記
載されている活性化要素配列の短かくされた機能配列ま
たは変更された機能配列の全ては、　　ｒ７８０遺伝子
転写活性化要素」であると考えられ２本発明の範囲内に
ある。遺伝学的に修飾された植物組織を得るための好ま
しい実施態様における最終段階は、　Ｔ−ＤＮＡを有す
るヘクターに発現複合体を挿入することと２Ｍｉ換えＤ
ＮＡを植物組織に移入することを包含する。−修飾され
たＴ−ＤＮＡはゲノムの一部として安定に組み込まれる
。

好ましい実施態様における本発明の主な特徴は。

７８０遺伝子由来の植物転写活性化要素と、プロモータ
配列との作用により、転写発現が高められる構造遺伝子
を有する組換えプラスミドである。これらの構成成分は
、お互いに正しい位置および方向に挿入されねばならな
い。転写活性化要素はプロモータの５゛側に配置される
のが最良であること；該活性化要素は遺伝子の転写開始
部位から約２０００ｂｐ以内に配置されなければならな
いこと；そして転写活性化配列の方向は機能性に重要で
ないことが確定している。転写活性化要素−プロモータ
複合体によって制御されるためには２構造遺伝ｒは該複
合体の３″側に挿入されねばならない。（少数の周知の
プロモータは両方向に制御″ｆｇを行なうことができる
。この場合、プロモータのいずれかの側が下流と考えら
れる。）タンパクのアミン末端を完全にコードする構造
遺伝子部分は該遺伝子の５゛末端（上流）であり、カル
ボキシル末端に近いアミノ酸をコードする末端は該遺伝
子の３゛末端（下流）と呼ばれる。コード領域の方向に
より確立される５“から３”への方向性のある命名法は
、プロモータを有する隣接領域を包含するように拡張さ
れる。５′末端は、転写活性化要素−プロモータ複合体
の３′未端に隣接していなければならない。ポリアゾリ
ル化シグナルは、コード配列の３゛末端から正しい方向
の下流にに位置しなければならない。

他に考慮しなければならないことは１発現複合体の機能
要素間の距離である。これらの距離に関しては、実質的
な変化が存在するようである：従って、距離に関する必
要条件は１機能性によって最も良く記述される。第１近
似として２合理的な作動可能性は１機能性要素間の距離
が、それらが誘導される遺伝子内における距離に類似し
ている場合に得ることができる。転写活性化要素と他の
機能性配列との間の距離を変化させることにより。

構造遺伝子の発現レベルにおける変化を達成し得ると期
待される。融合タンパクを与える構築物の場合、付加的
な必要条件として、２つの遺伝子またはその断片は、２
つのコード配列が同じリーディングフレーム内に存在す
るように連結されなければならない。この必要条件は、
当該分野においてよく理解されている。ごの必要条件に
対する例外は、イントロンが、一方の遺伝子からｉＸｉ
されるコード配列と、他方の遺伝子から誘導されるコー
ド配列とを分離している場合である。この場合。

コード配列は適合可能なスプライシング部位によって境
界を設けられなければならず、そしてイントロンスプラ
イシング部位は、イントロンが転写後のプロセッシング
により除去された後に両方の遺伝子の正しいリーディン
グフレームが融合体中に確立されるように、配置されな
ければならない。

発現制御または成長制御の割合における差異は。

所定の遺伝子が異種の植物の上流転写活性化要素プロモ
ータ複合体の制御ｎ下に挿入される場合に観察され得る
。

プロモータ配列と７８０由来の転写活性化要素との制御
下に所望の構造遺伝子を有する組換え体ＤＮＡ分子は、
当該分野に周知のいかなる方法によっても植物組織中に
導入され得る。所定の植物種または特定型の植物組織に
用いられる技術は５周知の有用な技術に依存する。植物
組織に組換えＤＮＡを導入する方法は、以下のものを包
含するが、それらに限定されない：形質転換（Ｊ、　Ｐ
ａ５ｚｋｏｉｖｓｋｉ　ら（１９８４）ＥＭＢＯＪ、旦
：２７１７）　ｉエレクトロポレーション（Ｍ、Ｐｒｏ
ｍｓら（１９８５）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃ、＋、　ＵＳＡ８２：　５８２４）　　；マ
イクロインジエクシゴン（Ａ、Ｃｒｏｓｓｗａｙら、　
　（１９８６）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　
２０２：１７９）　　；あるいはＴ−ＤＮＡの仲介によ
るアグロバクテリウムツメファシェンス（Ａ　ｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）から植物組
織への移入。Ｔ−ＤＮＡによる形質転換は。

