CN116746490B - 一种提高乌菜游离小孢子出胚率及胚性培养物增殖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提高乌菜游离小孢子出胚率的方法，方法如下：(1)挑选处于单核靠边期的乌菜花蕾，并预处理、消毒；(2)研磨花蕾，将研磨液过滤至烧杯中并离心，得纯合小孢子；(3)向NLN培养基中加入2.5～10mg/L 5‑氮胞苷，用其重悬纯化小孢子；(4)对所得产物热激后转入暗培养；待出现肉眼可见的胚状体后，转移到摇床上培养。本发明还提供了一种提高乌菜胚性培养物增殖的方法。本发明的优点在于：本发明在乌菜小孢子胚培养过程中，通过添加5‑氮胞苷于NLN培养基上，可以显著提高乌菜游离小孢子出胚率；同时，通过将胚状体转移至添加有5‑氮胞苷的MS固体培养基上，进一步提高乌菜胚性培养物的增殖率。
Description
技术领域
本发明涉及遗传育种技术领域，尤其涉及一种提高乌菜游离小孢子出胚率及胚性培养物增殖的方法。
背景技术
乌菜(Brassica campestris L.ssp.Chinensis)是十字花科芸薹属白菜亚种的一个变种，杂种优势明显，但其常规杂交法育种年限较长，结合现代生物技术进行乌菜育种对提高其育种水平和效率至关重要。
游离小孢子培养技术是芸薹属蔬菜单倍体育种的一种重要的手段，其获得的DH植株是真正的纯系，且比传统的育种手段简单、高效，这大大减少了生产纯系所需的世代数，从而降低了育种计划时间和成本。
近几十年来，国内外的一些研究者关于十字花科蔬菜游离小孢子培养做了大量工作，致力于优化小孢子成胚和胚性培养物增殖体系，但目前尚有许多植物小孢子的胚胎发生率低、胚状体增殖率低，尤其是乌菜品种，这大大限制了这一技术在乌菜实际育种工作中的应用。
在植物中，DNA甲基化参与基因表达的调控，在植物生长发育过程中起着非常重要的作用，且目前许多实验结果都证实了这一点。如果甲基化不足或者太高，都会导致植物生长发育的不正常和形态异常；如拟南芥胚胎发育和种子生活力，均与DN4甲基化水平相关；脐橙DNA甲基化的频繁发生，致使它们的芽变频率比较高。因此，通过调控乌菜植物体胚的DNA甲基化水平，或能提高乌菜小孢子的胚胎发生率及增殖率。
5-氮胞苷(5-AzaCytidine，5-AzaC)是一种DNA甲基化抑制剂，为核苷类似物，能够选择性地使某些基因被激活，从而使一些真核细胞的分化状态得到改变。因此，可尝试将5-AzaC用于乌菜植物体胚形成、增殖过程，以提高乌菜小孢子的胚胎发生率及增殖率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种通过在培养基中添加5-氮胞苷来提高乌菜游离小孢子出胚率及胚性培养物增殖的方法。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种提高乌菜游离小孢子出胚率殖的方法，包括如下步骤：
(1)于抽薹盛花期，挑选并采摘处于单核靠边期的乌菜花蕾，并对其进行预处理、消毒；
(2)对消毒后的花蕾进行研磨，使花药中的小孢子游离出来，得到研磨液；随后，将研磨液过滤至烧杯中并进行离心处理，获得纯合小孢子；
(3)向NLN培养基中加入2.5～10mg/L的5-氮胞苷，并用其重悬步骤(2)得到的纯化小孢子；
(4)对步骤(3)所得产物进行热激处理后转入暗培养；待出现肉眼可见的胚状体后，将其转移到摇床上振荡培养。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，预处理指：将采摘的乌菜花蕾样本置于4℃环境下预冷处理24h。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，消毒方法为：将预处理后的乌菜花蕾样本置于无菌环境下，依次进行70％酒精消毒30s、0.1％的HgCl2摇晃消毒6min，最后再采用无菌水冲洗3次，每次5min。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，研磨、过滤、离心的具体方法为：利用经过消毒的玻璃棒，在B5溶液中将花蕾碾碎，使花药中的小孢子游离出来，得到研磨液；将研磨液通过300目无菌钢丝网筛过滤至新的无菌小烧杯，获得滤液；将滤液用40μm细胞网筛进行第二次过滤，放入无菌离心管，在8000rpm下离心3min；之后，将上清液丢弃，沉淀用B5培养基进行重悬浮，再进行离心，将上清液丢弃，从而得到纯合小孢子。