JPH025883A - 植物の普遍的ストレス誘導性調節要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明の分野は、一般に植物の分子生物学の分野であり
、特に組換えＤＮＡ技術による植物遺伝子工学に関する
。本発明は９種々の環境ストレスに応答して誘発合成反
応を示す植物遺伝子の５゛側ＤＮＡ配列の単離、特徴づ
けおよび用途に関する。これらの配列は、植物の普遍的
ストレス誘発性調節要素（ｐｌａｎｔ　ｕｎｉｖｅｒｓ
ａｌ　５ｔｒｅｓｓ−ｔｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｒｅｇｕｌ
ａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔ　）を構成し、この要素は次
のような環境ストレスに曝された後、所望の構造遺伝子
を有する植物内での発現を誘発し得る。この環境ストレ
スには、高温（熱ショック）、水ストレス、塩ストレス
、重金属イオン、部分的な嫌気生活、ある種の呼吸器系
阻害物質、アミノ酸類似体、非生理学的に高濃度の植物
成長調節物質（例えば、アブシジン酸、もしくは２．４
−ジフェノキシ酢酸などが高濃度に存在すること）、お
よび創傷が含まれるが、これらに限定されない。

（従来の技術） 真核遺伝子内には、遺伝子発現を制御するＤＮＡ配列要
素が存在することが分かってきている。以下に、　ＲＮ
Ａポリメラーゼ■によって転写される遺伝子について考
察する。ｍＲＮＡ合成の開始を誘発する配列要素が知ら
れており、この要素は、環境の刺激に応答して転写を制
御し、さらに転写のレベルを調節する。

プロモーターはＤＮＡ配列の一部であり、遺伝子の最初
の部分にあり、　ＲＮＡポリメラーゼに転写を開始させ
てタンパク合成を進行させるシグナルを包含する。真核
プロモーターは、複雑であり、約−３０位付近のＴＡＴ
Ａボックス共通配列を有し、しばしば転写開始部位に対
して５゛側の約−１７ｂｐ位に。

ＣＡＡＴボックス共通配列をも有し、後者は＋１と定義
されティる〔アール・ブレスナツバ（Ｒ，ａｒｅａ　ｔ
ｈｎａｃｈ　）およびビー・チャンポン（Ｐ、　Ｃｈａ
ｍｂｏｎ）　、　１９８１年。

Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　５０巻、３
４９頁；ジエイ・メシングら（Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇら
）　、　１９８３年、　ＧｅｎｅｔｉｃＥｎ　１ｎｅｅ
ｒｉｎ　　ｏｆ　　Ｐｌａｎｔｓ、ティ”コスゲ（Ｔ、
Ｋｏｓｕｇｅ）　。

シー・メレディス（Ｃ，Ｍｅｒｅｄｉｔｈ　）およびエ
イ・ホランダ−（Ａ、　Ｈｏ１ｌａｅｎｄｅｒ　）　曙
、　２１１頁〕。植物では、このＣＡＡＴボックスが、
メシングら（１９８３年）がＡＧＧＡボックスと命名し
た共通配列によって置換され、この配列はキャップ部位
から同様の距離に位置している。遺伝子の５゛側非転写
領域の他の配列で、下流の遺伝子の発現を調節する配列
が知られている。環境条件（例えば、照明、栄養源利用
率、高温、嫌気生活、または重金属の存在）の応答に関
係する配列がある。発生中、または組織特異的な様式に
おいて、遺伝子発現を制御するシグナルもある。プロモ
ーターは、対応する遺伝子のコード領域の開始点の５゛
側、すなわち上流に通常位置し、そのプロモーター配列
を有するＤＮＡ領域部分、および転写の調節もしくは絶
対レベルに影響を及ぼす補助的な配列は、　ｉｏｏ　ｂ
ｐ未満もしくは１　ｋｂｐはどで構成されている。

ジー・コーリー（Ｇ、　Ｋｈｏｕｒｙ　）およびビー・
ブレス（Ｐ、　Ｇｒｕｓｓ）　　（Ｃｅｌｌ、　３３巻
、３１３頁、　１９８３年）によって定義されるように
、エンハンサ−は、１組の真核プロモーター関連要素の
１つであって。

この要素は、近傍の遺伝子に対する位置や方向に比較的
影響されずに転写効率を増大させる。原形のエンハンサ
−は動物ウィルスＳＶ４０に見られる。

一般に、動物のエンハンサ−１または動物ウィルスのエ
ンハンサ−は、５′側の１　ｋｂｐ程度の距離にわたっ
て、いずれかの方向に機能することが可能であり、遺伝
子の５゛側もしくは３”側のいずれかに作用することが
できる。同定配列のモチーフは一般に繰り返される。Ｓ
Ｖ４０エンハンサ−のコア共通配列に相同性を有する配
列が植物遺伝子内に同定されていたが、植物中における
これら配列の機能の重要性は、まだ決定されていない。

構成的、かつ誘発性を有するある種の植物遺伝子の５゛
側にエンハンサ−様要素があるという報告もある。この
ような報告の１つには、ジエイ・オーデルら（Ｊ、　０
ｄｅｌｌら）　、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１３巻、８１０
頁。

１９８５年があるが、カリフラワー・モザイクウィルス
（ＣａＭＶ）の３５３遺伝子の５゛側の非転写領域の約
１００　ｂｐの伸張は、レポーター遺伝子の発現を増大
するのに必要であるとしている。関連する報告では、上
流領域部分のタンデム重複によって、レポーター遺伝子
の活性がさらに増大すると述べている。〔アール・カイ
ら（Ｒ，Ｋａｙ　ｅｔ　ａｔ、）　、　５ｃｉｅｎｃｅ
。

２３６巻、　１２９９頁、　１９８７年；デイ・オーら
（Ｄ、　Ｏｗｅｔ　ａｌ、）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　、　８４巻。

４８７０頁、　１９８７年〕。植物内で機能する。２つ
の独特な転写活性化要素は、アグロバクテリウム・ツメ
ファシェンス（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｎ　　ｔｕ＋
５ｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｔ−ＤＮＡの工遺伝子、およびオ
クトピン・シンターゼ遺伝子から誘発されている〔ダブ
リュ・ブルース（Ｗ、　Ｂｒｕｃｅ）およびダブリュ・
ガーリー（匈。

Ｇｕｒｌｅｙ）　、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ
、、　　７巻、５９頁、　１９８７年；ダブリュ・ブル
ースおよびダプリュ・ガーリ＋、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　１９８７年に
提出；ジエイ・エリスら（Ｊ、　Ｅｌｌｉｓ　ｅｔ　ａ
ｌ）　、　ＥＭＢＯＪ、。

６巻、１１頁、　１９８７年〕。調節されたエンハンサ
−様要素は９組織特異的な発現を仲介し、かつ照明に応
答すると考えられる要素を含んでいる〔エム・ティムコ
ら（Ｍ、　Ｔｉｍｋｏ　ｅｔ　ａｌ、）　、　Ｎａｔｕ
ｒｅ、　３１８巻、５９７頁、　１９８５年；エイチ・
コーレンら（Ｈ，Ｋａｕｔｅｎ　ｅｔ　ａｌ　）　、　
ＨＭＢＯＪ、　、　　５巻、１真、　１９８６年；ジェ
イ・シンプソンら（Ｊ、　Ｓｉｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ
）　、　ＥＭＢＯＪ、　、　　４巻、　２７２３頁、　
１９８５年；ジエイ・シンプソンら、　Ｎａｔｕｒｅ、
　３２３頁、５５１頁；アール・ツルア−ら（Ｒ，Ｆｌ
ｕｈｒ　ｅｔ　ａｌ、）　、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３
２巻。

１１０６頁、　１９８６年〕。

植物は、細菌、酵母、昆虫または哺乳類と同じように温
度の上昇に反応する。正常細胞のタンパ合成が停止する
か、または劇的に低下し、比較的小規模なタンパクの優
先的な転写および翻訳が続いて起こる。高温によって合
成が誘発されるこのようなタンパクは、熱ショックタン
パク（ＨＳＰ　）として知られている。ＨＳＰの大きさ
の分布は、真核細胞と類似しており、各種の類似タンパ
クと。

有意のアミノ酸相同性がある（Ｓ、　Ｌｉｎｑｕｉｓｔ
、　Ａｎｎ。

Ｒｅｖ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋　５５巻、　１１５１
頁、　１９８６年において総括されている）。最も研究
された真核熱ショック系はショウジヨウバエである〔エ
ヌ・アシュバーナー（Ｎ、八５ｈｂｕｒｎｅｒ）および
ジエイ・ボナー（Ｊ、Ｂｏｎｎｅｒ　）　、　Ｃｅ１ｌ
、　１７巻、２４１頁、　１９７９年）。

大豆では、熱ショックによって、特徴的なＨＳＰの合成
が誘発され、２種類に分類できる。低分子量のＨＳＰは
、　１５ｋＤａから２７ＫＤａの分子量である；この低
分子＋１ｓＰは３０〜５０種類存在する。分子量が６８
〜１１０ｋＤａの範囲にある高分子量の大豆ＨＳＰは数
種類存在する〔ジエイ・ケイら（Ｊ、　Ｋｅｙ　ｅｔ　
ａｌ）　。

Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ、　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、　ａｎｄ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、第２巻、デイ−・
ランダルら（Ｄ、　Ｒａｎｄａｌｌ　ｅｔ　ａｔ、）編
、ミズーリーコロンビア大学、コロンビア、ミズーリ；
ジエイ・ケイら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　、　７９巻、　３５２６頁、　１９８１年〕。

ＨＳＰの正確な機能は分かっていないが、これら遺伝子
の優先的な誘発は、大豆苗木の耐熱性獲得と関連がある
〔シー・ワイ・リンら（Ｃ，Ｙ、　Ｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ
　）　、　ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ、　７４巻、１５
２頁、　１９８４年〕。

他の多くの生物と同様に植物においても、他の環境スト
レス（例えば、浸透圧ストレス、創傷。

重金属へさらすこと、ならびに呼吸阻害物質、アミノ酸
類似体および成長調節の２．４−ジクロロフェノキシ酢
酸（２，４−Ｄ）またはアブシジン酸による処理によっ
て１種々の程度に誘発されるＨＳＰが存在する〔イー・
ツァルネッ力ら（Ｅ、　Ｃｚａｒｎｅｃｋａｅｔ　ａｌ
、）　、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、　３巻、
４５頁、　１９８４年ニジエイ・ヘイキラら（Ｊ、　Ｈ
ｅ１ｋｋｉｌａ　ｅｔ　ａｌ、）　、　ＰｌａｎｔＰｈ
ｙｓｏｌ、　７６巻、２７０頁、　１９８４年）。これ
らの環境ストレスに応答してＨＳＰを誘発させる共通の
シグナルは、異常なもしくは損傷を受けた細胞タンパク
であると仮定されてきた〔ジェイ・アナンサンら（Ｊ、
八ｎａｎｔｈａｎ　ｅｔ　ａｌ、）　、　５ｃｉｅｎｃ
ｅ　、　２３２巻。

５２２頁、　１９８６年）。各大豆熱ショック遺伝子の
発現は、環境ストレスによってのみ誘発されるわけでは
ない。それ故、熱ショック遺伝子の発現を誘発するスト
レス全てに対する応答を制御する単一の誘導機構はない
（イー・ツァルネッカら、　１９８４年）。さらに、い
くつかの熱ショックタンパク質は、検出可能なレベルの
構成的発現を示し、他の系（例えば、ショウジヨウバエ
）では、いくつかの熱ショック遺伝子は９発育中の特定
時期に活性化される。植物の熱ショック遺伝子の調節領
域が。