基本的にはアグロバクテリウムの自然における植物宿主
範囲に限定されないように思われる。単子葉植物（Ｇ、
Ｍ、Ｓ、　１ｌｏｏｙｋａａｓ−Ｖａｎ　Ｓｌｏｇｔｅ
ｒｅｎら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ　　３１１ニア６３
−７６４）　、裸子植物（Ａ、　Ｍ、Ｄａｎｄｅｋａｒ
ら（１９８７）　Ｒｔｏｔｅｃｈｎｏｌ、５：５８９７
−５９０）、および藻類（Ｒ，Ｌ、　Ａｕ５ｉｃｈ、欧
州特許出願筒［８，５８０号）において好結果を得たＴ
−ＤＮＡの仲介による形質転換が報告されている。代表
的なＴ−ＤＮＡベクター系は以下の参考文献に記載され
ている（Ｇ、　Ａｎら（１９８５）ＥＭＢＯＪ、　４：
２１１　；　Ｌ、　Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ
　ら（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ　　３０３：２０９　；
　Ｌ、　Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ　ら（１９
８３）ＥＭＢＯＪ、　２：９８７；Ｌ、　ｌ１ｅｒｒｅ
ｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ　ら（１９８５）Ｐｌａｎｔ　
　Ｇｅｎｅｔｉｃ　　７ｉｎｅｅｒｉ」ニューヨーク：
　Ｃａｕ＋ｂｒｉｄｇｅｔｌｎｉｖｅｒｓｉＬｙ　Ｐｒ
ｅｓｓ、　ｐ、６３）。（いったん植物組繊中に導入さ
れると、構造遺伝子の発現は、当該分野に周知のいかな
る方法によっても分析することができ、転写レベルまた
は合成されたタンパクによって測定され得る。植物組織
のインビトロ培養に対する技術、および多くの場合にお
ける完全な植物体へ再生させる技術は周知である。導入
された発現複合体を商業的に有用な栽培種に移入する方
法は当業者に知られている。本発明のＤＮＡ分子を有す
る形質転換植物組織は２例えばＤＮＡハイブリダイゼー
ション分析を用いて、導入されたＤＮへ断片の存在によ
り同定し得る。導入されたＤＮＡ断片の存在は、形質転
換した組織の同定しうる表現型である。

植物細胞および植物組織中に外来遺伝子を安定に挿入す
る新規な方法と、形質転換細胞および組織を操作して形
質転換植物を得る新規な方法が開発されているので、当
業者は、多くの実験で練習することなく、このような所
望の新規な方法と組み合せることにより１本発明のＤＮ
Ａ断片および構築物を使用し得る。代表的な実施態様（
ｐＷ９−ＴＯ：４７６／−１１２−５’　Ａ、第１図参
照）では、上流活性化要素は１発現プラスミド中、　Ｂ
ａａ＋旧部位におけるプロモータと構造遺伝子との「Ｔ
ＡＴＡ」要素の５゛側に挿入されている。当業者に明ら
かであるように発現複合体の成分は、インビトロでの操
作に対して都合の良い、自然に存在するかまたは人為的
に設計された制限によって結合され得る。主とし′ζ考
慮しなければならないことは、結合部分の配列が、転写
および翻訳の機能性に適合し得るごとである。

（実施例） 以下の実施例は２本発明を例示する目的でのみ与えられ
るものであって２本発明の範囲を限定することを意図す
るものではない。これらの実施例では２分子生物学；植
物組繊中における組換えＤＮへの操作：そして形質転換
植物の培養および再生に関する分野の当業者によく知ら
れており、かつ容易に使用し得る多くの技術が用いられ
ている。酵素は市販品を人手することができ、当該分野
に周知のペングーの推奨条件または他の変更条件に従っ
て使用される。試薬、緩衝液５そして培養条件も、当業
者に知られている。標準的な分子生物学の手法参考文献
としては以下のものが挙げられる（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ　ら（１９８２）　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ　。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ
、　Ｎｅ１ｍ　Ｙｏｒｋ　；　Ｒ，Ｗｕ　　（編）　（
１９７９）　Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、、６８　；　Ｒ，Ｗｕら（）、Ｗ）　
（１９８３）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ。

１００　ａｎｄ　１０１：Ｌ、　Ｇｒｏｓｓｍａｎ　ａ
ｎｄ　Ｋ、　Ｍｏ１ｄａｖｅ（編）　（１９８０）Ｍｅ
ｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、６５；　Ｊ、　Ｍｉｌｌｅｒ
（Ｉり　（１９７２）均１虹力醪ｎｔｓ　　ｉｎ　　Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　　Ｃｏ１ｄ
　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　
　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮｅｗＹ
ｏｒｋ　；　　Ｏｌｄ　ａｎｄ　Ｐｒｉｍｒｏｓｅ（１
９８１）　Ｐｒ１ｎｃｉ−ｐｌｅｑ妊堕ｎｅ　　ル狙り
刈ｂ１暉狙、　　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１
ｉｆｏｒｎｉａＰｒｅｓｓ　　、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、Ｃ
ａ１ｉｆｏｒｎｉａ　；　Ｒ，５ｃｈｉｅｆ　　ａｎｄ
Ｐ、Ｗｅｎｓｉｎｋ（１９８２）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　
　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒｕ枦
Ａ■：　Ｇｌｏｖｅｒ　（編）（１９８５）　ＤＮＩｊ
　　Ｃ１ｏｎｉｎＨ，Ｖｏｌｓ。

