WO2001059135A1 - Verfahren zur beeinflussung der pollenentwicklung durch veränderung des saccharosestoffwechsels - Google Patents

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Frederik BÖRNKE
Uwe Sonnewald
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    • C12N9/90—Isomerases (5.)

Definitions

  • the present invention relates to methods for influencing pollen development by changing the sucrose metabolism in transgenic plant cells and plants.
  • the invention relates in particular to a method for producing male-sterile plants, in which developing pollen is extracted from carbohydrates.
  • the invention relates to the expression of a protein with the enzymatic activity of a sucrose isomerase in transgenic plant cells.
  • the present invention further relates to nucleic acid molecules. which contain a DNA sequence encoding a protein with the enzymatic activity of a sucrose isomerase, and wherein the DNA sequence is operatively linked to regulatory sequences of a promoter active in plants, so that the DNA sequence is expressed in anthers or pollen.
  • the present invention relates to transgenic plants and plant cells which contain the nucleic acid molecule according to the invention and are male-sterile due to the expression of the DNA sequence which encodes a protein with the enzymatic activity of a sucrose isomerase, as well as harvest products and propagation material of the transgenic plants.
  • Plants have two or more copies of their genetic information per cell as eukaryotes. Each gene is usually represented by two alleles, which can be identical in the homozygous state or different in the heterozygous state.
  • the first generation FI hybrids i.e. heterozygous individuals
  • This effect known as heterosis or hybrid vitality, has been used by plant breeders for many decades to produce hybrid varieties.
  • Such hybrid lines are cultivated using cytoplasmic male sterility (CMS) or self-incompatibility (SI), the two most important genetic systems for preventing self-fertilization.
  • CMS cytoplasmic male sterility
  • SI self-incompatibility
  • an externally applied preherbicide is converted into a herbicide by the introduced transgene.
  • transgenic tobacco plants which express the ⁇ rgE gene from E. coli under the control of the TA29 promoter
  • the application of the non-toxic substance N-acetyl-L-phosphinotricin leads to male sterility during pollen development (Kriete et al. ( 1996) Plant J. 9: 809-818).
  • the activity of the ⁇ rgE gene deacetylates the non-toxic proverbicide and converts it to the cytotoxic L-phosphinotricin.
  • the hybrid plant produced is a useful plant whose seeds, fruits or flowers, i.e. generative organs, are to be harvested, a restorer system must also be inserted so that the FI plant is again male fertile.
  • a restorer system was developed which is based on the expression of a ribonuclease inhibitor gene which was isolated from the same bacterium (B. amyloliquefaciens) which the ribonuclease itself expresses.
  • F 1 hybrid lines are of particular importance not only because of their increased vitality and yield.
  • the seed breeding industry has also gained great commercial importance because the farmer can no longer multiply FI hybrid varieties, as the F2 generation splits the positive properties and plants that arise from the seeds of FI hybrids show a much lower resistance and performance than the Fl hybrids. The farmer therefore has to buy new seeds for each sowing from the seed manufacturer.
  • the present invention is therefore based on the object of making available new methods for influencing pollen development and thus for the production of male-sterile plants, as well as recombinant DNA molecules which contain a DNA sequence which is used to manipulate pollen development and here in particular to produce male sterile plants can be used.
  • Proteins with sucrose isomerase activity catalyze the isomerization of the disaccharide sucrose to other disaccharides.
  • sucrose isomerases also called sucrose mutases, catalyze the rearrangement into an ⁇ 1-. 6 bond or / and an ⁇ l—. ⁇ l bond. This results in isomerization to an ⁇ l—. 6 bond, the disaccharide palatinose, while the disaccharide trehalulose is formed when rearranged to form an ⁇ l- ⁇ xl bond.
  • Examples of organisms whose cells contain a nucleic acid sequence encoding a protein with sucrose isomerase activity are, in particular, microorganisms of the genera Protaminobacter, Erwinia. Serratia. Leuconostoc. Pseudomonas, Agrobacterium, Klebsieila and Enterobacter. The following examples of such microorganisms should be mentioned in particular: Protaminobacter rubrum (CBS 547, 77).
  • NCPPB 1578 Erwinia rhapontici
  • Serratia plymuthica ATCC 15928
  • Serratia marcescens NCIB 8285
  • Leuconostoc mesenteroides NRRL B-521f ATCC 10830a
  • Pseudomonas mesoacidophila MX-45 FERM 11808 and FERMrobacter MX 3619
  • -232 FERM 12397 or FERM BP 3620
  • sucrose isomerase DNA sequences leads to a male sterile phenotype.
  • This effect can also be achieved by other measures which result in a change in the sucrose metabolism, in particular a withdrawal of sucrose and utilizable hexoses. and thus result in an undersupply of the pollen with carbohydrates.
  • Pollen development can be disrupted, for example, by inhibiting invertases, hexose transporters and hexokinases, which leads to the male sterile phenotype of the plants transformed with the corresponding nucleic acid molecules.
  • the development of functional pollen can also be prevented by producing or accumulating osmotically active substances in the anthers, which leads to drying of developing pollen and thus to the male sterile phenotype.
  • sucrose which is formed in photosynthetically active leaves and transported in the phloem's pathways.
  • the sucrose is secreted by tapetum cells in the apoplasts, hydrolysed to glucose and fructose by apoplastic invertases and taken up in the pollen by means of a hexose transporter.
  • the hexoses are phosphorylated using hexokinases and thus made available to the metabolism.
  • the hexoses are taken up together with protons which were pumped into the apoplasts by means of ATPases.
  • Monosaccharides can be effectively inhibited, can be used ideally for the production of sterile male plants.
  • the basic requirement for the production of such male-sterile crop plants is the availability of suitable transformation systems.
  • a wide range of transformation methods have been developed and established here over the past two decades. These techniques include the transformation of plant cells with T-DNA using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes as a transformation agent, diffusion of protoplasts, the direct gene transfer of isolated DNA into protoplasts, the injection and electroporation of DNA into plant cells, the introduction of DNA by means of the biolistic Methods and other options.
  • DNA sequences which encode a protein with the enzymatic activity of a sucrose isomerase in their anthers, their tapetum or their pollen and which are male-sterile due to this specific expression is that DNA sequences are available.
  • sucrose isomerase can be used by the person skilled in the relevant literature and the gene databases using suitable ones
  • sucrose isomerase from other organisms by means of conventional molecular biological techniques and use them in the context of the present invention.
  • the person skilled in the art can derive suitable hybridization probes from the known sucrose isomerase sequences and use them for the screening of cDNA and / or genomic banks of the desired organism from which a new sucrose isomerase gene is to be isolated.
  • the person skilled in the art can fall back on common hybridization, cloning and sequencing methods which are well known and established in any bio or genetic engineering laboratory (see, for example, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).
  • the person skilled in the art can of course also synthesize and use suitable oligonucleotide primers for PCR amplifications of sucrose isomerase sequences using known sequences.
  • targets can be mentioned as targets:
  • Cell wall-bound invertases A large number of genes or cDNA clones can be found in the relevant databases and publications, which enable the person skilled in the art by means of routine methods to generate suitable constructs for the inhibition of the cell wall-bound invertase and to transfer them to plant cells. Examples of suitable sequences are: Arabidopsis (Schwebel-Dugue et al. (1994) Plant Physiol. 104, 809-810), carrot (Ramloch-Lorenz et al. (1993) Plant J. 4, 545-554), tobacco, (Greiner et al. (1995) Plant Physiol. 108, 825-826), Tomato (Ohyama et al. (1998) Genes Genet. Syst.
  • invertase activity can be suppressed by expression of invertase inhibitors.
  • invertase inhibitors An example is the invertase inhibitor from tobacco (Greiner et al. (1998) Plant Physiol. 116, 733-742). Overexpression of an invertase inhibitor in transgenic plants led to the inhibition of endogenous invertase activity in potato tubers (Greiner et al. (1999) Nat. BioTech. 17, 708-71 1).
  • hexose transporters monosaccharide transporters
  • hexose transporters monosaccharide transporters
  • a large number of genes or cDNA clones can be found in the databases and publications, which allow the person skilled in the art to construct constructs for inhibiting pollen-expressed hexose transporters. Examples of published sequences are: Petunia (Ylstra et al. (1998) Plant Physiol. 118, 297-304), Arabidopsis (Truernit et al. (1999) Plant J. 17, 191-201), tobacco (Sauer and Stadler ( 1993) Plant J. 4. 601-610), Medicago sativa (Acc. No .: AJ248339), Ricinus cornmunis (Acc.
  • hexokinases Another starting point are the hexokinases mentioned above. The same applies here as for the other targets, the databases and publications show a large number of genes or cDNA clones which allow the person skilled in the art to do so.
  • inhibitors of the corresponding proteins could also be used. Examples of this would be the overexpression of invertase inhibitors (Greiner et al. (1998) Plant Physiol. 116, 733-742) or of antibodies which are directed against certain proteins. Examples of the successful expression of antibodies in plants are summarized in Whitelam and Cockburn (Trends in Plant Science (1996), 8, 268-272), further examples can be found in the specialist literature.
  • sucrose isomerase activity leads to the formation of palatinose, which leads to an undersupply of the affected cells with carbohydrates leads.
  • the sucrose isomerase will therefore preferably be expressed cell-specifically in the target cells.
  • the activity of sucrose isomerase can be controlled by expression of inhibitors. Inhibitors have arisen in nature for enzymes comparable to sucrose isomerase. An example has already been mentioned above that
  • Invertase inhibitors include proteinase inhibitors (e.g. in Gruden et al. (1997) Plant Mol. Biol. 34, 317-323), polygalacturonase inhibitors (e.g. in Mahalingam et al. (1999) Plant Microb. Interact. 12, 490 -498) and amylase inhibitors (e.g. in Grossi et al. (1997) Planta 203, 295-303). All of these inhibitors bind to the target protein and prevent its catalytic activity. Furthermore, the sucrose isomerase could be controlled by antibodies which bind the isomerase and thus switch off its activity, where desired.
  • proteinase inhibitors e.g. in Gruden et al. (1997) Plant Mol. Biol. 34, 317-323
  • polygalacturonase inhibitors e.g. in Mahalingam et al. (1999) Plant Microb. Interact. 12, 490 -49
  • amylase inhibitors e.g. in Gross
  • sucrose isomerase DNA sequences in the anthers, in the tapetum and / or in the pollen of the transformed plants are described further below.
  • tissue- or cell-specific promoters are also preferably used for antisense or sense constructs in order to restrict changes in the carbohydrate metabolism with the aim of undersupplying the pollen to the relevant tissues.
  • sucrose isomerase encoding DNA sequences under the control of regulatory sequences are available that ensure anther / tapetum pollen-specific expression by means of conventional cloning methods (see, for example, Sambrook et al. (1989), supra).
  • the present invention thus relates to a recombinant nucleic acid molecule comprising a) regulatory sequences of a promoter active in anthers, in tapetum and / or in pollen; b) operatively linked to a DNA sequence encoding a protein with the enzymatic activity of a sucrose isomerase; and c) operatively linked regulatory sequences which can serve as transcription, termination and or polyadenylation signals in plant cells.
  • a protein with the enzymatic activity of a sucrose isomerase is understood to be a protein which catalyzes the isomerization of sucrose to other disaccharides, the ⁇ l -. ⁇ 2-glycosidic bond between glucose and fructose in the sucrose is converted into another glycosidic bond between two monosaccharide units, in particular into an ⁇ l-6 bond and or ⁇ l—. ⁇ l bond.
  • a protein with the enzymatic activity of a sucrose isomerase is particularly preferably understood to be a protein which is capable of isomerizing sucrose to palatinose and / or trehalulose.
