CN114916441A - 一种利用褪黑素提高乌菜游离小孢子出胚率的方法 - Google Patents

一种利用褪黑素提高乌菜游离小孢子出胚率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用褪黑素提高乌菜游离小孢子出胚率的方法，涉及遗传育种技术领域，包括在盛花期对乌菜花蕾喷施浓度为0‑15mg/L的褪黑素，喷施处理24h后采摘相应的花蕾，并置于4℃条件冷激，用于后续小孢子的游离和培养；培养过程包括挑选单核靠边期的花蕾样本进行消毒后研磨，使花药中的小孢子游离出来，然后将研磨液过滤至烧杯中并进行离心处理，获得纯合小孢子等；本发明提供的方法简单，能够有效提高乌菜游离小孢子出胚率。

Description

一种利用褪黑素提高乌菜游离小孢子出胚率的方法
技术领域
本发明涉及遗传育种技术领域，尤其涉及一种利用褪黑素提高乌菜游离小孢子出胚率的方法。
背景技术
乌菜又叫乌塌菜、塌菜等，是十字花科芸苔属芸苔种白菜亚种的一个变种，主要分布在长江流域，在我国安徽、江苏、上海等众多地区均有种植。乌菜主要以叶片为食，其营养价值丰富，口感鲜美，供货期长，又因其好看的外形广受消费者青睐。
游离小孢子的培养是单倍体育种的重要手段，是基于植物细胞具有全能性的原理，将单核靠边期的小孢子从花药中游离出来，于培养基中进行培养，从而获得再生植株的过程。
芸苔属植物游离小孢子培养，主要是通过添加不同的外源物质来提高小孢子的出胚率。常见的有添加活性炭，阿拉伯半乳糖，谷胱甘肽等，但对乌菜游离小孢子培养的效果并不显著。此外，不同的植物生长调节剂，如NAA、BR、6-BA等添加在NLN培养基中，对芸苔属小孢子的培养也有着不同程度的影响，找到一种显著提高乌菜游离小孢子出胚率的方法和最佳体系仍迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种利用褪黑素提高乌菜游离小孢子出胚率的方法，以解决现有技术中乌菜游离小孢子培养效果不显著的技术问题。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种利用褪黑素提高乌菜游离小孢子出胚率的方法，该方法具体为：
步骤1、在盛花期，对乌菜植株的花蕾喷施浓度为0-15mg/L褪黑素，24h后采摘并置于4℃条件冷激；
步骤2、冷激处理后，挑选单核靠边期的花蕾用70％的酒精消毒30s，再用0.1％的升汞消毒6min，最后用无菌水冲洗3次，每次5min，之后放入烧杯中；
向烧杯中加入适量B5培养基，用无菌玻璃棒在B5液体中研磨花蕾，使花药中的小孢子游离出来，获得研磨液，令磨液通过300目无菌钢丝网筛过滤至新的50mL无菌小烧杯中，获得滤液；滤液通过细胞网筛二次过滤至50mL无菌离心管中，于8000rmp离心3min，离心处理后弃上清液，用B5培养基重悬浮，再次离心，弃上清液，获得纯合小孢子；
用NLN-13培养基重悬步骤2所得纯合小孢子，并加入活性炭，充分混匀后分装于直径为60mm的培养皿中，于33℃下热激24h后，转移至25℃恒温培箱培养，直至出胚；待出现肉眼可见的胚胎时再转移至25℃的摇床中震荡培养，整个培养过程均再黑暗条件下进行。
进一步，步骤1中冷激时间为24h。
所述步骤2中细胞网筛为40um。
进一步，所述步骤2中摇床的震荡速度为50rmp/min。
本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明提供了一种可以显著提高乌菜游离小孢子出胚率的方法，该方法操作简单，且有利于优化乌菜游离小孢子培养体系，提高单倍体育种效率，加快育种进程。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例用于验证盛花期于花蕾上喷施不同浓度褪黑素(MT)对后期乌菜游离小孢子出胚率的影响：