■およびＩＩ、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ
、　ＵＫ　；　Ｈａｍｅｓおよび１１１ｇｇ１ｎｓ（Ｗ
）（１９８５）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄ　　ｈ敗
１旦１ｏｎ　ＩＲＩ、Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ、　
ＵＫ；　５ｅｔｌｏ−およびＡ、　Ｈｏ１ｌａｅｎｄｅ
ｒ（１９７９）Ｇｅｎｅｔｉｃ　　Ｅｎ　１ｎｅｅｒｊ
ｎ　　：す力に初力扱ａｎｄＭｅｔｈｏｄｓ。

Ｖｏｌｓ、　１−４　、　ＰＩｅｎｕａ＋Ｐｒｅｓｓ　
、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　。ここで使用した略語および
命名法は、当該分野において標準的であると思われ、こ
こに引用されているような専門雑誌において一般的に使
用されている。

（以ド余白） Ｕｔ例−土 本実施例では、参照遺伝子に相対的なりボーク遺伝子プ
ロモータの転写発現を調べるためのクロニング、形質転
換、および分析方法について述べる。

子を含んでいた。

組換えＤＮＡ実験に用いたエセリヒア・コリ（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）宿主は、　ＬＥ３９２株
である。

７８０遺伝子の参照類似体は、試験遺伝子の相対的な転
写レベルを測定し得るように構築した。−２９０位の上
流にあるＬ用１部位は参照遺伝子の構築を妨げるので、
７８０遺伝子の一２９０位の５゛側にある配列を欠失さ
せた。　ｐＵｃ−１９：　７８０の誘導体を選択した。

７８０のメツセージのリーダー領域を決定しているＤＮ
Ａ由来の８　ｂｐ　ＴＢ　Ｉ断片を除く目的で、欠失し
たｐＵｃ−１９：　７８０プラスミドをＬ狙Ｉで切断し
。

そして再連結した。Ｅ、　　ｃｏ旦を形質転換した後。

制限酵素を用いた分析により、プラスミドの構造を確か
めた。５゛側非翻訳リ一ダー配列中の８　ｂｐを欠失す
ると、　Ｓｌヌクレアーゼハイブリット保護分析によっ
て、試験遺伝子転写物と参照遺伝子転写物との区別が可
能になる。

シャトルベクターｐＷ９は、　ｐ２３３Ｇ　　（Ｗ、　
Ｇｕｒｌｅｙら（１９８６）Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　　
Ｂｉｏｌ、　６．５５９　）由来のＴレフト（ρＴｉ１
５９５５）の４．２ｋｂ影但１１１−４小Ｉ断片を、　
ｐＡｃＹｃ１８４　（Ａ、ＣｈｕｎｇおよびＳ、Ｃｏｈ
ｅｎ（１９７８）　Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１３４．１１４１）に挿入するこ
とにより、構築される。ρ２３３Ｇ誘導断片には、約３
．８ｋｂのＴ−レフトＤＮＡと、約０．４ｋｂのｐＢＲ
３２２配列とが含まれている。Ｔ−レフト配列は、以下
に述べるアグロバクテリウム・ツメファシェンスＡｇ５
２６０のＴｉプラスミド中へシャトルベクターを相同的
に組換えるための部位を与える。廻参照遺伝子は、続い
て１．２　ｋｂｐのＳａｌ　ｒ　−５ｐｈ　　Ｉ断片と
して、シャトルベクターｐＷ９にクローン化され、ρ−
９−ＴＯを与える。

ｐＵｃ−１９：　７８０　（５μｇ　）をＥｃｏｒシ１
で線状にし。

エキソヌクレアーゼＢａ１３１　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ＋　５０ｕ
／ｄ、　０．０５−容量）で切断することにより、５′
側欠失体を形成した。５ａｌｌリンカ−を加えた（Ｔ、
　Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ＣＩｏｎｉ」、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂ
ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ　、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　。次いで、
これらの分子を現罰ｄＩ［［で切断し、５ａｌｌ−坦ｎ
ｄＩ［Ｉ断片として切断した７８０断片を遊離させた。

次いで、これらの断片は、５ａｌＩおよび旧ｎｄＨ１で
切断したｐＵｃ１９に連結した。欠失の範囲は、上で述
べたように、配列分析により決定した（Ａ、　Ｍａｘａ
ｍおよび−、Ｇｉｌｂｅｒｔ（１９８０）Ｍｅｔｈ、　
ｆｉｎｚｙｍｏｌ、６５　：　４９９　　；　Ｆ、Ｓａ
ｎｇｅｒら（１９８１）Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　
１４３　：　１６１　）。