  • the proportion of palatinose and trehalulose in the total disaccharides which are formed by isomerization of sucrose is> 2%, preferably> 20%, particularly preferably> 50% and most preferably> 60%.
  • the DNA sequence encoding a protein with the enzymatic activity of a sucrose isomerase can be isolated from natural sources or synthesized by known methods. Using common molecular biological techniques (see, for example, Sambrook et al. (1989), supra), it is possible to prepare or produce desired constructs for the transformation of plants. The cloning, mutagenization, sequence analysis, restriction analysis and other biochemical-molecular biological methods commonly used for genetic engineering manipulation in prokaryotic cells are well known to those of ordinary skill in the art.
  • sucrose isomerase-DNA sequence not only can suitable chimeric gene constructs be produced with the desired fusion of promoter and sucrose isomerase-DNA sequence, but the person skilled in the art can, if desired, introduce various mutations into the sucrose isomerase-coding DNA sequence using routine techniques, whereby it leads to the synthesis of proteins with possibly modified ones biological properties comes.
  • enzymes that are localized in certain compartments of the plant cell by adding corresponding signal sequences.
  • mutants can be produced which are no longer subject to the regulatory mechanisms normally prevailing in the cell via allosteric regulation or covalent modification.
  • mutants can be produced which have an altered substrate or product specificity.
  • mutants can be produced which have a changed activity, temperature and / or pH profile. Mutants are preferably produced that target the Aim to change the enzymatic properties, preferably to increase the affinity for sucrose by lowering the Km value.
  • the DNA sequence which encodes a protein with the enzymatic activity of a sucrose isomerase is selected from the group consisting of a) DNA sequences which comprise a nucleotide sequence which has the sequence shown in SEQ ID NO. 6 encode the given amino acid sequence or fragments thereof, b) DNA sequences which contain the sequence shown in SEQ ID No.
  • DNA sequences which comprise a nucleotide sequence which hybridize with a complementary strand of the nucleotide sequence of a) or b) or parts of this nucleotide sequence d) DNA sequences which comprise a nucleotide sequence is degenerate to a nucleotide sequence of c) or comprise parts of this nucleotide sequence, e) DNA sequences which are a derivative. Represent analog or fragment of a nucleotide sequence of a), b), c) or d).
  • sucrose isomerase sequence from Erwinia rhapontici
  • preferred DNA sequences are those which have a particularly high affinity for sucrose, i.e. which have a low Km value, e.g. the sucrose isomerase from Pseudomonas mesacidophila (Km for sucrose 19.2 mM, Nagai et al. (1994) Biosci. Biotech. Biochem. 58: 1789-1793) or Serratia plymuthica (Km for sucrose 63.5 mM; McAllister et al. ( 1990) Biotechnol. Lett. 12: 667-672).
  • hybridization means hybridization under conventional hybridization conditions. preferably under stringent conditions, as described, for example, in Sambrook et al. (1989, supra).
  • DNA sequences that hybridize with the DNA sequences encoding a protein with the enzymatic activity of a sucrose isomerase can e.g. isolated from genomic or cDNA libraries.
  • the identification and isolation of such DNA sequences can be e.g. using DNA sequences which have exactly or essentially one of the above-mentioned sucrose isomerase-encoding nucleotide sequences of the prior art or parts of these sequences, or the reverse complement of these DNA sequences, e.g. by means of hybridization according to standard methods (see e.g. Sambrook et al. (1989), supra).
  • the fragments used as the hybridization probe can also be synthetic fragments which have been produced using conventional synthesis techniques and whose sequence essentially corresponds to one of the DNA sequences mentioned above for sucrose isomerase or a part of one of these sequences.
  • the DNA sequences which encode a protein with the enzymatic activity of a sucrose isomerase also comprise DNA sequences whose nucleotide sequences are degenerate to that of one of the DNA sequences described above.
  • the degeneration of the genetic code offers the expert, inter alia, the possibility of adapting the nucleotide sequence of the DNA sequence to the codon preference (codon usage) of the target plant, that is to say the plant sterile due to the specific expression of the sucrose isomerase DNA sequence, and thereby optimizing the expression.
  • the DNA sequences described above also include fragments, derivatives and allelic variants of the DNA sequences described above, which encode a protein with the enzymatic activity of a sucrose isomerase. “Fragments” are understood to mean parts of the DNA sequence that are long enough to be one of the to encode the proteins described.
  • the term "derivative” in this context means that the sequences differ from the DNA sequences described above in one or more positions, but have a high degree of homology to these sequences. Homology means a sequence identity of at least 40 percent, in particular an identity of at least 60 percent, preferably over 80 percent and particularly preferably over 90 percent.
  • the deviations from the DNA sequences described above can be caused, for example, by deletion. Substitution, insertion or recombination have arisen.
  • deviations from the DNA sequences described above may have arisen, for example, through deletion, substitution, insertion or recombination.
  • the DNA sequences which are homologous to the sequences described above and which are derivatives of these sequences are generally variations of these sequences which are modifications which have the same biological function. These can be both naturally occurring variations, for example sequences from other organisms or mutations, wherein these mutations can have occurred naturally or have been introduced by targeted mutagenesis. Furthermore, the variations can be synthetically produced sequences.
  • the allelic variants can be both naturally occurring variants and also synthetically produced variants or those produced by recombinant DNA techniques.
  • the described DNA sequence coding for a sucrose isomerase comes from Erwinia rhapontici (as indicated in SEQ ID No. 4).
  • the present invention further relates to a recombinant nucleic acid molecule comprising a) regulatory sequences of a promoter active in anthers, in tapetum and / or in pollen; b) bound to it in sense or antisense orientation is a DNA sequence, the transcription of which inhibits the plant's own
  • invertase hexose transporter, hexokinase and / or proton ATPase expression, and c) operatively linked regulatory sequences that can serve as transcription, termination and / or polyadenylation signals in plant cells.
  • any promoter active in plant cells can be used here. Since, according to the invention, sucrose isomerase must be expressed in anther, tapetum and / or pollen tissue, any promoter that is capable of expression in anthers, tapetum or pollen, be it. in anthers, tapetum or pollen or exclusively in these tissues.
  • the promoter can be selected so that the expression is constitutive or only in anther-, tapetum- and / or pollen-specific tissue, at a certain point in time of plant development and / or at an external point Influences, biotic or abiotic stimuli certain point in time (induced gene expression).
  • the promoter can be homologous or heterologous with respect to the plant to be transformed. If a constitutive promoter is used, cell-specific or tissue-specific expression can also be achieved by inhibiting gene expression in the cells or tissues in which it is not desired, for example by expressing antibodies which bind the gene product and thus prevent its enzyme activity, or by suitable inhibitors.
  • Promoters particularly suitable in the context of the invention are anther, tapetum and / or pollen-specific promoters. Examples of this are the promoter of the tapl gene from Antirrhinum majus (Sommer et al. (1990)
  • NTM9 genes from Nicotiana tabacum are active promoters in the early stages of pollen development; Here, a male sterile phenotype could be generated by means of promoter / barnase fusion constructs in transgenic tobacco plants; - The pollen-specific promoter of the ZM13 gene from maize (Hamilton et al.
  • RNA-specific regulatory nucleic acid elements Identify hybridization experiments or DNA-protein binding studies, anther-specific regulatory nucleic acid elements.
  • a first step for example, the entire poly (A) + RNA is isolated from anther tissue of the desired organism, from which the regulatory sequences are to be isolated, and a cDNA library is created.
  • cDNA clones based on poly (A) + RNA molecules from a non-anther tissue are used to identify those clones from the first bank by hybridization whose corresponding poly (A) + RNA Molecules only accumulate in anther tissue.
  • promoters are isolated which have anther-specific regulatory elements.
  • the person skilled in the art also has other methods based on PCR for the isolation of suitable anther-specific promoters. The same naturally also applies to pollen- or tapetum-specific promoters.
  • the anther-specific promoter is the TA29 promoter from tobacco. Furthermore, there is a transcription or termination sequence which serves to correctly terminate the transcription and can also be used to add a polyA tail to the transcript, which is assigned a function in stabilizing the transcripts. Such elements are described in the literature and are interchangeable.
  • the invention further relates to vectors and microorganisms which contain nucleic acid molecules according to the invention and whose use enables the production of male-sterile plants.
  • the vectors are in particular plasmids, cosmids, viruses, bacteriophages and other vectors commonly used in genetic engineering.
  • the microorganisms are primarily bacteria, viruses, fungi, yeasts and algae.
  • the invention further relates to a method for producing male-sterile plants, comprising the following steps: a) Production of a recombinant nucleic acid molecule which comprises the following sequences: regulatory sequences of one in anthers. promoters active in the tapetum and / or pollen; operatively linked to it a DNA sequence encoding a protein with the enzymatic activity of a sucrose isomerase; and operatively linked to regulatory sequences that can serve as transcription, termination and / or polyadenylation signals in plant cells; b) transfer of the nucleic acid molecule from a) to plant cells and c) regeneration of transgenic plants.
  • a recombinant nucleic acid molecule which comprises the following sequences: regulatory sequences of one in anthers. promoters active in the tapetum and / or pollen; operatively linked to it a DNA sequence encoding a protein with the enzymatic activity of a sucrose isomerase; and operatively linked to regulatory sequences
  • the invention further relates to a method for producing male-sterile plants, comprising the following steps: a) Production of a recombinant nucleic acid molecule which comprises the following sequences: - regulatory sequences of one in anthers, in the tapetum and or in
  • Pollen active promoter bound to it in sense or antisense orientation is a DNA sequence whose transcription leads to an inhibition of the plant's own invertase, hexose transporter, hexokinase and / or proton ATPase expression, and operatively linked regulatory sequences which act as transcription , Termination and / or polyadenylation signals can serve in plant cells, b) transfer of the nucleic acid molecule from a) to plant cells and c) regeneration of transgenic plants.
  • the invention further relates to plant cells which contain the nucleic acid molecules according to the invention which encode a protein with the enzymatic activity of a sucrose isomerase.
  • the invention also relates to crop products and propagation material of transgenic plants and the transgenic plants themselves which contain a nucleic acid molecule according to the invention.
  • the transgenic plants of the invention are male-sterile due to the introduction and expression of a DNA sequence encoding a sucrose isomerase in the anthers.
  • cloning vectors which contain a replication signal for E. coli and a marker gene for the selection of transformed bacterial cells.
  • examples of such vectors are pBR322, pUC series, M13mp series, pACYC184 etc.
  • the desired sequence can be introduced into the vector at a suitable restriction site.
  • the plasmid obtained is then used for the transformation of E. coli ZeXXes. Transformed E. coli ZeXXes are grown in a suitable medium and then harvested and lysed, and the plasmid is recovered.
  • Restriction analyzes, gel electrophoresis and other biochemical-molecular biological methods are generally used as the analysis method for characterizing the plasmid DNA obtained. After each manipulation, the plasmid DNA can be cleaved and DNA fragments obtained can be linked to other DNA sequences.
  • a large number of techniques are available for introducing DNA into a plant host cell, and the person skilled in the art can determine the appropriate method in each case without difficulty.
  • these techniques include the transformation of plant cells with T-DNA using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes as the transformation medium, the fusion of protoplasts, the injection, the
  • Electroporation the direct gene transfer of isolated DNA into protoplasts, the introduction of DNA using the biolistic method and other options that have been well established for several years and are common Repertoire of the expert in plant molecular biology or plant biotechnology belong.
  • plasmids When injecting and electroporation of DNA into plant cells, there are no special requirements per se for the plasmids used. The same applies to direct gene transfer. Simple plasmids, e.g. pUC derivatives can be used. However, if whole plants are to be regenerated from such transformed cells, the presence of a selectable marker gene is recommended.