实验方法：
以10个品种的乌菜(南京紫乌、黄心菜二号、徽乌二号、淮南黄心菜、7-2、乌15、乌16、乌19、乌23、乌25，其中7-2、乌15、乌16、乌19、乌23、乌25为安徽农业大学种植园培育所得)为实验材料，每个品种50份，分别进行编号1-50；并对500份材料进行常规田间管理，直至抽薹开花。
将每个品种的50份材料分为5组，每组10株；按照如下方式进行处理：
组一：在乌菜花蕾上喷施清水，作为对照；
组二：在乌菜花蕾上喷施2.5mg/L的褪黑素；
组三：在乌菜花蕾上喷施5mg/L的褪黑素；
组四：在乌菜花蕾上喷施10mg/L的褪黑素；
组五：在乌菜花蕾上喷施15mg/L的褪黑素。
喷施处理24h后采摘相应的花蕾，并置于4℃条件冷激24h，用于后续小孢子的游离和培养。
每组均按照以下步骤进行培养，培养步骤具体为：
冷激处理后，挑选单核靠边期的花蕾样本，先用70％的酒精消毒30s，再用0.1％的升汞消毒6min，最后用无菌水冲洗3次，每次5min，然后放入烧杯中；
向盛有消毒后花蕾的烧杯中加入适量B5培养基，用无菌玻璃棒在B5液体中研磨花蕾，使花药中的小孢子游离出来，获得研磨液。
将研磨液通过300目无菌钢丝网筛过滤至新的50mL无菌小烧杯中，获得滤液；滤液通过细胞网筛二次过滤至50mL无菌离心管中，于8000rmp离心3min，离心处理后弃上清液，用B5培养基重悬浮，再次离心，弃上清液，获得纯合小孢子。
之后用NLN-13培养基重悬所得纯合小孢子，并加入活性炭，充分混匀后分装于直径为60mm的培养皿中，之后于33℃下热激24h后，转移至25℃恒温培养箱培养，直至出胚；
待出现肉眼可见的胚胎时再转移至25℃的摇床中震荡培养(转速50r/min)，20天后统计出胚率，整个培养过程均在黑暗条件下进行，所得结果如表1：
盛花期于花蕾上喷施不同浓度MT对乌菜游离小孢子出胚率的影响
Figure BDA0003659479600000041
表1
由表1可知，与清水处理的对照组相比，在盛花期花蕾上喷施不同浓度的褪黑素对小孢子的出胚率均有所提高，但不同品种之间小孢子的出胚率存在差异。适宜浓度却能显著提高乌菜游离小孢子出胚率，尤其是乌15这个乌菜品种喷施了10mg/L的MT，出胚率达到5.81胚/蕾，较对照组提高了近1.8倍。
实施例2
本实施例用于验证向游离小孢子NLN培养基种添加不同浓度MT对乌菜游离小孢子出胚率的影响：
以10个品种的乌菜(南京紫乌、黄心菜二号、徽乌二号、淮南黄心菜、7-2、乌15、乌16、乌19、乌23、乌25)为实验材料，每个品种50份，分别进行编号1-50；并对500份材料进行常规田间管理，直至抽薹开花。
分别采摘10个品种的花蕾，做好品种标记，并置于4℃条件冷激24h，用于后续小孢子的游离和培养。
冷激处理后，挑选单核靠边期的花蕾样本，先用70％的酒精消毒30s，再用0.1％的升汞消毒6min,最后用无菌水冲洗3次，每次5min，然后放入烧杯中；
向盛有消毒好的花蕾的烧杯中加入适量B5培养基，用无菌玻璃棒在B5液体中研磨花蕾，使花药中的小孢子游离出来，获得研磨液。将研磨液通过300目无菌钢丝网筛过滤至新的50mL无菌小烧杯中，获得滤液；滤液通过细胞网筛二次过滤至50mL无菌离心管中，于8000rmp离心3min；离心处理后弃上清液，用B5培养基重悬浮，再次离心，弃上清液，获得纯合小孢子；
用NLN-13培养基重悬4中的纯合小孢子，并加入活性炭，充分混匀后分装于直径为60mm的培养皿中，每个品种的小孢子悬浮液平均分装到5个培养皿中，编号A、B、C、D、E，并进行以下处理：
