JPH02142483A - Ｅｎｏｄ２遺伝子調節領域 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明の分野は、一般に植物の分子生物学の領域であり
、さらに詳細には組換えＤＮＡ技術による植物遺伝子工
学に関する。本発明は特に、ダイズの初期ノジュリン（
ｎｏｄｕｌｉｎ）遺伝子の調節領域に関する。この調節
領域は、ブラシリゾビウム　ジャポニクム（Ｂｒａｄ　
ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　’ａ　ｏｎｉｃｕｍ）の接種後に
１発育するダイズの根粒中で下流遺伝子の発現を組織特
異的に調節する領域である。

（従来の技術） マメ科植物の窒素固定根粒（ｎｉｔｒｏｇｅｎ−ｆｉｘ
ｉｎｇｒｏｏｔ　ｎｏｄｕｌｅ）　　は、根がリゾビウ
ム細菌に感染し次いで細菌と植物との共生が発生するこ
とによって形成される。共生の発生は、植物と細菌との
間の特異的認識に依存し、植物および細菌の両者からの
遺伝情報が必要である。

根粒の発生は、マメ科植物の種類によって異なる。２種
類の異なるダイズの根粒、つまり、決定群と非決定群と
がある。例えば、ダイズ（肚匹植り面の根粒は、決定群
（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）であり球形である。これと
は異なり、アルファルファ　（４ｓｐｐ、）＋　　クロ
ーバ−（Ｔｒｉｆｏｌｔｕｍ　ｓｐｐ、）およびエント
ウ　（Ｐｉｓｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ）の根粒は非決定群
（ｉｎ−ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）であり、ａＩ長形で
ある。さらに、これらの根粒は、解剖学上ならびに物質
代謝上、異種のものであり、マメ科植物間の遺伝的な差
異と。

マメ科植物に感染するりゾビウムの異なる種間の差異と
による。根粒発生の過程の差を反映している。

ビンセント（Ｊ、Ｍ、　Ｖｉｎｃｅｎｔ）は、　　”Ｎ
ｉｔｒｏｇｅｎ　Ｆｉｘａｔｉｏｎ’（Ｗ、Ｅ、Ｎｅｗ
ｔｏｎおよびＷ、Ｈ，Ｏｒｍｅ−Ｊｏｈｎｓｏｎ）　＆
ｉ集＋　（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐａｒｋ　Ｐｒｅｓ
ｓ社発行、米国、メリーランド州、ボルチモア、２巻、
１０３〜１３１真。

１９８０年）の根粒発生の説明の項で、根粒形成の３つ
の異なった段階、つまり、感染前段階、感染および根粒
形成の段階、そして、根粒が機能する段階を区分してい
る。感染前の段階では、リゾビウム細胞は、その宿主細
胞を認識して根毛に付着し。

次いで根毛がカールする。次の段階で、該１！１９は感
染糸（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｔｈｒｅａｄ）を通じて根
の中に入り、いくらか皮層細胞が脱分化して分裂組繊を
形成する。この感染糸は１分裂組繊細胞に向かって成長
する。細菌は、これらの細胞の約１／２の細胞質中に放
出され９次いでその細菌の細胞は分化して根粒菌になる
。最終段階では、根粒の細胞は、さらに分化して窒素固
定根粒となる。

根粒特異的タンパクは、根粒中でのみ発現し。

感染過程、４１粒の発生および共生窒素固定に関連があ
るようである。植物起源のタンパク（ノジュリン）と細
菌起源のタンパク（バタテロイジン（ｂａｃ　ｔｅｒｏ
　ｉｄ　ｉｎ）　）との両者が、根粒中に見い出されて
いる。根粒特異的タンパクは、ブラシリゾビウム　ジャ
ポニクムを感染させたダイス（（Ｒ，Ｐ、Ｌｅｇｏｃｋ
ｉおよびり、Ｐ、Ｓ、Ｖｅｒｍａ）１９８０年、前出〕
およびリゾビウム　レグミノサルムＰＲＥ（Ｒｈｉｚｏ
ｂｉｕｍ　ｌｅ　ｕｍｉｎｏｓａｒｕｍＰＲＥ）を感染
させたエントウ（Ｐｉｓｕｍ　　ｓａｔｉｖｕｍ）（Ｔ
。

Ｂｉｓｓｅｌｉｎｇら、　ＥＭＢＯＪ、　　２巻、　９
６１〜９６６頁、　１９８３年）〕のそれぞれの根の調
製物中に同定されている。各々の場合に、免疫沈澱法で
根粒タンパクを同定するのに、根粒特異的抗血清を使用
した。これら抗血清は各々、感染していない植物由来の
根の調製物を用いて、可溶性根粒タンパクに対する抗血
清を滴定することによって作製された。これらの研究の
欠点は、根粒特異的タンパクが植物起源なのか細菌起源
なのか確認できないことと、各タンパクの抗原性が免疫
分析法に影響するということである。

ダイスについては、根粒ポリゾームのインビトロでの翻
訳産物が、根粒特異的抗血清で分析された。対照実験に
よって、細菌ＲＮＡはインビトロの系では翻訳されない
ことがわかった。分子量の範囲が１８〜２０ｋｄの、少
なくとも１８〜２０種の、宿主植物由来のポリペプチド
が同定された。これらのタンパクは、非感染の根、根粒
菌および自然の状態（７）Ｂ、　　ジャポニクム（Ｒ，
Ｐ、レボキーおよびり、Ｐ、Ｓ。

パーマ、　Ｃｅ１Ｌ　２０巻、　１５３〜１６３頁、　
１９８０年）には存在していなかった。さらに、根粒菌
を分離し３５Ｓメチオニンとともにインキユベートシ、
根粒菌タンパクに標識を付けた。２つのポリペプチドを
、根粒特異的抗血清と交差反応させた。根粒菌が排出し
たポリペプチドは分子量が約１１ｋｄであった（Ｒ，Ｃ
，ファンデン　ボスら（Ｒ，Ｃ，ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｏ
ｓｅｔ　ａｌ）＋　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ、　１０９巻、　１３１〜１３９４１９７８年〕。ウ
ェスタンタンパクプロットを。

根粒特異的抗血清でプローブすることによって。

エントウの根のタンパクの抽出物中から約２０種の根粒
特異的タンパクが同定された。検出されたタンパクは１
分子量が１５〜１２０ｋｄの範囲内であるが。

これらのタンパクの起源は決定されなかった。これらの
実験において、インビボの根粒タンパクが同定されたが
（Ｔ、ビッセリングら、　（１９８３年）前出）、ダイ
スの研究では、インビトロでの翻訳産物であって先端が
切断されている可能性のあるものが検出された。

パーマとその共同研究者はまた。グイズノジュリンｃＤ
ＮＡクローンを単離した〔エフ、フラー（Ｆ。

Ｆｕｌｌｅｒ）　　ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８０巻。

２５９４〜２５９８頁、　１９８３年）。これらのクロ
ーンは。

根粒ＲＮＡ調製物からＮＯＤ　ｍＲＮＡをハイブリッド
選択するのに用いられ、長さが約１１５０．７７０およ
び３１５０ヌクレオチドのＩｗＲＮＡから、それぞれ、
　２７．２４および１００ｋＤａのインビトロでの翻訳
産物が得られた。

いくらかの相同性を互いに有する。２つの追加のクロー
ンすなわち２３．５および２４．５ｋＤａのインビトロ
翻訳産物（Ｆ、フラーおよびり、Ｐ、Ｓ、パーマ＋　Ｐ
ｌａｎｔＭｏｌ、　Ｂｉｏｌ、３巻、２１〜２Ｂ頁、　
１９８４年）を与えるそれぞれ長さが１６００および１
１００ヌクレオチドのハイブリッド選択ｍＲＮＡが同定
された。

発育中のエントウの根粒の各段階で得られる根粒ｍＲＮ
Ａを、そのＲＮＡをインビトロで翻訳し９次いで翻訳産
物を２次元のゲル電気泳動法によって分離することによ
り研究した。１５〜８０ｋＤａの範囲の分子量を有する
２１種の根粒特異的タンパクが見い出された（Ｆ、ゴー
バーら（Ｆ、Ｇｏｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ）　ＥＭＢＯＪ。

４巻、８６１〜８６７頁、　１９８５年〕。

公知の機能を有するノジュリンとしては、レグヘモグロ
ビン（Ｃ，Ａ、アップルパイ（Ｃ，＾、Ａｐｐｌｅｂｙ
）Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　３
５巻、　４４３〜４７Ｂ頁。

１９８４年〕、根粒特異的グルタミンシンセターゼ〔Ｊ
、Ｖ、キャリモアーら（Ｊ、Ｖ、Ｃａｌｌｉｍｏｒｅ　
ｅｔ　ａｌ）　Ｐｌａｎｔａ。

１５７巻、２４５〜２５３頁、　１９８３年）および根
粒特異形のウリカーゼ団、バーグマンら（Ｍ、Ｂｅｒｇ
ｍａｎｎ　ｅｔａｌ）　ＥＭＢＯＪ、　　２巻、　２３
３３〜２３３９頁、　１９８３年］がある。はとんどの
ノジュリンの機能は明らかにされていない。ノジュリン
は、基質の根粒菌への輸送。