  • the usual selection markers are known to the person skilled in the art and it is not a problem for him to select a suitable marker.
  • the Ti or Ri plasmid is used for the transformation of the plant cell, at least the right boundary, but frequently the right and left boundary of the T-DNA contained in the Ti or Ri plasmid, must be linked as flank region to the genes to be introduced become.
  • Agrobacteria are used for the transformation, the DNA to be introduced must be cloned into special plasmids, either in an intermediate or in a binary vector.
  • the intermediate vectors can be integrated into the Ti or Ri plasmid of the agrobacteria on the basis of sequences which are homologous to sequences in the T-DNA by homologous recombination.
  • Intermediate vectors cannot replicate in agrobacteria. Using a helper plasmid, the intermediate vector can be transferred to Agrobacterium tumefaciens (conjugation).
  • Binary vectors can replicate in E. coli as well as in Agrobacteria. They contain a selection marker gene and a linker or polylinker, which are framed by the right and left T-DNA border region. You can go straight to the agricultural bacteria are transformed.
  • the agrobacterium serving as the host cell is said to contain a plasmid which carries a vir region. The vir region is necessary for the transfer of the T-DNA into the plant cell. Additional T-DNA may be present.
  • plant explants can expediently be cultivated with Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes. Whole plants can then be regenerated from the infected plant material (for example leaf pieces, stem segments, roots, but also protoplasts or suspension-cultivated plant cells) in a suitable medium, which can contain antibiotics or biocides for the selection of transformed cells.
  • Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes.
  • Whole plants can then be regenerated from the infected plant material (for example leaf pieces, stem segments, roots, but also protoplasts or suspension-cultivated plant cells) in a suitable medium, which can contain antibiotics or biocides for the selection of transformed cells.
  • the introduced DNA is integrated in the genome of the plant cell, it is generally stable there and is also retained in the progeny of the originally transformed cell. It normally contains a selection marker which gives the transformed plant cells resistance to a biocide or an antibiotic such as Kanamycin, G 418. Bleomycin, hygromycin, methotrexate, glyphosate, streptomycin, sulfonylurea, gentamycin or phosphinotricin and others.
  • the individually selected marker should therefore allow the selection of transformed cells from cells that lack the inserted DNA.
  • Alternative markers are also suitable for this, such as nutritive markers and screening markers (such as GFP, green fluorescent protein).
  • selection markers can also be dispensed with entirely, but this is accompanied by a fairly high need for screening. If marker-free transgenic plants are desired, please Those skilled in the art also have strategies available which permit subsequent removal of the marker gene, for example cotransformation, sequence-specific recombinases.
  • the regeneration of the transgenic plants from transgenic plant cells is carried out according to customary regeneration methods using known nutrient media.
  • the plants obtained in this way can then be examined for the presence of the introduced DNA, which encodes a protein with the enzymatic activity of a sucrose isomerase, using conventional methods, including molecular biological methods, such as PCR, blot analyzes.
  • the transgenic plant or the transgenic plant cells can be any monocot or dicot plant or plant cell, preferably it is useful plants or cells of useful plants. It is particularly preferably rapeseed, cereals, sugar beet, corn, sunflower and soybean. In principle, any useful plant for the implementation of the invention is desirable, for which hybrid systems are particularly useful and valuable.
  • the invention also relates to propagation material and harvest products of the plants according to the invention, for example fruits, seeds, tubers, rhizomes, seedlings, cuttings, etc.
  • the transformed cells grow within the plant in the usual way.
  • the resulting plants can be grown normally.
  • the plants differ from wild-type plants in phenotypical terms by the male sterile phenotype.
  • the specific expression of the sucrose isomerase in the anthers of the plants according to the invention or in the plant cells according to the invention can be detected and tracked using conventional molecular biological and biochemical methods. These techniques are known to the person skilled in the art and he is easily able to select a suitable detection method, for example a Northern blot analysis for detecting sucrose isomerase-specific RNA or for determining the level of accumulation of sucrose isomerase-specific RNA, a southern blot analysis.
  • sucrose isomerase Analysis for the identification of DNA sequences coding for sucrose isomerase or a Western blot analysis for the detection of the sucrose isomerase protein encoded by the DNA sequences according to the invention.
  • the detection of the enzymatic activity of sucrose isomerase can also be determined by a person skilled in the art using protocols available in the literature.
  • a suitable restorer system is also desirable.
  • male fertility can be restored in the following ways.
  • DNA sequences that encode a protein with the enzymatic activity of a palatinase can be used as a restorer gene.
  • Palatinase also called palatinose hydrolase, catalyzes the cleavage of the disaccharide palatinose into the hexoses fructose and glucose.
  • nucleic acid sequences can be used as restorer genes which code for a protein with the enzymatic activity of a trehalulase.
  • the trehalulase, too Called trehalulose hydrolase the cleavage of the disaccharide trehalulose also catalyzes into fructose and glucose.
  • the male sterile phenotype can be overcome or abolished by crossing with plants that express a protein with the enzymatic activity of a palatinase and / or a protein with the enzymatic activity of a trehalulase, thus realizing a complete hybrid system, including a restorer function become.
  • Palatinase genes are known in the art.
  • PCT / EP 95/00165 discloses the sequence of a palatinase gene from the Protaminobacter rubrum bacterium and the sequence of a palatinase gene from the Pseudomonas mesoacidophila MX-45 bacterium.
  • a DNA sequence from Erwinia rhapontici is now disclosed for the first time, which encodes a protein with the enzymatic activity of a palatinase.
  • This sequence is in the attached sequence listing under SEQ ID No. 1, the deduced amino acid sequence is given under SEQ ID No. 2 or 3 specified.
  • a DNA sequence from Erwinia rhapontici is provided for the first time, which encodes a protein with the enzymatic activity of a trehalulase.
  • the sequence is in the attached sequence listing under SEQ ID No. 7, the deduced amino acid sequence is given under SEQ ID No. 8 and 9 respectively.
  • the invention thus also relates to those in SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 7 specified nucleotide sequences which encode a protein with the enzymatic activity of a palatinase or trehalulase, and the use of nucleic acid molecules which encode proteins with the enzymatic activity of a palatinase or trehalulase, for restoring male fertility in transgenic plants.
  • the invention further relates to a method for producing male fertile hybrid plants, comprising the following steps: a) producing a first transgenic male sterile parent plant, comprising a nucleic acid molecule which encodes a protein with the enzymatic activity of a sucrose isomerase, b) producing a second transgenic parent plant, comprehensive one
  • the same promoters that are useful for the expression of the sucrose isomerase are of course suitable for the expression of the palatinase or trehalulase gene.
  • the palatinase or trehalulase DNA sequences can also be advantageously expressed under the control of constitutive promoters, such as the 35S RNA promoter from CaMV. Both the palatinase and the trehalulase enzyme activity have no influence on the plant cells and thus also no influence on the plant growth, even when expressed in all tissues of the transgenic plant.
  • palatinase DNA sequences which code for an enzyme with high affinity for palatinose are preferably used. Accordingly, those trehalulase DNA sequences are preferably used which code for an enzyme with high affinity for trehalulose.
  • restorer line can therefore be a line which contains a DNA sequence coding for a protein with the activity of a palatinase or a trehalulase.
  • So expressing to restore fertility in sucrose isomerase. male sterile plants serve the expression of a corresponding sucrose isomerase inhibitor in the restorer line.
  • Such an inhibitor can be, for example, an antibody directed against sucrose isomerase, or a Inhibitor, as is known for example for invertases (Greiner et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17: 708-711).
  • the restorer line can express a ribozyme directed against sucrose isomerase mRNA.
  • Ribozymes can be made to have endonuclease activity directed against a particular mRNA (see, e.g., Steinecke et al. (1992) EMBO J. 11: 1525).
  • sucrose isomerase In connection with the present invention, one would cross a plant sterile by expression of the sucrose isomerase with a restorer line in which the corresponding sucrose isomerase sequences in the antisense orientation are under the control of suitable promoters, so that antisense transcripts for sucrose isomerase are produced .
  • the anther-specific sense expression that brings about the male sterile phenotype is inhibited or abolished, so that male fertile crossing products are produced.
  • the phenomenon of cosuppression can be used in a manner analogous to the antisense technique for restoring male fertility.
  • the expression of the antisense or cosuppression RNA is under the control of an inducible promoter, the activation of which allows the targeted restoration of male fertility.
  • Another alternative includes the expression of an RNA transcript which brings about the RNAse-P mediated cleavage of sucrose isomerase mRNA molecules.
  • an external leader sequence is constructed that directs the endogenous RNAse-P to the sucrose isomerase mRNA and ultimately mediates the cleavage of this mRNA (Altman et al., U.S. Patent No. 5,168,053; Yuan et al. (1994) Science 263: 1269).
  • the external guide sequence preferably contains 10 to 15 nucleotides complementary to sucrose isomerase and a 3'-NCCA nucleotide sequence, where N is preferably a purine.
  • the transcripts of the external leader sequence bind to the target mRNA via the formation of base pairs, which enables the mRNA to be cleaved by the RNAse-P at nucleotide 5 'from the paired region.
  • transgenic, male-sterile plants which, in addition to a sucrose isomerase gene operatively linked to a promoter sequence, contain a prokaryotic control region in the same expression cassette.
  • transgenic, male fertile plants are produced that express a prokaryotic polypeptide under the control of a corresponding promoter.
  • the prokaryotic polypeptide binds to the prokaryotic control region and represses the expression of the sucrose isomerase.
  • LexA repressor binds hybrids to the LexA operator region and thereby prevents the transcription of the sucrose isomerase gene.
  • LexA operator DNA molecules can be obtained, for example, by the synthesis of DNA fragments, which contain LexA operator sequences well known to those skilled in the literature, for example by Garriga et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 236: 125.
  • DNA sequences which code for the LexA repressor can be obtained, for example, by synthesis of such DNA molecules or by DNA cloning techniques as are known to the person skilled in the art and are described, for example, by Garriga et al., Vide supra.
  • sequences coding for the LexA repressor can be taken, for example, from plasmid pRB500 (ATTC 67758).
  • the invention is based on the successful production of new plants which are male-sterile due to the introduction and expression of a nucleic acid sequence coding for a sucrose isomerase in the anthers, which is to be understood in the following examples, which serve only to illustrate the invention and in no way as a limitation are explained. Examples
  • Cloning processes such as: restriction cleavage, DNA isolation, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes. Linking DNA fragments, transforming E. coli cells, growing bacteria. Sequence analysis of recombinant DNA was carried out according to Sambrook et al. (1989, vide supra). The transformation of Agrobacterium tumefaciens was carried out according to the method of Höfgen and Willmitzer (1988, Nucl. Acids Res. 16: 9877). Agrobacteria were grown in YEB medium (Vervliet et al. (1975) Gen. Virol. 26:33).
  • chromosomal DNA was isolated from the cells of a 50 ml overnight culture according to the standard protocol. Then approximately 300 ⁇ g of the DNA were partially digested with the restriction enzyme Sau3A and separated on a preparative agarose gel. Fragments between 5 and 12 kb were eluted from the gel using the Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden).
  • phages were plated to isolate genomic clones. After transferring the phages to nylon filters (Genescreen, NEN), the filters were hybridized with a radioactively labeled DNA fragment. Positive signals were visualized by means of autoradiography and isolated.
  • E. coli (XL-1 Blue. XL-MRF 'and XLOLR) bacteria were from the company
  • DSM 4484 Erwinia rhapontici
  • the vectors pCR-Blunt (Invitrogen, Netherlands), pMAL-c2 (New England Biolabs), pUC 19 (Yanish-Perron (1985) Gene 33: 103-119) and
  • leaf disks with a diameter of approx. 0.8 cm were extracted for 2 h at 70 ° C. with 100 ⁇ l 80% ethanol and 10 mM HEPES buffer (pH 7.5).
