CN112568125B - 一种提高小麦成熟胚再生率的组织培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高小麦成熟胚再生率的组织培养方法，属于植物组织培养技术领域。本发明发现在小麦成熟胚的组织培养过程中，添加一定浓度的组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以有效提高胚性愈伤组织诱导率和再生率；特别是在小麦成熟胚培养的预培养基中添加200μM的丁酸钠或0.5μM的曲古抑菌素A，可有效提高小麦材料CB037、Fielder和中国春的小麦成熟胚再生率。

Description

一种提高小麦成熟胚再生率的组织培养方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种提高小麦成熟胚再生率的组织培养方法。
背景技术
小麦（Triticum aestivum L.）是世界第一大口粮作物，约35%~40%的人以其为口粮。随着全球人口总量的不断增加和生物技术的不断发展，通过分子设计育种改良小麦的产量和品质等农艺性状已成为重要趋势。基因功能研究需要利用基因工程方法将外源基因导入小麦，而小麦组织培养的低再生频率是遗传转化的重要限制因素。
目前，小麦遗传转化常用的外植体有幼胚、成熟胚、花药和幼穗等，其中，幼胚被认为是最理想的外植体，愈伤组织诱导率和植株再生率都比较高，获得转基因小麦植株的报道多以转化幼胚为主。但幼胚取材受时间和空间的限制，适宜的取材时间难以准确把握，在一定程度上制约了小麦遗传转化的规模化开展。成熟胚具有取材方便、不易受环境条件影响、个体间生理状态一致等优势，成为目前研究者进行突破的热点。但是，小麦成熟胚的组织培养比较困难，再生率比较低，能够用于遗传转化的基因型还很少。
组蛋白修饰是表观遗传修饰的重要调控机制之一，包括组蛋白乙酰化、甲基化、泛素化及磷酸化等过程。其中，组蛋白乙酰化的过程是动态和可逆的，包括乙酰化和去乙酰化两个过程，分别由组蛋白乙酰转移酶（HATs）和组蛋白去乙酰化酶（HDACs）催化完成。研究表明HDACs在植物生长发育中发挥关键作用，其中包括花发育、种子发育、根发育以及器官生长过程中细胞的增殖和死亡等，同时响应生物和非生物胁迫，如干旱、盐胁迫、低温等。目前对植物中HDACs的功能研究主要集中在拟南芥等模式植物中，关于HDACs在小麦成熟胚组织培养中的研究尚未见报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种提高小麦成熟胚再生率的组织培养方法。本发明研究发现，在小麦成熟胚培养的预培养基中添加一定浓度的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，可有效提高胚性愈伤组织诱导率和再生率。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供组蛋白去乙酰化酶抑制剂在提高小麦成熟胚的胚性愈伤组织诱导率和再生率中的应用。
优选的，上述应用中，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂选自曲古抑菌素A（Trichostatin A）或丁酸钠（sodium butyrate）。
优选的，上述应用中，所述曲古抑菌素A的加入浓度为0.5µM，丁酸钠的加入浓度为200µM。
本发明的第二方面，提供一种提高小麦成熟胚再生率的组织培养方法，包括以下步骤：
（1）对小麦种子进行预处理，将预处理后的小麦种子的成熟胚刮碎，接种于添加有组蛋白去乙酰化酶抑制剂的预培养基中，在黑暗、25℃条件下培养7天，得到小麦成熟胚愈伤组织；
（2）将步骤（1）得到的小麦成熟胚愈伤组织转移到诱导培养基中，在黑暗、25℃条件下培养14天，得到胚性愈伤组织；