７８０遺伝子の５゛側非翻訳隣接領域内に及んでいる３
′側欠失体は調製するために、　ｐＵｃ−１９：　７８
０のＥｃｏＲ１部位を、まずリンカ−の添加により、　
Ｂａｍ１ｌ　１部位に変換した（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉ
ｓら（１９８２）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎ３
．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ
　、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　。次いで、この修飾したプ
ラスミドを、　Ｈｉｎｃｌｌで切断し、−ヒで述べ１こ
ように、　Ｂａ１３１で処理した。この旧ｎｃｌｌの位
置は。

１７．０７５位である（Ｒ，Ｂａｒｋｅｒら（１９８３
））　、上述のように、５ａ１１リンカ−を加え、５ａ
ｌＩおよびＢａｏ＋ｔｌ　Ｉで切断した後、この７８０
誘導断片を、同様に切断したｐＵｃ１９に連結した。欠
失体は上で述べたように配列分析により確認した。

内部欠失変異体および内部重複変異体は、適当な５゛側
欠失変異体と３°側欠失変異体とを接続した後に構築し
た。適当な５“側欠失体を、鉢ローｊｌｉｎｄｌｌｌ断
片として単離し、　Ｓａ↓Ｉ　−Ｈｌｎｄ［［で切断し
たｐＵＣ−１９：　７８０の３′側欠失クローンに連結
した。

３　３　：’　　　を４むシャトルベクターの１１！− ｐＵＣ−１９：　７８０の誘導体は、陰ＩＩ　１および
坦ｎｄｌｌで切断し、同様に切断したｐＷ９−ＴＯに連
結し、ξ　ｃｏｌｉに形質転換した。制限酵素を用いた
分析により。

７８０誘導断片が試験ブラスミＦ内に挿入されているこ
とを確認した。

１、　４　　ベクターの　　と　　の 本来存在するＴｉプラスミドの７８０遺伝子と、新しく
導入されるシャトルベクターの７８０誘導体との間の遺
伝的相同組換えを防ぐために、へｇ５２６０株と名づけ
られたＡ、　　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　（ＳＬｒ）の
変異誘導体を構築する必要があった。ｐＴｉ１５９５５
の内在する７８０遺伝子をＴ−ライト部分から除去する
と、Ｔレフト部分に導入した変異７８０プロモータの分
析が容易になった。７８０遺伝子を含む４．７ｋｂの−
Ｘｈｏ　１−１１ｉｎｄＩ［１断片（１５，２０８位か
ら１９，９５３ｂｐまでＨＢａｒｋｅｒら（１９８３）
Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、２　：　３３５　）
を、５０！ｇ／ｍのカナマイシン耐性を与えるトランス
ポゾンＴｎ５（Ｓ、Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎら、　（１９８
０）　Ｃｅ１ｌ　１９．７９５）由来の１．５ｋｂ　Ｓ
ａｔ　Ｉ　−Ｈ４ｎｄｌＩ［断片に置換した。欠失させ
た′ｒ−ライト断片の置換は、　ｐＨＩＪｌ　　（Ｊ、
　Ｂｅｒｉｎｇｅｒら（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ２７６
：６３３）をＲ７５１−９ＭＧ２の代わりに用いて組換
え体を選択したこと以外は、　Ａ、　Ｍａｔｚｋｅおよ
びＭ、Ｃｈｉｌｔｏｎ（１９８１）　Ｊ、　Ｍｏ１．　
Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ。

↓：３９で述べられているような二重相同組換えによっ
て行なった。しかし、　ｐＨＩＪＩは、シャトルベクタ
ーの導入を妨げるので、Ｊ、旧１１　ｅ　ｒ　（ｂｉｔ
　ｓｉｎ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
　（１９７２）、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　ｌ１ａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）によって述べ
られているカルベニシリン−シクロセリン法を用いて、
アンピリジン惑受性細菌を増加させることにより、　Ａ
ｇ５２６０からｐＨＩＪｌを除去した。欠失させたＴｉ
プラスミドは、Ｔ−ラ・イトの左側境界配列と、　１０
５０転写物に対応する遺伝子と、　１４５０転写物（Ｊ
、　Ｗｉｎｔｅｒら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
１ｄｓ　Ｒｅｓ。

１２　：　２３９１）をコードしている遺伝子の３゛末
端の大部分を欠いていた。変異体Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃ
ｉｅｎｓＡｇ５２６０を、　７８ｏ誘導体または上流活
性化配列を有する様々な構築物を含むシャトルベクター
の受容体として用いた。植物組織に移入した組換え分子
は、この株からのものである。

二重遺伝子シャトルベクターは、　Ｒ，Ｆｒａｌｅｙら
（１９８３）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ　ＵＳＡ　　８０：４８０３により述べられているよ
うに、　Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　ＬＥ３９２からＡ、　　
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　Ａｇ５２６０中へ三親接合に
より移入した。得られた形質転換体のコロニーは、スト
レプトマイシン（２５０！ｇ／ｍｆ）、カナマイシン（
２０！ｇ／ｄ）、およびクロラムフェニコール（１７〜
２０μｇ　／ｄ）を含むへＢ最少培地（Ｍ、　Ｃｈｉｌ
ｔｏｎら（１９７４）Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　八
ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ　　　７Ｌ　：　　３
６７２）上で、２８°Ｃにて３〜５日間増殖させること
により選択した。