  • An HPLC system from Dionex which was equipped with a PA-1 (4 x 250 mm) column and a pulsed electrochemical detector, was used for the analysis of an aliquot of these extracts. Before the injection, the samples were centrifuged for 2 minutes at 13,000 rpm. Sugars were then eluted with a 10 minute gradient from 0 to 1 M sodium acetate after 4 minutes at 150 mM NaOH and a flow rate of 1 ml / min.
  • the appropriate standards from Sigma were used to identify and quantify the sugars.
  • sucrose isomerase A subfragment of sucrose isomerase was cloned by means of polymerase chain reaction (PCR). Genomic DNA from E. rhapontici (DSM 4484) was used as template material and was isolated according to the standard protocol. The amplification was carried out using the specific primers
  • Primer FB 84 5'-GTCGACGTCTTGCCAAAAACCTT-3 ⁇ derived from a prior art sucrose isomerase sequence.
  • Primer FB 83 comprises bases 109-127 and primer FB 84 bases 1289-1306 of the coding region of the sucrose isomerase gene from E. rhapontici.
  • the PCR reaction mixture (100 ⁇ l) contained chromosomal bacteria DNA (1 ⁇ g), primers FB 83 and FB 84 (250 ng each), Pfu DNA polymerase reaction buffer (10 ⁇ l, Stratagene), 200 ⁇ M dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) and 2.5 units of Pfu DNA polymerase (Stratagene).
  • the mixture was heated to 95 ° C. for 5 min.
  • the polymerization steps (30 cycles) were carried out in an automatic T3 thermal cycler (Biometra) according to the following program: denaturation 95 ° C (1 minute), attachment of the primers at 55 ° C (40 seconds), polymerase reaction at 72 ° C ( 2 minutes).
  • the fragment obtained was cloned into the vector pCR blunt (Invitrogen). The identity of the amplified DNA was verified by sequence analysis.
  • the amplified subfragment can be used as a hybridization probe for the isolation of further sucrose isomerase DNA sequences from other organisms or as a probe in the analysis of transgenic cells and plants.
  • the sketch below shows a schematic overview of the cloned palatinose gene cluster from Erwinia rhapontici. The position of the open reading frame and the direction of transcription are shown by arrows.
  • sucrose isomerase from Erwinia rhaponitici
  • sucrose isomerase The fully open reading frame of sucrose isomerase was cloned by means of polymerase chain reaction (PCR). Genomic DNA from E. rhapontici (DSM 4484) was used as template material and was isolated according to the standard protocol. The amplification was carried out using the specific primers • FB 96 5'-GGATCCACAATGGCAACCGTTCAGCAATCAAAT-3 'and • FB 97 5 ' -GTCGACCTACGTGATTAAGTTTATA-3 'for pCR-SucIsol. Primer FB 96 comprises bases 109-127 and additionally contains a start codon, primer FB 97 bases 1786-1803 of the coding region of the sucrose isomerase gene. For the construction of the construct pCR-SucIso2, FB 83 (5'-
  • the primers additionally carry the following restriction cloning sites: primers FB 96 or FB 83, BamHI; Primer FB 97, Sall.
  • the PCR reaction mixture (100 ⁇ l) contained chromosomal bacterial DNA (1 ⁇ g), primers FB 96 and FB 97 for pCR-SucIsol, or primers FB 83 and FB 97 for pCR-Sudso2 (250 ng each), Pfu DNA- Polymerase reaction buffer (10 ⁇ l, Stratagene), 200 ⁇ M dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) and 2.5 units of P col DNA polymerase (Stratagene). Before the start of the amplification cycles, the mixture was heated to 95 ° C. for 5 min. The polymerization steps (30 cycles) were carried out in an automatic T3
  • Fragment A contains the sequence of a sucrose isomerase from E. rhapontici. which extends from nucleotide 109-1803 of the sucrose isomerase gene.
  • the nucleotide sequence of the primers used was highlighted in each case.
  • the DNA sequence is under SEQ ID No. 4 specified.
  • Primer FB 180 comprises bases 2-21, primer FB 176 bases 1638-1656 of the coding region of the palatinase gene.
  • the primers additionally carry the following restriction cloning sites: Primer FB 180 Bglll; Primer FB 176 Sall.
  • the PCR reaction mixture 100 ⁇ l contained chromosomal bacteria DNA (1 ⁇ g), primers FB 180 and FB 176 (250 ng each), Pfu DNA polymerase reaction buffer (10 ⁇ l, Stratagene), 200 ⁇ M dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) and 2.5 units of Pfu DNA polymerase (Stratagene).
  • a DNA sequence coding for a sucrose isomerase was isolated from the plasmid pCR-Sudso2 and with the 35S promoter of the Cauliflower Mosaic Virus, which mediates a constitutive expression in transgenic plant cells, a signal peptide necessary for the uptake into the endoplasmic reticulum a vegetable gene (proteinase inhibitor II gene from potato (Keil et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 5641-5650; Genbank Accession X041 18), and a plant termination signal.
  • the sucrose isomerase fragment was extracted the construct pCR-SucIso2 (see Fig.
  • the vector pMA represents a modified form of the vector pBinAR (Höfgen and Willmitzer (1990) Plant Sei . 66: 221-230), which shows the 35S promoter of the Cauliflower Mosaic Virus, which mediates constitutive expression in transgenic plants, a signal peptide of Potato proteinase inhibitor II, which mediates the targeting of the fusion protein into the cell wall, and contains a plant termination signal.
  • the plant termination signal includes the 3 'end of the polyadenylation site of the octopine synthase gene.
  • Interfaces for the restriction enzymes BamHI, Xbal, Sall, PstI and SphI are located between the partial sequence of the proteinase inhibitor and the termination signal, which enable the insertion of corresponding DNA fragments, so that a fusion protein between the proteinase inhibitor and The inserted protein is formed, which is then transported into the cell wall by transgenic plant cells that express this protein (Fig. 3).
  • Fragment A contains the 35S promoter of the Cauliflower Mosaic Virus (CaMV). It contains a fragment which comprises nucleotides 6909 to 7437 of the CaMV (Franck (1980) Cell 21: 285.
  • Fragment B contains nucleotides 923-1059 of a proteinase inhibitor II gene from the potato (Keil et al., Supra ), which is fused via a linker with the sequence ACC GAA TTG GG to the sucrose isomerase gene from Erwinia rhapontici, which comprises nucleotides 109-1803, thereby making a signal peptide necessary for the uptake of proteins into the endoplasmic reticulum (ER) vegetable protein N-terminally fused to the sucrose isomerase sequence.
  • CaMV Cauliflower Mosaic Virus
  • Fragment C contains the polyadenylation signal of gene 3 of the T-DNA of the ti plasmid pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3: 835), nucleotides 1 1749-11939.
  • the plasmid pTA29-cwIso was prepared in a manner analogous to that described in Example 5, but with the modification that the expression of the fusion protein from proteinase inhibitor signal peptide and sucrose isomerase is under the control of the anther-specific promoter TA29 from tobacco.
  • the functionality of the anther-specific TA29 promoter has already been demonstrated (Mariani et al. (1990) Nature 347: 727-741).
  • Termination signal includes the 3 'end of the polyadenylation site of the octopine synthase gene.
  • the plasmid pTA29-cwIso contains three fragments A, B and C, which were cloned into the sites for restriction enzymes of the polylinker of pUC18 (see Figure 3).
  • Fragment A contains the TA29 promoter from Nicotiana tabacum.
  • the fragment contains the nucleotides -1477 to +57 relative to the transcription initiation site of the TA29 gene (Seurinck et al. (1990) Nucl. Acids. Res. 18: 3403). It was generated by PCR from genomic DNA from Nicotiana tabacum Var. Samsun NN amplified.
  • the amplification was carried out using the specific primers • FB158 5'-GAATTCGTTTGACAGCTTATCATCGAT-3 'and • FB159 5'-GGTACCAGCTAATTTCTTTAAGTAAA-3'.
  • the primers also carry the following restriction sites: primer FB158, EcoRI; Primer FB159, Asp718.
  • the PCR reaction mixture (100 ⁇ l) contained genomic tobacco DNA (2 ⁇ g), primers FB 158 and FB 159 (250 ng each), Pf DNA polymerase reaction buffer (10 ⁇ l, Stratagene), 200 ⁇ M dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) and 2.5 units of P col DNA polymerase (Stratagene). Before the start of the amplification cycles, the mixture was heated to 95 ° C. for 5 min. The polymerisation steps (35 cycles) were carried out in an automatic T3 thermal cycler (Biometra) according to the following program: denaturation 95 ° C. (1 minute), attachment of the primers at 55 ° C. (40 seconds), polymerase reaction at 72 ° C. (2 minutes).
  • Fragment B contains nucleotides 923 to 1059 of a proteinase inhibitor II gene from the potato (Keil et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 5641-5650; Genbank Acc. No. X041 18), which are available via a Linker with the sequence ACC GAA TTG GG to the sucrose isomerase gene from E. rhapontici. which comprises nucleotides 109 to 1803 are fused.
  • Fragment B was cut out as an Asp718 / Sall fragment from the above-described construct p35S-cwIso (Example 5) and cloned between the restriction sites Asp718 and Sall of the polylinker region of pUC 18.
  • Fragment C contains the polyadenylation signal of gene 3 of the T-DNA of the ti plasmid pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3: 835), nucleotides 11749-11939, which is a PvuII / Hindlll fragment from the plasmid pAGV 40 (Herrera- Estrella et al. (1983) Nature 303: 209) and after addition of Sphl linkers to the PvuII interface between the SphI and Hindill interface of the polylinker of pUC 18 has been cloned.
  • the chimeric gene was then cloned as an EcoRI / Hindlll fragment between the EcoRI and Hindlll sites of the plasmid pBIN19 (Bevan (1984) Nucl. Acids Res. 12: 8711).
  • Tobacco plant cells were transformed as described above using Agrobacterium -mediated gene transfer with the construct pTA29-cwIso and whole tobacco plants were regenerated.
  • the pTA29-cwIso transformants obtained showed a male sterile phenotype, otherwise no differences from the wild type were discernible.
  • the coding region of the palatinase from E. rhapontici was fused with a signal peptide of a plant gene necessary for inclusion in the ER (proteinase inhibitor II gene from kann, Keil et al. (1986 ) vide supra), placed under the control of the anther-specific promoter of the TA29 gene from tobacco.
  • the construct pTA29-cwPalQ obtained in this way consists of three fragments A, B and C (see Figure 5) and enables the expression of palatinase in the cell wall of tapetum cells.
  • Fragment A contains the TA29 promoter from Nicotiana tabacum.
  • the fragment contains the nucleotides -1477 to +57 relative to the transcription initiation site of the TA29 gene (Seurinck et al. (1990) Nucl. Acids. Res. 18: 3403). It was generated by PCR from genomic DNA from Nicotiana tabacum Var. Samsun NN amplified. The amplification was carried out using the specific primers
  • the primers also carry the following restriction sites: primer FB158, EcoRI; Primer FB159, Asp718.
  • the PCR reaction mixture (100 ⁇ l) contained genomic tobacco DNA (2 ⁇ g), primers FB 158 and FB 159 (250 ng each), Pf DNA polymerase reaction buffer (10 ⁇ l, Stratagene), 200 ⁇ M dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) and 2.5 units of P col DNA polymerase (Stratagene). Before the start of the amplification cycles, the mixture was heated to 95 ° C. for 5 min.