根粒菌が排出するアンモニアの同化または根粒組織の老
化の際、皮層細胞の脱分化および分裂増殖の後に、根粒
組織を形成する時に特異的機能を有する。

ブラシリゾビウム　ジャポニクムに感染させた成熟（２
１日）タイズ根粒から調製したｃＤＮへライブラリーは
、初期（７日）ノジュリン遺伝子のｍＲＮ八転へ物のコ
ピーについて分析がなされている〔フランセンら（Ｆｒ
ａｎｓｓｅｎ　ｅＬ　ａｌ）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、　８４巻、　４４９５〜４４９９頁、　１９８
７年〕。これらの遺伝子は１根粒構造が形成されている
間中発現される。ｐＥｎｏｄ２　（その挿入断片がノジ
ュリン−７５（Ｎ−７５）をコードするｃＤＮＡクロー
ン）の配列が決定された。その９９８ｋｂの挿入断片は
、短いポリ（Ａ）テールを存し、プロリンに冨んだタン
パクをコードしている。長さが約１２００ヌクレオチド
の根粒ｍＲＮＡを、ハイブリッド選択し、インビトロで
翻訳して。

各々Ｍｎが約７５ｋＤａの２つのポリペプチドを得た。

ｍＲＮＡのコード量（ｃｏｄｉｎｇ　ｃａｐａｃｉｔｙ
）は、　７５ｋＤＡより有意に小さいが、コラーゲンの
ようなプロリンに富んだタンパクは、ポリアクリルアミ
ドゲル上で特異的な挙動をすることが知られている（Ｊ
、Ｗ。

フレイタッグら（Ｊ、Ｗ、Ｆｒｅｙｔａｇ　ｅｔ　ａｌ
）、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

１８巻、　４７６１〜４７６８頁、　１９７９年〕。Ｎ
−７５の発現は。

根粒発育７日目に初めて検出され、その時、根粒の分裂
組織が、根の表皮を通じて現れ、約１３日日まで明確な
発現が増大する。発現は、Ｒ，フレデイ−（Ｒ，ｆｒｅ
ｄｉｉ）で誘発された効力のない根粒中に。

感染系もしくは根粒菌なしで観察された。従って。

Ｎ−７５は、感染過程自体よりも、根粒の形態形成時に
発現されるようである（Ｈ，フランセンら、　Ｐｒｏｃ
。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８４巻、４４
９５〜４５９９頁、　１９８７年）。

遺伝子の発現を制御するＤＮＡ配列要素についてはます
ます解明されつつある。以下に、ポリメラーゼＨによっ
て転写される植物遺伝子について考察する。ｍＲＮＡ合
成の開始を指示する公知の配列環境の刺激に応答して転
写を制御する配列、転写のレベルを調節する配列および
組織特異的に遺伝子発現を調節する配列がある。

プロモーターは２遺伝子の開始部に位置するＤＮＡ配列
の一部分であって、　　ＲＮＡポリメラーゼに転写を開
始させて次いでタンパク合成を進めることができるシグ
ナルを含んでいる。真核プロモーターは複雑であり、転
写開始部位（＋１）に対してほぼ３０の位置にＴＡＴＡ
ボックス共通配列を有する要素を含む（Ｒ，ブリースナ
ツバおよびＰ、チャンポン（Ｒ。

Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈ　ａｎｄ　Ｐ、Ｃｈａｍｂｏｎ）
　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、５０巻、３４９〜
３８３頁、　１９８１年；Ｃ，クレーマイヤーら（Ｃ，
Ｋｕｈｌｅｍｅｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ）　Ａｎｎ、Ｒｅｖ
、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏ！３８巻、２２１〜２５７
頁、　１９８７年］。植物では、Ｊ、メシングら（Ｊ、
Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ　）が、Ｔ、コスゲ、Ｃ。

メレティスおよび＾、ホＬ／７ダー（Ｔ、Ｋｏｓｕｇｅ
、　Ｃ。

Ｍｅｒｅｄｉｔｈ　ａｎｄ　Ａ、Ｈｏ１ｌａｅｎｄｅｒ
）ｔｌ集の”Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ″１９８３年１中でＡＧＧＡボッ
クスと命名した共通配列を、　ＣＡＡＴボックスの代わ
りに用いてキャップ部位（＋１））から同様の距離のと
ころに位置させることができる。遺伝子の５゛側領域に
ある他の配列として、下流の遺伝子の発現を調節する配
列が知られている。例えば照明、栄養利用率、高熱、嫌
気生活または重金属の存在などのような環境条件に応答
して参画する配列がある。

発育中または組織特異的に遺伝子の発現を制御するシグ
ナルもまた。存在する。プロモーターは通常、対応する
遺伝子のコード領域の開始部の５°側すなわち上流に位
置し、プロモーター配列と、転写の調節もしくは絶対レ
ベルに影響する補助的なプロモーター関連配列を含むＤ
ＮＡ系とは、　１００ｂｐより小さいかまたはｌ　ｋｂ
ｐと同じ程度の大きさである。

Ｇ、コーリイおよびＰ、グルメ（Ｇ、Ｋｈｏｕｒｙ　ａ
ｎｄ　Ｐ。

Ｇｒｕｓｓ）、　Ｃｅ１ｌ、　２２巻、　３１３〜３１
４頁、　１９８３年、によって定義されているように、
エンハンサ−とは。

近くの遺伝子に対する位置および方向に比較的左右され
ずに転写の効率を増大させると考えられる。

１組の真核プロモーター関連の要素の１つである。

原型のエンハンサ−は、動物ウィルスのＳＶ４０に見い
出される。一般に、動物のエンハンサ−または動物ウィ
ルスのエンハンサ−は、５′側１　ｋｂｐの距離にわた
っていずれの方向にも機能し、そして遺伝子に対し５゛
側もしくは３゛側で作用できる。同定配列モチーフ（５
’−ＧＴＧＧＡＡＡ　（もしくはＴＴＴ）Ｇ−３’　）
が一般に反復されている。ＳＶ４０エンハンサ−のコア
共通配列と相同で、植物遺伝子内に同定されるか、この
遺伝子に隣接する配列が存在するが、これらの配列の植
物内における機能的な意義はまだ決定されていない。

植物のある種の構成遺伝子および誘導遺伝子に対して５
“側に存在するエンハンサ−様要素の報告もある。Ｊ、
オーデルら（Ｊ、０ｄｅｌｌ　ｅｔ　ａｔ）、　Ｎａｔ
ｕｒｅ。

３１３巻、８１Ｏ〜８１２頁、　１９８５年、には、キ
メラ構造のリポータ−遺伝子の発現レベルを増大するの
に必要なＣａＭＷ３５５転写の開始部位に対して５′側
の約１００ｂｐの配列を記載している。植物内で機能し
うる。２つの異なる転写活性化要素が、アグロバクテリ
ウム　ツメファシェンス（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）　Ｔ−ＯＮへの７８０遺伝子
とＯＣＳ遺伝子から誘導されている（Ｗ、ブルースおよ
びＷ、ガーリ−（Ｗ、Ｂｒｕｃｅ　ａｎｄ　Ｗ、Ｇｕｒ
ｌｅｙ）　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　７巻。

５９〜６７頁、　１９８７年；Ｊ、エリスら（Ｊ、Ｅｌ
ｌｉｓ　ｅｔ　ａｌ）。

ＥＭＢＯＪ、　　６巻、１１〜１６頁、　１９８７年〕
。調節されるエンハンサ−様要素には１組織特異的発現
や照明に対する応答を媒介すると信じられている要素が
含まれる〔門、チムニら（Ｍ、Ｔｉｍｋｏ　ｅｔ　ａｌ
）、　Ｎａｔｕｒｅ。

３１８巻、５７９〜５８２頁、　１９８５年；Ｈ，コー
レンら（Ｈ，Ｋａｕｌｅｎ　ｅｔ　ａｌ）、　ＥＭＢＯ
Ｊ、　５巻、１〜８頁、　１９８６年；Ｊ、シンプソン
ら（Ｊ、Ｓｉｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ）ＥＭＢＯＪ、。

４巻、　２７２３〜２７２９頁、　１９８５年；Ｊ、シ
ンプソンら。

Ｎａｔｕｒｅ＋　３２３巻、　５５１〜５５４頁、　１
９８６年；Ｒ，フルールら（Ｒ，Ｆｌｕｈｒ　ｅｔ　ａ
ｌ）Ｓｃｉｅｎｃｅ＋　２３２巻、１１０６〜１１１２
頁、　１９８６年〕。

根粒遺伝子の発現を調節する分子機構は、まだ明らかに
されていない。ｖ、ｐ、モー口ら（Ｖ、Ｐ、Ｍａｕｒ。

ｅｔ　ａｌ）、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅ
ｓ、　１３巻、　２３９〜２４９真、　１９８５年では
、ダイスの３つのノジュリン遺伝子の保存ＤＮＡ配列モ
チーフに対する５゛側に隣接する配列が分析されている
。その研究者らは、３つの保存配列モチーフ、すなわち
共通配列ａ　５’−ＧＴＴＴＣＣＣＴ−３’　、共通配
列ｂ　５’−ＧＧＴＡＧＴＧ−３’および共通配列ｃ５
”−ＴＣＴＧＧＧＡＡＡ−３°を見い出した。これらの
配列が、ノジュリン遺伝子の調節時に機能するのか否か
は知られていないが、たとえそのように機能するとして
も９発現をもたらす刺激については知られていない。ダ
イズ中のＥｎｏｄ２遺伝子の発現を制御する分子機構も
知られていないが、Ｆ、ゴーバースら（Ｐ、Ｇｏｖｅｒ
ｓ　ｅｔ　ａｌ）、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２３巻。

