CN109609542A

CN109609542A - 多聚磷酸盐激酶基因ppk1在水稻中的基因工程应用

Info

Publication number: CN109609542A
Application number: CN201811625533.3A
Authority: CN
Inventors: 杨柳燕; 王鑫; 魏儒平; 王国红; 戈炜焜; 杨轶程
Original assignee: Boyu Environmental Protection Technology Research Institute (nanjing) Co Ltd; Nanjing University
Current assignee: Boyu Environmental Protection Technology Research Institute (nanjing) Co Ltd; Nanjing University
Priority date: 2018-12-28
Filing date: 2018-12-28
Publication date: 2019-04-12

Abstract

本发明公开了多聚磷酸盐激酶基因ppk1在提高水稻除磷能力中的应用，属于植物基因工程领域。本发明通过在水稻中表达多聚磷酸盐激酶基因ppk1，介导Pi转化为polyP，实现在维持水稻高磷含量的同时获得接近野生型的生物量，从而实现真正意义上的水稻强化除磷。

Description

多聚磷酸盐激酶基因ppk1在水稻中的基因工程应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种多聚磷酸盐激酶基因ppk1在水稻中的基因工程应用。

背景技术

磷是地球生物系统必需的大量元素之一，它不但是许多生物大分子如核酸、磷脂和含磷蛋白酶类的重要组成部分，而且还广泛地参与到生物体内的能量转移、信号转导、光合作用等过程，它参与了所有生命循环的全过程且不可或缺。然而20世纪以来在人类活动作用下，大量沉积型的原本以磷矿石形态存在的磷经过人类、植物界、以及动物界，进入陆地并最终流向水环境。作为淡水系统中浮游生物生长的限制性因子，磷在水体中的持续存留导致了水体的富营养化。为了修复富营养化水体，利用水生植物生长同化作用除磷已被广泛应用，但通常情况下磷的含量只占植物干重的0.05-0.5％。要提高单位种植面积内磷去除的总量，一方面需要挑选“喜磷”水生植物，另一方面对现有植物进行改造，增加单位生物量中磷含量。

从污染水体除磷修复角度来看，在已经能够进行基因工程改造的植物中，禾本科的水稻具有重大的参考价值。水稻磷营养的基因工程改造主要集中在强化水稻内源磷酸盐转运蛋白(PHTs)的表达、上调起正向调控作用的转录因子的表达或者下调起反向调控作用的转录因子的表达。这些手段都能够显著提高水稻的总磷含量，但由于Pi在细胞质中过量存积导致植株发育缓慢、叶片早衰以及生物量显著降低，影响植株对磷的吸收总量。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供多聚磷酸盐激酶基因ppk1在水稻中的基因工程应用。

为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案：

多聚磷酸盐激酶基因ppk1在提高水稻除磷能力中的应用，所述多聚磷酸盐激酶基因ppk1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

作为优选，所述水稻的品种为日本晴。

表达多聚磷酸盐激酶的基因工程水稻的构建方法，包括如下步骤：

(1)将多聚磷酸盐激酶基因ppk1表达组件克隆至表达质粒，得到重组质粒；

(2)将重组质粒电转化根癌农杆菌，得到根癌农杆菌工程菌；

(3)将根癌农杆菌工程菌侵染水稻，得到稳定表达多聚磷酸盐激酶的基因工程水稻。

其中，所述多聚磷酸盐激酶基因ppk1表达组件依次包括35S启动子、SEQ ID NO.1所示多聚磷酸盐激酶基因ppk1、Nos终止子。

其中，所述根癌农杆菌为根癌农杆菌EHA105。

上述表达多聚磷酸盐激酶的基因工程水稻的构建方法构建得到的表达多聚磷酸盐激酶的基因工程水稻在本发明的保护范围之内。

有益效果：

本发明通过在水稻中表达多聚磷酸盐激酶基因ppk1，介导Pi转化为polyP，实现在维持水稻高磷含量的同时获得接近野生型的生物量，从而实现真正意义上的水稻强化除磷。

附图说明

图1最终表达载体pCAMBIA1302-35S/ppk1/Nos。

图2PPK1转基因水稻单拷贝株系(a)和双拷贝株系(b)Southern Blot检测。一个泳道代表一个待检测株系，一共28个株系，鉴定出单拷贝株系和双拷贝株系各14个