处理一：在分装好的培养皿A中不添加褪黑素，以作为对照；
处理二：在分装好的培养皿B中添加浓度为0.025mg/L的MT；
处理三：在分装好的培养皿C中添加浓度为0.05mg/L的MT；
处理四：在分装好的培养皿D中添加浓度为0.1mg/L的MT；
处理五：在分装好的培养皿E中添加浓度为0.2mg/L的MT。
得到五组培养物，每组培养物于33℃下热激24h后，转移至25℃恒温培养箱培养，直至出胚；待出现肉眼可见的胚胎时再转移至25℃的摇床中震荡培养(转速50r/min)，20天后统计出胚率，整个培养过程均再黑暗条件下进行；所得结果如表2：
向NLN培养基中添加不同浓度MT对小孢子出胚率的影响
Figure BDA0003659479600000061
表2
由表2可知，与对照组相比，对于大部分乌菜品种来说，向NLN-13培养基中添加褪黑素能提高小孢子的出胚率，但部分品种便显抑制出胚的现象，如淮南黄心菜这个材料，在添加较低浓度褪黑素时，较对照组出现抑制现象，但适宜浓度的褪黑素有助于小孢子出胚。
实施例3
本实施例用于验证向盛花期花蕾上喷施不同浓度MT的同时向小孢子培养基中添加不同浓度的MT对乌菜游离小孢子出胚率的影响：
以50份乌15为实验材料，分别进行编号1-50；并对50份材料进行常规田间管理，直至抽薹开花；
将50份材料分为5组，每组10株；按照如下方式进行处理：
组一：在乌菜花蕾上喷施清水，作为对照；
组二：在乌菜花蕾上喷施2.5mg/L的褪黑素；
组三：在乌菜花蕾上喷施5mg/L的褪黑素；
组四：在乌菜花蕾上喷施10mg/L的褪黑素；
组五：在乌菜花蕾上喷施15mg/L的褪黑素。
喷施处理24h后采摘相应的花蕾，并置于4℃条件冷激，用于后续小孢子的游离和培养。
冷激处理后，挑选单核靠边期的花蕾样本，先用70％的酒精消毒30s，再用0.1％的升汞消毒6min,最后用无菌水冲洗3次，每次5min，然后放入烧杯中；
向盛有消毒好的花蕾的烧杯中加入适量B5培养基，用无菌玻璃棒在B5液体中研磨花蕾，使花药中的小孢子游离出来，获得研磨液，将研磨液通过300目无菌钢丝网筛过滤至新的50mL无菌小烧杯中；滤液通过细胞网筛二次过滤至50mL无菌离心管中，于8000rmp离心3min；离心处理后弃上清液，用B5培养基重悬浮，再次离心，弃上清液，获得纯合小孢子。
用NLN-13培养基重悬所得纯合小孢子，并加入活性炭，充分混匀后分装于直径为60mm的培养皿中，将每种浓度褪黑素喷施处理后的游离小孢子悬浮液平均分装到5个培养皿中，编号a、b、c、d、e，并进行以下处理：
处理一：在分装好的培养皿a中不添加褪黑素，以作为对照；
处理二：在分装好的培养皿b中添加浓度为0.025mg/L的MT；
处理三：在分装好的培养皿c中添加浓度为0.05mg/L的MT；
处理四：在分装好的培养皿d中添加浓度为0.1mg/L的MT；
处理五：在分装好的培养皿e中添加浓度为0.2mg/L的MT；
获得五组培养物；
将培养物于33℃下热激24h后，转移至25℃恒温培养箱培养，直至出胚；待出现肉眼可见的胚胎时再转移至25℃的摇床中震荡培养(转速50r/min)，20天后统计出胚率，整个培养过程均再黑暗条件下进行；所得结果如表3。
喷施不同浓度的MT分别在不同浓度MT处理下对游离小孢子出胚率的影响
Figure BDA0003659479600000081
Figure BDA0003659479600000091
表3
由表3可知，经过盛花期于花蕾处喷施褪黑素处理后，再向NLN培养基中添加褪黑素，不仅没有促进乌菜游离小孢子出胚率，反而抑制出胚，对于喷施15mg/L并且向NLN-13培养基添加0.2mg/L的褪黑素后，出胚率仅有1.53胚/蕾，较对照组降低了2倍，这显著抑制乌菜游离小孢子的出胚率。