５６４〜５６６頁、　１９８６年には９発育中のエント
ウの根粒中に、リゾビウム　レグミノサルムのｎｏｄ遺
伝子またはＳｙｍプラスミドの１０ｋｂＮ域にある隣接
遺伝子が、ダイスのＥｎｏｄ２遺伝子に相同の初期のノ
ジュリン遺伝子の誘導に関与していることが示されてい
る。

ジエンセンら（Ｊｅｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ）＋　Ｎａｔ
ｕｒｅ、　３２１巻。

６６９〜６７４頁、　１９８６年、では、野性のマメ科
植物ロクス　コルニクラタス（Ｌｏｔｕｓ　ｃｏｒｎｉ
ｃｕｌａｔｕｓ）が、レグヘモグロビン−ＣＡＴキメラ
構築物（ｃｈｉｍｅｒｉｃｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）で形質
転換されている。根をアグロバクテリウム　リゾゲネス
（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏ　ｅｎｅｓ
）の菌株に感染させ、ハイブリッド遺伝子を含む形質転
換植物が得られた。リゾビウムロチ（ハ■吐ｉｕｍ　１
ｏｔｉ）に感染させると、適用されたすべての基準に合
致するように、導入されたＣＡＴ遺伝子を発現する根粒
が形成された。

（発明の要旨） この発明では、ダイズ内で機能するＤＮＡ配列の単離と
特性決定について述べられ、各配列は、ブラシリゾビウ
ム　ジャポニクムを接種後にダイスの根粒が発生する初
期の段階で、下流の構造遺伝子の発現を調節する。これ
らの調節領域は、他のノジュリン遺伝子よりも早く根粒
発生の発現を指令するという点において、さきに述べた
ノジュリン遺伝子由来の調節領域とは異なる。これらの
調節領域は、初期のノジュリン遺伝子（Ｅｎｏｄ２　）
の領域である。

Ｅｎｏｄ２遺伝子は、ノジュリン−７５，すなわち、み
かけの分子量が約７５ｋＤａで根粒発育の初期の段階で
発現するポリペプチドをコードする。Ｅｎｏｄ２ａＸＪ
１節領域は、！！伝子の転写開始部位から５゛側に約１
ｋｂ延びている。組織特異的に調節された遺伝子発現に
必要なすべてのシグナルが、この１０００ｂｐの５゛側
に隣接する領域内に含まれている。Ｅｎｏｄ２ａＳＪ１
節領域は、根粒発青領域の初期の発育中のタイズ根粒の
表層内で組織特異的に下流の構造遺伝子の発現を制御す
る。

組織特異的な初期ノジュリン調節領域の例は。

Ｎ−７５をコードするダイス（但り１岨ｍａｘ）のＥｎ
ｏｄ２ａおよびＥｎｏｄ２ｂの遺伝子の５“側隣接領域
に見出される。Ｅ　ｎ　ｏ　ｄ　２ａ　調節領域は、そ
の遺伝子の転写開始部位から約１　ｋｂ５’側にのびて
いる。この調節領域は。

表１の約５２０位のヌクレオチドから約１５６５位のヌ
クレオチドまでのびるヌクレオチド配列を有する。

Ｅｎｏｄ２ｂ調節領域は、その遺伝子の転写開始部位か
ら約１　ｋｂ５’側にのび１表２に示す約１３２０位の
ヌクレオチドから約２３６５位のヌクレオチドまでの領
域である。これらの調節領域は１発育中の根粒中で組織
特異的に下流の遺伝子の発現を指示する。

組織特異的な初期のノジュリン遺伝子の調節領域のその
他の例には、ダイスのＢｎｏｄ２ａ遺伝子およびＥｎｏ
ｄ２ｂ遺伝子の５°側隣接領域に共通のＤＮＡ配列があ
る。この調節要素は１表１に示す、　１０５０位のヌク
レオチドから約１５６５位のヌクレオチドまでのびるＤ
ＮＡ配列、または１表２に示す、約１８５０位のヌクレ
オチドから約２３６５位のヌクレオチドまでのびるＤＮ
Ａ配列を含んでいる。この調節領域は９発育中の根粒内
で組織特異的に下流の構造遺伝子の発現を指示する。

この発明の主要な目的は、当業者が、ダイズ根粒中のＭ
ｉ織特異的な遺伝子の発現を行えるようにすることであ
る。この目的は、　Ｅｎｏｄ２調節領域と命名されたＤ
ＮＡ配列を利用することによって達成される。この調節
領域は、根粒発育の初期段階に下流の構造遺伝子の発現
を指令する。Ｅｎｏｄ２調節領域という用語は、　Ｅｎ
ｏｄ２遺伝子の根粒特異的調節領域を総称するのに用い
られる。Ｅｎｏｄ２調節領域は、プロモーター配列と、
下流の構造遺伝子の発現を調節する働きをするプロモー
ター関連配列とを含をする。

この発明は、　Ｅｎｏｄ２調節領域と、植物の発現可能
な構造遺伝子とを含有する組み換え体ＤＮＡ分子を提供
するものであり、該構造遺伝子は、前記調節領域に対し
で３°側に位置して、この領域の調節制御下にあり、そ
の結果、構造遺伝子は１発育中のダイズ根粒中で発現さ
れる。一般に、遺伝子融合体を含む構造遺伝子は、いず
れも植物中で発現可能であるが１本発明の組み換え体Ｄ
ＮＡ分子に利用することができる。

本発明の組み換え体ＤＮＡ分子は１発育中のダイズ根粒
中で、所望の、植物発現可能な構造遺伝子を選択して発
現させる方法に有用である。このような方法では、タイ
ズ植物は遺伝子的に形質転換されて３本発明の組み換え
体ＤＮＡ分子を含有し。

その分子は、　Ｅｎｏｄ２調節領域と、　Ｅｎｏｄ２調
節要素の調節制御下にあるように位置する所望の構造遺
伝子とを含有する。このように形質転換されたタイズ植
物は９発育中の根粒内で組織特異的に所望の構造遺伝子
を発現する。特に、所望の構造遺伝子の根粒に特異的な
発現は１本発明の組み換え体ＤＮＡ分子をダイスの組織
に導入し、タイズ植物を。

形質転換された組織から再生することによって達成する
ことができる。本発明の組み換え体ＤＮＡ分子は、ダイ
ズ内に天然には生成しない異種の構造遺伝子を組織特異
的に発現させるのに特に有用である。植物の細胞や組織
の、外因性のまたは異種のＤＮＡによる形質転換、およ
び形質転換された細胞もしくは組織からの植物の再生は
、当該技術分野で公知の手段で達成することができる。

本発明の組換えＤＮＡ分子は、　Ｅｎｏｄ２遺伝子調節
領域、およびダイズＥｎｏｄ２構造遺伝子以外の植物の
発現可能な構造遺伝子を含み、該植物の発現可能な構造
遺伝子が該調節領域の調節制御下で発現されうるように
位置づけられている。

植物の発現可能な構造遺伝子を組織特異的な手法でタイ
ズ植物の根粒中で発現させる本発明の方法は、　Ｅｎｏ
ｄ２遺伝子調節領域と植物の発現可能な構造遺伝子とを
有する組換えＤＮＡ分子を含有するように、タイズ植物
を形質転換する工程を包含し。

該構造遺伝子が、該調節領域の調節制御下で発現するよ
うに位置づけられている。

（発明の構成） 本願の明細書と特許請求の範囲で使う場合の目的と範囲
に曖昧さを除くために、下記のような定義を行う。

本願に記載されているｒ　Ｅｎｏｄ２遺伝子」は、タイ
ズ（但ｙ１吐ｍａｘ）の初期ノジュリン（ｎｏｄｕｌｉ
ｎ）遺伝子であり、みかけの分子量が約７５ｋＤａのノ
ジュリンポリペプチド〔すなわち、ノジュリン７５（Ｎ
−７５）　）をコードする。２つの遺伝子、　Ｅｎｏｄ
２ａおよびＥｎｏｄ２ｂ遺伝子が例示され、それぞれ表
１および表２に示すＤＮＡ配列によって同定される。

ｒ　Ｅｎｏｄ２調節領域」は、　Ｅｎｏｄ２コード配列
に対して５゛側に隣接するＤＮＡ配列であり、プロモー
ター配列とプロモーター関連配列とを含み、ダイズ中で
のＥｎｏｄ２遺伝子の組織特異的発現を制御する。