（3）将步骤（2）得到的胚性愈伤组织转移到分化培养基中，在光照16小时/天、光强3500Lux、温度25℃条件下培养21天。
优选的，步骤（1）中，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂选自曲古抑菌素A或丁酸钠；所述曲古抑菌素A的加入浓度为0.5µM，丁酸钠的加入浓度为200µM。
优选的，步骤（1）中，所述预培养基以MS基本培养基为基础，并添加有0.75 g/LMgCl2、15.0 g/L 甘露醇、15.0 g/L 山梨醇、0.5 g/L 水解酪蛋白、10.0 g/L 葡萄糖、1.0mg/L B1维生素、0.5 mg/L B3 维生素、0.5 mg/L B6维生素、2.0 mg/L 甘氨酸、100 mg/L 肌醇、78 mg/L乙酰丁香酮、2.0 mg/L 2,4-D、5.0 mg/L AgNO3、40.0 mg/L 半胱氨酸、100.0mg/L 维生素C和10 g/L琼脂；pH 5.8。
优选的，步骤（2）中，所述诱导培养基以MS基本培养基为基础，并添加有1.0 mg/LB1维生素、0.5 mg/L B3维生素、0.5 mg/L B6维生素、2.0 mg/L甘氨酸、100 mg/L 肌醇、3.0%蔗糖、2.0 mg/L 2,4-D、5.0 mg/L AgNO3和3.0 g/L植物凝胶；pH 5.8。
优选的，步骤（3）中，所述分化培养基以MS基本培养基为基础，并添加有1.0 mg/LB1维生素、0.5 mg/L B3维生素、0.5 mg/L B6维生素、2.0 mg/L甘氨酸、5.0 mg/L 谷氨酰胺、2.0%蔗糖、0.2 mg/L IAA和3.0 g/L植物凝胶；pH 5.8。
优选的，所述小麦种子来自小麦材料CB037、Fielder或中国春。
本发明的有益效果：
本发明首次研究发现，在小麦成熟胚的组织培养过程中，添加一定浓度的组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以有效提高胚性愈伤组织诱导率和再生率；特别是在小麦成熟胚培养的预培养基中添加0.5µM的曲古抑菌素A或200µM的丁酸钠，可有效提高小麦材料CB037、Fielder和中国春的小麦成熟胚再生率。
附图说明
图1：曲古抑菌素A对小麦成熟胚再生率的影响，A、CB037于未添加曲古抑菌素A的培养基上培养（对照）；B、CB037在添加0.5 µM曲古抑菌素A的培养基上培养；C、CB037在添加2.5 µM曲古抑菌素A的培养基上培养；D、Fielder于未添加曲古抑菌素A的培养基上培养（对照）；E、Fielder在添加0.5 µM曲古抑菌素A的培养基上培养；F、Fielder在添加2.5 µM曲古抑菌素A的培养基上培养；G、中国春于未添加曲古抑菌素A的培养基上培养（对照）；H、中国春在添加0.5 µM曲古抑菌素A的培养基上培养；I、中国春在添加2.5 µM曲古抑菌素A的培养基上培养。
图2：丁酸钠对小麦成熟胚再生率的影响；图中，A、CB037于未添加丁酸钠培养基上培养（对照）；B、CB037在添加200 µM丁酸钠培养基上培养；C、CB037在添加1000 µM丁酸钠培养基上培养；D、Fielder于未添加丁酸钠培养基上培养（对照）；E、Fielder在添加200 µM丁酸钠培养基上培养；F、Fielder在添加1000 µM丁酸钠培养基上培养；G、中国春于未添加丁酸钠培养基上培养（对照）；H、中国春在添加200 µM丁酸钠培养基上培养；I、中国春在添加1000 µM丁酸钠培养基上培养。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分介绍的，成熟胚具有取材方便、不易受环境条件影响、个体间生理状态一致等优势；但是，小麦成熟胚的组织培养比较困难，再生率比较低，能够用于遗传转化研究的小麦基因型还很少。