  • the polymerization steps (35 cycles) were carried out in an automatic T3 thermal cycler (Biometra) according to the following program: denaturation 95 ° C (1 minute), attachment of the primers at 55 ° C (40 seconds), polymerase reaction at 72 ° C ( 2 minutes).
  • Amplikon was digested with the restriction enzymes EcoRA and Asp718 and cloned into the corresponding restriction sites of the polylinker of pUC18. The identity of the amplified DNA was verified by sequence analysis.
  • the fragment B contains the nucleotides 923-1059 of a proteinase inhibitor II gene from the potato (Solanum tuber sum, Keil et al. 1986, vide supra), which via a linker with the sequence ACC GAA TTG GG to the palatinase gene from Erwinia rhapontici. which comprises nucleotides 2-1656 is fused.
  • a signal peptide of a vegetable protein necessary for the uptake of proteins into the endoplasmic reticulum is fused N-terminally to the palatinase sequence.
  • the region of the proteinase inhibitor II gene comprising nucleotides 923 to 1059 was isolated from the pMA vector via the restriction enzymes Asp718 and BamHI and between the corresponding ones
  • Fragment C contains the polyadenylation signal of gene 3 of the T-DNA of the ti plasmid P TiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3: 835), nucleotides 11749-11939, which is a PvuII / Hindill fragment from the plasmid pAGV 40 (Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303: 209) was isolated and cloned after addition of Sphl linkers to the PvuII interface between the SphI and Hindlll interface of the polylinker of pUC 18.
  • the chimeric gene was then cloned as an EcoRI / Hindlll fragment between the EcoRI and Hindlll sites of the plasmid pBIN19 (Bevan (1984) Nucl. Acids Res. 12: 8711).
  • the coding region of the palatinase gene from E. rhapontici is under anther-specific control, the gene product is included in the ER.
  • Transgenic plants that were transformed with pTA29-cwPalQ by means of Agrobacterium-mediated gene transfer showed no different phenotype compared to the wild type.
  • the daughter plants resulting from crossings of these plants with the male sterile plants from Example 6 again showed the male fertile phenotype of the pTA29-cwPalQ parent plants.
  • plasmid p35S-cwPalQ The DNA sequence, which codes for a palatinase, was fused with a signal peptide of a plant gene (proteinase inhibitor II gene from potato (Solanum tuberosum, Keil et al (1986, vide supra)) required for inclusion in the endoplasmic reticulum) and under brought the control of the 35S RNA promoter, whereby the plasmid p35S-cwpalQ was formed.
  • a plant gene proteinase inhibitor II gene from potato (Solanum tuberosum, Keil et al (1986, vide supra)
  • the palatinase fragment was cut out of the construct pCR-palQ via the restriction sites BglII and Sall and ligated into a pMA vector opened in BamHI / Sall.
  • the vector pMA represents a modified form of the vector pBinAR (Höfgen and Willmitzer (1990) Plant Sci.66: 221-230), which contains the 35S promoter of the Cauliflower mosaic virus, which mediates constitutive expression in transgenic plants Signal peptide of the proteinase inhibitor II from potato (Keil et al. 1986, vide supra)), which mediates the targeting of the fusion protein into the cell wall and contains a plant termination signal.
  • the plant termination signal includes the 3 'end of the polyadenylation site of the octopine synthase gene. Between the partial sequence of the proteinase inhibitor and the termination signal there are interfaces for the restriction enzymes BamHI, Xbal, Sall, PstI and SphI (in this order), which allow the insertion of corresponding DNA fragments, so that a fusion protein between the proteinase inhibitor and The inserted protein is formed, which is then transported into the cell wall of transgenic plants or plant cells that express this protein (see Figure 5).
  • the restriction enzymes BamHI, Xbal, Sall, PstI and SphI in this order
  • Fragment A contains the Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) 35S RNA promoter. It contains a fragment which comprises nucleotides 6909 to 7437 of the CaMV (Franck (1980) Cell 21, 285.
  • Fragment B contains nucleotides 923-1059 of a proteinase inhibitor II gene from the potato (Solanum tuberosum, Keil et al. 1986, vide supra), which is linked to the palatinase gene from Erwinia via a linker with the sequence ACC GAA TTG GG rhapontici, which comprises nucleotides 2-1656, is fused.
  • a signal peptide of a vegetable protein necessary for the uptake of proteins into the endoplasmic reticulum is fused N-terminally to the palatinase sequence.
  • Fragment C contains the polyadenylation signal of gene 3 of the T-DNA of the ti plasmid pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3, 835), nucleotides 11749-11939.
  • Transgenic plants which were transformed with p35S-cwPal by means of Agrobacterium -mediated gene transfer, showed no different phenotype compared to the wild type.
  • sucrose isomerase fragment was constructed from the construct pCR-Suc! So2 via the restriction enzymes BamHI and Sall was cut out and ligated into a pMAL-c2 vector (New England Biolabs), which had also been cut in this way, whereby the construct pMAL-SucIso ( Figure 4) was obtained.
  • This enables expression of the enzyme as a fusion protein with the maltose-binding protein under the control of the tac promoter inducible by IPTG.
  • Fragment A contains the tac promoter, which enables gene expression which can be induced by IPTG.
  • Fragment B contains part of the malE gene with translation start. Fragment C contains the coding region of sucrose isomerase. Fragment D contains the rrnR terminator from E. coli.
  • Bacterial cells transformed with pMAL-Suciso show IPTG-inducible expression of the sucrose isomerase from E. rhapontici.
  • the functional characterization of the sucrose isomerase gene was carried out by expression in E. coli.
  • the plasmid pMAL-Suciso was transformed into E. coli (XL-I blue, Stratagene).
  • the expression of the fusion protein between the maltose-binding protein and the sucrose isomerase was carried out according to the manufacturer's instructions on a culture scale of 50 ml. After harvesting the cells, the pellet was resuspended in 1 ml of 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0) and the soluble protein fraction was released by ultrasound treatment , An aliquot of the crude extract was mixed with the same volume of 600 mM sucrose and incubated for 24 hours at 30 ° C. To detect the resulting palatinose an aliquot of the batch was subjected to HPLC analysis. The chromatogram confirmed the production of palatinose by the recombinant sucrose isomerase in E. coli.
  • sucrose isomerase activity in transgenic plants
  • sucrose isomerase The detection of the in vivo functionality of the sucrose isomerase in transgenic plants was carried out as follows: ethanolic extracts were prepared from 0.5 cm 2 leaf disks of untransformed tobacco plants and the transformants 35S-cwIso (from Example 5) and analyzed by HPLC and the sugars identified based on the relevant standards. As the chromatograms showed, the expression of sucrose isomerase in the cell wall led to a substantial accumulation of palatinose in the examined p35S-cwIso plants. The wild type contains no palatinose, as was also clearly evident from the chromatograms.
  • the functional characterization of the palatinase gene was carried out by expression of the recombinant protein in E. coli.
  • the plasmid pQE-palO was transformed into E. coli (XL-I blue, Stratagene).
  • the recombinant protein was expressed according to the manufacturer's instructions (Qiagen, Hilden, Germany) on a culture scale of 50 ml. After harvesting the cells by centrifugation, the Pellet resuspended in 1 ml 30 mM HEPES (pH 7.5) and the soluble protein fraction released by ultrasound treatment. 20 ⁇ l of the crude extract were mixed with 80 ⁇ l 100 mM palatinose and incubated at 30 ° C. for 40 minutes.
  • the glucose released was determined in an aliquot of the mixture by a coupled optical-enzymatic test.
  • the palatinase activity of the recombinant enzyme was clearly demonstrated.
  • the enzyme shows its highest activity at a reaction temperature of 30 ° C and a pH of 7.0.
  • Primers FBI 84 and FBI 85 comprise bases 4-23 and 1638-1659, respectively, of the coding region of the trehalulase gene.
  • the primers additionally carry the following restriction sites: primers FB96 or FBI 84: BamHI; Primer FBI 85: Sall.
  • the PCR reaction mixture 100 ⁇ l contained chromosomal bacteria DNA (1 ⁇ g), primers FB184 and FB185 (250 ng each), Pfu DNA polymerase reaction buffer (10 ⁇ l, Stratagene), 200 ⁇ M dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) and 2.5 units of P col DNA polymerase (Stratagene).
  • the mixture was heated to 95 ° C. for 5 min.
  • the polymerization steps (30 cycles) were carried out in an automatic T3 thermal cycler (Biometra) according to the following program: denaturation 95 ° C (1 minute), attachment of the primers at 55 ° C (40 seconds), polymerase reaction at 72 ° C ( 2 minutes).
  • the amplicon was digested with BamHI and Sall and the fragment was cloned into the vector pCR blunt (Invitrogen), whereby the plasmid pCR-PalZ was obtained (see Figure 6). The identity of the amplified DNA was verified by sequence analysis.
  • Fragment A contains the sequence of an E. rhapontici trehalulase that extends from nucleotide 4 - 1659 of the trehalulase gene.
  • cwPalZ consists of three fragments A, B and C (see Figure 3) and enables the expression of trehalulase in the cell wall of tapetum cells.
  • Fragment A contains the TA29 promoter from Nicotiana tabacum.
  • the fragment contains the nucleotides -1477 to + 57 relative to the transcription initiation site of the TA29 gene (Seurinck et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 3403). It was generated from genomic DNA from Nicotiana tabacam Var. Samsun NN amplified. The amplification was carried out using the specific primers
  • the primers also carry the following restriction sites: primer FB158, EcoRI, primer FB159, Asp 718.
  • the PCR reaction mixture 100 ⁇ l contained genomic tobacco DNA (2 ⁇ g),
  • Fragment B contains nucleotides 923-1059 of a proteinase inhibitor II gene from the potato (Solanum tuber osam) (Keil et al (1986), vide supra), which is described in a linker with the sequence ACC GAA TTG GG is fused to the trehalulase gene from Erwinia rhapontici, which comprises nucleotides 4 - 1659.
  • a signal peptide of a vegetable protein necessary for the uptake of proteins in the endoplasmic reticulum is fused to the trehalulase sequence at the N-terminal.
  • Fragment C contains the polyadenylation signal of gene 3 of the T-DNA of the ti plasmid pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3, 835), nucleotides 1 1749-11939, which is a PvuII-HindIII fragment from the plasmid pAGV 40 (Herrera- Estrella et al. (1983) Nature 303, 209) and after addition of Sphl linkers to the PvuII interface between Sphl-HindIII interfaces of the polylinker of pUC 18 was cloned.
  • the chimeric gene was then cloned as an EcoRI-Hindlll fragment between the EcoRIHindlll sites of the plasmid pBIN 19 (Bevan (1984) Nucleic Acid Res. 12. 871 1).
  • pQE-palO In order to avoid glycosylation of palatinase from E. rhapontici in transgenic plants, suitable amino acids in the area of potential glycosylation sites were replaced by site-directed mutagenesis.
  • the plasmid pQE-palO served as template.
  • pQE-palO corresponds to pCR-palQ in terms of the palatinase sequence, but is suitable for the expression of the palatinase sequence in E. coli.
  • the reaction mixture (50 ⁇ l) for PCR-based mutagenesis was composed as follows: 50 ng pQE-palQ DNA, each 250 ng 5′- or 3′-primer, P Reich-DNA polymerase reaction buffer (5 ⁇ l, Stratagene), 200 ⁇ M dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) and 2.5 units of Pfu DNA polymerase (Stratagene).
  • the polymerization steps (15 cycles) were carried out in an automated T3 thermal cycler (Biometra) according to the following program: denaturation 95 ° C (30 seconds), attachment of the primers at 55 ° C (1 minute), polymerase reaction at 72 ° C (15 minutes ).