誘導性エンハンサ−の特性を持っているか否かはまだ知
られていない。熱ショックｍＲＮＡの非翻訳のリーダー
領域も、熱ショック遺伝子産物の合成の相対的効率に影
響する調節情報を持っている〔エム・スコツ）　（Ｍ、
　５ｃｏｔｔ）およびエム・パーデュ（Ｍ、　Ｐａｒｄ
ｕｅ　）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、　ＵＳＡ。

７８巻、　３３５３頁、　１９８１年；アール・ストル
ティら（Ｒ，５ｔｏｒｔｉ　ｅｔ　ａｌ、）　、　Ｃｅ
１ｌ、　２２巻、８２５頁　１９８゜年〕。

他の環境ストレスは、他の遺伝子の組を誘導する。例え
ば、植物の嫌気生活は、いくつかの主要なタンパクの合
成を誘発する〔アール・オキモトら（Ｒ，Ｏｋｉｍｏｔ
ｏ　ａｔ　ａｌ、　）　、　Ｐｌａｎｔａ、　１５０巻
、８９頁、　１９８０年〕。いくつかのこれらタンパク
の機能が確立されている。すなわち、これらの酵素は。

酸素が存在しないことに順応するのに必要なエネルギー
代謝の変化に関係しているのである〔エム・フリーリン
グら（Ｍ、　Ｆｒｅｅｌｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ　）　、　
Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　、　１９巻、２９７頁〕。ア
ンチリナム・マジュス（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ　　シ
山胆）を紫外線に曝らすと、カルコンシンターゼの合成
が誘発される。

この酵素は保護色素の合成において重要な工程を触媒す
る〔エイチ・コーレンら（Ｈ，Ｘｑｕｌｅｎ　ｅｔａｌ
、）　、　ＥＭＢＯ，Ｊ、、　　５巻、■頁〕。真核細
胞中のメタロチオネインの誘発は、環境中で重金属イオ
ンに曝らすことに対する通常の応答である。メタロチオ
ネインは、システィンを多く含有する金属結合タンパク
であり、それ故２重金属中毒に対しである種の保護を行
うと考えられている〔デイ・ハマー（Ｄ、　Ｈａｍｅｒ
）　、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　５
５巻。

９１３頁、　１９８６年において総説されている〕。

植物遺伝子の５”側頭域に位置する配列がいくつかある
が、これらの配列は植物の調節要素として提示されてき
・た。すなわち、これらの要素は１組織の特異性を制御
し、光や嫌気生活のような環境条件に応答すると考えら
れている。例えば、リブロースビスリン酸カルボキシラ
ーゼのサブユニットとクロロフィル結合タンパク遺伝子
との５゛側非転写領域由来のＤＮＡ断片は、これらの遺
伝子に光調節を付与する配列情報を有し、エンハンサ−
様要素のいくつかの性質を示すと報告されている〔アー
ル・フルールら（Ｒ，Ｆｌｕｈｒ　ｅｔ　ａｌ、　）　
、　５ｃｉｅｎｃｅ。

２３２巻、　１１０６頁、　１９８６年；ジエイ・シン
プソンら（Ｊ、　Ｓｉｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　）　
、　ＥＭＢＯＪ、　、　４巻、　２７２３頁、　１９８
５年；ジェイ・シンプソンら、　Ｎａ　ｔｕｒｅ、　３
２３巻、５５１頁、　１９８６年；エム・ティムコら、
　Ｎａｔｕｒｅ。

３１８巻、５７９頁、　１９８５年〕。植物ＤＮＡの調
節配列が、異種の植物発現遺伝子上にあるトウモロコシ
のアルコール脱水素酵素遺伝子に嫌気的な誘導性を与え
ることが確認された〔ジエイ・ウォーカーら（Ｊ、　Ｗ
ａｌｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ｔｌｓＡ　、　８４巻、　６６２４〜６６２８頁、　１
９８７年〕。

調節金属応答要素（ＭＲＥ　）は、メタロチオネイン（
すなわち１重金属イオンと強固に結合し９重金属イオン
に曝されるとその合成が誘発されるタンパクをコードす
る哺乳類の遺伝子の５゛側領域内で同定された。異種遺
伝子の５′側に位置するＭＲＥの多重コピーが、これら
の遺伝子に金属調節性を与える。さらに、　ＭＲＥは、
異種遺伝子の５″側または３′側のいずれかに位置して
いる場合に、転写を誘発するエンハンサ−として作用す
る。哺乳類のＭＲＥの共通配列は、　５’　−ＣＰｙＴ
ＴＴＧＣＰｕＰｙＰｔＣＧ−３’　テあり、　ＰｕはＡ
もしくはＧであり、ＰｙはＣもしくはＴである〔ジー・
スチュアートら（Ｇ、　５ｔｕａｒｔ　ｅｔａｌ、）　
、　　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ｌ
ｌ５Ａ　、　８１巻、７３１８頁、　１９８４年〕。植
物内で重金属イオンに応答して調節する特異的ＤＮＡ配
列に関する報告はないようである。

高温度のストレスに応答して熱ショック遺伝子を直接誘
導する。熱ショック要素（）ＩＳＥ　）と呼ばれる配列
モチーフは、細歯、酵母、昆虫、ヒトおよび植物につい
て研究されてきた。ショウジヨウバエでは、このモチー
フに対する共通配列は、５゛−ＣＴｘＧＡＡｘｘＴＴＣ
ｘＡＧ−’３’であり、ＸはＡ、Ｔ、ＣもしくはＧであ
る〔エイチ・ベルハム（Ｉｌ、　Ｐｅｌｈａｍ）　。

Ｃｅ１ｌ、　３０巻、５１７頁、　１９８２年〕。ショ
ウジヨウバエのＨＳＥは、熱ストレスが印加されている
間に。

下流の熱ショック遺伝子の発現を活性化するのに必要な
タンパク因子と結合する〔シー・バーカー（Ｃ，Ｐａｒ
ｋｅｒ　）およびジエイ・トボル（Ｊ、　Ｔｏｐｏｌ）
　。

Ｃｅ１ｌ、　３７巻、２７３真、　１９８４年〕。一般
に、　ＨＳＥが機能するには、共通配列に対して１０個
のうち８個が一致することが必要であるが９反復してれ
ばさらに一致していなくても活性であることが分かった
〔ニー・アイムら（Ａ、八ｙｍｅ　ｅｔ　ａｌ、）　、
　Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　、　１８２巻、４６９頁、　１９８５年；
エム・ビエンッ（Ｍ　Ｂｉｅｎｚ　）　、　Ｔｒｅｎｄ
ｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｃｉ、、　１０巻。

１５７頁、　１９８５年；エイチ・ベルｉｚＬ、　ＥＭ
ＢＯＪ、　。

１巻１４７３頁、　１９８２年〕。ショウジヨウバエの
ＩｆＳＢもエンハンサ−要素の性質をいくつか示す（エ
ム・ビエンツおよびエイチ・ベルハム、　Ｃｅ１ｌ、　
４５４Ｊ。

７５３頁、　１９８６年）。

異種系内の熱ショク遺伝子の発現については。

いくつもの報告がある。エイチ・ベルハム（Ｈ。

Ｐｅｌｈａｍ）ら（１９８２年）は、　ＳＶ４０形質転
換す７ＬｚＣＯ５細胞内のショウジヨウバエｈｍυが熱
によって誘導され、転写されると記載した。同様な観察
をエム・ミロールトら（Ｍ、Ｍｉｒａｕｌｔ　ｅｔ　ａ
ｌ、　ＥＭＢＯＪ、　１巻。

１２７９真、　１９８２年））が行い１．転写が熱ショ
ックまたは亜ヒ酸塩処理によって誘発されたと報告して
いる。ショウジヨウバエの熱ショック遺伝子の熱で調節
される転写は、アフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　
）の卵母細胞についても報告されている〔エイチ・ペル
ハムおよびエム・ビエンツ、　ＥＭＢＯＪ、、１巻、　
１４７３真、　１９８２年；アール・ボールミイ（Ｒ，
Ｖｏｅｌｌｍｙ）およびデイ・ランジー？　−（Ｄ、　
Ｒｕｎｎｇｅｒ）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ、　、　７９巻１７７６頁。

１９８２年〕。線虫のシーノルハブデイテイス・エレガ
ンス（Ｃａｅｎｏｒｒｈａｂｄｉｔｉｓ　　ｍｌ」ｌｕ
）の異なって転写される勧立匝遺伝子対が、マウスの繊
維芽細胞系に形質転換されたが、転写は、熱ショックま
たは亜ヒ酸塩処理による刺激に依存していた（アール・
ケイら、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　　６
巻、　３１３４頁。

１９８６年）。そΦ研究結果は、　ＨＳＥの数がプロモ
ーター強度の決定要素であるということを示唆している
。相違するＴＡＴＡ要素間のあるＨＳＥは、野生型レベ
ルの約１０％で転写を調節したが、該ＴＡＴＡ間の４つ
の重複Ｈ５Ｈは、野生型レベルより高い転写レベルを与
えた。しかし、　ＨＳＥの配列と間隔がプロモーター活
性にどのように影響するのかまだ明確に分かっていない
。

熱ショック遺伝子の異種発現も、植物について報告され
ている。１７．３ｋＤａＯ熱ショックタンパクをコード
すると考えられる大豆遺伝子（ｈｓ６８７１）の発現が
、　Ｔ−ＤＮＡ介在性形質転換後のヒマワリ胚軸腫瘍組
織で研究された〔エフ・スコツフル（Ｆ。

５ｃｈｏｆｆｌ）およびジー・バウマン（Ｇ、　Ｂａｕ
ｍａｎｎ）　。

ＥＭＢＯＪ、　　４巻、　１１１９頁、　１９８５年〕
。５゛側の約１ｋｂのＤＮＡ配列は、熱で誘導される遺
伝子の発現を調節するのに十分な情報を有していた。ダ
ブリュ・ガーレイら（Ｗ、　Ｇｕｒｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ
、）も、　Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、　、　　６巻、５５９頁、　１９８６年に報
じているが。

形質転換されたヒマワリ組織内で、大豆の熱ショック遺
伝子が転写を調節のを観察している。転写は、熱ショッ
クのみならず亜ヒ酸塩処理およびカドミウム処理によっ
ても誘発された。デイ・ロチニスターら（Ｄ、　Ｒｏｃ
ｈｅｓｔｅｒ　ｅｔ　ａｔ、　）は、形質転換されたペ
チュニアの葉内でのハイブリッドトウモロコシＩｆ別遺
伝子の発現を研究した（ＥＭＢＯＪ、　。

５巻、４５１頁、　１９８６年）。熱ショックによる発
現の誘導が、異種の植物宿主で保持されたので、その転
写は、　１，１　ｋｂの５°側ＤＮＡ配列内に包含され
る熱ショック応答配列要素によって誘発されると推定さ
れた。

熱ショック遺伝子由来のプロモーターおよび関連のＤＮ
Ａ配列が異種遺伝子の調節された転写を誘導する組み換
え体ＤＮＡ分子が構築された。エム・ビエンッおよびエ
イチ・ベルハムは、アフリカッメガエルｈｓｐ７０　　
（ｈμυｕ勧ｆυ遺伝子由来の上流の配列が、＃乳類細
胞系内のグロビン・レポーター遺伝子の発現を制御する
ことを証明した。ショウジヨウバエの熱シラツクプロモ
ーターが、同様に哺乳類系のレポーター遺伝子の発現を
制御するのに用いられた〔エイ・アイムら１９８５年；
デイ・ボージーら（Ｄ、　Ｐａｕｌｉ　ｅｔ　ａｌ）　
、　ＥＭＢＯＪ、　　５巻。