图3高磷(a)和低磷(b)条件下ppk1在单拷贝(EM2)和双拷贝(EM4)株系中表达量。

图4各株系根部(a)和地上部(b)PHT1家族成员表达量。

图5各株系根部(a)和地上部(b)OsPHR2及其互作蛋白SPX1、SPX4表达量。

图6正常供磷(a)和低磷(b)处理四周后各株系单株除磷量。

具体实施方式

实施例1：PPK1的生物信息学分析。

1.1PPK1与野生型日本晴全基因组序列比对

根据文献中所报道的铜绿微囊藻Microcystis aeruginosa NIES-843全基因组序列(Accession number：AP09552)在NCB中查询到ppk1的核苷酸序列(Accession number：NC010296.1)和PPK1的氨基酸序列(Accession number：BAF99951)，使用NCBI提供的在线比对工具BlastN和BlastP将它们分别与野生型日本晴全基因组(Accession number：GCF00143951)进行比对。

BlastN比对结果显示野生型日本晴基因组序列中不存在任何与ppk1核苷酸序列相类似的基因；同样地，BlastP比对结果显示野生型日本晴不存在任何与PPK1氨基酸序列相类似的蛋白。这一结果表明在后续转基因水稻构建过程中,可以用ppk1的核苷酸序列作为目的片段对转基因水稻进行PCR和qRT-PCR鉴定，其不会受到任何水稻内源基因序列的千扰。

1.2PPK1的信号肽分析

采用SignalP4.1(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对PPK1是否存在信号肽进行分析。作为原核来源的PPK1，当以革兰氏阴性菌数据库对其信号肽进行分析时，软件预测结果表明其氨基酸序列中不存在信号肽。以真核生物数据库再次对其信号肽进行了分析，软件预测结果表明其氨基酸序列被真核生物误识别为信号肽的可能性比原核生物还要小，这一结果表明：若在水稻中过表达PPK1，PPK1能够维持自身的完整性和活性，而不会因宿主的翻译后加工而失活。

实施例2：PPK1转基因水稻的获得。

2.1ppk1过表达载体构建

(1)根据ppk1的核苷酸序列设计引物，以铜绿微囊藻NIES843基因组DNA为模板，PCR扩增得到去除终止密码子的ppk1，“T-A”克隆至pMD19-Simple得到pMD19-ppk1；NcoI与PmLI双酶切pMD19-ppk1回收目的片段并与经过相同限制性内切酶双酶切的pCAMBIA1302相连，继而ppk1替换了pCAMBIA1302上原有的mGFP5，并形成了一套新的独立表达组件-35S/ppk1/Nos，将这个载体称为中间载体。引物序列为：

ppk1-F(SEQ ID NO.3)：5’-CCATGGCTAAAGCTTCTACCGTAACTT-3’

ppk1-R(SEQ ID NO.4)：5’-CACGTGTTGACTAATACCCGCAGATTTAAGG-3’

(2)根据35S启动子和Nos终止子序列设计引物，以构建完成的pCAMBIA1302中间载体为模板，PCR扩增得到这套表达组件并“T-A”克隆至pMD19-Simple得到pMD19-35S/ppk1/Nos。引物序列为：

35S/ppk1/Nos-F(SEQ ID NO.5)：5’-GCTCTAGATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAAT-3’

35S/ppkl/Nos-R(SEQ ID NO.6)：5’-GCTCTAGAACCCGCCAATATATCCTGTCAAACA-3’

(3)XbaI单酶切pMD19-35S/ppk1/Nos回收表达组件并与经过相同限制性内切酶单酶切的全新的pCAMBIA1302相连，继而得到最终表达载体pCAMBIA1302-35S/ppk1/Nos(图1)；构建完成的最终表达载体经测序验证后电转化根癌农杆菌EHA105，从而获得用于侵染日本晴愈伤组织的根癌农杆菌工程菌。

2.2PPK1转基因植株的获得

(1)诱导愈伤组织：去皮的成熟日本晴水稻种子放入10mL离心管中，用7mL 70％乙醇浸泡1min(淹没种子)，倒掉乙醇；用7mL 30％次氯酸钠浸泡30min，倒去次氯酸钠后用无菌去离子水清洗4次，最后一次浸泡30min。用镊子把种子拨到灭菌的滤纸上，吸干水分，最后把种子置于诱导培养基上，在28℃光照培养箱培养4周。