この調節領域は＋’Ｅｎｏｄ２遺伝子の転写開始部位か
ら約１ｋｂ上流まで及んでいる。組織特異的に調節され
た遺伝子の発現に必要なすべてのシグナルは。

約１ｋｂの５゛側隣接領域に含まれている。このような
りＮＡの拡がり内には、真核プロモーターのＴＡＴＡ共
通配列およびＣＡＡＴ共通配列に対して相同性を有する
配列と、ノジュリン遺伝子の共通配列ｌおよびｃ（Ｖ、
Ｐ、Ｍａｕｒｏら（１９８５）　、上記文献）が存在す
る。後者の配列は、根粒形成の間に、　Ｅｎｏｄ２より
後に発現されるｎｏｄ遺伝子の発現の調節に関与すると
考えられている。また、タイズ［！ｎｏｄ２ａ遺伝子の
調節領域内に見出される。　ＳＶ４０エンハンサ−のコ
ア共通配列に対して相同性を有する配列モチーフが存在
する。さらに、遺伝子発現のレベルを調節する他の配列
要素も存在するが、これらの要素は、β−ハＰユ国明か
ら０刺激に応答する。すなわち、釘±ｎ辿ｎ廊注些　お
印μｍμＷ−を接種した後の発育中のタイズ根粒におけ
る組織特異的発現を決定する。Ｅｎｏｄ２　調節領域に
よって制御されるＥｎｏｄ２遺伝子の発現は１発育中の
タイズ根粒の表層部に限定されるという点で組織特異的
である。Ｅｎｏｄ２調節領域は、播種し接種した後約７
日日に発現が始まる１発育中のダイズ根粒中の初期遺伝
子発現を制御する。発現は、　Ｂ、　ロＰ庶国吋のよう
なタイズ根粒形成細菌との接触によって誘発される。Ｅ
ｎｏｄ２遺伝子の発現は、　Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　　ｆ
ｒｅｄｉｉ株で誘発される効力のない根粒中でも起こる
。’Ｅｎｏｄ２ａ１節領域」は、プロモーター配列とプ
ロモーター関連配列とを有し、タイズのＥｎｏｄ２ａ遺
伝子の発現を制御するＤＮＡ配列である。Ｅｎｏｄ２ａ
ｉ）１節領域は、　Ｅｎｏｄ２ａ遺伝子の転写開始部位
から約１ｋｂ上流にまで及んでいる。この領域は９表１
に示すＤＮＡ配列の約５２０位のヌクレオチドから約１
５６５位のヌクレオチドによって特に同定される。［Ｅ
れｏ　ｄ　２　ｂ　３１１節領域」は。

プロモーター配列とプロモーター関連配列とを有し、ダ
イズＥｎｏｄ２ｂ遺伝子の発現を制御するＤＮＡ配列で
ある。Ｅｎｏｄ２ｂｉｌ１節領域は、　Ｅｎｏｄ２ｂ遺
伝子転写開始部位から約１ｋｂ上流にまで及んでいる。

この領域は２表２に示すＤＮＡ配列の約１３２０位のヌ
クレオチドから約２３６５位のヌクレオチドによって特
に同定される。これらの調節領域が下流の構造遺伝子の
組繊特異的な発現を指令することにより、該遺伝子はタ
イズにおける発育中の根粒の表層部で選択的に発現され
る。ｒ　Ｅｎｏｄ２共通調節領域」は。

Ｅｎｏｄ２遺伝子の転写開始部位の約５００塩基上流に
まで及ぶＤＮＡ配列である。このＥｎｏｄ２共通調節領
域の例としては、約１０５０位のヌクレオチドから約１
５６５位のヌクレオチドにまで及ぶＥｎｏｄ２ａ　（表
１　）と、約１８５０位のヌクレオチドから約２３６５
位のヌクレオチドにまで及ぶＥｎｏｄ２ｂ　（表２）の
相同配列が挙げられる。この共通調節領域は１発育中の
タイズ根粒の表層部における下流遺伝子の組織特異的発
現を制御する。

「発現」とは、ポリペプチドが形成されるような構造遺
伝子の転写および翻訳を意味する。遺伝子の発現は１例
えばタンパク産物を直接検出するか、あるいはタンパク
電気泳動法または免疫学的方法によって評価することが
できる。あるいは。

転写のｍＲＮＡ産物を検出することによって（すなわち
、ノーザンハイプリダイゼーションによって）。

発現を評価することができる。後者の方法は、タンパク
分解のようなプロセスの形容が排除されるので、転写を
調節する配列の試験には特に適切な方法である。

「プロモーター」とは、転写の開始を指令する。

構造遺伝子の５゛末端に位置するＤＮＡ配列を意味する
。プロモーター配列は、下流の構造遺伝子の発現を行わ
せるのに必要であるが、必ずしも充分ではない。このプ
ロモーター自体が、天然のものであるか１合成のもので
あるかにかかわらず、１つより多くの起源に由来するセ
グメントの複合物であってもよい。真核プロモーターは
、　ｍＲＮＡの５゛末端（キャップ部位、＋１）に対し
て約１０〜３０ｂｐ５’側の標準形５’−ＴＡＴＡＡＴ
−３′（ＴＡＴＡボックス）に相同のＤＮＡ配列要素の
存在によって一般に認識される。

標準形５’　−ＣＣＡＡＴ−３’　に相同のＤＮＡ配列
の存在によって認識される他のプロモーター要素配列が
ＴＡＴＡボックスに対して約３０ｂｐ　　５’側にしば
しば見出されるが常に見出されるわけではない。本願に
おいては、プロモーターは、転写開始部位から約１００
ｂｐ５゛側に及んでいると考えられる。−１００位から
さらに上流か、または−１００位と＋１位との間の領域
内に位置する「プロモーター関連配列要素ｊは。

調節制御に寄与するか、またはこれを行い、遺伝子発現
の相対的レベルを決定し得る。遺伝子発現の調節制御に
関連するＤＮＡ配列は、遺伝子の転写開始部位の約１ｋ
ｂ上流にまで及ぶことがある。また、転写レベルおよび
翻訳しづルのいずれについても遺伝子の調節に寄与する
。＋１位と翻訳開始部位との間に追加のプロモーター関
連配列が存在してもよい。

「構造遺伝子」とは、タンパク、ポリペプチドまたはそ
の一部をコードするＤＮＡセグメントを有し、おそらく
リポソーム結合部位および／または翻訳開始コドンを有
するが、転写を開始させる少なくとも１つの要素を欠い
ている遺伝子の部分を意味する。この用語は、細胞内に
本来見出されるが１人工的に導入された構造遺伝子のコ
ピーを意味する。構造遺伝子は、この遺伝子が導入され
ている植物細胞中には通常見出されないタンパクをコー
ドすることができる。この場合、この遺伝子は、「外来
の構造遺伝子」と呼ばれる。外来の構造遺伝子は、その
全体または一部が、細菌のゲノムもしくはエピソーム、
真核ＤＮＡもしくは色素体ＤＮＡ　、　ｃＤＮΔ、ウィ
ルスＤＮＡ　、あるいは化学的に合成されたＤＮＡに由
来するものである。さらに、構造遺伝子は、コードセグ
メント中か、あるいは発現産物の生物学的活性もしくは
化学構造１発現速度もしくは発現制御の様式に影容し得
る非翻訳領域中に、１つまたはそれ以上の改変部分を有
すると考えられる。このような改変には、１つまたはそ
れ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、および置換が含ま
れるが１　これらに限定されない。構造遺伝子は、連続
するコード配列で構成されるか、あるいは植物内で機能
する適切なスプライス接合部によって境界が決定される
１つまたはそれ以上のイントロンを含んでいてもよい。

構造遺伝子は。

天然に存在するものであるか合成されたものであるかに
かかわらず、１つまたはそれ以上の起源に由来するセグ
メントからなる複合体であってもよい。そののような構
造遺伝子は融合タンパクを生産し得る。本願では、構造
遺伝子は、翻訳終止コドンから下流にポリアデニル化シ
グナルを含んでいると考えられる。このポリアデニル化
シグナルにより１通常、　ｍＲＮＡ前駆体の３゛末端に
ポリアデニル酸領域が付加される。また、標準のポリア
デニル化シグナルが、転写物の切断を引き起こすが。

ポリ　（Ａ）付加自体は起こさないことが知られている
（ＣｏＭａｎ　ｔｅｌｌ　ら（１９８３）、　Ｎａｔｕ
ｒｅ、　３０５　：６００）。

Ｅｎｏｄ２調節領域／構造遺伝子複合体を含む組換え体
ＤＮＡ分子を植物組織に導入すると、構造遺伝子と調節
領域とが同じ起源由来のものでない構造（非相同構造）
を有することになると考えられる。

このような構造には、植物組織内で本来発現されるが、
　ｔ！ｎｏｄ２遺伝子のようには調節されない遺伝子の
追加のコピーが、　Ｅｎｏｄ２調節領域の調節制御下で
転写されるような構造が含まれる。調節領域および／ま
たは構造遺伝子が、植物組織中で遺伝子発現を行うため
に必須の機能要素を結合する方法は、当該技術分野で理
解されている。

「調節制御」とは、転写開始部位の上流の配列要素によ
る遺伝子発現の制御を意味する。ｔＮ節により、転写が
オンオフされるか、あるいは遺伝子発現のレベルが変化
し得る。構造遺伝子を配列要素の調節制御下に配置する
とは、このような配列要素の充分近傍に構造遺伝子を配
置することを意味する。構造遺伝子が配置される位置は
、このような配列要素に対して、該遺伝子がオンオフさ
れるか、あるいは発現レベルが測定し得る程度に変化す
るような位置である。このことは当業者により理解され
ている。さらに、　ｎ＋ＲＮＡの非翻訳リーダー領域に
は、翻訳レベルにある遺伝子発現の調節に寄与する配列
要素が存在する。