７５５頁、　１９８６年〕。エイ・スベナら（Ａ、　５
ｐｅｎａ　ｅｔａｌ）は、シラウジヨウバエ熱ショック
調節配列が植物組繊中で正確に機能するということを報
告した（ＥＭＢＯＪ、　、　　４巻、　２７３９頁、　
１９８５年）。植物内の熱ショック遺伝子の調節作用は
、他の生物内でのこれら遺伝子の調節作用と類似してい
るようである。デイ・ロチニスター（Ｄ、Ｒｏｃｈｅｓ
ｔｅｒ）ら（１９８６）は、転写領域の開始部位の５゛
側のｌｋｂの部分が、熱ショックに依存性の転写を正し
く制御するのに充分なものであると推定した（１９８６
年）。

エイ・スペナ（Ａ、５ｐｅｎａ）らの１９８５年の報告
では。

２５８ｂｐのショウジヨウバエのプロモーター配列が。

形質転換されたタバコ組織内では転写を調節するのに充
分であったが、その配列より長いかまたは短いプロモー
ターフラグメントの影響を決定する試みは全く報告され
ていない。ダブリュ・ガーリイ（Ｗ、　Ｇｕｒｌｅｙ）
ら（１９８６年）は、大豆のＧｍｈｓ　１７．５−Ｅ遺
伝子の５゛末端にある。ショウジヨウバエｌｌ５Ｅ共通
配列と部分的に相同性を有する配列要素を報告した。形
質転換されたひまわりの腫瘍組織における発現の研究に
より、−９５位とキャップ部位との間のＤＮＡ配列の情
報は熱誘発性転写を命令するのに充分であるが、−９５
位と一１１７５位間の配列は転写の誘発レベルと基底レ
ベルをともに著しく増大させるということが明らかとな
った。

（以下余白） （発明の要旨） 本発明の研究は、植物内で機能する１つのＤＮＡ配列で
ある。普遍的ストレス誘導性調節要素の単離と特徴づけ
とについて述べる。この要素は９次のものを包含する広
範囲の環境ストレスの適用に応答して、下流の構造遺伝
子の発現を調節する：環境ストレスとしては、熱ショッ
ク、重金属イオンへ曝らすこと２部分的な嫌気生活、浸
透圧ストレス、塩ストレス、およびある種の呼吸阻害物
質。

酸類または植物成長調節物による処理が包含される。こ
の調節要素は、他に知られている植物の熱ショック調節
配列が示すよりも、より多くの環境ストレスに対する誘
導的応答を示す点が特徴である。

このような植物調節要素の特定例は、大豆のむ石江皿」
遺伝子の５゛側上流領域に見られ、その配列を第２図に
示す。この遺伝子の５゛側領域のヌクレオチド配列の分
析によれば、ストレスによって誘導された発現を正しく
調節し、構造遺伝子の転写と翻訳とを開始するのに必要
な配列情報が主な転写の開始部位から数えて５゛側に約
−７２０位まで延びる領域内に入っていることを示して
いる。下流の遺伝子の発現レベルに寄与する他の配列は
、　−７２０から約−１１９０の上流領域と、この遺伝
子の５゛側非翻訳部分を含む領域（約＋１から約＋７２
まで）とに見られる。釦■と並」遺伝子の普遍的ストレ
ス誘導性調節要素には、３つの重複プロモーター領域が
含まれており、　ＴＡＴＡボックス相同性が存在するこ
とによって示されている。この遺伝子の非転写領域は、
コンセンサス熱ショック要素に対し。

各々５０％もしくはそれ以上の相同性を有する配列をも
っている。これらの植物熱ショック要素は。

約−３５から約−７２０まで延びる領域内に存在する。

公知の金属調節応答要素に相同を有する配列もこのＤＮ
Ａ領域に見られる。このような配列は、調節因子がＤＮ
Ａに結合する部位を与えることができる。

上記の植物熱ショック配列の１つあるいはそれ以上が、
ストレス反応で機能すると考えられる。この遺伝子の５
′側非翻訳領域のコンセンサス熱ショック要素に約７０
％の相同性を有する別の配列が。

約−４５位にある。翻訳開始コドン（＾ＴＧ）まで延び
る５′側非翻訳領域内の配列は、遺伝子発現の効率に寄
与し得る。

本発明の第１の目的は、当業者が１種々のストレス条件
に応答して植物内の構造遺伝子が発現するのを選択的に
促進させることができるようにすることである。この目
的は、植物の普遍的ストレス誘導性調節要素と呼ばれる
ＤＮＡ配列を利用することによって達成される。この配
列は、非常に広範囲の環境ストレスの条件によって誘導
される。

普遍的ストレス誘導性調節要素には、プロモーター配列
と、プロモーター関連調節配列とが含まれ。

遺伝子発現の調節に・作用をする。普遍的ストレス誘導
性調節要素を構成するＤＮＡ配列には、コンセンサス熱
ショック要素に５０％もしくはそれを越える相同性を有
する１つあるいはそれ以上の配列モチーフが含まれてい
る。このような配列モチーフは植物の熱シボツク要素に
相当する。

特別な実施態様として、動態り筐」遺伝子の。

普遍的ストレス誘導性調節要素が提供される。

動画り並」遺伝子の約−７２０から−２１まで延びるＤ
ＮＡ配列（第２図に示す）は、植物の普遍的ストレス誘
導性調節要素として作用する。−７２０から〜２１まで
のこのＤＮＡ配列には、３つの重複プロモーターが含ま
れているが、このことは、この遺伝子の非転写領域に、
　ＴＡＴＡボックス相同性が存在することと、植物熱シ
ョック要素のすべてが見出されることによって明らかで
ある。植物の普遍的ストレス誘導性調節要素として機能
する釦画り刈」遺伝子のＤＮＡフラグメントは、この遺
伝子の、約−７２０から約＋１（主要な転写開始部位）
まで延びるフラグメント、約−７２０から約＋７２（翻
訳開始部位）までのフラグメント約−１１９０から約−
２１までのフラグメント、約−１１９０から約＋１まで
のフラグメント、および約−１１９０がら約＋７２まで
のフラグメントを含んでいる。−１１９０がら＋７２ま
でのフラグメントを含んでいる。−１１９０から＋７２
まで延びる配列を使用することが好ましい。その理由は
、有効なストレスで誘導される発現に寄与し得るすべて
の補助的な配列がそこに含まれてぃるからである。釦■
Ｌ皿」フラグメントに少なくとも約９０％の相同性を有
し、普遍的ストレス誘導性調節要素として機能するＤＮ
Ａフラグメントは。

機能上は動画り邪」フラグメントと同等とみなされる。

本発明は、植物の普遍的ストレス誘導性調節要素と、植
物発現構造遺伝子とを有する組換えＤＮＡ分子を提供す
るものであり、該構造遺伝子が、調節要素の３°側で調
節要素の調節制御下に位置するので、ストレス条件が印
加されることにより、構造遺伝子の発現レベルが増大す
る。具体的に述べれば、蝕屓り胆」遺伝子の、普遍的ス
トレス誘導性調節要素を有す４　ＤＮＡ分子が提供され
る。本発明のＤＮＡ分子は、植物の熱ショック遺伝子の
構造遺伝子ではない構造遺伝子を有するのが好ましい。

本発明のＤＮＡ分子は、広範囲の環境ストレスの印加に
応答して、植物細胞中の所望の植物発現構造遺伝子の高
レベルの発現を選択的に誘導する方法に有用である。本
発明の方法は、植物の普遍的ストレス誘導性調節要素と
、このストレス誘導性調節要素の調節制御下に位置する
所望の植物発現構造遺伝子とを有する組換えＤＮＡ分子
を植物細胞に導入することを包含する方法である。形質
転換された植物細胞に、続いてストレス条件を印加する
と、所望の構造遺伝子の発現がストレスにより誘導され
る。本発明の方法は、双子葉植物と単子葉植物との両方
において遺伝子を選択的に発現するのに、一般に利用す
ることができるので、植物内で発現可能ないずれの構造
遺伝子の発現にも一般に利用できる。この方法は、植物
の熱ショック構造遺伝子ではない構造遺伝子を発現させ
るのに特に有用である。

ここに記載のＤＮＡ分子は、植物組織に導入することが
可能であり、導入の結果、ストレス誘導性調節要素／構
造遺伝子の組合せの発現を、植物組織へのストレス条件
の印加により２選択的に増大させることができるＤＮＡ
分子である。外因性もしくは外来のＤＮＡによる植物細
胞および植物組織の形質転換は、当該技術分野で公知の
いずれの方法でも達成することができる。具体例を挙げ
れば。

これはＴ−ＤＮＡが介在する形質転換によって達成でき
た。

本発明の他の目的は、ここに記載され、かつここに記載
の方法で調節された組換えＤＮＡ分子およびストレス誘
導性キメラ遺伝子を有する植物、植物細胞および植物組
織である。

（以下余白） （発明の構成） 本願における用語の定義を以下に行なうが、明細書と請
求の範囲で用語を用いる際の目的と範囲に対するあいま
いな表現を除くことを目的とする。

ここに記載するＧｍｈｓｐ２６−Ａ遺伝子は、大豆の熱
ショック遺伝子である。それは第２図に示す遺伝子配列
によって同定され、約２６ｋＯａのタンパクをコードす
ることを示している。にｍｈｓｐ２６−Ａは、検出可能
なレベルの構成的発現を行い、植物組織が次のような種
々の環境ストレス条件に曝されると、より高い発現レベ
ルまで誘導される。環境ストレスとしては、高温（熱シ
ョック）、浸透圧ストレス、塩ストレス、重金属イオン
、部分的な嫌気生活、ある種の呼吸阻害物質、アミノ酸
類似物、アブシジン酸もしくは２．４−ジフェノキシ酢
酸のような植物成長調節物質が非生理学的に高濃度存在
すること、および創傷が含まれるが、これらに限定され
ない。

この遺伝子は、このような種々の環境の刺激に応答して
誘導されることによって、植物の他の公知の熱ショック
遺伝子とは区別される。

「植物の普遍的ストレス誘導性調節要素」という用語は
、ここでは、機能的ＤＮＡ配列を意味し、植物発現構造
遺伝子の上流に位置すると、その構造遺伝子のストレス
誘導性発現を命令することができる。植物の普遍的スト
レス誘導性調節要素の調節制御下にあって構造遺伝子を
誘導する環境ストレスとしては、高温（熱ショック）、
浸透圧ストレス、塩ストレス、重金属イオン、部分的な
嫌気生活、ある種の呼吸阻害物、アミノ酸類似物、アブ
シジン酸もしくは２．４−ジフェノキシ酢酸のような植
物成長調節物質が非生理学的に高濃度存在すること、お
よび創傷がふくまれるが、これらに限定されない。スト
レス誘導性調節要素によって遺伝子発現を誘導する広範
囲の環境ストレスによって、この調節要素は、公知の植
物熱ショック遺伝子に関連する他の調節要素と区別され
る。植物の普遍的ストレス誘導調節要素は、転写開始部
位に関連するプロモーター機能と、ストレスに対する誘
導応答に関連する調節機能とを持っている。