(2)继代培养：选择小米粒大小的黄色有韧性的脱落下来的愈伤组织，在无菌条件下用灭菌的镊子转移到继代培养基上，28℃生长1周。

(3)准备农杆菌：挑取构建完成的根癌农杆菌工程菌于YEP双抗(含50mg/L Str和50mg/L Kan)平板上划线，28℃培养至肉眼可见单菌落出现。无菌牙签挑取单菌落接种于3ml YEP双抗液体培养基中，28℃振荡过夜。取活化菌液300μL，接种于3ml新鲜的YEP双抗培养基中，28℃继续培养至菌液在600nm波长处的吸光值(OD₆₀₀)0.8-1.0。

(4)侵染愈伤组织和共培养：选择淡黄圆润有韧性的愈伤组织从继代培养基中挑出放入50ml离心管中，愈伤组织的数量没过离心管锥形部位即可。取培养好的菌液1ml于1.5ml离心管中，4℃，3000rpm，离心2min，去上清。用30ml AAM感菌液将收集的菌体制成悬浮液，此悬浮液倒入挑好的愈伤组织中，侵染5min。倒掉液体，将愈伤组织取出，置于无菌的含吸水纸的培养皿上沥干30min。在共培养培养基上垫一层直径略小于培养皿的无菌滤纸，将愈伤组织置于该滤纸上，25℃暗培养60h。

(5)脱除根癌农杆菌：将愈伤组织从共培养培养基中取出，用无菌水洗涤6次，期间手工剧烈震荡。再用含500mg/L羧苄青霉素(car)的无菌水洗涤2次，然后浸泡30min。最后置于无菌滤纸上沥干2h。

(6)筛选阳性愈伤组织：脱菌后的愈伤组织经过三轮抗生素筛选。第一轮：将晾干的愈伤组织转入含250mg/L Car和50mg/L Hyg的选择培养基上，28℃光照培养14d；第二轮：将第一轮筛选获得的阳性愈伤组织转入含250mg/L Car和80mg/L Hyg的选择培养基上，28℃光照培养14d；第三轮：将第二轮筛选获得的阳性愈伤组织再次转入含250mg/L Car和80mg/L Hyg的选择培养基上，28℃光照培养7d。

(7)诱导分化阳性愈伤组织和生根：挑取5粒致密黄亮的阳性愈伤组织移入装有分化培养基的高型组培罐中，28℃，12h光照/12h黑暗分化培养30d；待苗长至3-5cm左右，转入装有生根培养基的高型玻璃管中，封口膜封口后28℃，12h光照/12h黑暗生根培养7-14d。

(8)锻炼转基因苗：当苗长至封口膜处，打开封口膜，加入适量无菌去离子水，28℃，12h光照/12h黑暗炼苗3-7d左右。

(9)检测转基因阳性苗：剪取待测苗1cm²叶片，采用植物基因组DNA快速提取法提取基因组DNA，并以此为模板，用ppk1-F和ppk1-R为引物进行PCR扩增，然后使用琼脂糖凝胶电泳鉴定。

(10)转基因阳性苗缓苗和移栽：将经鉴定的转基因阳性苗从生根管取出，自来水洗去琼脂，自来水中缓苗3d，1/2IRRI营养液缓苗3d，IRRI全营养液壮苗10d，移栽到温室进行水培或者土培生长。

2.3PPK1转基因水稻的拷贝数鉴定

采集野生型和不同转基因株系的新鲜叶片，用CTAB抽提法提取基因组DNA，Southern Blot检测不同株系转基因水稻的拷贝数。Southern Blot步骤为：基因组DNA的酶切，酶切产物的纯化，纯化后产物的电泳，琼脂糖凝胶的变性和中和，Southern印迹，杂交，杂交信号的检测。根据图2的结果，选取两个单拷贝株系和两个双拷贝株系作为进一步试验的材料，分别命名为EM1、EM2和EM3、EM4。