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中，对纯化小孢子进行重悬时，利用细胞计数器调整小孢子的密度为1×105～5×105个/mL。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中，将步骤(3)所得产物置于33℃下热激处理24h后转入25℃下暗培养；待出现肉眼可见的胚状体后，将其转移到25℃摇床上以50rpm速度振荡培养，至形成子叶型胚状体。
一种提高乌菜胚性培养物增殖的方法，包括如下步骤：
(1)于抽薹盛花期，挑选并采摘处于单核靠边期的乌菜花蕾，并对其进行预处理、消毒；
(2)对消毒后的花蕾进行研磨，使花药中的小孢子游离出来，得到研磨液；随后，将研磨液过滤至烧杯中并进行离心处理，获得纯合小孢子；
(3)向NLN培养基中加入2.5～10mg/L的5-氮胞苷，并用其重悬步骤(2)得到的纯化小孢子；
(4)对步骤(3)所得产物进行热激处理后转入暗培养；待出现肉眼可见的胚状体后，将其转移到摇床上振荡培养至形成子叶型胚状体；
(5)将步骤(4)所得胚状体转移至MS固体培养基，并置于18℃培养室以“光照14h黑暗10h”条件培养6～20天；其中，所述MS固体培养基中提前添加有2.5～10mg/L的5-氮胞苷。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)本发明在乌菜小孢子胚培养过程中，通过添加一定浓度的甲基化抑制剂“5-氮胞苷(5-AzaC)”于NLN培养基上，并置于摇床震荡培养，可以显著提高乌菜游离小孢子出胚率；
(2)本发明通过添加一定浓度的甲基化抑制剂“5-氮胞苷”于NLN培养基上，并置于摇床震荡培一段时间后转移至添加有5-氮胞苷的MS固体培养基上，可以显著提高乌菜胚性培养物的增殖率，提高单倍体育种效率，为育种事业做贡献；
(3)本发明提供的方法具有操作简单、生产高效等优点，且能够适用于各种品种的乌菜。
附图说明
图1是实施例1中暗培养过程中小孢子膨大示意图(为显微镜图，膨大的小孢子表示：更有可能性会继续生长至子叶型或者其他类型胚)；
图2是实施例1中子叶型胚状体外观图(体视显微镜下图)；
图3是实施例4中光照14h黑暗10h条件培养20天后的植株图；
图4是实验例1中乌19品种乌菜在添加不同浓度5-氮胞苷后的胚状体外观图(图中，A图为添加0mg/L 5-氮胞苷的胚状体外观，B图为添加2.5mg/L 5-氮胞苷的胚状体外观)；
图5是实验例3中2.5mg/L5-AzaC+20d胚性培养物的外观图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种提高乌菜游离小孢子出胚率的方法，包括如下步骤：
(1)于抽薹盛花期，挑选并采摘处于单核靠边期的乌菜花蕾；将采摘的乌菜花蕾样本置于4℃环境下预冷处理24h；随后，将预处理后的乌菜花蕾样本置于无菌环境下，依次进行70％酒精消毒30s、0.1％的HgCl2摇晃消毒6min，最后再采用无菌水冲洗3次，每次5min。
(2)利用经过消毒的玻璃棒，在B5溶液中将花蕾碾碎，使花药中的小孢子游离出来，得到研磨液；将研磨液通过300目无菌钢丝网筛过滤至新的无菌小烧杯，获得滤液；将滤液用40μm细胞网筛进行第二次过滤，放入无菌离心管，在8000rpm下离心3min；之后，将上清液丢弃，沉淀用B5培养基进行重悬浮，再进行离心，将上清液丢弃，从而得到纯合小孢子。
(3)向NLN培养基中加入2.5mg/L的5-氮胞苷，并用其重悬步骤(2)得到的纯化小孢子；重悬时，利用细胞计数器调整小孢子的密度为1×105个/mL。
(4)将步骤(3)所得产物置于33℃下热激处理24h后转入25℃下暗培养，如图1所示；待出现肉眼可见的胚状体后，将其转移到25℃摇床上以50rpm速度振荡培养，至形成子叶型胚状体，如图2所示。
实施例2