この調節要素の普遍的ストレスに対する応答は、長さが
約２０個までのヌクレオチドの大きさの、複数の、不連
続の比較的短い調節配列が存在していることに関連があ
る。これらの不連続の調節配列は、例えば、調節タンパ
クの結合部位として作用することにより、ストレスの印
加に応答して遺伝子発現を誘導する機能をもっている。

このような調節配列は、単一ストレス刺激または多重ス
トレス刺激のいずれにも応答することができる。単一の
個別の調節配列が誘導応答に必要な場合もあれば、２個
または以上のこれらの配列の協働作用が誘導応答に必要
な場合もある。植物熱ショック要素の相同物は、植物の
普遍的ストレス誘導性調節要素がストレス誘導を調節す
る際に機能する。本発明の、植物の普遍的なストレス誘
導性調節要素の例として、大豆のＧｍｈｓｐ２６−Ａ遺
伝子のストレス誘導性調節要素が挙げられる。

Ｇｍｈｓｐ２６−Ａ遺伝子の５゛側領域は、第２図に示
すように、約−１１９０のヌクレオチドから約＋７２の
ヌクレオチドまで（すなわち、翻訳開始部位まで）延び
ている。この領域の中には、熱ショックまたは重金属イ
オンのようなストレスに応答して遺伝子発現を誘導する
働きをもつプロモーター関連配列と、転写開始を命令す
るプロモーター配列とが含まれている。約−２１（主要
転写開始のＴＡＴＡボックスが所在する位置）から約−
７２０までの５′側に延びる領域は、下流の遺伝子のス
トレス誘導調節を行なうのに充分なものである。約−１
１９０から−７２０の間の領域と、５°側の非翻訳領域
（約＋１から約＋７２まで）との配列は、発現の効率に
寄与する。Ｇｍｈｓｐ２６−Ａ遺伝子の５°側の領域に
は、第２図に示すように、コンセンサス熱ショック要素
に少なくとも５０％の相同性を有する１０個の配列があ
り、３個のＴＡＴＡ相同配列が約−７２０と約−２１と
のヌクレオチド間に認められる。第１１番目の熱ショッ
ク要素相同配列が、＋４５付近のｍＲＮＡの非翻訳リー
ダー領域、すなわちキャップ部位約と約＋７２位の翻訳
開始部位との間に認められる。１個またはそれ以上のこ
れら熱ショック相同要素は、ストレスの印加に応答して
作用する。３個のサブプロモーターが、Ｇｍｈｓｐ２６
−Ａ遺伝子の５°側領域で同定された。これらのサブプ
ロモーターは、ストレス刺激に対して幾分具なる応答を
示す。Ｇｍｈｓｐ２６−Ａの普遍的ストレス誘導性調節
要素は、ストレス刺激に応答して発現を誘導する機能が
ある熱ショック要素相同物に加えて、不連続の調節配列
をもっている。調節要素配列中のこのような機能的ヌク
レオチドの位置は、遺伝子発現に対する調節領域の変異
誘導体（すなわち、５゛側の欠失変異体、内部欠失変異
体および部位特異的変異体）の機能を通常の方法を用い
て測定することができる（実施例７を参照されたい）。

このような方法は、調節領域の分析にうまく利用されて
いる〔例えば、ブルースおよびガーリイ（Ｂｒｕｃｅ　
ａｎｄ　Ｇｕｒｌｅｙ）の、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　へ１９８８年に提出した
論文、および１９８７年１２月１８日出願の米国特許出
願第１３５．１４７号〕。

「発現」という用語は、タンパクが生産されるように構
造遺伝子が転写・翻訳されることを意味する。遺伝子発
現は、例えば、タンパク産物の直接検出法、タンパクの
電気泳動分析法または免疫学的方法によって評価するこ
とができる。あるいは、発現は、転写によるｍＲＮＡ産
物の検出によって評価することもできる（例えば、ノー
ザン・ハイブリダイゼーション法）。この方法は転写調
節配列の試験には特に適切なものであるが、その理由は
、タンパク分解のような転写後のプロセスの影響が排除
されるからである。

「プロモーター」という用語は、転写の開始を命令する
、構造遺伝子の５゛末端に位置するＤＮＡ配列を意味す
る。プロモーター配列は、下流の構造遺伝子の発現を開
始させるのに必要であるが、必ずしも充分なものではな
い。プロモーター自体は、天然もしくは合成の２種以上
の起源由来のセグメントの複合体である。真核プロモー
ターは、通常、ｍＲＮＡの５“末端（キャップ部位＋１
）に対し約１０〜３０ｂｐ　５　’　側にある、標準形
５’　−ＴＡＴＡＡＴ−３’（ＴＡＴＡボックス）と相
同性を有するＤＮＡ配列要素の存在で認識される。ＴＡ
ＴＡボックスのもう一つのプロモーター成分の配列に対
して約３０ｂｐ　５°側の配列が、いつもではないがし
ばしば見出されるが、これは標準形の５′−ＣＣＡＡＴ
−３°に相同性を有するＤＮＡ配列の存在によって認識
される。ここでは、プロモーターは、転写開始部位の約
１００ｂｐ　５“側に延びていると考えられる。Ｇｍｈ
ｓｐ２６−Ａ遺伝子の場合、３つの重複プロモーターが
存在する。約−１００位よりさらに上流に位置するプロ
モーター関連配列は、調節制御に寄与するか、もしくは
その調節制御を行い、遺伝子発現の相対的なレベルを決
定できる。また、−１００位と翻訳開始部位との間の領
域における転写レベルもしくは翻訳レベルのいずれかに
、遺伝子調節に寄与する配列要素が存在する。

「構造遺伝子」という用言吾は、タンパク、ポリペプチ
ドまたはその一部分をコードするＤＮＡセグメントを有
する遺伝子の一部分を意味し、おそらくリポソーム結合
部位および／または翻訳開始コドンを含むが、転写を開
始させる５°配列の少なくとも一つの要素を欠いている
ことを意味する。

また、この用語は、細胞内に天然に見出されたものであ
るが、人工的に導入された構造遺伝子のコピーを意味す
る。構造遺伝子は、該遺伝子が導入された植物細胞に通
常は見られないタンパクをコードし得るが、この場合、
この構造遺伝子は外来構造遺伝子と呼ばれる。外来構造
遺伝子は、細菌のゲノムもしくはエピソーム真核生物の
核ＤＮＡもしくはプラスミドＤＮＡ、　ｃＤＮＡ　、ウ
ィルスＤＮＡまたは化学的に合成されたＤＮＡから全体
もしくは、部分が誘導される。さらに、構造遺伝子は、
発現産物の生物学的活性もしくは化学構造、発現速度も
しくは発現制御の方法に影響すると考えられるコードセ
グメントもしくは非翻訳領域のいずれかに１つまたはそ
れ以上の改変があってもよい。このような改変には、挿
入、欠失、および１つまたはそれ以上のヌクレオチドの
置換が含まれるが、これらに限定されない。構造遺伝子
は、中断されていないコード配列を構成していてもよく
、または植物内で機能する適切なスプライス・接合部で
結合された１つまたはそれ以上のイントロンを含んでい
てもよい。構造遺伝子は、天然もしくは合成の１種また
はそれ以上の起源由来のセグメントの複合体であっても
よい。その構造遺伝子は、融合タンパクも生成できる。

本願では、構造遺伝子は、翻訳終結コドンから下流のポ
リアデニル化シグナルを含むと考えられる。そのポリア
デニル化シグナルによって、通常、ポリアデニル酸部分
が前駆体ｍＲＮＡの３゛末端に付加される。標準的なポ
リアデニル化シグナルは、転写部分の開裂を起こし、ポ
リアデニル化反応自体を起こさせるものではないといこ
とも知られている〔シー・モンテルら（Ｃ，Ｍｏｎｔｅ
ｌｌ　ｅｔ　ａｌ）、　Ｎａｔｕｒｅ、３０５巻、６０
０頁、１９８３年〕。植物組織に、普遍的ストレス誘導
性プロモーター／構造遺伝子の複合体（発現複合体）を
含む組換えＤＮＡ分子を導入することは、構造遺伝子お
よび調節要素が同じ起源由来のものでない構成と、天然
に存在する遺伝子の付加コピーが、ストレス誘導性Ｇｍ
ｈｓｐ２６−Ａプロモーターの調節制御下で転写される
構成が含まれると考えられる。必要な機能要素を組み合
わせて、植物組織で発現させる方法は、当該技術分野で
は知られている。

「調節制御」という用語は、転写開始部位の上流の配列
要素による遺伝子発現の変調を意味する。

調節によって、転写がスイッチオンもしくはスイッチオ
フされ、または遺伝子発現のレベルが変化する。構造遺
伝子を配列要素の調節制御下に置くということは、業者
には理解されているように、構造遺伝子をこのような配
列要素の充分近くであって、構造遺伝子が、スイッチオ
ンもしくはスイッチオフされ、その発現レベルがかなり
変化するような上記配列要素に対する位置に置くことを
意味する。また、翻訳レベルで遺伝子発現の調節に寄与
するｍＲＮＡの非翻訳リーダー領域内に、配列要素が存
在してもよい。

「化学的に合成されたＪという用語は、ＤＮＡの配列に
ついては、成分ヌクレオチドが、非酵素手段を用いてイ
ンビトロで組立てられたことを意味する。ＤＮＡの手作
業による化学合成法は、充分確立された方法を用いて実
施することができる〔すなわち、エム・カルーザース（
Ｍ、　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）、“ズ７　ン（Ｗｅｉｓｓ
ｍａｎ）編、Ｐｒａｅｇｅｒ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　
にューヨーク）、第１章、１９８３年コし、あるいは自
動合成は、市販されている多数の機械の一つを用いて行
うことができる。

「植物組織」は、植物細胞で構成され、下記のような、
植物の分化した組織および未分化の組織を含んでいる。

これらの組織には、根、若枝、葉、花粉、種子、クラウ
ンゴールのような腫瘍組織、および胚やカルスのような
培養中の植物細胞の種々の形態の集合体が含まれるが、
これらに限定されない。植物組織は、植物状態で（ｉｎ
　ｐｌａｎｔａ）、または器官培養、組織培養もしくは
細胞培養で培養できる。

ここで用いる「相同性Ｊという用語は、ヌクレオチド配
列が同一であることを意味する。ＤＮＡ配列間の相同性
の程度は、ＤＮＡハイブリダイゼーション法で実験的に
決定することができる。その試験法は、例えばビー・ヘ
イムズ（Ｂ、　Ｈａｍｅｓ）およびニス・ヒギンス（Ｓ
、旧ｇｇｉｎｓ）の“Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄイギ
リス、１９８５年に記載されている。

グリシン・マックス（大豆）のＧｍｈｓｐ２６−Ａ遺伝
子は、熱ショック遺伝子であり、約２６ｋＤａのタンパ
クをコードすると考えられるのでこのように命名されて
いる。他の公知の植物熱ショック遺伝子と異なり、Ｇｍ
ｈｓｐ２６−Ａの転写は、熱ショックに加えて広範囲の
環境ストレスによって誘導さる。Ｇｍｈｓｐ２６−Ａ遺
伝子のヌクレオチド配列を第２図に示す。この遺伝子は
、約１１９０ｂｐの５′側配列、７２ｂｐの転写された
リーダー領域、３８８ｂｐのイントロンで中断される２
２５コドンの読取り枠、および２３６ｂｐの３゛側下流
の転写された配列で構成されている。この遺伝子産物の
機能は知られていない。