  • the parental DNA was digested with 1 unit of Dpnl restriction enzyme for 1 hour at 37 ° C. Then 1 ul of the approach to transform E. coli was used.
  • the mutation event was verified in each case by sequencing the corresponding region of the palatinase sequence. Functional expression of the mutagenized enzyme in E. coli has shown in all cases that the respective amino acid substitution does not have a negative effect on the enzymatic activity. The mutations were then combined with one another using the strategy described above, so that ultimately a palatinase was produced which no longer has any putative glycosylation sites. This enzyme, too, had no adverse catalytic properties after expression in E. coli.
  • the mutated palatmase sequence was then cloned into a vector for plant transformation and expressed in plants.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Beeinflussung der Pollenentwicklung durch Veränderung des Saccharosestoffwechsels in transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Erzeugung männlich steriler Pflanzen, worin dem Pollen Saccharose entzogen wird. Besonders betrifft die Erfindung die Expression eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase in transgenen Pflanzenzellen. Weiter betrifft die vorliegende Erfindung Nukleinsäuremoleküle, die eine DNA-Sequenz enthalten, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert, und worin die DNA-Sequenz mit regulatorischen Sequenzen eines in Pflanzen aktiven Promotors operativ verbunden ist, so dass die DNA-Sequenz in Antheren oder Pollen exprimiert wird. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung transgene Pflanzen und Pflanzenzellen, die das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül enthalten und aufgrund der Expression der DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert, männlich steril sind, sowie Ernteprodukte und Vermehrungsmaterial der transgenen Pflanzen.

Description

Verfahren zur Beeinflussung der Pollenentwicklung durch Veränderung des Saccharosestoffwechsels
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Beeinflussung der Pollenentwicklung durch Veränderung des Saccharosestoffwechsels in transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Erzeugung männlich steriler Pflanzen, worin sich entwickelnden Pollen Kohlenhydrate entzogen wird. Besonders betrifft die Erfindung die Expression eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase in transgenen Pflanzenzellen. Weiter betrifft die vorliegende Erfindung Nukleinsäuremoleküle. die eine DNA-Sequenz enthalten, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert, und worin die DNA-Sequenz mit regulatorischen Sequenzen eines in Pflanzen aktiven Promotors operativ verbunden ist, so dass die DNA-Sequenz in Antheren oder Pollen exprimiert wird. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung transgene Pflanzen und Pflanzenzellen, die das erfindungsgemäße Nukleinsauremolekul enthalten und aufgrund der Expression der DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert, männlich steril sind, sowie Ernteprodukte und Vermehrungs- material der transgenen Pflanzen.
Pflanzen besitzen als Eukaryonten zwei oder mehr Kopien ihrer genetischen Information pro Zelle. Jedes Gen wird in der Regel durch zwei Allele, die im homozygoten Zustand identisch bzw. im heterozygoten unterschiedlich sein können, repräsentiert. Bei der Kreuzung von zwei ausgewählten Inzuchtlinien sind die in der ersten Generation gebildeten FI -Hybride, also heterozygote Individuen, häufig größer, robuster und auch ertragreicher als die homozygoten Eltern, vermutlich weil ihre beiden allelischen Genprodukte a) mit geringerer Wahrscheinlichkeit inaktiviert werden oder b) eine größere Reaktionsbreite aufweisen. Dieser als Heterosis oder Hybridvitalität bezeichnete Effekt wird bereits seit vielen Jahrzehnten von Pflanzenzüchtern zur Produktion von Hybrid-Sorten genutzt. Die Züchtung solcher Hybridlinien erfolgt unter Nutzung der cytoplasmatischen männlichen Sterilität (CMS) oder der Selbst-Inkompatibilität (SI), den beiden wichtigsten genetischen Systemen zur Verhinderung der Selbstbefruchtung.
Die Möglichkeit, ein neues Gen mittels gentechnischer Methoden in das Genom einer Pflanzenzelle einzubauen, hat in den letzten Jahren eine dritte Möglichkeit zur Erzeugung von Hybridpflanzen eröffnet, nämlich die Nutzung eines synthetisch männlich-sterilen Systems.
Gentechnisch erzeugte männliche Sterilität wurde bereits durch verschiedene Strategien realisiert. Zu diesen gehören u.a. die Expression einer Ribonuklease (RNase) aus Bacillus amyloliquefaciens im Tapetum (das Tapetum ist die Zellschicht, welche die Pollenzellen während ihrer Entwicklung mit Nährstoffen versorgt) von Tabakantheren (Mariani C. et al. (1990) Nature 347:737-741 ; Mariani C. et al. (1992) Nature 357:384-387), die Überexpression des ro/C-Gens aus Agrobacterium rhizogenes in Tabak (Schmülling T. et al. (1988) EMBO J. 7:2621- 2629; Schmülling T. et al. (1993) Mol. Gen Genet. 237:385-394) und in Kartoffel (Fladung M. (1990) Plant Breeding 104:295-305) sowie die Expression einer Glucanase, durch deren Aktivität die Kallose-Zellwand der Microsporocyte frühzeitig zerstört wird (Worrall D. (1992) Plant Cell 4:759-771). Weitere Ansätze zur Erzeugung männlich steriler Pflanzen stehen in Zusammenhang mit der Veränderung der Pigmentzusammensetzung der Blüte auf der Grundlage der Isolierung und Manipulation der an der Flavonoidbiosynthese beteiligten Gene. Dabei wird die Inhibition eines bestimmten Schritts der Flavonoidsynthese in der Regel durch die Antisense-Technik oder die Expression zusätzlicher Sense-Konstrukte erreicht (siehe z.B. van der Krol A.R. et al. (1988) Nature 333:866-869; Napoli C. (1990) Plant Cell 2:279-289; van der Meer I.M. et al. (1992) Plant Cell 4:253-262; Taylor L.B. and - _>
Jorgenson R. (1992) J. Heredity 83: 11-17). Diese Arbeiten, von denen die meisten die trans-Inaktivierung der Chalkonsynthase betreffen, bestätigten die Vermutung, dass Flavonoide nicht nur die Blütenfarbe mitbestimmen, sondern auch eine essentielle Rolle in der Antheren- und Pollenentwicklung spielen.
Bei einem weiteren Ansatz zur Erzeugung männlicher Sterilität wird ein extern appliziertes Proherbizid durch das eingeführte Transgen in ein Herbizid umgewandelt. So fuhrt bei transgenen Tabakpflanzen, welche das αrgE-Gen aus E. coli unter der Kontrolle des TA29-Promotors exprimieren, die Applikation der nicht- toxischen Substanz N- Acetyl-L-phosphinotricin während der Pollenentwicklung zu männlicher Sterilität (Kriete et al. (1996) Plant J. 9:809-818). Durch die Aktivität des αrgE-Gens wird das nicht-toxische Proherbizid deacetyliert und in das cytotoxische L-Phosphinotricin umgewandelt.
Handelt es sich bei der erzeugten Hybridpflanze um eine Nutzpflanze, deren Samen, Früchte oder Blüten, also generative Organe, geerntet werden sollen, muss zusätzlich ein Restorer-System eingefügt werden, damit die FI -Pflanze wieder männlich fertil ist. Im Fall der oben erwähnten Expression einer Ribonuklease führt die Aktivität der Ribonuklease zur Zerstörung der Funktion des Tapetums mit der Konsequenz, dass der Pollen nicht mehr lebensfähig ist und männlich sterile Pflanzen entstehen. In diesem Fall wurde ein Restorer-System entwickelt, das auf der Expression eines Ribonuklease-Inhibitor-Gens basiert, welches aus dem gleichen Bakterium (B. amyloliquefaciens), das die Ribonuklease selbst exprimiert, isoliert wurde.
F 1 -Hybridlinien kommt aber nicht nur wegen ihrer erhöhten Vitalität und Ertragsleistung eine besondere Bedeutung zu. Die Saatzuchtindustrie hat zusätzlich dadurch eine große kommerzielle Bedeutung erlangt, dass FI -Hybridsorten vom Landwirt nicht weiter vermehrt werden können, da in der F2-Generation eine Aufspaltung der positiven Eigenschaften erfolgt und Pflanzen, die aus dem Samen von FI -Hybriden entstehen eine viel geringere Widerstands- und Leistungskraft zeigen als die Fl- Hybride. Der Landwirt muss somit für jede Aussaat beim Saatguthersteller neues Saatgut kaufen.
Obwohl an der Erzeugung von gentechnisch hergestellten Hybridlinien mit verbesserten agronomischen Eigenschaften und geringerem Arbeitsaufwand (da die mechanische Kastration entfallt) intensiv geforscht wird, führen die bisher zur Erzeugung von männlich sterilen Pflanzen zur Verfugung stehenden Verfahren jedoch in vielen Fällen nicht zu voll befriedigenden Ergebnissen. Darüber hinaus werden häufig Pflanzen mit einer erheblich gesteigerten Empfindlichkeit gegenüber Phytopathogenen erhalten, was ihre praktische Handhabung in einem hohen Maße erschwert. Es besteht somit ein starkes Bedürfnis nach weiteren Verfahren zur Erzeugung von männlich sterilen Pflanzen, welche die Nachteile des Standes der Technik nicht aufweisen.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, neue Verfahren zur Beeinflussung der Pollenentwicklung und damit zur Herstellung männlich steriler Pflanzen sowie rekombinante DNA-Moleküle zur Verfügung zu stellen, die eine DNA-Sequenz enthalten, die zur Manipulation der Pollenentwicklung und hier insbesondere zur Erzeugung männlich steriler Pflanzen eingesetzt werden kann.
Diese und weitere Aufgaben der Erfindung werden durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausfuhrungsformen gelöst.
Es wurde jetzt überraschenderweise gefunden, dass sich Gene, deren Expression in den Antheren zu einer Veränderung des Saccharosestoffwechsels führt und insbesondere bewirkt, dass sich entwickelnden Pollen Saccharose und andere Kohlenhydrate entzogen werden, für die Erzeugung männlich steriler Pflanzen eignen. Besonders nützlich sind dabei DNA-Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodieren.
Proteine mit Saccharoseisomerase- Aktivität katalysieren die Isomerisierung des Disaccharids Saccharose zu anderen Disacchariden. Dabei wird die zwischen den beiden Monosaccharideinheiten der Saccharose bestehende αl— . ß2-g_ykosidische Bindung, nämlich die glykosidische Bindung zwischen Glucose und Fructose in eine andere glykosidische Bindung zwischen zwei Monosaccharideinheiten überfuhrt. Insbesondere katalysieren Saccharoseisomerasen, auch Saccharosemutasen genannte, die Umlagerung in eine αl— . 6-Bindung oder/ und eine αl— . αl -Bindung. Dabei entsteht bei Isomerisierung zu einer αl— . 6-Bindung das Disaccharid Palatinose, während bei der Umlagerung zu einer αl— κxl -Bindung das Disaccharid Trehalulose entsteht.
Beispiele für Organismen, deren Zellen ein Protein mit Saccharoseisomerase- Aktivität kodierende Nukleinsäuresequenzen enthalten, sind insbesondere Mikroorganismen der Gattungen Protaminobacter, Erwinia. Serratia. Leuconostoc. Pseudomonas, Agrobacterium, Klebsieila und Enterobacter. Insbesondere sind hier folgende Beispiele für solche Mikroorganismen zu nennen: Protaminobacter rubrum (CBS 547, 77). Erwinia rhapontici (NCPPB 1578), Serratia plymuthica (ATCC 15928), Serratia marcescens (NCIB 8285), Leuconostoc mesenteroides NRRL B- 521f (ATCC 10830a), Pseudomonas mesoacidophila MX-45 (FERM 11808 bzw. FERM BP 3619), Agrobacterium radiobacter MX-232 (FERM 12397 bzw. FERM BP 3620), Klebsieila Subspezies und Enterobacter spezies.