实施例3：ppk1基因在水稻中的表达模式鉴定及其对水稻磷信号通路相关基因表达的影响。

3.1总RNA的提取和逆转录合成cDNA第一链

取野生型日本晴(WT)和PPK1转基因水稻单拷贝(EM2)和双拷贝(EM4)株系的种子，消毒后播种于装有1/2MS培养基的低型组培罐中，30℃暗培养3d至露白，转入28℃，12h光照/l2h黑暗的培养箱培养至两叶一心期，打开组培罐并加入无菌水炼苗至三叶一心期。期间采用微量基因组DNA快速提取法对转基因苗进行鉴定以便剔除假阳性苗，选取长势一致的阳性苗转入1/2IRRI营养液中水培至四叶一心期，再分别进行正常供磷(300μM KH₂PO₄)和低磷(15μM KH₂PO₄)处理。4周后采集叶片、叶鞘和根部，采用TriZol试剂抽提总RNA，于酶标仪上测定RNA的浓度和纯度。以获得的总RNA为模板，经过逆转录获得水稻cDNA第一链，供后续使用。逆转录体系的配制和反应条件如表1：

表1PCR反应体系及反应条件

3.2ppk1基因表达模式鉴定

以3.1中获得的野生型(WT)和PPK1转基因水稻单拷贝(EM2)、双拷贝(EM4)株系的cDNA为模板进行qRT-PCR扩增，同时以水稻细胞骨架蛋白基因Actin作为内参基因。ppk1和Actin的qRT-PCR引物如下：

Qppk1-F：5’-TTGTTTACGACCCGGATTGC-3’

Qppk1-R：5’-TGGTTCATCGATGGGTGTCA-3’

QActin-F：5’-CAACACCCCTGCTATGTACG-3’

QActin-R：5’-CATCACCAGAGTCCAACACAA-3’

qRT-PCR反应体系的配制和反应条件如表2所示：

表2qRT-PCR反应体系及反应条件

由图3可以看出(1)ppk1在水稻的根、叶鞘和叶片中均有表达，没有特定的组织特异性；(2)ppk1在水稻中的表达不受外源磷浓度的影响。

3.3ppk1基因对水稻磷信号通路相关基因表达的影响

取野生型日本晴(WT)和PPK1转基因单拷贝(EM2)和双拷贝(EM4)株系的种子，按照3.1中所述方法培苗，高低磷处理10d后将各植株分为地上部和根部，然后对其中PHT1家族11个成员(OsPT1、OsPT2、OsPT3、OsPT4、OsPT5、OsPT6、OsPT7、OsPT8、OsPT9、OsPT10、OsPT12)和水稻缺磷信号转导途径的中心调控因子OSPHR2及其两个互作蛋白SPX1与SPX4的表达水平进行qRT-PCR检测，结果如图4和图5所示。

由图4可知，较WT而言,PPK1转基因株系中OsPT1、OsPT2、OsPT3、OsPT4、OsPT8、OsPT9和OsPT10这7个成员的表达量在低磷、高磷或两种磷浓度下均有显著提升，且多数情况下双拷贝株系EM4这些基因的表达水平又显著高于单拷贝株系EM2。同时，这些成员表达量的增加提高了PPK1转基因株系较磷吸收和转运能力。由图5可知，PPK1转基因株系根部OSPHR2的表达较WT显著上调，而地上部OSPHR2的表达则较WT无显改变。而SPX1的表达量在PPK1转基因株系中显著下调，SPX4的表达量仅在低磷条件下PPK1转基因株系的根部显著下调，其他条件下保持不变。对这三个基因的定量结果表明：(1)低磷条件下，ppk1的超表达强化了水稻的缺磷信号；(2)高磷条件下，ppk1的超表达则模拟了缺磷信号；(3)在根部，ppk1超表达株系通过上调OSPHR2的表达并下调SPX1和SPX4表达来响应缺磷信号；(4)在地上部，PPK1转基因株系则是通过下调SPX1的表达来响应这一缺磷信号。

实施例4：PPK1转基因水稻除磷能力分析

取野生型日本晴(WT)、PPK1转基因单拷贝(EM1、EM2)、双拷贝(EM3、EM4)株系和日本晴2×35S驱动的OsPHR2超表达株系(PHR2)种子，按照3.1中所述方法培苗，将阳性苗转入IRRI全营养液中水培，设置正常供磷(300μM KH₂PO₄)和低磷(15μM KH₂PO₄)两种磷浓度处理4周。取各株系样品烘干至恒重，称量各自地上部和根部的干重。采用钼锑抗比色法测定六个株系地上部和根部的总磷含量。水稻单株除磷量＝地上部总磷含量×地上部干重+根部总磷含量×根部干重。结果如图6所示。