いくつかの大豆熱ショック遺伝子の誘導パターンが、イ
ー・ツアルネッ力ら（Ｂ、　Ｃｚａｍｅｃｋａ　ｅｔ　
ａｌ、）によって研究された（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂ
ｉｏｌ、、　　３巻、４５頁、１９８４年）。放射標識
したＣＤＮＡａを含有する組換えプラスミドを、ノーイ
ンハイブリダイゼーション法において、ポリアデニル化
された対照と、ストレスＲＮＡと　に対するプローブと
して用いた。

表１に、対照培養条件下および試験するストレス条件下
での発現の比較結果を示す。ｐｃＢ５４　（Ｇｍｈｓｐ
２６−Ａ）の熱ショック遺伝子を、さらに研究するため
に選択した。その理由は、この遺伝子が、広範囲の環境
ストレスに応答してより高レベルの発現が誘導されるか
らである。また、この遺伝子の、検出可能な構成的発現
が存在することが見出された。

（以下余白） ｐｃＢ５４内の大豆挿入ＤＮＡに相同性を有する配列を
、通常のＤＮＡハイブリダイゼーション法を用いて、ゲ
ノム組換えライブラリーから選択した。約６、２ｋｂの
ＢｇｌＩＩフラグメントを選択したが、その後Ｇｍｈｓ
ｐ２６−Ａ遺伝子をもっていることが分かった。

この６．２ｋｂのＢｇｌＩＩフラグメントの制限マツプ
を第１図に示す。Ｇｍｈｓｐ２６−Ａ遺伝子のヌクレオ
チド配列が決定された。−１１９０位のヌクレオチドか
ら＋　１５７３位のヌクレオチドまで延びるその配列を
第２図に示す。ヌクレオチド配列分析によって全遺伝子
がクローン化されたことを確認した。このＤＮＡ配列は
、１１９０ｂｐの５”側配列、１３３５ｂｐの転写され
たＤＮＡおよび転写物の３°末端の下流側にある約２３
０ｂｐを有している。転写された領域の読取り枠は、２
２５コドンにわたって延びてふり、２６．０ｋＤａのタ
ンパクをコードすると考えられる。単一のイントロンが
コドン１０７と１０８との間のタンパクコード領域を分
割している。供与スプライス部位および受容スプライス
部分が、代表的な真核コンセンサスに適合している〔ア
ール・パジェットラ（ＲｏＰａｄｇｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ
）、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、５５巻
、１１１９頁、１９８６年〕。

Ｇｍｈｓｐ２６−Ａ遺伝子の転写の終点を、Ｓ１ヌクレ
アーゼ・マツピング法および逆転写酵素プライマー・エ
クステンション法によって研究した。第２図に示すよう
に、１つの主要転写開始部位および、２つの副転写開始
部位（ｏｎｅ　ｍａｊｏｒ　ａｎｄ　ｔｗｏ　ｍ１ｎｏ
ｒｓｔａｒｔ　５ｉｔｅｓ　ｆｏｒ　ｔｒａｎｓｃｒｉ
ｐｔｉｏｎ）が見出された。

保護されたハイブリッドの型は、熱ショックおよび塩化
カドミウム処理によって誘導される多重５゛末端が存在
することを示した。これらの観察結果は、ブライマー・
エクステンション法によって確認された。これらの３つ
の開始部位は、約６５ｂｐの間隔をおいて配列され、Ｔ
ＡＴＡコンセンサス領域（第２図に示す）に順位の配列
から２７〜３０ｂｐ下流に位置している。主要の（すな
わち、最も頻度の高い）転写部位は、タンパク合成の際
の開始部位として働＜　ＡＴＧに対して最も近い５°側
で始まる部位であるが、この主要転写開始部位は、＋１
で始まると定義し、ＴＡＴＡボックスと、これと関連す
る補助配列とはサブプロモーター１と称する。二つの他
のサブプロモーターと開始部位との番号は、サブプロモ
ーター１の開始部位に対する位置を示す。サブプロモー
ター２と関連のある、ＴＡＴＡ相同配列と他の同定され
た配列とは、サブプロモーター１から次の上流の配列で
あり、＋１から５゛側に最も離れているサブプロモータ
ーはサブプロモーター３と称する。ヌクレオチド配列を
、コンピュータを用いて調べたところ、 ＴＡＴＡボックスコンセンサンス配列に類似のＡＴが豊
富な領域が、各転写開始部位から約２７〜３１ｂｐ上流
に存在することを示している。ＴＡＴＡ様モチーフは、
サブプロモーター１（こ対しては５’−ＴＡＴＡ八Ａ八
へ−へ°、サブプロモーター２に対しは５°−ＴＡＴＡ
ＴＡＧＧＴＡＴＡＴ−３゜サブプロモーター３に対して
は５’−ＡＡＴＴＡＡＴＡ−３’である。

５゛−非転写領域も、コンセンサス熱ショック要素（Ｈ
３Ｅ）配列５°−ＣＴＸＧＡＡＸＸＴＴＣＸＡＧ−３°
（ＸはＡ、Ｔ。

ＣもしくはＧ）に相同性を有する配列として分析された
〔エイチ・ベルハム（ＨｌＰｅｌｈａｍ）、　Ｃｅ１ｌ
。

３０巻、５１７頁、１９８２年〕。このコンセンサス配
列に部分的な相同性を有する配列のいくつかの重複した
コピーが、三つの推定上のＴＡＴＡボックスの各々の上
流に見出された。コンセンサス配列に対する相同性の程
度は、５／１０から７／１０まで一致する範囲にある。

−７２０位と一２１位との間のＤＮＡ配列のなかに、Ｈ
３Ｂコンセンサス配列に少なくとも５０％の相同性を有
する１０個の配列があり、また＋１位と＋７２位との間
の、Ｈ５Ｂコンセンサスに対して７０％の相同性を有す
る追加モチーフがある。これらのＨ３Ｂ様配列の位置は
、第２図に示しである。動物の系では、一般に一致が不
充分であると、熱ショック応答が不充分になるが、ｌｌ
５Ｂモチーフの繰り返しはコンセンサス配列との不一致
を補うというデータがある。

Ｇｍｈｓｐ２６−へ遺伝子の５゛側配を、動物で発見さ
れた金属調節要素（ＭＲＢ）コンセンサス配列５゛−Ｃ
ＰｙＴＴＴＧＣＰｕＰｙＰｙＣＧ−３’　（ＰｕはＡま
たはＧＳＰｙはＣまたはＴ）に相同性を有する領域につ
いて分析した（ジー・スチュアートら、Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　、　８１巻、７３１８頁、１９８４年）。限定
的な相同性を有するいくつかの領域が見出された。７／
１２の一致はサブプロモーター１のＨ３Ｂ様配列に重複
しており、一方サブプロモーター２および３は各々、Ｔ
ＡＴＡモチーフと転写開始部位との間のＭＲＢコンセン
サスに対し８／１２の一致を有する。ＭＲＢ様配列配列
植物遺伝子の重金属調節に機能する。これらの配列は、
調節因子がＤＮＡに結合する部位を与えることができる
。

３つのサブプロモーターの各々の相対的な誘導性を、対
照の成長条件下と、熱ショック条件およびカドミウムス
トレス条件下とで試験した。表２のデータは、サブプロ
モーター３の使用量が最も少ないが、試験されたストレ
ス条件下では最も誘導性があることを示している。サブ
プロモーター２からの転写の頻度は中程度である。サブ
プロモーター１から始まる転写は最も頻度が高いが、熱
ストレスもしくは重金属ストレス下の７オールド・イン
ダクションは、サブプロモーター３より少ない。各サブ
プロモーターからの転写の相対的な誘導性は、ストレス
処理によって異なるが、各サブプロモーターが、特定の
組合せのストレス条件に対して特異性を示すことを示唆
している。Ｇｍｈｓｐ２６−Ａ遺伝子に多重開始部位が
存在するということは、異なるストレス条件下で遺伝子
を誘導させる多重転写因子が存在することを示唆してる
。

表２ 対照のストレス条件下および選択されたストレス条件下
の３つの主要開始部位の各々におけるＧｍｈｓｐ２６−
Ａ転写開始率 （以下余白） 植物の普遍的調節要素内のいずれのＤＮＡ配列の機能で
も、植物分子生物学の分野の熟練者によって試験するこ
とができる。本発明に利用もしくは開示されている配列
には小さな変動があるかもしれないということは理解さ
れる。しかし、長い配列内のいくつかのＤＮＡ配列が９
機能を決定するうえで、他の配列より重要であるという
ことは、当該技術分野ではよく知られていることである
。当該技術分野の熟練者は、以下のような変異試験法に
よって、配列に許容しうる変化を試験することができる
。これらの試験法には、デイ・ジョートルら（Ｄ、５ｈ
ｏｒｔｌｅ　ｅｔ　ａｌ）　、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ　Ｇｅ
ｎｅｔ、、　　１５巻、２６５頁、　１９８．１年；エ
ム・スミス（Ｍ、　Ｓｍ１ｔｈ）　。

同上跡、１９巻、４２３頁、　１９８５年；デイ・ポッ
トスタイン（Ｄ、　Ｂｏｔｓｔｅｉｎ　）およびデイ・
ジョートル。

５ｃｉｅｎｃｅ、　２２９巻、　　１１９３頁、　　１
９８５年；ニス・マクナイト　（Ｓ、　ＭｃＫｎｉｇｈ
ｔ　）　′Ｊ６よびアール・キンゲスバリー（Ｒ，Ｋｉ
ｎｇｓｂｕｒｙ）　、　５ｃｉｅｎｃｅ、２１７巻、３
１６頁。

１９８２年；アール・マイヤースら（Ｒ，Ｍｙｅｒｓ　
ｅｔ　ａｌ）　。

５ｃｉｅｎｃｅ、　２３２巻、３１６頁、　１９８６年
に記載されている方法があり、特に限定はされない。ま
た異なる長さの欠失部を生成させたり分析する方法も知
られている（例えば、ティ・マニアティスら、　“Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　　、　　（Ｃｏｌｄ　
Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　＝ニーヨー
ク）。これらおよび他の変化は、標準の方法で測定でき
るので。

当該技術分野の通常の熟練者は、調節要素と構造遺伝子
の機能単位を操作し利用することができる（実施例７参
照）。

植物内で機能するストレス誘導性プロモーターが行う転
写制御下で、構造遺伝子を発現する遺伝子的に改変した
植物組織の生成は１本願に開示した特別の教示事項と、
当該技術分野で公知の種々の技術が組合わされている。

はとんどの例で、すべての方法の各工程に、好都合な方
法が存在する。方法の選択は１発現複合体を導入し安定
に保持させ漕ベクター系の選択、改質すべき植物種と所
望の再生方法、および使用する特定の構造遺伝子のよう
に変化するものに依存している。通常の熟練者ならば、
適切な代わりの工程を選択・使用して所望の結果を得る
ことができる。例えば１本発明の植物調節要素を得るた
めの最高の出発点は。

本願で例示したグリシン・マックス・Ｖａｒ、コーゾイ
　（Ｃｏｒｓｏｙ）のＧｍｈｓｐ２６−Ａであるが、植
物の普遍的ストレス誘導性調節要素を有するＤＮＡを操
作する手順に適切な改変が行われる限り、また代わりの
配列によって与えられる調節が同等であることが知られ
ているならば、他の植物のストレス遺伝子もしくは他の
異なる起源の相同ＤＮＡ配列を代わりに用いてもよい。