ヒマワリ　（ｌｌｅｌｉａｎｔｈｕｓ　　ａｎｎｕｕｓ
、　ｃｖ、　Ｌａｒｇｅ　Ｇｒｅｙ）の苗木に腫瘍を接
種し、以前に述べられたように。

植物体を成長させた（Ｗ、　Ｇｕｒｌｅｙら（１９８６
）、　ｆｉ　：　５５９）。

１４〜１６日間腫瘍を成長させた後、各プラスミド構築
体に対し、平均２００〜３００個の腫瘍を回収し。

直ちに液体窒素で凍結させた。

１．５　　耘亙糞】ｐ透析 試験遺伝子および参照遺伝子の転写発現は、　Ｓｔヌク
レアーゼハイブリッド保護により分析した。

分析は、以前に述べられたように、ヒマワリの腫瘍から
単離した約１５μｇのポリＡに富むＲＮＡを用いて実施
した。（Ｅ、Ｃｚａｒｎｅｃｋａら（１９８４）、　Ｐ
ｌａｎｔＭｏｌ、　Ｂｉｏｌ、３．４５　；Ｗ、　Ｇｕ
ｒｌｅｙら（１９８６））　、　−７４ｂｐから＋６０
ｂρまでの位置に相当するハイブリダイゼーションプロ
ーブを、５′側欠失クローンのｐ−７４から単離し、　
　＋６０ｂｐの位置にある拘＋ａｌｌ断片）は、試験遺
伝子の野生型のリーダー配列および隣接配列を含んでい
る。ポリ（Ａ）　ＲＮＡは、二本鎖ＤＮ＾Ｎａ−ブと、
３８°Ｃにて一晩ハイプリダイズさせた。Ｓ１ヌクレア
ーゼ（５０υ／戚）で、２３°Ｃにて３０分間消化した
後、保護されたハイブリッド形成鎖は、７Ｍの尿素を含
む８％のポリアクリルアミｌ゛ゲルで分画し、−７０°
ＣにてＸＡＲ−５（にｏｄａｋ　Ｃｏ、）フィルムに１
〜２日間露光した。

相対的な転写レベルは、参照遺伝子の転写産物のｃｐｏ
＋に対する試験遺伝子の転写産物のｃｐＩａの割合を、
参照遺伝子の転写産物のＣｐＩＩｌに対する野生型の転
写産物のＣρ■の割合で割ったものとして定義した（Ｐ
、　Ｄｉｅｒｋｓ　ら（１９８３）　Ｃｅ１ｌ　３２−
　：　６９５　）。

放射活性を有するバンドをゲルから切り出し、チェレン
コフ（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ　）力うンティングに用いた。

すべての相対的な転写レベルは、３回またはそれ以上の
独立したハイブリダイゼーション実験の平均を示す。

試験遺伝子（５°側非翻訳領域に欠失や重複を有するも
の）の活性、　−２９０位から＋１位までの領域がその
まま残っている参照■遺伝子の活性と比較した。参照遺
伝子の転写産物は試験遺伝子の転写産物より８　ｂｐ短
かく、Ｓ１ヌクレアーゼハイブリツト保護マツピングに
よって区別できた。野生型のリーダー配列をハイブリダ
イゼーションのプローブとして用いた場合、転写産物を
区別する基準は、　ＤＮＡプローブと参照遺伝子転写産
物との間に局在する非相同領域によるものである。この
非相同領域は、標識されたＤＮＡ中に生じた８ｂｐルー
プにおけるＳｌヌクレアーゼ切断を可能にした。野生型
の遺伝子の主要な転写開始部位は、町徂■部位の６０ｂ
ｐ上流側に位置している。参照遺伝子のみを含む腫瘍由
来のＲＮＡを、　Ｓｔハイブリッド保護分析に供すると
、　４６ｂｐから５４ｂｐの予測された位置にハンドの
集まりが見られた。この集まりの位置は、ブローブーＲ
ＮＡハイブリッド内の予測された８　ｂｐループにおけ
る切断によって生じる断片の大きさに対応していた。試
験遺伝子と参照遺伝子との両者を含む腫瘍由来のＲＮＡ
を分析した場合には、２つの保護されたハイブリッドバ
ンドの集まりが予想した位置に見られた。このことは、
この方法が、これら２つのプロモータの相対的な活性を
評価するのに使用し得るということを示している。試験
遺伝子の転写産物から得られたシグナルは、単一のバン
ドよりもむしろハンドの集まりであった。弱く保護され
たバンドも１２０ｂｐの位置に見られた。このことは、
＋１と定義した主要な開始部位から６゜ｂｐ　　５”側
に開始部位を有する副次的な転写産物に対応していた。