基于此，本发明对如何提高小麦成熟胚组织培养过程中的再生率进行了深入研究。本发明研究发现，在小麦成熟胚培养的预培养基中添加一定浓度的组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以有效提高胚性愈伤组织诱导率和再生率。本发明进一步对组蛋白去乙酰化酶抑制剂的种类和加入浓度进行了优化考察，结果发现，在小麦成熟胚培养的预培养基中添加200µM的丁酸钠或0.5µM的曲古抑菌素A，可有效提高小麦材料CB037、Fielder和中国春的小麦成熟胚再生率，由此提出了本发明。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中，本发明所用的春小麦材料为CB037、Fielder和中国春。
本发明实施例中所用到的培养基的成分如表1所示。
表1：培养基组成
培养基 成分
预培养基 MS 基本培养基 + 0.75 g/L MgCl<sub>2</sub> + 15.0 g/L 甘露醇 + 15.0 g/L 山梨醇 + 0.5 g/L 水解酪蛋白 +10.0 g/L 葡萄糖 + 1.0 mg/L B<sub>1</sub>维生素 + 0.5 mg/L B<sub>3</sub> 维生素 + 0.5 mg/L B<sub>6</sub>维生素 + 2.0 mg/L 甘氨酸 + 100 mg/L 肌醇+ 78 mg/L乙酰丁香酮 + 2.0 mg/L 2,4-D + 5.0 mg/L AgNO<sub>3</sub> + 40.0 mg/L 半胱氨酸+ 100.0 mg/L 维生素C， pH 5.8，10 g/L琼脂。
诱导培养基 MS 基本培养基 + 1.0 mg/L B<sub>1</sub>维生素 + 0.5 mg/L B<sub>3</sub>维生素 + 0.5 mg/L B<sub>6</sub>维生素+ 2.0 mg/L甘氨酸 +100 mg/L 肌醇 + 3.0%蔗糖 + 2.0 mg/L 2,4-D + 5.0 mg/L AgNO<sub>3</sub>，pH 5.8， 3.0 g/L植物凝胶。
分化培养基 MS 基本培养基 + 1.0 mg/L B<sub>1</sub>维生素 + 0.5 mg/L B<sub>3</sub>维生素 + 0.5 mg/L B<sub>6</sub>维生素 + 2.0 mg/L甘氨酸 +5.0 mg/L 谷氨酰胺 + 2.0% 蔗糖 + 0.2 mg/L IAA， pH 5.8，3.0 g/L植物凝胶。
MS基本培养基成分为：NH4NO3 1650 mg/L、KNO3 1900 mg/L、CaCl2·2H2O 440 mg/L、MgSO4·7H2O 370 mg/L、KH2PO4 1700 mg/L、KI 0.83 mg/L、H3BO3 6.2 mg/L、MnSO4·4H2O22.3 mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L、CuSO4·5H2O 0.025 mg/L、CoCl2·6H2O 0.025 mg/L、FeSO4·7H2O 27.8 mg/L、Na2EDTA·2H2O 37.3 mg/L。
实施例1：
一、小麦成熟种子的获得：
CB037、Fielder和中国春3月份春播于山东农业大学实验站农场，同年6月份收获成熟种子。
二、小麦成熟种子灭菌：
挑选成熟饱满、当年收获、无破损的CB037、Fielder和中国春种子，在超净工作台内倒入75%乙醇（v/v），摇床180转/分钟，震荡消毒10分钟，再用25%次氯酸钠（次氯酸钠原液有效氯≥10%）（v/v）消毒25分钟，无菌水冲洗4次，无菌水没过种子25℃培养箱中过夜。次日早晨，用25%次氯酸钠（次氯酸钠原液有效氯≥10%）（v/v）消毒15分钟，无菌水冲洗4次。
三、小麦成熟胚的组织培养