同様に、　Ｇｍｈａｌ１２６−Ａの構造遺伝子は、さら
に適切に手順の改変を行って、いずれかの植物発現性構
造遺伝子と置き換えられる。

構造遺伝子または他の配列の相同体は、それらの核酸が
、当該技術分野でよく知られている適切な厳密性を有す
る条件下で、交差ハイブリッド形成する性質によって同
定することができる。

本発明の主要な特徴は、転写発現が、大豆のＧｍｈｓｐ
２６−Ａ遺伝子の調節要素のような普遍的ストレス誘導
性調節要素で制御される。植物誘導性遺伝子を有する組
換えＤＮＡ分子である。この発現複合体は、普遍的スト
レス誘導性調節要素のプロモーターおよびプロモーター
関連配列、および植物内で発現可能な構造遺伝子で構成
されている。このプロモーター配列と構造遺伝子は、プ
ロモーターの配列が、構造遺伝子の転写を活性化できる
ように。

互いに、正しく位置し配向していなければならない。構
造遺伝子は、ストレス誘導性調節要素によって制御する
ために、その遺伝子の５°末端が調節要素の３°末端に
隣接するように、調節要素の３゛側に挿入しなければな
らない。ポリアデニル化シグナルは、コード配列の３゛
末端の下流に正しい配向で配置していなければならない
。もうひとつの考慮すべきことは１発現複合体の機能的
要素間の距離である。これらの距離については、かなり
の変化があるようなので、その距離に必要な条件は１機
能性という用語で最もよく示される。

まず第一に１機能要素間の距離は、その要素の起源の遺
伝子の場合と類似している場合に、妥当な操作性が得ら
れる。プロモーター配列と、構造遺伝子の５′末端との
間の距離、または調節制御するのに妥当な上流のプロモ
ーター関連の配列要素と、構造中の他の成分との間の距
離は変えることが可能で、このようにして、下流の構造
遺伝子の発現レベルを変化させることができる。融合タ
ンパクを産生ずる構造の場合に付は加えるべき必要条件
は、二つの遺伝子またはそれらのフラグメントの連結が
、その二つのコードする配列が同じ読取り枠内にあるよ
うな連結でなければならないということであり、この必
要条件は、当該技術分野ではよく知られている。この必
要条件の例外は。

イントロンが、ある遺伝子由来のコードする配列を、他
の遺伝子由来のコードする配列から隔離している場合で
ある。この場合、コードする配列は。

適合性のスプライス部位によって制限されていなければ
ならず、またイントロンスプライス部位は。

転写後の工程によってイントロンが除去された後。

両遺伝子の正しい読取り枠が、融合体内に確立されるよ
うに１位置していなければならない。植物内での遺伝子
の発現させる方法は、当該技術分野では広く知られてお
り、熟練技術者であればすべての必要条件を確実に満た
すであろう。

ストレス誘導性プロモーターの制御下にある所望の構造
遺伝子をもっている組換えＤＮＡ分子１例えば大豆のＧ
ｍｈｓｐ２６−Ａ遺伝子由来の分子は、当業者に知られ
ているいずれかの手段で植物組織に導入することができ
る。所定の植物種もしくは特定のタイプの植物組織に使
用する技術は、公知の成功した技術に依存している。異
質の遺伝子を植物細胞に安定に挿入する方法や、改質さ
れた細胞を操作する方法の新規な方法が開発されている
が。

熟練者は、公知の手段から選択して所望の結果を得るこ
とができるであろう。組換えＤＮＡを植物組織に導入す
る手段には、特に限定はないが、形質転換法〔ジエイ・
バツコブスキイラ（Ｊ、　Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ　ｅｔ
　ａｌ）　、　ＥＭＢＯＪ、、　３巻、　２７１？頁、
　　１９８４年〕　；エレクトロポレーション法（ｅｌ
ｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）　　Ｃエム・フロムら（
Ｍ、　Ｆｒｏｍ　ｅｔ　ａｌ）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　［ＩＳＡ、　８２巻、　５８２
４頁、　　１９８５年〕　；マイクロインジェクション
法〔エイ・クロスウェイら（Ａ、　Ｃｒｏｓｓｗａｙ　
ｅｔ　ａｌ）　Ｍｏｌ、　Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ１２０２
巻。

１７９頁、　１９８６年〕　；またはアグロバクテリウ
ム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）から植物細胞へ、　Ｔ−ＤＮ
Ａを介して転移させる方法がある。アグロバクテリウム
属の天然の宿主に対するＴ−ＤＮＡの形質転換に基本的
な限定はないようである。Ｔ−ＤＮＡを介する形質転換
の成功例としては、単子葉植物〔シイ・フーイカースー
バン・スログテルンら（Ｇ、Ｈｏｏｙｋａａｓ−Ｖａｎ
　Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ　ｅｔ　ａｌ）　。

Ｎａｔｕｒｅ、　３１１巻、７６３頁、　１９８４年〕
、裸子植物〔エイ・ダンプカーら（Ａ、　　Ｄａｎｄｅ
ｋａｒ　ｅｔ　ａｌ）　、　　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、
。

５巻、５８７頁、　１９８４年〕右よび藻類〔アール・
オージッヒ（Ｒ，Ａｕ５ｉｃｈ）　、欧州特許願第１０
８．５８０号〕の例が報告されている。代表的なＴ−Ｄ
ＮＡベクター系は、以下の文献に記載されている。すな
わちジー・アンら（Ｇ、Ａｎ　ｅｔ　ａｌ　）　、　Ｂ
ＭＢ［］　Ｊ、、　　４巻。

２７７　Ｌ　１９８５年；エル・ヘレラーエストレララ
（し、　　Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｂｓｔｒｅｌｌａ　　ｅｔ
　　ａｌ　　）　　、　　　Ｎａｔｕｒｅ、　　　３０
３　　巻。

２０９　頁、　１９８３年；エル・ヘレラーエストレラ
ら。

ＢＭＢＯＪ、、　　２巻、９８７頁、　１９８３年；エ
ル・ヘレラーエストレラら、　　”Ｐｌａｎｔ　Ｇｅｎ
ｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”ニューヨーク、ケ
ンブリッジ大学出版局、６３頁。

１９８５年である。植物組織に導入した後の、構造遺伝
子の発現は、当該技術分野で公知のいずれかの手段で検
定することが可能で１発現は、転写されたｍＲＮＡもし
くは合成されたタンパクとして測定される。植物組織の
インビトロ培養、および多くの場合、全植物体の再生に
関する技術が知られている。誘導された発現複合体を、
商業的に有用な栽培品種に換える方法が、当業者に知ら
れている。

特定の実施態様において、　Ｇｍｈｓｐ２６−Ａ遺伝子
をＴ−ＤＮＡベースのシャトルベクターｐＷ９に導入し
たが、このベクターは、　Ｇｍｈｓｐ２６−Ａを異種の
植物宿主に転移させることができる。当業者ならば容易
に分かることであるが１発現複合体のＧｍｈｓｐ２６−
Ａの代わりに、インビトロの操作に簡便な、天然にもし
くは人工的に作製した制限部位を用いて、他の植物発現
遺伝子を組み込んでもよい。考慮すべき大切なことは、
結合部分の配列が、転写および翻訳の機能と適合してい
るということである。遺伝子的に改変された植物組織を
得るための好ましい例の最終工程には９発現複合体をＴ
−ＤＮＡ含有ベクターに挿入し１次いで、この改変され
たＴ−ＤＮＡがゲノムの一部として安定に一体化される
ような植物組織に１組換えＤＮＡを転移させる工程があ
る。

下記実施例は、この発明を例示することだけを目的とす
るもので、この発明の範囲の限定を意図するものではな
い。実施例では１組換えＤＮＡを。

植物組織や培養物内で操作したり、形質転換植物を再生
する場合に１分子生物学の分野の熟練者がよく知ってお
りかつ使用できる多くの技術を利用している。酵素は市
販のもので、販売者の説明書または当該技術分野で公知
の他の変法にしたがって用いられる。試薬、緩衝液およ
び培養条件も当該技術分野で知られている。標準の分子
生物学の方法が記載されている文献としては次のものが
しる。すなわち、ティ・マニアナイスら“Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＣ１ｏｎｉｎｇ″Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　　ニューヨーク、　　１９８２
年；アール・つ（ＲｌＷｕ）編集、　Ｍｅｔｈ、　Ｂｎ
ｚｙｍｏｌ、６８巻、　１９７９年；アール・つら編集
、　Ｍｅｔｈ、Ｂｎｚｙｍｏｌ、　１００巻および１０
１巻、　１９８３年；エル・グロスマン（Ｌ、　Ｇｒｏ
ｓｓｍａｎ）およびケイ・モルデイプ（に、　Ｍｏ１ｄ
ａｖｅ　　編集、　Ｍｅｔｈ。

Ｂｎｚｙｍｏｌ、　６５巻、　　１９８０年；ジェイ・
ミラー（Ｊ、　Ｍｉｌｌｅｒ）編集、　　”Ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｎｅｔｉ
ｃｓ”Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒ。

ニューヨーク、　１９７２年；オールド（Ｏｌｄ　）お
よびブリムローズ（Ｐｒ　ｉｍｒｏｓｅ）　　Ｐｒ１ｎ
ｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　ＧｅｎｅＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏ
ｎ　　、カリフォルニア大学出版局、バークレイ、カリ
フォルニア、　　１９８１年；アール・シュリーフ（Ｒ
ｏＳｃｈｌｉｅｆ）およびビイ・ウエンシンク　　（Ｐ
、　　Ｗｅｎｓｉｎｋ）　　、　　　“Ｐｒａｃｔｉｃ
ａｌ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＢｉｏｌｏｇｙ　　、　１９８２年；グローバー（Ｇ
ｒｏｖｅｒ）編集。

“ＯＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ″、第■および■巻、　ＩＲ
Ｌ　Ｐｒｅｓｓ。

オックスホード、イギリス、　　１９８５年：ヘイムズ
（Ｈａｍｅｓ）およびヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）編集
、“ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　）Ｉｙｂｒｉｄｉｓａｔ
ｉｏｎ　　、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　、オックスホード
、イギリス、　　１９８５年；セットロー（Ｓｅｔｌｏ
ｗ）およびエイ・ホランダー（Ａ、ｔｌｏｌｌａｅｎｄ
ｅｒ）　　“ＧｅｎｅｔｉｃＢｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　
：　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ”
　、第１〜４巻、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　ニュ
ーヨーク、　１９７９年であり、これら文献は、ここに
参照文献として採用する。ここで用いた略号や学名は、
当該分野では標準とみなされ、上記の文献のような専門
誌に通常用いられているものである。

（以下余白） 実施例１　：　Ｇｍｈｓｐ２６−Ａ遺伝子のゲノムクロ
ーンの単離 この実施例では、グリシン・マックスｖａｒ、コーゾイ
のＧｍｈｓｐ２６−Ａ熱ショック遺伝子のゲノムクロー
ンを単離する工程を簡単に述べる。

ｃＤＮＡライブラリーは、熱ショックを与えた大豆の胚
軸由来のポリアデニル化されたＲＮＡを、逆転写酵素の
鋳型として、構築した〔エフ・ショッフル（Ｆ、　５ｃ
ｈｏｆｆｌ）およびジエイ・ケイ　（Ｊ、Ｋｅｙ）　。

Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、、　　１巻
、３０１頁、　１９８２年〕。

ｐＦｓ２００５．　ｐＦｓ２０１９およびｐＦｓ２０３
３は１本願研究で単離した熱誘導性転写部のｃＤＮＡコ
ピーを有する三つの組換え体プラスミドである。

次いでイー・ツアルネッ力らは（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．
Ｂｉｏｌ。

３巻、４５頁、　１９８４年）、ストレス誘導性転写部
に対応する追加のｃＤＮＡを単離した。対照と、ストレ
スで誘導されるポリアデニル化ＲＮＡとを、大豆の芽生
えまたは成熟胚軸の培養スライスから単離した。ストレ
ス処理としては以下のものが含まれる＝４０℃の熱ショ
ック；　１２５ｍＭの塩化カリウムによる塩ストレス；
ポリエチレングリコール−６０００による一５バールと
いう低い水ポテンシャル；植物成長調節物質（０，７５
ｍＭのアブシジン酸または５１０μｇ／ｄの２．４−ジ
クロロフェノキシ酢酸）；０．１ｍＭ亜ヒ酸ナトリウム
もしくは１ｍＭジニトロフェノールによる呼吸阻害；　
０．１　ｍＭ力ナバニンもしくは１ｍＭのｐ−フルオロ
フェニルアラニンを用いるアミノ酸類似体による欠損タ
ンパクの合成；　１０ｐｐｍのエチレンの空気中への散
布；および培養液に窒素ガスを散布することによる嫌気
生活である。放射能で標識したｃＤＮＡは、ポリ（Ａ）
　”　ＲＮＡ試料から作製し、上記ｃＤＮＡライブラリ
ィをスクリーニングするのに使用した。ｌ１ｌＣ［Ｅ５
３．　ｐｃＥ５４およびｐＣＢ７５は、　ｃＤＮＡで。

いくつかのストレス条件からスクリーニングされた際に
、対照のシグナルに比べて、ハイブリッド形成シグナル
が増加したクローンである。ｐｃＢ５４は、対照条件下
で検出可能なレベルの発現を示し。

はとんどのストレス処理条件下で誘導された（イー・ツ
アルネッ力ら、　　１９８４年）。

伝子の発現 ｐｃＢ５４．　ｐＣＢ５３．　ｐＣＥ７５およびショフ
ルとケイ　（１９８２年）が選択した３種の熱誘導性ク
ローンを放射能で標識し、ノーザンハイブリダイゼーシ
ョン法に用いて、環境ストレスによって誘導された遺伝
子の応答パターンを分析した（イー・ツアルネッ力ら、
　　１９８４年）。ｐＣＥ５４は１発現のパターンが独
特なので、これを選択してさらに研究した。このプロー
ブに相同性のある遺伝子が構成的に発現され、はとんど
すべてのストレス試験条件で誘導された。見掛けの構成
的発現のレベルは９組織試料の処理法によるｐＣＩＥ５
４を用いて、観察されることがわかった。切除後直ちに
液体窒素内で凍結した対照の組織試料は、切除し分析す
るまで氷上で冷却した組織よりも遺伝子発現のレベルが
著しく低い。このことは１組織の創傷やかなりの冷ショ
ック（氷上での冷却）が、　Ｇｍｈｓｐ２６−Ａ遺伝子
の発現を誘導する刺激であることを示している。

実施例１．３　ｐＣＥ５４に相同性を有するゲノムクロ
ーンの単離 ｐｃＢ５４を放射能で標識して、ジエイ・スライドム（
Ｊ、　Ｓｌｉｇｈｔｏｍ＞とワイ・７　（Ｙ、　Ｍａ）
　（ＡｇｒｉｇｅｎｅｔｉｃｓＡｄｖａｎｃｅｄ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　７ジスン、ラ
イスコンシン）によって構築された。大豆ゲノムＯＮへ
の２１０５９組換えライブラリーをスクリーニングする
際のハイブリダイゼーションプローブとして使用した。

大豆（グリシン・マックスｖａｒ、、コーゾイ）の全Ｄ
ＮＡをＭｂｏ　Ｉで部分的に分解し、λ１０５９のＢａ
ｍ旧部位に連結した〔ジエイ・カーノら　（Ｊ、　Ｋａ
ｒｎｅｔ　ａｌ　）　、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、　Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７７巻。

５１７２頁、　１９８０年〕。このライブラリーがすで
に使用されていたことは、アール・ナガオら（Ｒ，Ｎａ
ｇａ。

ｅｔ　ａｌ）のＭｏ１．　Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、　　
５巻、　３４１７頁、　１９８５年に記載されている。

本願の研究のスクリーニングでは、　ｐＣＢ５４とハイ
ブリダイズする組換えプラスミドとしてｈｓＹ５４を得
た。Ｂｇｌ　ＩＩによる分解で。

およそ４ｋｂ、　　６ｋｂおよび９ｋｂの三つの主要な
挿入フラグメントを得た。ｐＣＢ５４の大豆特異的挿入
物は、　　ｈｓＹ５４中の４ｋｂと６．２ｋｂのＢｇｌ
　ＩＩ制限フラグメントとハイブリダイズすることが、
ハイブリダイゼーション法で決定された。約６．２ｋｂ
のＢｇｌＩＩフラグメントの制限地図を第１図に示す。

実施例２　：　Ｇｍｈｓｐ２６−Ａ遺伝子のＤＮＡ配列
の決定ｈｓＹ５４の６．２ｋｂのＢｇｌｌＩ７ラグメン
トをｐＵｃベクターにサブクローン化した〔ジエイ・ビ
エイラ（Ｊ、　Ｖｉｅｉｒａ）およびジェイ・メシング
（Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ）。

Ｇｅｎｅ、　１９巻、２５９頁、　１９８２年〕。配列
決定を行うために重複欠失部を有するクローンを、アー
ル・ゾールら（Ｒ，Ｄａｌｅ　ｅｔ　ａｔ　）　、　Ｐ
ｌａｓｍｉｄ、　１３巻。

３１頁、　１９８５年の方法で構築した。次に大豆挿入
物のＤＮＡ配列を、エイ・マクサム（Ａ、　Ｍａｘａｍ
）とダブリュ・ギルバー）　（Ｗ、Ｇ１１ｂｅｒｔ）、
　Ｍｅｔｈ、Ｂｎｚｙｍｏｌ、。

６５巻、４９９頁、　１９８０年；およびエフ・サンガ
ーら（Ｆ、　Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ　）　、　Ｊｏ
Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、、　　１４３巻。

１６１頁、　　１９８０年、のジデオキシヌクレオチド
チェーンターミネーション法の化学的開裂法を用いて決
定した。−４２０位から＋１５７３Ｇｔまでの配列を両
ＤＮＡｗＡについて決定したが、センス鎖だけは、さら
に上流の領域（−１１９０位から一４２０位まで）の配
列を決定した。配列を調べることによって、　Ｇ＋＋ｒ
ｈｓｐ２６−Ａの全遺伝子が、　ｈｓＹ５４の６ｋｂの
ＢｇｌＩＩフラグメントに含まれていることが分かった
。−１１９０位から＋　１５７３位までの配列を第２図
に示す。

実施例３　：　Ｇｍｈｓｐ２６−Ａ遺伝子の転写部の地
図化Ｇｍｈｓｐ２６−Ａに相同性を有する転写部の地図
を。

１〜２μｇのポリ（Ａ）　ＲＮＡを用いるＳ１ヌクレア
ーゼプロテクシヨン法か、または５〜１０μｇのポリ（
八）　ＲＮＡを用いるプライマーエクステンション法で
作成した。転写部の８１ヌクレアーゼによる地図作成は
、すでに記載した方法（イー・ツアルネッ力ら、　Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　［ＪＳＡ、　
８２巻、　３７２６頁。

１９８５年）に述べられたように、ジエイ・フアバロー
ロら（Ｊ、Ｆａｖａｌｏｒｏ　ｅｔ　ａｌ）、　Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　Ｂｎｚｙｍｏｌ、。

６５巻、７１８頁、　１９８０年の方法にしたがって行
った。

Ｇｍｈｓｐ２６−Ａ遺伝子の転写部の５°末端の分析に
用いたハイブリダイゼーションプローブは、５“末端旧
ｎｄ［［部位に標識した１、　６ｋｂの旧ｎｄＩ［−３
ａｌ　Ｉフラグメント　（第１エキソン内）であった。

逆転写酵素ブライマーエクステンション分析は。

＋２４位から＋４０位の５°末端から下流の配列に対し
て相補的な１合成オリゴヌクレオチド（５”−ＧＧＡＡ
ＣＡＡＧＴＡＴＡＧ（：ＴＧＧ−３°）ブライマーを用
いて行った。対照のボＩＪ　（Ａ）　ＲＮＡ　、熱ショ
ックを与えたポＩＪ　（Ａ）　ＲＮＡ　、またはカドミ
ウムで誘導されたポリ（Ａ）　ＲＮＡを、密閉マイクロ
キャピラリー内で室温にて１６時間、５′末端を標識し
たプライマーでアニールした。エクステンション反応混
合物を、２００単位のマｏ＝イＭＬＶ逆転写酵素（Ｂｅ
ｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）とともに、１時間、室温でインキュベートした。

このインビトロで合成した産物を。

８％ポリアクリルアミド−尿素ゲルで分離し、−７０℃
のスクリーンに曝した。三つの主要開始部位の各々から
始まる１種々の条件下での全Ｇｍｈｓｐ２６−Ａの転写
割合（％）は、　ＳＬヌクレアーゼマツピングゲルから
切り取った。単離されたバンドの放射活性を計数するこ
とによって決定した。

この実施例では、大豆Ｇｍｈｓｐ２６−Ａ遺伝子の、植
物の普遍的ストレス誘導性調節要素の調節制御下で、大
豆のＧｍｈｓｐ２６−Ａ熱ショック遺伝子のような植物
発現性構造遺伝子を発現させる方法について述べる。

実施例４．１　ｐＧｍｈｓｐ２６−Ａの構築グリシン・
マックス・ｖａｒ、　、　コーゾイのＧｍｈｓｐ２６−
Ａ遺伝子を、λゲノムクローンｈｓＹ５４から、約３．
２ｋｂのＳａｌ　Ｉ　−Ｐｓｔ　Ｉフラグメントとして
単離する。

ＢｇｌｌＩリンカ−を添加することによって、上記の７
ラグメントを修飾した後、このフラグメントを。

先に述べたＢｇｌＩＩで切り取ったベクタープラスミド
ｐＷ９　（ダブリ１−ガーリイら、　Ｍｏｌ、　Ｃｅ１
ｌ、　Ｒｉａｌ、６巻、５５９頁、　１９８６年）に連
結した。ｐＴｉ１５９５５のＴ−レフト由来のＤＮＡ配
列が、シャトルベクターを。

アグロバクテリウム・ツメファシェンス中間宿主のＴｉ
プラスミドに相同の組換えをするための部位を提供する
。アグロバクテリウム属の宿主は、　Ｇｍｈｓｐ２６−
へ発現複合体を植物組織に移入させ１次いで環境ストレ
スの調節制御下で発現を誘導させる。

実施例５．ベクター移入と腫瘍形成 アグロバクテリウム・ツメファシェンス５２６０　（ダ
ブリュ・ガージーら、　３１１０１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏ
ｌ、、　　７巻。

５９頁、　１９８７年）を、　Ｇｍｈｓｐ２６−Ａの誘
導体もしくはキメラ構造体を有する種々の構造のシャト
ルベクターの受容体として用いる。組換え分子が植物組
織に移入されるのは、この菌株からである。