副次的な転写産物のレベルは、主要な転写産物のレベル
の１〜１０％と判定された。邦Ｕ遺伝子の上流領域にお
ける一連の５゛側欠失体および内部欠失体に対する野生
型活性の百分率として相対的な転写レベル（ＲＴＬ　）
を表２に示す。５′側欠失変更体は、欠失の３゛末端の
位置を用いて示されている。すなわち、（Δ）−４２７
は、　−４２７位まで５゛側が欠失している）。内部欠
失体は、欠失の両末端の位置で示されている（すなわち
、　ＩＤ−３４８／２９０は、　−３４８位から一２９
０位までに及ぶ内部の欠失を有する）。１０より大きい
ＲＴＬは実験間で、±１０％またはそれ以下の変動があ
る。１０より小さいＲＴＬは、±４％より小さい変動が
ある。

４７６位から一１１２位のＤＮＡ断片（−４７６／−１
１２断片、第１図参照）を、７８０誘導転写活性化要素
の性質の特徴付けに使用した。この断片は、　　−１１
２位までに及ふ３゛側欠失を含むｐＵＣ：　７８０　誘
導体から取り出した。工断片め３°末端の」【部位を。

Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）が述べているよ
うに、リンカ−を付加することにより、Ｂａａ＋Ｈ１部
位に変換した。この断片を影狸ＩＩ　１回片に変換する
ことにより、　ｐＷ９−ＴＤ　：Δ−３７における一３
７位までの５″側欠失の上流側に両方向で、活性化要素
をクローン化した（第１図）。−４７６位から一２００
位までの工断片のＳａｌ　１部位サイトも、リンカ−を
付加することによって、Ｂａ５８１部位に変換した。適
合する断片をＢａｗｌ　Ｉ断片として取り出した後、各
々をｐＷ９−ＴＤ　：Δ−３７に連結した。形質転換し
た後。

制限エンドヌクレアーゼ分析により、プラスミドのプロ
フィルを決定し、そして各断片の各方向で試験するため
に２代表的なプラスミドを選択した。

第２図は、　−４７６／−１１２活性化要素を含む種々
の試験構築物を表し、かつＲＴＬを与える。

Ｌ述したＳ１ヌクレアーゼハイブリツド保護によって、
−３７位まで欠失させたプロモータの転写を促進する際
における退部性化要素の機能を評価した。−３７位の上
流に、　−４７６位から一１１２位の領域が配置されて
おり、かつｐＵｃ１９ポリリンカーの２ｓｂｐが介在し
ている構築体は、野生型の転写レベルとほぼ同じ値を示
した（９３％）。−４７６位から一１１２位の断片を、
（野生型に対して）逆方向に挿入した場合には、野生型
の転写活性の９０％であった。−４７６位から一２００
位の断片が野生型の方向で挿入されており、かつ２５ｂ
ｐのポリリンカーが介在している構築物では、野生型の
転写レベルより大きな値を示した（１２７％）。逆方向
であって、　ＴＡＴＡ領域から遠い位置に２５ｂｐのポ
リリンカーを有する場合には、９２％の相対的な転写活
性があった。従って、上流活性化要素の方向は、転写効
率を上昇させる能力には有意に影響しない。−４７６／
−２００活性化要素断片のＲＴＬの分析においても。

上流活性化要素の方向が若干活性を増大させること以下
は、類似した結果が得られた。

４７６位から一１１２位までに及ぶ７８Ｑ遺伝子断片内
に含まれる活性化要素領域を、該断片と、切断した７８
０遺伝子プロモータのＴＡＴＡボックスとの間に　約５
４０ｂｐのスペーサＤＮＡが介在している場合の活性に
ついて試験した。φχ１７４の６１３　ｂｐの１ｌａｅ
ｌＨ断片を、上で述べたように、５ａｉｌリンカ−を付
加することにより、５ａｌｔ断片に変換し、珊上流領域
コアプロモータとの間に挿入した。７１３０遺伝子上流
活性化要素が野生型の方向で存在する構築体は、野生型
に比べて約２倍の転写レベル（２１０％）を示した。−
４７６位から一１１２位までの断片が逆方向に存在する
構築体は、わずかに低い相対的転写レベル（１８３％）
を示した。工コアプロモータの５゛側にφχ１７４由来
の断片のみを配置した対照実験により、このＤＮＡ断片
は、植物転写活性能を有さないことが確認された。

２．３　　　　の３”　に配　された　　　要素−の一
■ 上流の転写活性化要素は、エンハンサ様要素の性質を有
していたので、　ｐＷ９−ＴＤ　：Δ−３７内の遺伝子
の３゛側に配置された場合に、切断された７ｕプロモー
タの転写を活性化する能力について試験した。

４７６位から一１１２位までの断片を、　Ｈｉｎｄｌｌ
ｌリンカ−の付加により修飾し、ポリ（八）付加部位の
２００ｂｐＴ流であって、コアプロモータから約１　ｋ
ｂｐのところにある旧ｎｄ１１１部位に配置した。この
位置において、７８１２ｉｔ断片の両方向を試験した。