Es wurde jetzt überraschend beobachtet, dass transgene Pflanzen, in deren Antheren aufgrund der Expression gentechnisch eingeführter Saccharoseisomerase-DNA- Sequenzen Saccharose in Palatinose überfuhrt wird, diese Expression von Saccharoseisomerase-DNA-Sequenzen zu einem männlich sterilen Phänotyp führt.
Ohne an eine Hypothese gebunden sein zu wollen, wird derzeit folgende Erklärung für das jetzt beobachtete Phänomen angenommen. Sich entwickelnde Pollen werden durch spezialisierte Zellen der Antheren mit Assimilaten versorgt. Kohlenhydrate werden in Form des Disaccharids Saccharose in den Apoplasten transportiert. Zur Aufnahme der Zucker sekretieren die Pollen extrazelluläre Invertasen, die dafür sorgen, dass die Hexosen Glucose und Fructose entstehen. Diese Monosaccharide werden durch die verfügbaren Hexosetransporter aufgenommen und metabolisiert. Durch Expression einer Saccharoseisomerase in den Antheren entsteht aus Saccharose u.a. Palatinose. Das Disaccharid Palatinose kann allerdings nur von entsprechenden Hydrolasen, nicht aber durch die oben erwähnten Invertasen gespalten werden. Dies führt dazu, dass die Pollen sich nicht entwickeln können, mit der Konsequenz der männlichen Sterilität.
Dieser Effekt kann auch durch andere Maßnahmen erreicht werden, die in einer Veränderung des Saccharosestoffwechsels, insbesondere einem Entzug von Saccharose und verwertbaren Hexosen. und somit in einer Unterversorgung der Pollen mit Kohlenhydraten resultieren. So lässt sich die Pollenentwicklung z.B. durch Hemmung von Invertasen, Hexosetransportern und Hexokinasen stören, was zum männlich sterilen Phänotyp der mit entsprechenden Nukleinsäuremolekülen transformierten Pflanzen führt. Die Entwicklung funktionsfähiger Pollen kann auch dadurch verhindert werden, dass in den Antheren osmotisch wirksame Substanzen produziert werden bzw. dort akkumulieren, was zur Austrocknung sich entwickelnder Pollen und somit zum männlich sterilen Phänotyp führt. In den meisten Pflanzen wird die Kohlenstoffversorgung sich bildender Pollen durch Saccharose, die in photosynthetisch aktiven Blättern gebildet und in den Leitbahnen des Phloems transportiert wurde, gedeckt. Die Saccharose wird von Tapetumzellen in den Apoplasten sezerniert, durch apoplastische Invertasen zu Glukose und Fruktose hydrolysiert und mittels Hexosetransporter in die Pollen aufgenommen. Im Cytosol der Pollen werden die Hexosen mittels Hexokinasen phosphoryliert und somit dem Stoffwechsel zur Verfügung gestellt. Die Aufnahme der Hexosen erfolgt zusammen mit Protonen, die mittels ATPasen in den Apoplasten gepumpt wurden. Zur Unterbrechung der Kohlenhydratsversorgung der sich entwickelnden Pollen sind daher wie oben erwähnt verschiedene Ansätze, welche die Aufnahme und Verwertung der Monosaccharide verhindern, möglich.
Die Beobachtung, dass die Pollenentwicklung durch Einflussnahme auf den Saccharosestoffwechsel und hier insbesondere den Entzug verwertbarer
Monosaccharide wirksam gehemmt werden kann, lässt sich in idealer Weise für die Erzeugung männlich steriler Nutzpflanzen einsetzen. Grundvoraussetzung für die Erzeugung solcher männlich steriler Nutzpflanzen ist die Verfügbarkeit geeigneter Transformationssysteme. Hier wurde während der letzten zwei Jahrzehnte ein breites Spektrum an Transformationsmethoden entwickelt und etabliert. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, Diffusion von Protoplasten, den direkten Gentransfer isolierter DNA in Protoplasten, die Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methoden sowie weitere Möglichkeiten. Eine weitere Voraussetzung für die Herstellung von Pflanzen, die DNA-Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodieren, in ihren Antheren, ihrem Tapetum bzw. ihren Pollen exprimieren und aufgrund dieser spezifischen Expression männlich steril sind, besteht darin, dass entsprechende DNA-Sequenzen zur Verfügung stehen.
Solche Sequenzen aus Protaminobacter rubrum, Erwinia rhapontici, Enterobacter species SZ 62 und Pseudomonas mesoacidophila MX-45 sind in PCT/EP 95/00165 beschrieben. Auf die Offenbarung dieser Patentanmeldung wird hiermit Bezug genommen, sowohl hinsichtlich der offenbarten Sequenzen selbst, als auch im Hinblick auf die Auffindung und Charakterisierung dieser und weiterer Saccharoseisomerase kodierender Sequenzen aus anderen Quellen.
Weitere Saccharoseisomerase kodierende DNA-Sequenzen kann der Fachmann der einschlägigen Literatur und den Gendatenbanken unter Verwendung geeigneter
Suchprofile und Computerprogramme für das Screening nach homologen Sequenzen bzw. für Sequenzvergleiche entnehmen.
Darüber hinaus kann der Fachmann weitere Saccharoseisomerase kodierende DNA- Sequenzen aus anderen Organismen mittels herkömmlicher molekularbiologischer Techniken selbst auffinden und im Rahmen der vorliegenden Erfindung einsetzen. So kann der Fachmann bspw. geeignete Hybridisierungssonden von den bekannten Saccharoseisomerase-Sequenzen ableiten und für das Screening von cDNA- und/ oder genomischen Banken des jeweils gewünschten Organismus, aus dem ein neues Saccharoseisomerase-Gen isoliert werden soll, einsetzen. Hierbei kann der Fachmann auf geläufige Hybridisierungs-, Klonierungs- und Sequenzierungsmethoden zurückgreifen, die in jedem bio- oder gentechnologischen Labor wohl bekannt und etabliert sind (siehe z.B. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). Der Fachmann kann natürlich auch anhand bekannter Sequenzen geeignete Oligonukleotidprimer für PCR-Amplifikationen von Saccharoseisomerase-Sequenzen synthetisieren und einsetzen.
Gleiches gilt für andere Maßnahmen, die in einer Unterversorgung sich entwickelnder Pollen mit Kohlenhydraten und insbesondere in einem Entzug verwertbarer Monosaccharide und damit männlich sterilen Pflanzen resultieren. Auch hier sind dem Fachmann die diversen Angriffspunkte wie Invertasen, Hexosetransporter und Hexokinasen aus der Literatur wohl bekannt, weshalb er in der Lage ist, die entsprechenden Proteine bspw. durch Übertragung von Antisense- oder Sense- bzw. Cosuppressionskonstrukten wirksam zu hemmen und so die Verwertung von Saccharose in den Antheren zu unterbrechen.
Als Targets sind hier, wie oben bereits erwähnt, zu nennen:
Zellwandgebundene Invertasen: Hier sind den einschlägigen Datenbanken und Veröffentlichungen eine Vielzahl von Genen bzw. cDNA- Klonen zu entnehmen, die es dem Fachmann mittels Routineverfahren ermöglichen, geeignete Konstrukte für die Hemmung der zellwandgebundenen Invertase zu erzeugen und auf Pflanzenzellen zu übertragen. Beispiele für geeignete Sequenzen sind: Arabidopsis (Schwebel-Dugue et al. (1994) Plant Physiol. 104, 809-810), Karotte (Ramloch- Lorenz et al. (1993) Plant J. 4, 545-554), Tabak, (Greiner et al. (1995) Plant Physiol. 108, 825-826), Tomate (Ohyama et al. (1998) Genes Genet. Syst. 73, 149-157), Vicia faba (Accession No. Z35163), Pisum sativum (Accession No. Z83339), Beta vulgaris (Accession No. X81795). Weitere Sequenzen sind durch Homologievergleiche leicht zu identifizieren, so dass eine Hemmung der Invertasen in allen relevanten Nutzpflanzen möglich ist. Neben der Hemmung durch Antisense- bzw. Sensekonstrukte kann die Invertase- Aktivität durch Expression von Invertaseinhibitoren unterdrückt werden. Ein Beispiel ist der Invertaseinhibitor aus Tabak (Greiner et al. (1998) Plant Physiol. 116, 733-742). Überexpression eines Invertaseinhibitors in transgenen Pflanzen führte zur Hemmung der endogenen Invertaseaktivität in Kartoffelknollen (Greiner et al. (1999) Nat. BioTech. 17, 708-71 1).
Ein weiteres Target stellen Hexosetransporter (Monosaccharidtransporter) dar. Auch hier sind den Datenbanken und Veröffentlichungen eine Vielzahl von Genen bzw. cDNA-Klonen zu entnehmen, die es dem Fachmann erlauben, Konstrukte zur Hemmung Pollen-exprimierter Hexosetransporter zu erstellen. Beispiele für veröffentlichte Sequenzen sind: Petunie (Ylstra et al. (1998) Plant Physiol. 118, 297- 304), Arabidopsis (Truernit et al. (1999) Plant J. 17, 191-201), Tabak (Sauer und Stadler (1993) Plant J. 4. 601-610), Medicago sativa (Acc. No.: AJ248339), Ricinus cornmunis (Acc. No.: L08191). Weitere Sequenzen sind durch Homologievergleiche leicht zu identifizieren, so dass eine Hemmung der Hexosetransporter in allen relevanten Nutzpflanzen möglich ist. Hier ist anzumerken, dass die Kohlenhydrate die für die Versorgung des wachsenden Pollenschlauchs bei Befruchtung notwendig sind, ebenfalls über einen Hexosetransporter aufgenommen werden müssen. Dies bedeutet, dass die Hemmung der Transporter sowohl die Pollenbildung als auch die Vitalität der Pollen behindert.
Weiter kann eine Unterversorgung der Pollen mit Kohlenhydraten durch Hemmung von Protonen-ATPasen erreicht werden. Auch hier sind den Datenbanken und
Veröffentlichungen eine Vielzahl von Genen bzw. cDNA-Klonen zu entnehmen, die es dem Fachmann erlauben. Konstrukte zur Hemmung der plasmamembran- gebundenen Protonen- ATPase zu erstellen. Beispiele für veröffentlichte Sequenzen sind: Vicia faba (Nakajima et al. (1995) Plant Cell Physiol. 36, 919-924), Kartoffel (Harms et al. (1994) Plant Mol. Biol. 26, 979-988), Reis (Ookura et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35, 1251-1256). Weitere Sequenzen sind durch Homologievergleiche leicht zu identifizieren, so dass eine Hemmung der plasmamembrangebundenen Protonen-ATPase in allen relevanten Nutzpflanzen möglich ist.
Ein weiterer Ansatzpunkt sind die oben erwähnten Hexokinasen. Hier gilt das gleiche wie für die anderen Targets, den Datenbanken und Veröffentlichungen sind eine Vielzahl von Genen bzw. cDNA-Klonen zu entnehmen, die es dem Fachmann erlauben. Konstrukte zur Hemmung der Hexokinase zu erstellen. Beispiele für veröffentlichte Sequenzen sind: Spinat (Wiese et al. (1999) FEBS Lett. 461, 13-18), Kartoffel (Veramendi et al. (1999) Plant Physiol. 121-134), Brassica napus (Accession No. AI352726), Capsicum annum (Accession No. AA840716), Arabidopsis (Acc. No.: U28215), weitere Sequenzen sind durch Homologiever- gleiche leicht zu identifizieren, so dass eine Hemmung der Hexokinase in allen relevanten Nutzpflanzen möglich ist.