综上所述，我们可以得出在乌菜盛花期花蕾上喷施褪黑素相比于在培养基中添加褪黑素或在花期及培养基培养过程中均添加褪黑素更有利于乌菜游离小孢子出胚，然而，对于最佳的喷施浓度因基因型的差异而有所不同。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种利用褪黑素提高乌菜游离小孢子出胚率的方法，其特征在于，该方法具体为：
步骤1、在盛花期，对乌菜植株的花蕾喷施浓度为0-15mg/L褪黑素，24h后采摘并置于4℃条件冷激；
步骤2、冷激处理后，挑选单核靠边期的花蕾用70％的酒精消毒30s，再用0.1％的升汞消毒6min，最后用无菌水冲洗3次，每次5min，之后放入烧杯中；
向烧杯中加入适量B5培养基，用无菌玻璃棒在B5液体中研磨花蕾，使花药中的小孢子游离出来，获得研磨液，令磨液通过300目无菌钢丝网筛过滤至新的50mL无菌小烧杯中，获得滤液；滤液通过细胞网筛二次过滤至50mL无菌离心管中，于8000rmp离心3min，离心处理后弃上清液，用B5培养基重悬浮，再次离心，弃上清液，获得纯合小孢子；
用NLN-13培养基重悬步骤2所得纯合小孢子，并加入活性炭，充分混匀后分装于直径为60mm的培养皿中，于33℃下热激24h后，转移至25℃恒温培箱培养，直至出胚；待出现肉眼可见的胚胎时再转移至25℃的摇床中震荡培养，整个培养过程均再黑暗条件下进行。
2.根据权利要求1所述的方法，步骤1中冷激时间为24h。所述步骤2中细胞网筛为40um。
3.根据权利要求2所述的方法，所述步骤2中摇床的震荡速度为50rmp/min。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115316280A (zh) * 2022-09-16 2022-11-11 安徽农业大学 提高乌菜子叶形胚形成率及一步成苗率的方法
CN116746490A (zh) * 2023-07-03 2023-09-15 安徽农业大学 一种提高乌菜游离小孢子出胚率及胚性培养物增殖的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106718825A (zh) * 2016-11-22 2017-05-31 安徽省农业科学院园艺研究所 一种乌菜游离小孢子培养方法
CN113973715A (zh) * 2021-11-26 2022-01-28 安徽农业大学 一种提高乌菜小孢子出胚率的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106718825A (zh) * 2016-11-22 2017-05-31 安徽省农业科学院园艺研究所 一种乌菜游离小孢子培养方法
CN113973715A (zh) * 2021-11-26 2022-01-28 安徽农业大学 一种提高乌菜小孢子出胚率的方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115316280A (zh) * 2022-09-16 2022-11-11 安徽农业大学 提高乌菜子叶形胚形成率及一步成苗率的方法
CN116746490A (zh) * 2023-07-03 2023-09-15 安徽农业大学 一种提高乌菜游离小孢子出胚率及胚性培养物增殖的方法
CN116746490B (zh) * 2023-07-03 2024-02-02 安徽农业大学 一种提高乌菜游离小孢子出胚率及胚性培养物增殖的方法

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