本实施例的一种提高乌菜游离小孢子出胚率的方法，与实施例1基本相同，主要不同之处在于：步骤(3)中，向NLN培养基中加入5mg/L的5-氮胞苷，并用其重悬步纯化小孢子；重悬时，利用细胞计数器调整小孢子的密度为2.5×105个/mL。
实施例3
本实施例的一种提高乌菜游离小孢子出胚率的方法，与实施例1基本相同，主要不同之处在于：步骤(3)中，向NLN培养基中加入10mg/L的5-氮胞苷，并用其重悬步纯化小孢子；重悬时，利用细胞计数器调整小孢子的密度为5×105个/mL。
实施例4
本实施例的一种提高乌菜胚性培养物增殖的方法，包括如下步骤：
(1)于抽薹盛花期，挑选并采摘处于单核靠边期的乌菜花蕾；将采摘的乌菜花蕾样本置于4℃环境下预冷处理24h；随后，将预处理后的乌菜花蕾样本置于无菌环境下，依次进行70％酒精消毒30s、0.1％的HgCl2摇晃消毒6min，最后再采用无菌水冲洗3次，每次5min。
(2)利用经过消毒的玻璃棒，在B5溶液中将花蕾碾碎，使花药中的小孢子游离出来，得到研磨液；将研磨液通过300目无菌钢丝网筛过滤至新的无菌小烧杯，获得滤液；将滤液用40μm细胞网筛进行第二次过滤，放入无菌离心管，在8000rpm下离心3min；之后，将上清液丢弃，沉淀用B5培养基进行重悬浮，再进行离心，将上清液丢弃，从而得到纯合小孢子。
(3)向NLN培养基中加入2.5mg/L的5-氮胞苷，并用其重悬步骤(2)得到的纯化小孢子；重悬时，利用细胞计数器调整小孢子的密度为1×105个/mL。
(4)将步骤(3)所得产物置于33℃下热激处理24h后转入25℃下暗培养；待出现肉眼可见的胚状体后，将其转移到25℃摇床上以50rpm速度振荡培养，至形成子叶型胚状体。
(5)继续培养5天后，将所得子叶型胚状体转移至MS固体培养基，并置于18℃培养室以“光照14h黑暗10h”条件培养20天，如图3所示；其中，所述MS固体培养基中提前添加有2.5mg/L的5-氮胞苷。
实施例5
本实施例的一种提高乌菜游离小孢子出胚率的方法，与实施例4基本相同，主要不同之处在于：
步骤(3)中：向NLN培养基中加入5mg/L的5-氮胞苷，并用其重悬步纯化小孢子；重悬时，利用细胞计数器调整小孢子的密度为2.5×105个/mL。
步骤(5)中：继续培养8天后，将所得子叶型胚状体转移至MS固体培养基，并置于18℃培养室以“光照14h黑暗10h”条件培养10天；其中，所述MS固体培养基中提前添加有5mg/L的5-氮胞苷。
实施例6
本实施例的一种提高乌菜游离小孢子出胚率的方法，与实施例4基本相同，主要不同之处在于：
步骤(3)中：向NLN培养基中加入10mg/L的5-氮胞苷，并用其重悬步纯化小孢子；重悬时，利用细胞计数器调整小孢子的密度为5×105个/mL。
步骤(5)中：继续培养10天后，将所得子叶型胚状体转移至MS固体培养基，并置于18℃培养室以“光照14h黑暗10h”条件培养6天；其中，所述MS固体培养基中提前添加有10mg/L的5-氮胞苷。
实验例1
本实验例用于验证不同浓度5-氮胞苷(5-AzaC)对不同乌菜品种出胚率的影响：
一、实验方法：
选取新黄乌501、小八叶乌塌菜、彩芯912、乌19、乌20、黑心乌六个品种的乌菜，进行游离小孢子培养。在游离小孢子过程中，配制好浓度分别为0、2.5、5、10mg/L的5-氮胞苷，分别加入NLN培养基中，15天后统计各品种的出胚率情况，进而研究不同浓度5-氮胞苷对乌菜游离小孢子出胚率的影响(其他步骤相同，参照实施例1)。
二、实验结果：
结果如表1所示。同时，乌19品种乌菜在添加0mg/L 5-氮胞苷后的胚状体外观如图4A所示，添加2.5mg/L 5-氮胞苷后的胚状体外观如图4B所示。
表1、不同浓度的5-氮胞苷对乌菜游离小孢子出胚率的影响
从表1可以看出：(1)与不添加5-氮胞苷的组相比，添加不同浓度5-氮胞苷的NLN培养基中，小孢子出胚率均有所提高，但不同乌菜品种之间小孢子的出胚率存在差异。(2)适宜浓度能显著提高乌菜游离小孢子出胚率，尤其是在添加了5-氮胞苷的“乌19”这个品种乌菜的出胚率提高了2.1倍，且在添加2.5mg/L的5-氮胞苷的培养基中各品种出胚率达均达最高。
综上，5-氮胞苷可以提高不同乌菜品种出胚率，2.5mg/L是其最适宜浓度。
实验例2