结果表明：(1)高磷条件下，单拷贝株系EM1和EM2单株磷的去除总量能够达到WT的1.5倍左右(5.3mg-P/plant)，双拷贝株系EM3和EM4单株磷的去除总量能够达到WT的2.5倍左右(8.2mg-P/plant)；(2)低磷条件下，单拷贝株系EM1和EM2单株磷的去除总量能够达到WT的2倍左右(1.2mg-P/plant)，双拷贝株系EM3和EM4单株磷的去除总量能够达到WT的3倍左右(1.7mg-P/plant)；(3)磷吸收能力最强的PHR2由于生物量的显著减少导致其单株磷的去除总量在高低磷条件下分别仅有WT的约50％(1.7mg-P/plant)和30％(0.2mg-P/plant)。这说明，较传统水稻内源磷相关基因的超表达而言，MaPPK1的超表达能够显著提高水稻单株磷的去除总量。

序列表

<110> 南京大学

博域环保技术研究院(南京)有限公司

<120> 多聚磷酸盐激酶基因ppk1在水稻中的基因工程应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2169

<212> DNA

<213> 铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa NIES-843)

<400> 1

atggctaaag cttctaccgt aacttccgaa atcgatctta aagattcgca atattacttt 60

aaccgagaat taagctggtt agaatttaat cgtcgcgtgc tttatgaagc acttgatcct 120

cggactcccc tactggaaag attaaaattt accgccattt tttgtgccaa tctcgacgaa 180

ttttttatgg tacgggtggc agttcttaaa caacaggtag aggcaaatgt agccgtttta 240

agtgccgatg gccggactgc ctcggaacag ctaaccgaga tcagtaaacg tctgcgtccc 300

cttgtacaac agcaggatcg tctttttgaa cacaccctaa aaaatctctt agtggaacag 360

ggaattcatc tgattaacta tgtagattta catcaagaac agcgcaatta tctccatgat 420

tactttgaac aaaatatttt ccccgtttta actcctctag cggtggatcc tagtcatcct 480

tttccctata tttctaatct tagtctcaat ttagccgtag tcgttcgcga tcccgacacc 540

gataaagaac tatttgccag ggtgaaagtg ccgcaggttt tcccccgttt tctggcatta 600

cccaaggaat tacgccacca agacggaaaa gcttcgattt ggacgggagt accccttgaa 660

caggtggtaa tgcacaattt agaggcactt ttccccagca tgatcattca agaatgttat 720

ccttttcggg tgacgcgcaa cgccgatatc tccgtcgaag aagatgaggc cgatgattta 780

ttattagcga tcgaggaaga agtacgcaag cgccgcatcg gtaaatcggc agtacgtctg 840

gaaattcaca gttctacccc tagcaatatt aaaaaccgga tcatgcgcga tctcggactt 900

gaggagatcg atgtttacga tgtggatgga ctgctgggac acaaagattt attttatttt 960

atgtctttac cctgtcccga actgaaagat ccgccttgga atcctgtcac tccaacagtt 1020

ttacagggat tgcgagaaat agttgacggt aacgaagacg gtatcctaga acaggatggc 1080

gaagatattt ttactttaat tcgcaataac gatattctcg ttcatcaccc ttaccattcc 1140

tttagtgcct cagtacaaca gtttatcgcc caggcggcct atgatgccca tgttttagcg 1200

attaaaatga ctttgtatcg tacttccgga gattccccga ttgtcaattc cctgattgca 1260

gcggcggaaa atgggaaaca ggtagcggcg ttagtggaac taaaagcacg ctttgatgag 1320

gaaaataaca ttacttgggc gaaaaagctc gaacaagccg gagttcacgt tgtttatggc 1380

ttagttggtc taaaaaccca tacgaaagtg gttctcgtgg tcagaaaaga aggggataaa 1440

atccgtcgtt atttccatat tggcacgggc aattataacc caaaaactgc caaattatac 1500

actgatttgg gtttacttag ctgtcgtgag gatttggggg cagatatcac cgatttattt 1560

aactttctga ctggatactc ccgtcagcaa tcctatcgca aacttttaat tgctccggtg 1620

agtttgcgaa aacggatgtt agcaatgatc gatcgcgagg ccaaaaactg taaaaatggc 1680

ggtacggggc gcattgtcgc aaaaatgaac tctattgtcg ataaaccgat tatagaagct 1740

ttatacgccg cttctcgtgc tggtgtgcag attgacttaa ttattcgcgg catctgttgt 1800

ttacgacccg gattgccaga aataagcgaa aatatccgag taattagcat tatcggccgc 1860

tttttggaac attcccgcat tttttacttt tacaatgatg gtcaggagga ggtttatatt 1920

ggtagcgccg attggatgac gcggaacctg actcgtcgcg tggaagcagt gacacccatc 1980

gatgaaccag cgatcgccaa ggaactagaa gaaattctcg gcattatgtt gtcagataac 2040

cggcaagcat gggaattaca atccgacggc agttatattc agcgtcgtgc tgccaaccag 2100

ggacaggaaa gcagtaccca tgtaattttg atggaaaaag cccttaaatc tgcgggtatt 2160

agtcaatag 2169

<210> 2

<211> 722

<212> PRT

<213> 铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa NIES-843)