二重遺伝子シャトルベクターを、エシェリヒア・コリ　
（Ｂ、ｃｏｌｉ　）　ＬＢ３９２からアグロバクテリウ
ム・ツメファシェンスに、アール・フラリイら（Ｒ，Ｆ
ｒａｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ）、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

８０巻、　４８０３頁、　１９８３年に記載された固体
培地上でのトリバレンタル・コンジュゲーション法（ｔ
ｒｉｐａｒｅｎｔａｌｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　）によ
って移入する。得られた移入接合体のコロニーは、スト
レプトマイシン（２５０μｇ／ｍｊ２）とカナマイシン
（２０μｇ／ｄ＞を合作するへ８最少培地〔エム・チル
トンら（Ｍ、Ｃｈｉｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ）　Ｐｒｏｃ
。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＥＬＳ＾、７１巻、
　３６７２頁、　１９７４年〕で、２８℃で３〜５日間
、増殖させて選択する。

腫瘍を、ひまわり〔ヒーリアンサス・アヌースｃｖ、ラ
ージグレイ　（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ　ａｎｎｕｕｓ、
　ｃｖ、ＬａｒｇｅＧｒｅｙ）　）の芽生えに発生させ
、このひまわりを。

既述のようにして成育させる（ダブリュ・ガージーら、
６巻、５５９頁、　１９８６年）。腫瘍増殖に要する１
４〜１６日後、各プラスミドの構築のために平均２００
〜３００の腫瘍を採取し、直ちに液体窒素で凍結して構
成的発現を分析する。

実施例６：ストレス誘導性遺伝子の発現腫瘍組織は、対
照の構成的遺伝子発現のために２８℃で、一方熱ショッ
クで誘導された発現のために４０℃で、それぞれ増殖培
地で培養する。他の形態の環境ストレスの条件は、ツア
ルネッ力ら（１９８４年）の文献に記載されているのと
同じである。組織を回収し、　ＲＮＡを抽出して、前記
のノーインハイブリダイゼーション法によって分析する
。

ＢｇｌＩＩフラグメント（ｐＧｍｈｓｐ２６−Ａ　、実
施例４）を単離し１両端を、フレノウＤＮＡポリメラー
ゼで処理して平滑末端とし１次いでそのフラグメントを
Ｐｔ１Ｃ１９のＳｍａ　Ｉ部位に挿入する。その後、当
業者によく知られている技術〔ティ・マニアナイスら（
１９８２年）；デイ・ジートルら（１９８１年）；エム
・スミスら（１９８５年）；デイ・ポットスタインとデ
イ・ジョートル（１９８４年）；マクナイトとキンゲス
バリー（１９８２年）；マイヤースら（１９８６年）〕
を用いて、上記のｐＵｃ１９誘導体を処理し、遺伝子の
上流領域に、欠失部とその他の配列の修飾を作製する。

植物の普遍的ストレス誘導性調節要素の突然変異誘導体
は、　ｐＭ旧のようなプラスミド系で試験することがで
きる（エル・ヘレラーエストレラら、　Ｎａｔｕｒｅ、
　３１０巻、１１５頁、　１９８４年）　。ｐＭＨｌは
、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの
構造遺伝子を有する。この遺伝子は、そこから上流に挿
入された調節配列とプロモーター配列の機能をモニター
するためのレポーター遺伝子として使用することができ
る。またｐＭ旧は、アグロバタテリウム属のＴｉプラス
ミドに相同性を有するＤＮＡ配列ももっているので１発
現複合体を植物組織に移入することができ、植物組織で
、調節要素の誘導体の機能を、ストレスの負荷に応答し
て測定することができる。

（以下余白） （発明の要約） 植物の普遍的なストレス誘導性調節要素は、種々の環境
ストレス（例えば、熱ショック、浸透圧、塩ストレス、
重金属イオン濃度、部分的嫌気生活など）に応答して誘
導された合成を示す植物遺伝子の５°側ＤＮＡ配列を有
する。このような調節要素の単離、特徴付け、および利
用が開示されている。植物の普遍的なストレス誘導性調
節要素は、転写開始部位に関連するプロモーター機能と
、種々のストレスに対する誘導応答に関連する調節機能
とを有する。環境ストレスに応答して、植物組織内にお
ける植物発現遺伝子の発現レベルの増大を誘導する方法
が提供される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｇｍｈｓｐ２６−Ａ遺伝子の、植物の普遍的
なストレス誘導性調節要素を含有する、グリシン・’？
−）クス（Ｇｌｙｃｉｎｅ　　ｍａｘ）ゲノムの６．２
　ｋｂ　　Ｂｇｌ　ＩＩフラグメントの制限酵素マツプ
を示す。Ｇｍｈｓｐ２６−Ａ遺伝子の主要転写部位が、
ｃＤＮＡ　ｐＣ［！５４の位置と共に示しである。Ｇｍ
ｈｓｐ２６−Ａのイントロンの位置は、次のように示し
である；遺伝子のコード領域はクロスハツチングで示し
、遺伝子の５°側と３°側の非翻訳領域は黒色で示しで
ある。遺伝子の主要転写開始部位の位置は＋１で示しで
ある。 第２図は、Ｇｍｈｓｐ２６−Ａ遺伝子の−１１９０から
＋１５７３までのＤＮＡ配列を示す。コード配列から推
定したアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列の下に示しで
ある。三つの転写開始部位は、ヌクレオチド配列の下に
黒の三角印で示してあり、主要転写部分の開始部位は、
上付き数字の１で示しである。サブプロモーター１．２
および３に対応するＴＡＴＡボックス様配列のモチーフ
にはアンダーラインを付け、対応する数字を付記しであ
る。コンセンサス熱ショック要素に対して相同性を有す
るＤＮＡ配列は、箱でかこみ、そのコンセンサスに相当
する塩基の数（１０以外）を各節の上に示しである。直
接の繰り返しは、上に線を引いてｒｄ」の文字をつけて
あり、間接の繰返し配列は、下に矢印を付けて示しであ
る。Ｇ＋ｎｈｓρ２６−Ａ遺伝子の３”側領域における
ポリアデニル化シグナルは上に線を引いである。 手続補正書（方式） 平成元年６月２１日 平成１年特許願第４６３４０号 ２、発明の名称 植物の普遍的ストレス誘導性調節要素 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　アメリカ合衆国　オハイ、ｔ　　４４０９２ウィ
クリフ、レークランド　ブールバード名称　ルブリゾル
　ジエネティクス インコーポレイテッド　　　（ばか１名）４、代理人 住所　〒５３０大阪府大阪市北区西天満５、補正命令の
日付（発送臼） 平成１年５月３０日 ６、補正の対象 願書の特許出願人および前記以外の特許出願人の代表者
の欄、委任状（訳文添付）および図面（第２図） ７、補正の内容

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、植物の普遍的なストレス誘導性調節要素と、植物発
   現構造遺伝子とを有する組換えＤＮＡ分子であって、 該植物構造遺伝子が該植物の普遍的なストレス誘導性調
   節要素の調節制御下にある組換えＤＮＡ分子。 ２、前記植物の普遍的なストレス誘導性調節要素が大豆
   の￥Ｇｍｈｓｐ２６−Ａ￥遺伝子のストレス誘導性調節
   要素であるか、あるいは該植物の普遍的なストレス誘導
   性調節要素が大豆の￥Ｇｍｈｓｐ２６−Ａ￥遺伝子のス
   トレス誘導性調節要素に対して少なくとも約９０％のヌ
   クレオチド配列相同性を有する、特許請求の範囲第１項
   に記載の組換えＤＮＡ分子。 ３、前記植物の普遍的なストレス誘導性調節要素が、第
   ２図のように、約−７２０位のヌクレオチドにある開始
   点から、約−２１位、＋１位、または＋７２位のいずれ
   かのヌクレオチドより選択された終点までのヌクレオチ
   ド配列、あるいは該ヌクレオチド配列に対して少なくと
   も約９０％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む、
   特許請求の範囲第１項に記載の組換えＤＮＡ分子。 ４、前記植物の普遍的なストレス誘導性調節要素が、第
   ２図のように、約−１１９０位のヌクレオチドにある開
   始点から、約−２１位、＋１位、または＋７２位のいず
   れかのヌクレオチドより選択された終点までのヌクレオ
   チド配列、あるいは該ヌクレオチド配列に対して少なく
   とも約９０％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む
   特許請求の範囲第１項に記載の組換えＤＮＡ分子。 ５、前記植物の普遍的なストレス誘導性調節要素が植物
   の熱ショック要素のコピーを含み、該植物の熱ショック
   要素がコンセンサス熱ショック要素配列５’−ＣＴｘＧ
   ＡＡｘｘＴＴＣｘＡＧ−３’に対して５０％またはそれ
   以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含む、特許請
   求の範囲第１項に記載の組換えＤＮＡ分子。 ６、前記植物発現構造遺伝子が植物の熱ショック構造遺
   伝子ではない、特許請求の範囲第１項に記載の組換えＤ
   ＮＡ分子。 ７、環境ストレス条件に応答して植物組織内における植
   物発現遺伝子の発現レベルの増大を誘導する方法であっ
   て、 植物組織内に組換えＤＮＡ分子を導入する工程であって
   、該組換えＤＮＡ分子が植物の普遍的なストレス誘導性
   調節要素と植物発現構造遺伝子とを有し、該植物発現構
   造遺伝子が該植物組織内において該植物の普遍的なスト
   レス誘導性調節要素の調節制御下で発現されるように位
   置している、工程と、 該調節要素が該構造遺伝子の発現を誘導するように、該
   植物組織にストレスを加える工程と、を包含する方法。 ８、前記植物の普遍的なストレス誘導性調節要素が大豆
   の￥Ｇｍｈｓｐ２６−Ａ￥遺伝子のストレス誘導性調節
   要素であるか、あるいは該植物の普遍的なストレス誘導
   性調節要素が大豆の￥Ｇｍｈｓｐ２６−Ａ￥遺伝子のス
   トレス誘導性調節要素に対して、少なくとも約９０％の
   ヌクレオチド配列相同性を有する、特許請求の範囲第７
   項に記載の方法。 ９、前記植物の普遍的なストレス誘導性調節要素が第２
   図のように約−７２０位のヌクレオチドにある開始点か
   ら、約−２１位、＋１位または＋７２位のいずれかのヌ
   クレオチドより選択された終点までのヌクレオチド配列
   、あるいは該ヌクレオチド配列に対して少なくとも約９
   ０％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む、特許請
   求の範囲第７項に記載の方法。 １０、前記植物の普遍的なストレス誘導性調節要素が第
   ２図のように約−１１９０位のヌクレオチドにある開始
   点から、約−２１位、＋１位または＋７２位のいずれか
   のヌクレオチドより選択された終点までのヌクレオチド
   配列、あるいは該ヌクレオチド配列に対して少なくとも
   約９０％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む、特
   許請求の範囲第７項に記載の方法。 １１、前記植物の普遍的なストレス誘導性調節要素が植
   物の熱ショック要素のコピーを含み、該植物の熱ショッ
   ク要素がコンセンサス熱ショック要素配列５’−ＣＴｘ
   ＧＡＡｘｘＴＴＣｘＡＧ−３’に対して５０％またはそ
   れ以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含む、特許
   請求の範囲第７項に記載の方法。 １２、前記植物発現構造遺伝子が植物の熱ショック構造
   遺伝子ではない、特許請求の範囲第７項に記載の方法。