本实验例用于验证不同浓度5-氮胞苷(5-AzaC)以及培养室培养时间对乌菜胚性培养物的增殖的影响：
一、实验方法：
首先，选用48株黑心乌(HXW)的小孢子胚为实验材料，将其平均分为四大组(每组12份材料)，每组均按照实施例1中提供的培养方法进行培养，但NLN培养基中不加入5-氮胞苷，当进行到实施例1的步骤(4)后，继续培养5天，再将所得子叶型胚状体分别转移至含有不同浓度5-氮胞苷(0～10mg/L)的MS固体培养基。具体如下：
大组一：MS固体培养基中提前加入0mg/L的5-氮胞苷，作为对照；
大组二：MS固体培养基中提前2.5mg/L的5-氮胞苷；
大组三：MS固体培养基中提前5mg/L的5-氮胞苷；
大组四：MS固体培养基中提前加入10mg/L的5-氮胞苷。
其次，将每个大组再平均分为四个小组，每个小组3份材料(三个重复)，每个小组在培养物转移到MS固体培养基(添加有对应5-氮胞苷)后，在18℃培养室以“光照14h黑暗10h”条件培养时间不同(6～20天)，具体如下：
小组1：将MS固体培养基(添加有对应5-氮胞苷)置于18℃培养室光照14h黑暗10h培养6天；
小组2：将MS固体培养基(添加有对应5-氮胞苷)置于18℃培养室光照14h黑暗10h培养9天；
小组3：将MS固体培养基(添加有对应5-氮胞苷)置于18℃培养室光照14h黑暗10h培养12天；
小组4：将MS固体培养基(添加有对应5-氮胞苷)置于18℃培养室光照14h黑暗10h培养20天。
每个小组完成后，统计各组数据，鲜重量包含培养基重量，且数据为其平均值。(培养基重量控制在175.40g左右)
二、实验结果：
结果如表2所示。
表2、不同浓度5-氮胞苷和培养时间对乌菜胚性培养物增殖的影响
由表2可知：与添加0mg/L 5-氮胞苷的组相比，在MS培养基中添加不同浓度的5-氮胞苷、18°光照14h黑暗10h培养6～20天，均能有效提高乌菜胚性培养物的增殖；但在“2.5mg/L 5-AzaC+20d”的组合下，乌菜胚性培养物的鲜重达最高，即增殖最大。
实验例3
本实验例用于验证“2.5mg/L 5-AzaC+20d”处理对不同品种乌菜胚性培养物增殖的影响。
一、实验方法：
选取新黄乌501、小八叶乌塌菜、彩芯912、乌19、乌20、黑心乌六个品种的乌菜，进行游离小孢子培养，照实施例1中提供的培养方法进行培养，但NLN培养基中不加入5-氮胞苷(5-AzaC)，当进行到实施例1的步骤(4)后，继续培养5天，再将所得子叶型胚状体分别转移至含5-氮胞苷的MS固体培养基。
每个品种取20份，并对各20份材料分别进行两个处理，即处理1和处理2。每个处理完成后，统计数据，鲜重量包含培养基重量，且数据为其平均值。其中：
处理1：MS固体培养基中添加的5-氮胞苷浓度为0mg/L，18°光照14h黑暗10h培养时长为20d；
处理2：MS固体培养基中添加的5-氮胞苷浓度为2.5mg/L，18°光照14h黑暗10h培养时长为20d。
二、实验结果：
结果如表3所示。处理2的胚性培养物如图5所示。
表3、不同处理对不同品种乌菜胚性培养物增殖的影响
从表3可知：对于不同乌菜品种而言，“2.5mg/L5-AzaC+20d”均可显著提高其胚性培养物的增殖。
实验例4
本实验例用以综合验证不同阶段添加5-氮胞苷(5-AzaC)对提高乌菜(以黑心乌为例)胚性培养物增殖的影响。
一、实验方法
设置三个实验组，每个组处理完成后，统计数据，鲜重量包含培养基重量，且数据为其平均值。其中：
实验组1：NLN培养基中加入2.5mg/L的5-氮胞苷；MS固体培养基中不添加5-氮胞苷(以实施例4为参照)；
实验组2：NLN培养基中加入2.5mg/L的5-氮胞苷；MS固体培养基中添加2.5mg/L5-氮胞苷(以实施例4为参照)；
实验组3：NLN培养基中不加入5-氮胞苷；MS固体培养基中添加2.5mg/L5-氮胞苷(以实施例4为参照)。
二、实验结果：
结果如表4所示。
表4、不同实验组胚性培养物增殖情况
从表4可知：在乌菜小孢子胚培养过程中，通过添加一定浓度的甲基化抑制剂“5-氮胞苷(5-AzaC)”于NLN培养基上，并置于摇床震荡培养，对后续提高胚性培养物增殖也具有一定作用，但还是在转胚阶段的MS固体培养基上添加5-氮胞苷的影响最大；同时，当NLN培养基与MS固体培养基均添加相应浓度的5-氮胞苷时，效果最好。