遺伝子の３゛側に配置した場合には、コアプロモータに
よる転写の増大は検出できなかった。

２、　４　７８０　　　　　　　　のＤＮＡ配二回点対
称性を有する領域や反復配列を見い出すために、コンピ
ュータにより２７８０遺伝子の一４７６位から＋６０位
までの領域のＤＮＡ配列を分析した。

表１に、この配列を示す。表１には１反復配列要素も示
されている。−４４０位から一２００位までの領域内に
は、ａ繰り返し配列（ＴＣＣＴＴＴＣＧＡＣ）が２コピ
ー、ｂ繰り返し配列（ＣＡＣＧＧＡＴ）が２コピー。

そしてＣ繰り返し配列（ＴＴＧＡＡＡＡ）が３コピー存
在する。この領域内には、ｄ繰り返し配列（ＣＴＴＴＡ
Ｇ（：）のあるコピーが存在し、　−２００位からら一
１１２位の間の領域には、もう一つのコピーが見られる
。

（発明の要約） 植物における遺伝子の発現を活性化または増大させるＤ
ＮＡ配列要素が同定され、特徴付けられている。特に、
　Ｔ−ＤＮＡ　７８０遺伝子の上流領域から単離された
ＤＮＡ部分は９組換えＤＮ八を有する植物組織における
植物発現遺伝子の転写レベルを活性化または、増大させ
得る。一般に、■遺伝子転写活性化要素は、植物におけ
る遺伝子の発現レベルを増大させるのに有用である。特
に、このような活性化要素は、該活性化要素の調節制御
下に配置された植物発現遺伝子を含む植物発現複合体の
構築に有用である。このような発現複合体は、挿入され
た遺伝子が発現される植物ｍ線中に導入可能である。

（以下余白） ４、”Ｏ，ｉｊ創位調所 第１図は、シャトル−、フタ−ｐＷ９−ＴＤ　ニー３７
に。

７８０遺伝子の上流領域にあるＤＮＡ断片−４７６／−
１１２を挿入することによるプラスミドｐＷ９−ＴＯ：
　−４７６／１１２−５’への構築を示す図である。第
１図には、ｐＴｉ１５９５５のＴ−ライトに■叶遺転子
上流領域が位置していることを示す模式図が含まれてい
る。７８Ｌ遺伝子上流領域の一４７６／−１１２および
一４７６／−２００Ｂａｍ旧／５ａｉｌ断片は、刀辺−
遺伝子転写活性化要素を含んでいる。Ｂａｇ旧リンカ−
で適当に修飾された−４７６７−１１２断片は、　Ｗ９
−ＴＤニー３７中の減衰された一３７訓虹試験遺伝子に
対して５°側に挿入される。該断片は、いずれの方向に
も挿入され得るが、一方のみが示されている。該断片は
、　ｐＷ９−Ｔ口：−３７に示されているように、試験
遺伝子に対して３′側の位置にも挿入され得る。両プラ
スミド内の斜線領域は。

クロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣａｌＩｒ）を含む
ｐＡｃＹｃ１８４の１ｊＢＩ−Ｂａｎ＋旧断片である。

（Ａ、ＣｂａｎｇおよびＳ、　Ｃｈｏｅｎ（１９７８）
　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏ＋、　　１３４：１１４１１
１５６）。黒く塗った領域は、邦彰参照遺伝子および試
験遺伝子である。点彩領域は、Ｔ−レフト（Ｔ−１ｅｆ
ｔまたはＴ−Ｌ）のＢａｍ−旧断片１７ａのη庚１−Ｂ
ａｇ旧副断片であり、それはＴｉプラスミドとの相同的
な組み換えのために用いられる。黒塗りの三角形は。

工参照遺伝子リーダー中のＴａｑ　Ｉ欠失を示している
。試験遺伝子の直ぐ上流にある２５ｂｐのＳａｌｌＢａ
ｍｌｌｌ断片は、　ｐＵｃ−１９のポリリンカーの一部
である。第１図では、八＝Ａｃｃｌ；Ｂ＝ＢａｓＨＩ；
Ｈ−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ；Ｓ＝影けＩ、および５ｐ＝Ｊ小
Ｉである。

向との関数として示すものである。垂直方向の黒の矢印
は１表示されているように、　−４７６／−１１２ある
いは一４７６／−２００７８０遺伝子断片のいずれかを
表している。白ぬきおよび黒塗りの四角形は、　−１１
２位から一３８位まで、および−３７位から＋１位まで
に広がっている工プロモータの領域を示している。

点彩領域は転写された７８０遺伝子と、および＋１位か
ら約＋９２６位までの３゛側非翻訳配列（ポリ（Ａ）付
加部位の下流の約１５０　ｂｐの配列を含む）を表して
いる。斜線を引いた四角形は、　１０ｂｐの５ａｌｌ　
リンカ−を付加されたΦＸ１７４　Ｈａｅｒ［ｌ６０３
　ｂｐ断片を示しており、それは活性化要素とＴＡＴＡ
領域との間隔を変化させるために用いられる。ＲＴＬは
、到彰遺伝子の生型（匈Ｔ）活性に対する百分率（％）
として、それぞれの構造的な組み合わせに対して与えら
れる。