ＤＮＡ配列に関して、「化学合成された」とは。

非酵素的手段を用い、インビトロにおいてヌクレオチド
成分を構成することである。手作業によるＤＮＡの化学
合成は、すでに充分確立された方法（すなわち、　Ｍ、
Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　　（１９３３）　、　Ｍｅｔｈｏ
ｄｏｌ。

ｏｆ　　ＤＮＡ　ａｎｄ　ＲＮＡ　Ｓｅ　ｕｅｎｃｉｎ
　、　Ｗｅｉｓｓｍａｎｍ＋ＰｒａｅｇｅｒＰｕｂｌｉ
ｓｈｅｒｓ　（Ｎｅｅｖ　Ｙｏｒｋ）第１章）を用いて
実施し得る。ＤＮＡの自動合成は、数多くの市販の機器
のうちの１つを用いて実施し得る。ここに与えられたＤ
ＮＡ配列情報を用いれば、　Ｅｎｏｄ２調節領域または
その一部を合成することができ、これらの合成配列は９
次いで本発明の組換えＤＮＡ分子の構築に利用すること
ができる。

「植物組織」には、植物の分化組織および未分化組織が
包含され、根、シュート、葉、花粉、！子、腫瘍組織（
例えば、クラウンゴール）、および培養植物細胞の様々
な形態の集合体（例えば。

胚やカルス）が含まれるが、これらには限定されない。

この植物組織は、植物体のものであるか。

あるいは器官２組織、または細胞培養物中のものであり
得る。

ここで用いられている「相同性」とは、ヌクレオチド配
列の同一性を意味する。ＤＮＡ配列間における相同性の
程度は、　ＤＮＡハイブリダイゼーション実験により、
実験的に決定される（例えば、Ｂ。

ＲａｎｇｅｓおよびＳ、）Ｉｉｇｇｉｎｓ　　（１９８
５）　、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＨｂｒｉｄｉｚａ
ｔｉｏｎ　　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ＋　０ｘｆｏｒｄ、　
ＵＫに記載されている方法）。

ｐＥｎｏｄ２は、　２１日齢のタイズ根粒ＲＮＡを用い
て調製したｃＤＮＡライブラリーから、１０日齢の根粒
から得られたＲＮＡをプローブとして用いて単離された
。

このように、　ｐＥｎｏｄ２は、初期ノジュリンｃＤＮ
Ａクローンを表現する。ｐ　Ｅｎｏｄ２によりコードさ
れる初期ノジュリンは、根粒ｍＲＮＡをハイブリッド選
択し。

インビトロで翻訳させることにより同定された。

見かけの分子ＩＭｒが７５．０００の２つのポリペプチ
ドが見出され、それぞれＮ−７５と命名された。ｐＥｎ
ｏｄ２に対して相同性を有するこれらのｄＮＡは、わず
か約１　、２００個のヌクレオチドの長さであり、高々
的４５ｋＤａのタンパクをコードする能力を有するにす
ぎ、なかった、それゆえ、　ｐＥｎｏｄ２のタイズ特異
的な挿入物が配列決定され、Ｎ−７５のアミノ酸配列が
推定された。同程度の大きさを有する２つの０ＲＦ（表
１および表２には、　０ＲＦＩおよび０ＲＦ２として示
されている）が見出された。一方のＯＲＦは約２０個の
メチオニンを有し、他方のＯＲＦは７重の反復配列を有
するプロリンに富んだ配列であった。５ＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル上で異常な泳動を行うこと、および２つ
のＮ−７５のラベルパターンにより。

プロリンに冨んだコード配列（ＯＲＦＩ）がＮ−７５の
コード配列であると結論された。Ｎ−７５は、そのプロ
リン含量と９発育中の根粒における発現パターンとによ
り、根粒の形態形成に関与していると考えられる。Ｎ−
７５は、播種し接種した後約７日日に現れ、１３日目ま
で増加した。ｍＲＮＡは、少なくとも２１日目まで存在
し続けた。Ｎ−７５は、　Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｔｒｅｄ
ｉｉ　ＵＳＤＡ　２５７を接種したタイズにおける発育
中の効力のない根粒中にも産生される。このことから、
　ｒｈｉｚｏｂｉａが根に感染してできる典型的な根粒
構造は、　Ｅｎｏｄ２の発現に必須ではないと結論され
る。

ハイブリダイゼーションの研究によれば、　Ｐｉｓｕｔ
ａｓａｔｉｖｕｍ、　Ｖｉｃｉａｓｔａｔｉｖａ、　ハ
ｎ肚匹圓、およびアルファルファにＥｎｏｄ２　ｃＤＮ
Ａ相同配列が存在する。

エントウについては、　Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　Ｉｅ　ｕ
ｍｉｎｏｓａｒｕｍの田遺伝子または該可遺伝子に隣接
した遺伝子がＥｎｏｄ２相同遺伝子の発現に関与するこ
とが知られている（Ｆ、Ｇｏｖｅｒｓら（１９８６）、
　Ｎａｔｕｒｅ、　３２３：５６４−５６６）　　。

ｐＥｎｏｄ２に対応する２つのグイズゲノムクローンが
単離され、コード領域および隣接領域のＤＮＡ配列が決
定されている（表１および表２）。これらの遺伝子（Ｅ
ｎｏｄ２ａおよびＥｎｏｄ２ｂと呼ぶ）は、　ＡＴＧ翻
訳開始コドンの５“側約６００ｂｐから、イントロンを
含まないコード領域を経て、約５００ｂｐの３°側隣接
配列まで実質的に相同であった。これらのゲノムクロー
ンをＥｎｏｄ２　ｃＤＮＡ配列と比較すると、これら遺
伝子の一方または両方が発育中の根粒中で発現されるこ
とを示している。転写開始部位の８１マツピングによれ
ば、　Ｅｎｏｄ２ａの開始部位は表１に示すように１５
４３±２０位のヌクレオチドにあり、　Ｅｎｏｄ２ｂの
開始部位は表２に示すように約２３５０位のヌクレオチ
ドに同様に位置すると推定される。

Ｅｎｏｄ２ａ遺伝子のＤＮＡ配列は、転写調節に作用す
ると考えられるモチーフについて分析された。転写開始
部位（１５２３〜１５６３位）の上流、約１４９０位の
ヌクレオチドに、標準的なＴＡＴ＾ボックス配列に対し
て相同性を有する配列が見出された。約１４７８位には
ＣＡＡＴボックス相同配列が見出された。約１４５０位
および１４６０位には、　ＮＯＤ共通配列」に対して相
同性を有する配列モチーフが２つ存在し、キャップ部位
近くの約１５５０位には、　ＮＯＤ共通配列」に対して
相同性を有する配列モチーフが１つ存在した。

５°側隣接配列の約１ｋｂ以内には、エンハンサ−配列
である５’−ＧＴＧＧＴＴＧＴ−３”に対して相同性を
有する（不一致は２個所まで）配列が、約５６７位、９
７９位。

１０２７位、　１３７７位、および１４０４位に５つ存
在する。

Ｅｎｏｄ２調節領域内におけるどのＤＮＡ配列の機能性
も、植物分子生物学の分野の当業者により試験され得る
。本願において利用されるか、あるいは開示された配列
に、わずかの変化が存在し得ることは理解されている。

より大きく伸びた配列内のいくつかのＤＮＡ配列が機能
性を決定づける際に他のＤＮＡ配列よりも重要であるこ
とは、当該技術分野において周知である。当業者は、変
異技術により、配列の可能な変化を試験することができ
る。

この変異技術には、以下の文献に記載されたちのが包含
されるが、これらには限定されない：　Ｄ、５ｈｏｒｔ
ｌｅら　（１９８１）　　、　　八ｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅ
ｎｅｔ、、　　↓５：２６５；　　Ｍ、Ｓｍ１ｔｈ（１
９８５）　、同上＋　１９：４２３；　Ｄ、Ｂｏｔｓｔ
ｅｉｎおよびり、５ｈｏｒｔｌｅ（１９８５）　、５ｃ
ｉｅｎｃｅ、　２２９　：１１９３；　Ｓ、ＭｃＫｎｉ
ｇｈｔおよびＲ，Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ　　（１９８２）
　、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２１７：　３１６；　Ｒ。

Ｍｙｅｒｓら（１９８６）　、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２
３２：６１３゜様々な長さの欠失部分を発生させ分析す
る方法も既知である（例えば、Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓら
（１９８２）　、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ■亜ｂＬＣｏｌ
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏａｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ、　ＣｏｌｄＳｐｒｒｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅ
ｗ　Ｙｏｒｋ　）　、これらの変化および他の変化は、
当業者がプロモータ要素および構造遺伝子の機能単位を
操作し実用化し得る標準的技術を用いて決定され得る。