<400> 2

Met Ala Lys Ala Ser Thr Val Thr Ser Glu Ile Asp Leu Lys Asp Ser

1 5 10 15

Gln Tyr Tyr Phe Asn Arg Glu Leu Ser Trp Leu Glu Phe Asn Arg Arg

20 25 30

Val Leu Tyr Glu Ala Leu Asp Pro Arg Thr Pro Leu Leu Glu Arg Leu

35 40 45

Lys Phe Thr Ala Ile Phe Cys Ala Asn Leu Asp Glu Phe Phe Met Val

50 55 60

Arg Val Ala Val Leu Lys Gln Gln Val Glu Ala Asn Val Ala Val Leu

65 70 75 80

Ser Ala Asp Gly Arg Thr Ala Ser Glu Gln Leu Thr Glu Ile Ser Lys

85 90 95

Arg Leu Arg Pro Leu Val Gln Gln Gln Asp Arg Leu Phe Glu His Thr

100 105 110

Leu Lys Asn Leu Leu Val Glu Gln Gly Ile His Leu Ile Asn Tyr Val

115 120 125

Asp Leu His Gln Glu Gln Arg Asn Tyr Leu His Asp Tyr Phe Glu Gln

130 135 140

Asn Ile Phe Pro Val Leu Thr Pro Leu Ala Val Asp Pro Ser His Pro

145 150 155 160

Phe Pro Tyr Ile Ser Asn Leu Ser Leu Asn Leu Ala Val Val Val Arg

165 170 175

Asp Pro Asp Thr Asp Lys Glu Leu Phe Ala Arg Val Lys Val Pro Gln

180 185 190

Val Phe Pro Arg Phe Leu Ala Leu Pro Lys Glu Leu Arg His Gln Asp

195 200 205

Gly Lys Ala Ser Ile Trp Thr Gly Val Pro Leu Glu Gln Val Val Met

210 215 220

His Asn Leu Glu Ala Leu Phe Pro Ser Met Ile Ile Gln Glu Cys Tyr

225 230 235 240

Pro Phe Arg Val Thr Arg Asn Ala Asp Ile Ser Val Glu Glu Asp Glu

245 250 255

Ala Asp Asp Leu Leu Leu Ala Ile Glu Glu Glu Val Arg Lys Arg Arg

260 265 270

Ile Gly Lys Ser Ala Val Arg Leu Glu Ile His Ser Ser Thr Pro Ser

275 280 285

Asn Ile Lys Asn Arg Ile Met Arg Asp Leu Gly Leu Glu Glu Ile Asp

290 295 300

Val Tyr Asp Val Asp Gly Leu Leu Gly His Lys Asp Leu Phe Tyr Phe

305 310 315 320

Met Ser Leu Pro Cys Pro Glu Leu Lys Asp Pro Pro Trp Asn Pro Val

325 330 335

Thr Pro Thr Val Leu Gln Gly Leu Arg Glu Ile Val Asp Gly Asn Glu

340 345 350

Asp Gly Ile Leu Glu Gln Asp Gly Glu Asp Ile Phe Thr Leu Ile Arg

355 360 365

Asn Asn Asp Ile Leu Val His His Pro Tyr His Ser Phe Ser Ala Ser

370 375 380

Val Gln Gln Phe Ile Ala Gln Ala Ala Tyr Asp Ala His Val Leu Ala

385 390 395 400

Ile Lys Met Thr Leu Tyr Arg Thr Ser Gly Asp Ser Pro Ile Val Asn

405 410 415

Ser Leu Ile Ala Ala Ala Glu Asn Gly Lys Gln Val Ala Ala Leu Val

420 425 430

Glu Leu Lys Ala Arg Phe Asp Glu Glu Asn Asn Ile Thr Trp Ala Lys

435 440 445