以上 図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　１ ｐＴＩ５９５５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｔ−ＤＮＡ￥７８０￥遺伝子転写活性化要素と、植
   物発現遺伝子とを有する組換えＤＮＡ分子であって、該
   植物発現遺伝子が、該転写活性化要素に対し、その調節
   制御下に配置されている、組換えＤＮＡ分子。 ２、前記Ｔ−ＤＮＡ￥７８０￥遺伝子転写活性化要素が
   、表１の約−４２７位から約−２７１位までのヌクレオ
   チドからなるヌクレオチド配列、あるいは該ヌクレオチ
   ド配列に対して少なくとも約９０％の相同性を有する機
   能的に等価なヌクレオチド配列を包含する、特許請求の
   範囲第１項に記載の組換えＤＮＡ分子。 ３、前記Ｔ−ＤＮＡ￥７８０￥遺伝子転写活性化要素が
   、表１の約−４７６位から約−２２９位までのヌクレオ
   チドからなるヌクレオチド配列、あるいは該ヌクレオチ
   ド配列に対して少なくとも約９０％の相同性を有する機
   能的に等価なヌクレオチド配列を包含する、特許請求の
   範囲に記載の組換えＤＮＡ分子。 ４、前記Ｔ−ＤＮＡ￥７８０￥遺伝転写活性化要素が、
   表１の約−４７６位から約−２００位までのヌクレオチ
   ドからなるヌクレオチド配列、あるいは該ヌクレオチド
   配列に対して少なくとも約９０％の相同性を有する機能
   的に等価なヌクレオチド配列を包含する、特許請求の範
   囲第１項に記載の組換ＤＮＡ分子。 ５、前記Ｔ−￥ＤＮＡ￥遺伝子転写活性化要素が、表１
   の約−４２７位から約−２２９位までのヌクレオチドか
   らなるヌクレオチド配列、あるいは該ヌクレオチド配列
   に対して少なくとも約９０％の相同性を有する機能的に
   等価なヌクレオチド配列を包含する特許請求の範囲第１
   項に記載の組換えＤＮＡ分子。 ６、前記Ｔ−ＤＮＡ￥７８０￥遺伝子転写活性化要素が
   、表１の約−４７６位から約−１１２位までのヌクレオ
   チドからなるヌクレオチド配列、あるいは該ヌクレオチ
   ド配列に対して少なくとも約９０％の相同性を有する機
   能的に等価なヌクレオチド配列を包含する、特許請求の
   範囲第１項に記載の組換えＤＮＡ分子。 ７、前記転写活性化要素が、前記植物発現遺伝子の転写
   開始部位の５′側約２０００ｂｐ上流までに位置してお
   り、その配向が野生型であるか、あるいは逆方向である
   、特許請求の範囲第１項に記載の組換えＤＮＡ分子。 ８、前記転写活性化要素が前記植物発現遺伝子の転写開
   始部位の５′側であって、かつ該植物発現遺伝子の「Ｔ
   ＡＴＡ」領域の５′未端の直ぐ５′側に位置しており、
   その配向が野生型であるか、あるいは逆方向である、特
   許請求の範囲第１項に記載の組換えＤＮＡ分子。 ９、植物組織における植物発現遺伝子の発現を活性化す
   る方法であって、 ａ）該植物発現遺伝子を有する組換えＤＮＡ分子にＴ−
   ＤＮＡ￥７８０￥遺伝子転写活性化要素を、該転写活性
   化要素が該植物発現遺伝子の発現を活性化するように挿
   入すること；および ｂ）該転写活性化要素を含む該組換えＤＮＡ分子を、植
   物組織に、該植物発現遺伝子が該植物組織において該転
   写活性化要素の制御下で発現するように導入すること、 を包含する、方法。 １０、前記転写活性化要素が、前記組換ＤＮＡ分子中に
   、前記植物発現遺伝子の転写開始部位の５′側約２００
   ０ｂｐ上流までに挿入されており、その配向が野生型で
   あるが、あるいは逆方向である、特許請求の範囲第９項
   に記載の方法。 １１、前記転写活性化要素が、前記植物発現遺伝子の転
   写開始部位の５′側であって、かつ該植物発現遺伝子の
   「ＴＡＴＡ」領域の５′末端の直ぐ５′側に位置してお
   り、その配向が野生型であるか、あるいは逆方向である
   、特許請求の範囲第９項に記載の方法。 １２、特許請求の範囲第２項、第３項、第４項、第５項
   、または第６項に記載のＴ−ＤＮＡ￥７８０￥遺伝子転
   写活性化要素を挿入する工程を包含する、特許請求の範
   囲第９項に記載の方法。