タイズまたは他の植物種内で機能する［Ｅｎｏｄ２遺伝
子調節領域の転写制御下で構造遺伝子を発現する遺伝的
に改変された植物組織の生産は２本願に開示された特定
の教示内容を、当該技術分野で周知の様々な技術および
手法と結合する。多くの場合、全工程の各段階には別の
手法が存在する。手法の選択は２発現複合体の導入およ
び安定な保持を目的としたベクター系の選択、改変され
るべき植物種と所望の再生計画、および使用されるべき
特定の構造遺伝子のような要素に依存している。

当業者は、所望の結果を得るために、適切な別の工程段
階を選択し使用することができる。例えば。

タイズ根粒発生の初期段階における組織特異的発現を引
き起こす植物調節要素を得るための根本的な開始点は２
本願で例示されているように、５ｍａｘのＥｎｏｄ２ａ
遺伝子またはＥｎｏｄ２ｂ遺伝子であるが。

Ｅｎｏｄ２　調節領域を有するＤＮＡを操作する方法に
対して適切な改変が加えられる限り、また別の配列によ
り与えられる調節が、タイズＥｎｏｄ２　ｉｆｆ伝子調
節領域の配列により決定される調節と同等であることが
知られていれば、他のダイズＥｎｏｄ２遺伝子の相同Ｄ
ＮＡ配列または異なる起源から得た相同ＤＮＡ配列で代
用することができる。Ｅｎｏｄ２構造遺伝子または他の
配列の類似物は、当該技術分野でよく知られているよう
に、適切な厳密性の条件下で核酸をクロスハイブリダイ
ズする能力により同定され得る。

本発明の主要な特徴は、ダイズのｆ！ｎｏｄ２　ｉｌ１
節領域により、その発現が制御される植物発現遺伝子を
有する組換えＤＮＡ分子にある。この発現複合体は、ダ
イズＥｎｏｄ２調節領域のプロモーターおよびプロモー
ター関連配列と、植物において発現可能な構造遺伝子と
を有する。調節領域および構造遺伝子は、プロモーター
配列およびプロモーター関連調節配列が発育中の根粒に
おいて組織特異的に構造遺伝子の転写を活性化し得るよ
うに、正確に配置され、かつ互いに正しく配向されなけ
ればならない。Ｅｎｏｄ２調節領域により制御されるた
めには、構造遺伝子は、その５゛末端が調節領域の３”
末端に隣接するように、調節領域の３”側に挿入されな
ければならない。ポリアデニル化シグナルは。

コード配列の３゛末端の下流に、正しい配向で配置され
なければならない。発現複合体の機能要素間の距離につ
いても考慮される。これらの距離には実質的な変化が存
在するようである。この距離に関する必要性は機能性の
面から最も良く説明される。第１近似として１機能要素
間の距離が、それらの誘導された遺伝子における距離と
同様である場合に９合理的な機能性が得られる。プロモ
ーター配列と構造遺伝子の５“末端との間の距離、また
は調節制御に応答し得る上流のプロモーター関連配列要
素と構築物中の他の成分との間の距離は。

変化することができ、こうして下流の構造遺伝子の発現
レベルに変化が生じる。融合タンパクを与える構築物の
場合、さらに必要なことは、２つの遺伝子またはその断
片が、２つのコード配列が同じ読み取り枠中に存在する
ように連結されることである。このような必要性は当該
技術分野で良く理解されている。この必要性の例外は、
一方の遺伝子から誘導されたコード配列がイントロンよ
り他方の遺伝子のコード配列から分離されている場合で
ある。この場合、コード配列は、適合するスプライシン
グ部位により境界が決定されなければならず、これらの
イントロンスプライシング部位は、転写後プロセッシン
グによりイントロンが除去された後、融合物中に両遺伝
子の正確な読み取り枠が確立されるように配置されなけ
ればならない。植物における遺伝子発現を達成する方法
は当該技術分野で一般的に理解されており、当業者は必
ずすべての必要性を満足させ得る。

ダイズのＨｎｏｄ２調節領域の制御下に、所望の構造遺
伝子を有する組換えＤＮＡ分子は、当業者に周知の任意
の方法で植物組織中に導入され得る。与えられた植物種
または特定のダイズの植物組織に用いられる技術は２周
知技術に依存している。植物細胞に外来遺伝子を安定に
挿入し、改変された細胞を操作するための新しい手段が
開発されているので、当業者は、所望の結果を得るため
に既知の方法の中から選択することができる。植物組織
に組換えＤＮＡを導入する手段には、形質転換（Ｊ。

Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら（１９８４）　、　ＥＭＢＯＪ
、、　３：　２７１？）　、エレクトロポレーション（
Ｍ、Ｆｒｏｍｍら（１９８５）　、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　　８２　：
５Ｂ２４　）　、マイクロインジェクション（＾、Ｃｒ
ｏｓｓｗａｙら（１９８６）　、　Ｍｏ１．Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、、　２０２　：１７９）　、または−Ａ　
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓから植
物組織へＴ−ＤＮ八を介して移入する方法などがあるが
、これには限定されない。

Ｔ−ＤＮＡによる形質転換は、」肛並匹旦社肚の天然の
宿主範囲に原則として限定されない。Ｔ−ＤＮＡを介し
た形質転換は、単子葉植物（Ｇ、ｌｌｏｏｙｋａａｓ−
ＶａｎＳｌｏｇｔｅｒｅｎら（１９８４）　Ｎａｔｕｒ
ｅ、肚：　７６３　）　、裸子植物（Ａ、Ｄａｎｄｅｋ
ａｒら＋　　（１９８７）　＋　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
、。

５　：５８７）　、および藻類（Ｒ，八ｕｓｉｃｈ、　
ＥＰＯ出願１０８゜５８０）について成功した報告があ
る。代表的なＴ−ＤＮＡベクター系は、以下の文献に記
載されている二Ｇ、Ａｎら（１９８５）　、　ＥＭＢＯ
Ｊ、、　４　：２７７；　Ｌ、Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔ
ｒｅｌｌａら（１９８３）　　Ｎａｔｕｒｅ、　３０３
：２０９；　１．Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら
（１９８３）　　ＥＭＢＯＪ、、　　２：９８７；　Ｌ
、Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら（１９８５）　
、　Ｐｌａｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ　１ｎｅｅｒｉ
ｎ　＋Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：ケンブリッジ大学出版会、　
ｐ、６３゜いったん植物組織へ挿入されると、構造遺伝
子の発現は、当該技術分野で周知のいかなる方法でも分
析できる０発現は、転写されたｍＲＮ＾または合成され
たタンパクとして測定することができる。植物組織のイ
ンビトロ培養に関する技術は周知であり。

数多くの場合には、全植物への再生に関する技術も周知
である。ダイズ組織の再生に関する方法も。

いくつか知られている。導入された発現複合体を産業上
有用な品種に移入する方法は、当業者に知られている。

当業者は、　Ｅｎｏｄ２遺伝子、またはＥｎｏｄ２調節
領域と該領域の調節制御下にある下流の構造遺伝子とを
有するキメラ遺伝子を、　＾ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　Ｔ−ＤＮＡに基づくベクター
またはＪｌｌＬｌ−≦１ニーｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕ
ｍｅｆａｃｉｅｎｓ　Ｔ−ＤＮＡに基づくシャトルベク
ター、あるいはＥｎｏｄ２遺伝子やキメラ遺伝子をタイ
ズや異種植物の宿主に移入し得るものに挿入することが
できる。当業者にとっては明らかなことであるが、イン
ビトロでの操作に便利な天然に存在する部位または人為
的に操作された部位を用い１発現複合体のＥｎｏｃ１２
コード領域に代えて。

あらゆる植物発現遺伝子を導入することができる。

接合部における配列は依然として転写および翻訳の機能
性と適合し得ると考えられる。遺伝子的に改変された植
物組織を得るための最終段階は１例えば、　Ｔ−ＤＮＡ
含有ベクターへ発現複合体を挿入し。

該組換えＤＮＡを植物組織に移入することにより植物組
織へ該発現複合体を導入することを包含する。改変され
たＴ−ＤＮＡはゲノムの一部として安定に組み込まれる
。

（以下余白） ｆ　ｌ：　　ｅｖｃｏｄ　Ｚ久プンＡクローンめヌクレ
オナト酌乙列ＡＴＡＣＴＴＡＪＪＩＡＡＴｒＣＴにＴＴ
Ｔ？八Ｔ丁（へＴＴＴＴＡ　　ｉｉ１６粗２： ｉｎｎべ２らデ°ｌムクローンのヌクレオチド°°ｂ乙
列人？Ｇτ入↑入　２７コ６ Ｔ’ｒＣＡＧＡＴＴＡ人ＡＡ入λ ＡＡＣＡｒＡＴＴ？ＴＡＴＡλ丁λＣＡ丁入ＡｊｔＡ％
入＾ＴｒＧ丁入ＡＣ入ＡＡＴＴ）ＪｋＴＣ入？Ｔ’ＧＡ
ｅＣ？ｒＡ？ＡＧＡＴＡＡ　　ｉＧ＋１０τＣＧＧＡＧ
ＡＣ丁＾八＾ＣＣ？Ａ （実施例） 以下の実施例は例示のみを目的として示すものであり２
本発明の範囲を制限することを意図するものではない。