Lys Leu Glu Gln Ala Gly Val His Val Val Tyr Gly Leu Val Gly Leu

450 455 460

Lys Thr His Thr Lys Val Val Leu Val Val Arg Lys Glu Gly Asp Lys

465 470 475 480

Ile Arg Arg Tyr Phe His Ile Gly Thr Gly Asn Tyr Asn Pro Lys Thr

485 490 495

Ala Lys Leu Tyr Thr Asp Leu Gly Leu Leu Ser Cys Arg Glu Asp Leu

500 505 510

Gly Ala Asp Ile Thr Asp Leu Phe Asn Phe Leu Thr Gly Tyr Ser Arg

515 520 525

Gln Gln Ser Tyr Arg Lys Leu Leu Ile Ala Pro Val Ser Leu Arg Lys

530 535 540

Arg Met Leu Ala Met Ile Asp Arg Glu Ala Lys Asn Cys Lys Asn Gly

545 550 555 560

Gly Thr Gly Arg Ile Val Ala Lys Met Asn Ser Ile Val Asp Lys Pro

565 570 575

Ile Ile Glu Ala Leu Tyr Ala Ala Ser Arg Ala Gly Val Gln Ile Asp

580 585 590

Leu Ile Ile Arg Gly Ile Cys Cys Leu Arg Pro Gly Leu Pro Glu Ile

595 600 605

Ser Glu Asn Ile Arg Val Ile Ser Ile Ile Gly Arg Phe Leu Glu His

610 615 620

Ser Arg Ile Phe Tyr Phe Tyr Asn Asp Gly Gln Glu Glu Val Tyr Ile

625 630 635 640

Gly Ser Ala Asp Trp Met Thr Arg Asn Leu Thr Arg Arg Val Glu Ala

645 650 655

Val Thr Pro Ile Asp Glu Pro Ala Ile Ala Lys Glu Leu Glu Glu Ile

660 665 670

Leu Gly Ile Met Leu Ser Asp Asn Arg Gln Ala Trp Glu Leu Gln Ser

675 680 685

Asp Gly Ser Tyr Ile Gln Arg Arg Ala Ala Asn Gln Gly Gln Glu Ser

690 695 700

Ser Thr His Val Ile Leu Met Glu Lys Ala Leu Lys Ser Ala Gly Ile

705 710 715 720

Ser Gln

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccatggctaa agcttctacc gtaactt 27

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cacgtgttga ctaatacccg cagatttaag g 31

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctctagatc cccctttcgc cagctggcgt aat 33

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctctagaac ccgccaatat atcctgtcaa aca 33

Claims

1.多聚磷酸盐激酶基因ppk1在提高水稻除磷能力中的应用，其特征在于，所述多聚磷酸盐激酶基因ppk1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的多聚磷酸盐激酶基因ppk1在提高水稻除磷能力中的应用，其特征在于，所述水稻的品种为日本晴。

3.表达多聚磷酸盐激酶的基因工程水稻的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(2)将重组质粒电转化根癌农杆菌，得到根癌农杆菌工程菌；

4.根据权利要求3所述表达多聚磷酸盐激酶的基因工程水稻的构建方法，其特征在于，所述多聚磷酸盐激酶基因ppk1表达组件依次包括35S启动子、SEQ ID NO.1所示多聚磷酸盐激酶基因ppk1、Nos终止子。

5.根据权利要求3所述表达多聚磷酸盐激酶的基因工程水稻的构建方法，其特征在于，所述根癌农杆菌为根癌农杆菌EHA105。

6.权利要求3～5任一所述表达多聚磷酸盐激酶的基因工程水稻的构建方法构建得到的表达多聚磷酸盐激酶的基因工程水稻。