（1）小麦成熟胚预培养
将消毒的小麦成熟胚用手术刀刮碎，置于预培养基上诱导愈伤组织。预培养基中添加0.5 µM 和2.5 µM的曲古抑菌素，以不添加曲古抑菌素的预培养基为对照。每个浓度3个重复，每个重复接种30个左右的小麦成熟胚。培养条件为：黑暗、温度25℃，培养时间为7天。
（2）愈伤组织诱导培养
将小麦成熟胚愈伤组织置于愈伤组织诱导培养基上进行培养，培养14天后统计胚性愈伤组织数目。培养条件为黑暗、温度25℃，培养时间为14天。
（3）分化培养
将胚性愈伤组织转移到分化培养基上，培养21天后统计愈伤组织分化数目和再生芽数目，培养条件为：光照16小时/天、光强3500Lux、温度25℃，培养时间为21天。
四、数据统计与分析
小麦成熟胚在预培养基培养7天时统计接种数目，在胚性愈伤组织诱导培养基培养14天统计胚性愈伤组织诱导数目，在分化培养基上培养21天统计成熟胚的愈伤组织分化数目和再生芽数目，并计算，见公式(1)，公式(2)和公式(3)。
Figure 743344DEST_PATH_IMAGE002
五、不同浓度曲古抑菌素对小麦成熟胚再生效率的影响
在添加曲古抑菌素的预培养基上培养CB037、Fielder和中国春3个小麦基因型的的成熟胚，胚性愈伤组织诱导率、愈伤组织分化率和再生率的统计结果见表2和图1。
添加0.5 µM的曲古抑菌素可有效提高小麦成熟胚的胚性愈伤组织诱导率和再生率；而添加2.5 µM的曲古抑菌素时，则在一定程度上降低再生效率。添加0.5 µM曲古抑菌素后，CB037的胚性愈伤组织诱导率由66.87%提高至69.39%，Fielder的胚性愈伤组织诱导率由45.41%提高至48.00%，中国春的胚性愈伤组织诱导率由30.95%提高至37.78%，与对照相比均有显著提高。在提高再生率方面，添加0.5 µM的曲古抑菌素可分别将CB037、Fielder和中国春的再生率由对照的79.62%提高至91.84%，31.15%提高至38.25%，16.86%提高至23.89%。由以上数据可知，适宜浓度的曲古抑菌素可有效提高不同小麦基因型的胚性愈伤组织诱导率和再生率，且较低浓度的曲古抑菌素促进效果更显著。
表2：不同浓度曲古抑菌素对小麦成熟胚再生效率的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE004A
实施例2：
一、小麦成熟种子的获得
CB037、Fielder和中国春3月份春播于山东农业大学实验站农场，同年6月份收获成熟种子。
二、小麦成熟种子灭菌
挑选成熟饱满、当年收获、无破损的CB037、Fielder和中国春种子，在超净工作台内倒入75%乙醇（v/v），摇床180转/分钟，震荡消毒10分钟，再用25%次氯酸钠（次氯酸钠原液有效氯≥10%）（v/v）消毒25分钟，无菌水冲洗4次，无菌水没过种子25℃培养箱中过夜。次日早晨，用25%次氯酸钠（次氯酸钠原液有效氯≥10%）（v/v）消毒15分钟，无菌水冲洗4次。
三、小麦成熟胚的组织培养
（1）小麦成熟胚预培养
将消毒的小麦成熟胚用手术刀刮碎，置于预培养基上诱导愈伤组织。预培养基中添加200 µM 和1000 µM的丁酸钠，以不添加丁酸钠的预培养基为对照。每个浓度3个重复，每个重复接种30个左右的小麦成熟胚。培养条件为：黑暗、温度25℃，培养时间为7天。
（2）愈伤组织诱导培养
将小麦成熟胚愈伤组织置于愈伤组织诱导培养基上进行培养，培养14天后统计胚性愈伤组织数目。培养条件为黑暗、温度25℃，培养时间为14天。
（3）分化培养
将胚性愈伤组织转移到分化培养基上，培养21天后统计愈伤组织分化数目和再生芽数目，培养条件为：光照16小时/天、光强3500Lux、温度25℃，培养时间为21天。
四、数据统计与分析
小麦成熟胚在预培养基培养7天时统计接种数目，在胚性愈伤组织诱导培养基培养14天统计胚性愈伤组织诱导数目，在分化培养基上培养21天统计成熟胚的愈伤组织分化数目和再生芽数目，并计算，计算公式同实施例1。