これらの実施例では９分子生物学。

植物組織内の組換えＤＮＡ操作、および形質転換植物の
培養と再生に関する分野の当業者には周知であり、実施
可能な数多（の技術を利用する。酵素については市販品
を入手することができ、販売業者の勧め、あるいは当該
分野において既知のその他の変形例に従って使用される
。試薬、緩衝液および培養条件もまた当該分野に公知で
ある。標準的な分子生物学操作を含む参考文献はｒ　Ｔ
、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）　？１ｏｌｅｃｕｌ
ａｒ　■蛙」、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂ
ｏｒしａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ
　　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ；　　Ｉ？、Ｗ
ｕ（編集）　（１９７９）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ、　６８；　Ｒ，Ｗｕら（編集）　（１９８３）　Ｍ
ｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　　１００および１０１．
　Ｌ。

Ｇｒｏｓｓｍａｎおよびに、Ｍｏ１ｄａｖｅ　（Ｉ集）
　（１９８０）　Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、６５；　Ｊ、Ｍｉｌｌｅｒ　（）Ｍ集
）　（１９７２）　Ｅｘ　ｅｒｉｍｅｎｔｓｊｎ　Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ＋Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ；
　ＯｌｄおよびＰｒｊｍｒｏｓｅ　（１９８１）　ｐ　
ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｍａｒ＋ｔ−Ｐ佳Ｉ違ｖｌＬｌｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　Ｉ’ｒｅ
ｓｓ。

Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ；　Ｒ，５ｃ
ｈｌｉｅｆおよびＰ、　ＩＩｅｎｓｊｎｋ（１９８２）
　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ　拒カ旦ハ：Ｇｌｏｖｅｒ　（Ｗ集）　（
１９８５）ＤＮＡ　　二窯熊吐、　　！およびＨ巻、　
ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ＋０ｘｆｏｒｄ、ＩＪＫＨＨａｍｅ
ｓおよびｌｆｉｇｇｉｎｓ（編集）　（１９８５）　Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　ｌ（ｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ、ＵＫ；　５ｅｔ
ｌｏ−およびＡ、Ｈｏ１ｌａｅｎｄｅｒ（１９７９）　
Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ　１ｎｅｅｒｉｎ　：Ｐｒ±匹弁
士巨ａｎｄＭｅｔｈｏｄｓ、　　１〜４巻、　Ｐｌｅｎ
ｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋを包含し、これ
らは特に１本文中に示されている。

ここで使用される略語および専門語は、当該分野におい
て標準と見なされ、ここで引用したような専門誌で一般
的に使用されるものである。

２８℃で実施した点を除き、タイズ植物（飢圧江Ｌｗａ
ｘ　　（Ｌ）　Ｍｅｒｒ、ｃｖ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ）を
、エントウ豆植物について述べられているように（Ｔ、
Ｂｉｓｓｅｌｉｎｇら（１９７８）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　５３９　：１〜１１）培養
した。播種時に２種子にＢｒａｄ　ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ
　’ａ　ｏｎｉｃｕｍｌｌＳＤＡＩＩＯを接種した。根
粒をメスで根から切除した。根粒を液体窒素中で冷凍し
、使用時まで一７０°Ｃで保存した。根粒と根からの全
ＲＮＡを記述のように（Ｆ、Ｇｏｖｅｒ　ら（１９８５
）、　ＩＩ；ＭＢＯＪ、土：８６１〜８６７）単離した
。オリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィーによ
ってポリ（Ａ）゛を得、アルカリ溶解操作（Ｔ、Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら（１９８２）　、前出）によってプラスミ
ドＯＮへを単離した。

２１日齢植物の根粒から単離したポリ（Ａ）”　　ＲＮ
Ａに相補的なりＮ＾を、逆転写酵素（Ａｎｇｌｉａｎ　
Ｂｉ。

ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｅｓ５ｅｘ、　Ｅｎｇｌａｎ
ｄ）を用いて合成し。

標準条件下で（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）　、前
出）、第二の鎖の合成を行った。二本鎖ｃＤＮＡを３１
ヌクレアーゼ（１０単位／μｇのｄｓ　ｃＤＮＡ　）で
処理し、５〜３０％スクロース勾配で分画した（Ｂｅｃ
ｋｍａｎ　５Ｗ５０ロークー、　４７．００Ｏｒｐｍ、
　６時間、４°Ｃ）　、　５００ｂｓ以上の長さの二本
鎖ｃＤＮＡにｄＣでテイルを付加し１次にＰｓｔＩ切断
したオリゴ（ｄＧ）テイル付加ｐＢＲ３２２（Ｂｏｃｈ
ｒｉｎＢｅｎＭａｎｎｈｅｉｍ）　と、１：１のモル比
でアニールした。

ハイブリダイズした混合物をＤＮＡリガーゼで処理し、
　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＲＲＩを形質転
換するために使用した（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２
）前出）。

個々の形質転換体を取り、　ＬＢ培地、１５％グリセロ
ール、および１２．５μｇ７ｍｆｔテトラサイタリンを
含む９６大のマイクロタイタープレートに移して３７°
Ｃで１６時間増殖させた。２つの複製フィルターをシー
ンスクリーンプラス（Ｇｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎ　Ｐ１ｕ
ｓ＋　ＮｅｉｖＥｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）上に
作製した。１２．５　ｕ　ｇ／ｒｒｄｌテトラサイクリ
ンを含むＬＢ寒天培地で１６時間細菌を増殖させた後、
製造業者の指示に従ってハイブリダイゼーション用のフ
ィルターを調製した。

分別スクリーニングのためのプローブを、５日齢の感染
していない根の分節と接種後１０日の根粒とから単離し
たポリ（Ａ）”ＲＮＡから調製した。ポリ（Ａ）”ＲＮ
Ａは、１０μＣｔ　α−〔３”Ｐ）　−ＡＴＰ　（比活
性＝３２００Ｃｉ／ｍＭＯＬ；　　ＩＣ１＝３７ＧＢｑ
；　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）を使用
したことを除き、第一の鎖のｃＤＮＡ合成について述べ
たように培養された。フィルターを記述されているよう
にハイブリダイズした（Ｈ，Ｊ、　Ｆｒａｎｓｓｅｎら
（１９８７）　、前出）。

１０日齢の根粒のポリ（Ａ）　”ＲＮＡと特異的にハイ
ブリダイズしたクローンは、根粒発達の初期段階で発現
される初期ノジュリン遺伝子であるため＊　Ｅｎｏｄク
ローンと呼ぶ、　Ｎｏｄクローンは根粒発育の後期に発
現されるノジュリン遺伝子である。１０００ｂｐの長さ
の挿入部を持つｐＥｎｏｄ２を選択してさらに特徴づけ
を行った。

ｐＥｎｏｄ２に相同なｍＲＮＡのインビトロ翻訳産物を
既述のように決定した（Ｆｒａｎｓｓｅｎら（１９８２
）前出）。

その結果から、　ｐｆ！ｎｏｄ２がコードしたポリペプ
チドが約７５，０００の見かけ上のＭｒと約６．５の等
電点とを有することが明らかになった。確立されている
ノジュリン命名法（Ａ、ｖａｎ　Ｋａｍｍｅｎ　（１９
８４）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐ、　　２：　４３〜４５）に従って、
同定したポリペプチドをＮ−７５と命名した。（”１１
）−ロイシンの存在下におけるｐＥｎｏｄ２−ハイブリ
ッド選択ｍＲＮＡのインビトロ翻訳後に、同様に（！５
Ｓ）−メチオニンで標識したａ＋ＲＮＡと共に移動した
ポリペプチドよりもわずかに塩基性の第２のペプチドを
認めた。

長さ約１２００ヌクレオチドのＥｎｏｄ２０１ＲＮＡの
翻訳産物は、約４５．０００の最大ポリペプチドコード
量を持つ。この矛盾から、推定アミノ酸配列が、コード
されたタンパクの例外的な大きさを説明しうるかどうか
を判定するために、　ｐＥｎｏｄ２挿入部のＤＮＡ配列
を検討することにした０Ｍ１３およびｐＵｃベクターの
クローニング（Ｊ、Ｍｅｓａｉｎｇ　（１９８３）　Ｍ
ｅｔｈ　Ｅｎｚｙｍｏｌ。

１０１　　：２０〜７８）およびジデオキシ法（Ｆ、Ｓ
ａｎｇｅｒら（１９７７）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、１ＩＳＡ　７４：　５４６３〜５４６７
；Ｍ、Ｄ、Ｂｉｇｇｅｎら（１９８３）Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　８０：３９６３〜
３９６５）およびマキサム−ギルバート塩基配列決定法
（＾、Ｍ、ＭａｘａｍおよびＷ、Ｇ１１ｂｅｒｔ（１９
８９）　。

Ｍｅｔｈ　ｆ！ｎｚｙａ＋ｏ１．６５：４９９〜５６０
）に関しては標準技法を使用した。　ＤＮＡの塩基配列
データを保存し、Ｒｏｓｔａｄｅｎが作製したプログラ
ム（Ｒ，５ｔａｄｅｎ（１９８４）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ＋　１２　：　５２１〜５３８）を
用いてマイクロＶＡＸ／ＶＭＳコンピュータで分析した
。