综上，我们可以得出：5-氮胞苷(5-AzaC)可能通过促进乌菜游离小孢子早期体胚的形成，进而促进小孢子的出胚率以及其胚性培养物的增殖；此外，浓度为2.5mg/L 5-AzaC与20d、18°光照14h黑暗10h培养对于乌菜胚性培养物的增殖具有显著的作用，可能是5-氮胞苷作为一种5-胞嘧啶类似物，可抑制DNA甲基转移酶活性，导致基因组DNA低甲基化。进而促进植物体胚的形成，从而提高了其胚性培养物的增殖。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种提高乌菜游离小孢子出胚率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)于抽薹盛花期，挑选并采摘处于单核靠边期的乌菜花蕾，并对其进行预处理、消毒；
(2)对消毒后的花蕾进行研磨，使花药中的小孢子游离出来，得到研磨液；随后，将研磨液过滤至烧杯中并进行离心处理，获得纯合小孢子；
(3)向NLN培养基中加入2.5mg/L的5-氮胞苷，并用其重悬步骤(2)得到的纯化小孢子；
(4)对步骤(3)所得产物进行热激处理后转入暗培养；待出现肉眼可见的胚状体后，将其转移到摇床上振荡培养。
2.根据权利要求1所述的提高乌菜游离小孢子出胚率的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，预处理指：将采摘的乌菜花蕾样本置于4℃环境下预冷处理24h。
3.根据权利要求1所述的提高乌菜游离小孢子出胚率的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，消毒方法为：将预处理后的乌菜花蕾样本置于无菌环境下，依次进行70％酒精消毒30s、0.1％的HgCl2摇晃消毒6min，最后再采用无菌水冲洗3次，每次5min。
4.根据权利要求1所述的提高乌菜游离小孢子出胚率的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，研磨、过滤、离心的具体方法为：利用经过消毒的玻璃棒，在B5溶液中将花蕾碾碎，使花药中的小孢子游离出来，得到研磨液；将研磨液通过300目无菌钢丝网筛过滤至新的无菌小烧杯，获得滤液；将滤液用40μm细胞网筛进行第二次过滤，放入无菌离心管，在8000rpm下离心3min；之后，将上清液丢弃，沉淀用B5培养基进行重悬浮，再进行离心，将上清液丢弃，从而得到纯合小孢子。
5.根据权利要求1所述的提高乌菜游离小孢子出胚率的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，对纯化小孢子进行重悬时，利用细胞计数器调整小孢子的密度为1×105～5×105个/mL。
6.根据权利要求1所述的提高乌菜游离小孢子出胚率的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，将步骤(3)所得产物置于33℃下热激处理24h后转入25℃下暗培养；待出现肉眼可见的胚状体后，将其转移到25℃摇床上以50rpm速度振荡培养，至形成子叶型胚状体。
7.一种提高乌菜胚性培养物增殖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)于抽薹盛花期，挑选并采摘处于单核靠边期的黑心乌花蕾，并对其进行预处理、消毒；
(2)对消毒后的花蕾进行研磨，使花药中的小孢子游离出来，得到研磨液；随后，将研磨液过滤至烧杯中并进行离心处理，获得纯合小孢子；
(3)向NLN培养基中加入2.5mg/L的5-氮胞苷，并用其重悬步骤(2)得到的纯化小孢子；
(4)对步骤(3)所得产物进行热激处理后转入暗培养；待出现肉眼可见的胚状体后，将其转移到摇床上振荡培养至形成子叶型胚状体；
(5)将步骤(4)所得胚状体转移至MS固体培养基，并置于18℃培养室以“光照14h黑暗10h”条件培养6～20天；其中，所述MS固体培养基中提前添加有2.5mg/L的5-氮胞苷。
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