五、不同浓度丁酸钠对小麦成熟胚再生效率的影响
CB037、Fielder和中国春3个小麦基因型的的成熟胚，在添加丁酸钠的预培养基培养后的再生结果见表3和图2。
表3：不同浓度丁酸钠对小麦成熟胚再生效率的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE006A
由表3可知，添加200 µM和1000 µM 丁酸钠可有效提高小麦成熟胚再生效率。添加丁酸钠后，CB037的胚性愈伤组织诱导率由66.87%分别提高至77.78%和70.37%，与对照相比均有显著的提高。Fielder在200 µM和1000 µM时，胚性愈伤组织诱导率分别为59.62%和57.58%，愈伤组织分化率35.77%和33.33%，与对照相比，均有极显著水平的提高；再生率分别为42.31%和39.39%，与对照31.15%相比，有显著差异水平的提高。中国春在添加200 µM丁酸钠时，胚性愈伤组织诱导率由对照的30.95%提高至34.64%，与对照相比有显著水平的提高。由以上数据可知，丁酸钠对不同小麦基因型再生率的均有促进作用，且较低浓度的丁酸钠促进效果更显著。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种提高小麦成熟胚再生率的组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对小麦种子进行预处理，将预处理后的小麦种子的成熟胚刮碎，接种于添加有组蛋白去乙酰化酶抑制剂的预培养基中，在黑暗、25℃条件下培养7天，得到小麦成熟胚愈伤组织；
（2）将步骤（1）得到的小麦成熟胚愈伤组织转移到诱导培养基中，在黑暗、25℃条件下培养14天，得到胚性愈伤组织；
（3）将步骤（2）得到的胚性愈伤组织转移到分化培养基中，在光照16小时/天、光强3500Lux、温度25℃条件下培养21天；
步骤（1）中，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂选自曲古抑菌素A或丁酸钠；所述曲古抑菌素A的加入浓度为0.5µM，丁酸钠的加入浓度为200µM；
步骤（1）中，所述预培养基以MS基本培养基为基础，并添加有0.75 g/L MgCl2、15.0 g/L甘露醇、15.0 g/L 山梨醇、0.5 g/L 水解酪蛋白、10.0 g/L 葡萄糖、1.0 mg/L B1维生素、0.5 mg/L B3维生素、 0.5 mg/L B6维生素、2.0 mg/L 甘氨酸、100 mg/L 肌醇、78 mg/L乙酰丁香酮、2.0 mg/L 2,4-D、 5.0 mg/L AgNO3、40.0 mg/L 半胱氨酸、100.0 mg/L 维生素C和10 g/L琼脂；pH 5.8；
步骤（2）中，所述诱导培养基以MS基本培养基为基础，并添加有1.0 mg/L B1维生素、0.5mg/L B3维生素、0.5 mg/L B6维生素、2.0 mg/L甘氨酸、100 mg/L 肌醇、3.0%蔗糖、2.0 mg/L2,4-D、5.0 mg/L AgNO3和3.0 g/L植物凝胶；pH 5.8；
步骤（3）中，所述分化培养基以MS基本培养基为基础，并添加有1.0 mg/L B1维生素、0.5mg/L B3维生素、0.5 mg/L B6维生素、2.0 mg/L甘氨酸、5.0 mg/L 谷氨酰胺、2.0%蔗糖、0.2mg/L IAA和3.0 g/L植物凝胶；pH 5.8。
2.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述小麦种子来自小麦材料CB037、Fielder或中国春。
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