実五〇九１： λＣＩ＋　３５内の５ａｕ３Ａによる部分消化物として
構成されたタイズ（虹股■（旦ｃｖ、Ｗａｙｎｅ　）ゲ
ノムライブラリーをＲ，ＮａｇａｏおよびＪ、Ｋｅｙ　
（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ　Ｇｅｏｒｇｉａ、Ａｔｈ
ｅｎｓ、ＧＡ）より入手した。ＬｃｏｌｉＫ８０２ｔ−
λＣＨ３５クローンの宿主として用いた。１０’という
多数のクローン（これは、グイスゲツムの２倍体である
）を、放射標識したｐＥｎｏｄ２プローブとハイブリダ
イズする配列の存在に関してスクリーニングした。

Ｃ１１６とＣＨ９はｐＥｎｏｄ２プローブとハイブリダ
イズした２つのゲノムのクローンであった。Ｂａｍ）ｌ
Ｉ。

は遼Ｒ１，およびＨｉｎｄＩ［を用いてＣＨ６およびＣ
Ｈ９での制限酵素切断地図の作成を実施した（第１図）
。

ＤＮＡを制限酵素で消化し、その断片をアガロースゲル
電気泳動にかけて分離し、そのあとシーンスクリーンプ
ラス（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎＰｌｕｓ）にプロットした
。プロットを、完全なｐＥｎｏｄ２あるいはそれから調
製したＰｓｔｌ−坦ｎｄｎｌクローンのいずれかにょっ
てプローブした。ｐＥｎｏｄ２とハイブリダイズする配
列を含む制限断片をｐＢＲ３２２にサブクローンし。

Ｌ匹且ＨＢＩＯＩにおいて増殖させた。ｐ４．５８Ｅは
ＣＨ６由来の４．５ｋｂの４遼Ｒ１断片を含有し、　ｐ
ｌｏ、２はＣＨ９由来の１０．２ＨｉｎｄＩ［［−Ｂａ
ｍ旧断片を含有する。

次に、　ｐ４．５８Ｅとｐｌｏ、２　）部分をｐＵｃｌ
ＢおよびｐｕＣ１９ベクターにサブクローンし、実施例
２で述べたように配列決定した。Ｅｎｏｄ２遺伝子を含
むｐ４．５８ＥとｐｌＯ，２の部分のＤＮＡ塩基配列を
表１および表２に示す。両方の遺伝子のコード化領域と
推定したアミノ酸配列を示す。

Ｅｎｏｄ２ａおよびＥｎｏｄ２ｂのゲノム配列の配列決
定については、上述の標準技法を使用した。これらの各
々の遺伝子の？−ド領域は９３０ｂｐの分断されない配
列である。表１は、約１６５０ｂｐの５゛側隣接配列と
、約３６０ｂｐの３′側隣接配列とともにＥｎｏｄ２ａ
遺伝子のコード領域のＤＮＡ塩基配列を示す。Ｅｎｏｄ
２ｂ遺伝子のコード領域および約６００ｂｐの５゛側隣
接配列は１表２に示すようにＥｎｏｄ２ａ遺伝子と配列
がほとんど同じである；　Ｅｎｏｄ２ｂ遺伝子の合計約
２４５０ｂｐの５゛側隣接配列および約４７０ｂｐの３
゛側隣接配列も表２に示す。２つの遺伝子は、コード領
域について１００％相同であり、また、　Ｈｎｏｄ２ａ
の１０４８位およびＥｎｏｄ２ｂの１８５２位の５ａｕ
３４部位までの約６００ｂｐの５゛側隣接ＤＮＡ　、な
らびに配列決定された３゛側隣接１）ＮＡに関してほと
んど１００％相同であることが認められた。

ｃＤＮＡクローンｐＢｎｏｄ２の配列の分析およびそれ
らの配列は、同様の長さの２つのオーブンリーディング
フレーム（ＯＲＰＩと０ＲＦ２）があることを示唆した
；両者を表１と２に示す。５ＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動実験での変則的な移動から、　０ＲＦ１が
Ｎ−７５をコードするＥｎｏｄ２遺伝子の活性なコード
配列であるという結論がある程度導かれた。０ＲＦ１に
よってコードされるポリペプチドはプロリンに富んでお
り、プロリンに冨むポリペプチドはＳＯ３−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動において異常な挙動を示すことが
知られている（Ｊ、Ｗ、Ｆｒｅｙｔａｇら（１９７９）
　、前出）。第２の理由は、ハイブリッド選択した翻訳
産物の１つがメチオニンを欠いていたことであった；　
０ＲＦＩ　　はメチオニンのコドンを１つしか持たない
（翻訳開始部位に）が、その代替的な０ＲＦＩは約２０
のメチオニンコドンを含んでおり、従ってその翻訳産物
は（３５Ｓ）−メチオニンで容易に標識されるはずであ
る。

土−型皿ぶ」旧１℃礼肌 第１図は、ダイスのＥｎｏｄ２ａ遺伝子および１Ｅｎｏ
ｄ２ｂ遺伝子と、これらの遺伝子に隣接する領域との制
限エンドヌクレアーゼ地図を示す概略図である。

ＣＩＡ−６（Ｅｎｏｄ２ａ遺伝子を含む）と、　　ＣＨ
Ａ−９（Ｅｎｏｄ２ｂ遺伝子を含む）との概略図が与え
られている。

両クローンの配列決定された領域（表１および表２）を
示す。２つのゲノムクローン間の相同性がほぼ１００％
の領域は、　Ｅｎｏｄ２　ｃＤＮＡクローンに相同のク
ローン領域として示しである。制限エンドヌクレアーゼ
は１次のような記号で示しである：１１＝ＨｉｎｄＴｆ
ｌ＋　Ｂ＝Ｂａｍｌｌｌ、　５＝Ｓａｕ３Ａ＋　Ｅ＝Ｅ
ｃｏＲＩ。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｅｎｏｄ２遺伝子調節領域、およびダイズＥｎｏｄ
   ２構造遺伝子以外の植物の発現可能な構造遺伝子を含む
   組換えＤＮＡ分子であって、 該植物の発現可能な構造遺伝子が該調節領域の調節制御
   下で発現されうるように位置づけられている、 組換えＤＮＡ分子。 ２、前記Ｅｎｏｄ２遺伝子調節領域がＥｎｏｄ２ａ調節
   領域である、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。 ３、前記調節領域が、表１の約５２０位のヌクレオチド
   から約１５６５位のヌクレオチドまでのヌクレオチド配
   列を含む、請求項２に記載の組換えＤＮＡ分子。 ４、前記Ｅｎｏｄ２遺伝子調節領域がＥｎｏｄ２ｂ調節
   領域である、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。 ５、前記調節領域が、表２の約１３２０位のヌクレオチ
   ドから約２３６５位のヌクレオチドまでのヌクレオチド
   配列を含む、請求項４に記載の組換えＤＮＡ分子。 ６、前記Ｅｎｏｄ２遺伝子調節領域がＥｎｏｄ２遺伝子
   の共通調節配列である、請求項１に記載の組換えＤＮＡ
   分子。 ７、前記調節領域が、表１の約１０５０位のヌクレオチ
   ドから約１５６５位のヌクレオチドまでのヌクレオチド
   配列を含む、請求項６に記載の組換えＤＮＡ分子。 ８、前記構造遺伝子が外来構造遺伝子である、請求項１
   に記載の組換えＤＮＡ分子。 ９、植物の発現可能な構造遺伝子を組織特異的な手法で
   ダイズ植物の根粒中で発現させる方法であって、 Ｅｎｏｄ２遺伝子調節領域と植物の発現可能な構造遺伝
   子とを有する組換えＤＮＡ分子を含有するように、ダイ
   ズ植物を形質転換する工程を包含し、該構造遺伝子が、
   該調節領域の調節制御下で発現するように位置づけられ
   ている、 方法。 １０、前記Ｅｎｏｄ２遺伝子調節領域がＥｎｏｄ２ａ調
   節領域である、請求項９に記載の方法。 １１、前記調節領域が表１の約５２０位のヌクレオチド
   から約１５６５位のヌクレオチドまでのヌクレオチド配
   列を含む、請求項１０に記載の方法。 １２、前記Ｅｎｏｄ２遺伝子調節領域がＥｎｏｄ２ｂ調
   節領域である、請求項９に記載の方法。 １３、前記調節領域が、表２の約１３２０位のヌクレオ
   チドから約２３６５位のヌクレオチドまでのヌクレオチ
   ド配列を含む、請求項１２に記載の方法。 １４、前記Ｅｎｏｄ２遺伝子調節領域がＥｎｏｄ２遺伝
   子の共通調節領域である、請求項９に記載の方法。 １５、前記調節領域が、表１の約１０５０位のヌクレオ
   チドから約１５６５位のヌクレオチドまでのヌクレオチ
   ド配列を含む、請求項１４に記載の方法。 １６、前記構造遺伝子が外来構造遺伝子である、請求項
   ９に記載の方法。 １７、前記形質転換工程が、前記組換えＤＮＡ分子をダ
   イズ組織に導入すること、および形質転換した組織から
   形質転換ダイズ植物を再生すること、を包含する、請求
   項９に記載の方法。 １８、前記構造遺伝子が、ダイズ植物の発育中の根粒に
   おいて発現し、そして該構造遺伝子が播種後約７日目か
   ら該根粒において発現する、請求項９に記載の方法。