Neben Sense- und Antisensekonstrukten könnten auch Inhibitoren der entsprechenden Proteine eingesetzt werden. Beispiele hierfür wären die Überexpression von Invertaseinhibitoren (Greiner et al. (1998) Plant Physiol. 116, 733-742) bzw. von Antikörper, die gegen bestimmte Proteine gerichtet sind. Beispiele für die erfolgreiche Expression von Antikörpern in Pflanzen sind in Whitelam und Cockburn (Trends in Plant Science (1996), 8, 268-272) zusammengefasst, weitere Beispiele sind der Fachliteratur zu entnehmen.
Weitere Ansätze liegen in der Kontrolle der Saccharoseisomerase-Aktivität. Die Saccharoseisomerase-Aktivität führt, wie oben beschrieben, zur Bildung von Palatinose, was zu einer Unterversorgung der betroffenen Zellen mit Kohlenhydraten führt. Um Wachstumseinbussen zu vermeiden, wird die Saccharoseisomerase demzufolge bevorzugt zellspezifisch in den Zielzellen ausgeprägt werden. Alternativ kann die Aktivität der Saccharoseisomerase durch Expression von Inhibitoren kontrolliert werden. Für mit der Saccharoseisomerase vergleichbare Enzyme sind in der Natur Inhibitoren entstanden. Ein Beispiel wurde bereits oben erwähnt, die
Invertase-Inhibitoren. Weitere Beispiele sind: Proteinase-Inhibitoren (z.B. in Gruden et al. (1997) Plant Mol. Biol. 34, 317-323), Polygalacturonase-Inhibitoren (z.B. in Mahalingam et al. (1999) Plant Microb. Interact. 12, 490-498) und Amylase- Inhibitoren (z.B. in Grossi et al. (1997) Planta 203, 295-303). Alle diese Inhibitoren binden das Zielprotein und unterbinden dessen katalytische Aktivität. Weiterhin könnte die Saccharoseisomerase durch Antikörper kontrolliert werden, welche die Isomerase binden und damit deren Aktivität, da wo erwünscht, ausschalten.
Weiter bedarf es zur Ausführung der vorliegenden Erfindung lediglich geeigneter regulatorischer Sequenzen, die die Expression einer operativ verknüpfter
Saccharoseisomerase-DNA-Sequenzen in den Antheren, im Tapetum und/oder in den Pollen der transformierten Pflanzen exprimieren. Auch hier kann der Fachmann geeignete Sequenzen problemlos dem Stand der Technik entnehmen. Einige für die Antheren- bzw. Pollen-spezifische Expression von kodierenden Sequenzen besonders geeignete Promotorsequenzen werden weiter unter beschrieben.
Diese gewebe- bzw. zellspezifischen Promotoren werden auch bevorzugt für Antisense- bzw. Sensekonstrukte eingesetzt, um Veränderungen des Kohlenhydratstoffwechsels mit dem Ziel, eine Unterversorgung der Pollen zu erreichen, ebenfalls auf die relevanten Gewebe zu beschränken.
Schließlich erfolgt die Herstellung chimärer Genkonstrukte. in denen Saccharoseisomerase kodierende DNA-Sequenzen unter Kontrolle von regulatorischen Sequenzen stehen, die eine Antheren/Tapetum Pollen-spezifische Expression gewährleisten, mittels konventioneller Klonierungsmethoden (siehe bspw. Sambrook et al. (1989), supra).
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein rekombinantes Nukleinsauremolekul umfassend a) regulatorische Sequenzen eines in Antheren, im Tapetum und/oder in Pollen aktiven Promotors; b) operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert; und c) operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations- und oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase ein Protein verstanden, das die Isomerisierung von Saccharose zu anderen Disacchariden katalysiert, wobei die αl — . ß2-glykosidische Bindung zwischen Glukose und Fruktose in der Saccharose in eine andere glykosidische Bindung zwischen zwei Monosaccharideinheiten überführt wird, insbesondere in eine αl- 6-Bindung und oder αl— . αl -Bindung. Besonders bevorzugt wird unter einem Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase ein Protein verstanden, das zur Isomerisierung von Saccharose zu Palatinose und/oder Trehalulose befähigt ist. Dabei beträgt der Anteil von Palatinose und Trehalulose an den gesamten Disacchariden, die durch Isomerisierung von Saccharose gebildet werden > 2%, bevorzugt > 20%, besonders bevorzugt > 50% und am meisten bevorzugt > 60%. Die DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert, kann aus natürlichen Quellen isoliert oder nach bekannten Verfahren synthetisiert werden. Mittels gängiger molekularbiologischer Techniken (siehe beispielsweise Sambrook et al. (1989), supra) ist es möglich, gewünschte Konstrukte für die Transformation von Pflanzen vorzubereiten bzw. herzustellen. Die für die gentechnische Manipulation in prokaryontischen Zellen üblicherweise eingesetzten Klonierungs-, Mutagenisierungs-, Sequenzanalyse-, Restriktionsanalyse- und weitere biochemisch-molekularbiologischen Methoden sind dem Durchschnittsfachmann wohl bekannt. So können nicht nur geeignete chimäre Genkonstrukte mit der gewünschten Fusion von Promotor und Saccharoseisomerase- DNA-Sequenz hergestellt werden, vielmehr kann der Fachmann mittels Routinetechniken falls erwünscht verschiedenartige Mutationen in die Saccharoseisomerase kodierende DNA-Sequenz einführen, wodurch es zu Synthese von Proteinen mit eventuell veränderten biologischen Eigenschaften kommt. Hierbei ist zum einen die Erzeugung von Deletionsmutanten möglich, bei denen durch fortschreitende Deletion vom 5'- oder vom 3'-Ende der kodierenden DNA-Sequenz die Synthese entsprechend verkürzter Proteine erreicht werden kann. Ferner ist es möglich, gezielt Enzyme herzustellen, die durch Addition entsprechender Signalsequenzen in bestimmten Kompartimenten der Pflanzenzelle lokalisiert sind. Weiterhin ist auch die Einführung von Punktmutationen denkbar an Positionen, bei denen eine Veränderung der Aminosäuresequenz einen Einfluss beispielsweise auf die Enzymaktivität oder die Regulierung des Enzyms hat. Auf diese Weise können z.B. Mutanten hergestellt werden, die nicht mehr den normalerweise in der Zelle herrschenden Regulationsmechanismen über allosterische Regulation oder kovalente Modifizierung unterliegen. Des weiteren können Mutanten hergestellt werden, die eine veränderte Substrat- oder Produktspezifität aufweisen. Weiterhin können Mutanten hergestellt werden, die ein verändertes Aktivitäts-, Temperatur- und/oder pH-Profil aufweisen. Bevorzugt werden Mutanten hergestellt, die auf die Veränderung der enzymatischen Eigenschaften abzielen, vorzugsweise auf eine Steigerung der Affinität zu Saccharose durch Erniedrigung des Km- Wertes.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die die in SEQ ID NO. 6 angegebene Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, b) DNA-Sequenzen, die die in SEQ ID No. 4 angegebene Nukleotidsequenz oder Teile davon umfassen, c) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz, die mit einem komplementären Strang der Nukleotidsequenz von a) oder b) hybridisieren, oder Teile dieser Nukleotidsequenz umfassen, d) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz, die zu einer Nukleotidsequenz von c) degeneriert ist, oder Teile dieser Nukleotidsequenz umfassen, e) DNA-Sequenzen, die ein Derivat. Analog oder Fragment einer Nukleotidsequenz von a), b), c) oder d) darstellen.
Neben der in SEQ ID No. 4 angegebenen Saccharoseisomerase-Sequenz aus Erwinia rhapontici werden als bevorzugte DNA-Sequenzen solche eingesetzt, die eine besonders hohe Affinität zu Saccharose besitzen, also einen niedrigen Km- Wert aufweisen, z.B. die Saccharoseisomerase aus Pseudomonas mesacidophila (Km für Saccharose 19,2 mM, Nagai et al. (1994) Biosci. Biotech. Biochem. 58:1789-1793) oder Serratia plymuthica (Km für Saccharose 63,5 mM; McAllister et al. (1990) Biotechnol. Lett. 12:667-672).
Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet im Rahmen dieser Erfindung eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen. vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al. (1989, supra) beschrieben sind.
DNA-Sequenzen, die mit den DNA- Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodieren, hybridisieren, können z.B. aus genomischen oder cDNA-Bibliotheken isoliert werden. Die Identifizierung und Isolierung derartiger DNA-Sequenzen kann dabei z.B. unter Verwendung von DNA-Sequenzen erfolgen, die exakt oder im wesentlichen eine der oben erwähnten Saccharoseisomerase kodierenden Nukleotidsequenzen des Standes der Technik oder Teile dieser Sequenzen aufweisen, bzw. der reversen Komplemente dieser DNA- Sequenzen, z.B. mittels Hybridisierung nach Standardverfahren (siehe z.B. Sambrook et al. (1989), supra). Bei denen als Hybridisierungssonde verwendeten Fragmenten kann es sich auch um synthetische Fragmente handeln, die mit Hilfe üblicher Synthesetechniken hergestellt wurden und deren Sequenz im wesentlichen mit einer der oben erwähnten DNA-Sequenzen für Saccharoseisomerase oder einem Teil einer dieser Sequenzen übereinstimmt. Die DNA- Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodieren, umfassen auch DNA-Sequenzen, deren Nukleotidsequenzen zu der einer der vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen degeneriert ist. Die Degeneration des genetischen Codes bietet dem Fachmann u.a. die Möglichkeit, die Nukleotidsequenz der DNA- Sequenz an die Codonpräferenz (codon usage) der Zielpflanze, also der aufgrund der spezifischen Expression der Saccharoseisomerase-DNA-Sequenz männlich sterilen Pflanze anzupassen und die Expression dadurch zu optimieren.
Die oben beschriebenen DNA-Sequenzen umfassen auch Fragmente, Derivate und allelische Varianten der oben beschriebenen DNA- Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodieren. Unter "Fragmenten" werden dabei Teile der DNA-Sequenz verstanden, die lang genug sind, um eines der beschriebenen Proteine zu kodieren. Der Ausdruck "Derivat" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die Sequenzen sich von den oben beschriebenen DNA- Sequenzen an einer oder mehreren Positionen unterscheiden, aber einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufweisen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität von mindestens 40 Prozent, insbesondere eine Identität von mindestens 60 Prozent, vorzugsweise über 80 Prozent und besonders bevorzugt über 90 Prozent. Die Abweichungen zu den oben beschriebenen DNA-Sequenzen können dabei beispielsweise durch Deletion. Substitution, Insertion oder Rekombination entstanden sein.
Die Abweichungen zu den oben beschriebenen DNA-Sequenzen können dabei beispielsweise durch Deletion, Substitution, Insertion oder Rekombination entstanden sein.
Bei den DNA-Sequenzen, die homolog zu den oben beschriebenen Sequenzen sind und Derivate dieser Sequenzen darstellen, handelt es sich in der Regel um Variationen dieser Sequenzen, die Modifikationen darstellen, die dieselbe biologische Funktion ausüben. Es kann sich dabei sowohl um natürlicherweise auftretende Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus anderen Organismen oder um Mutationen, wobei diese Mutationen auf natürliche Weise aufgetreten sein können oder durch gezielte Mutagenese eingeführt wurden. Ferner kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Bei den allelischen Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende Varianten handeln, als auch um synthetisch hergestellte oder durch rekombinante DNA- Techniken erzeugte Varianten. In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform stammt die beschriebene, für eine Saccharoseisomerase kodierende DNA-Sequenz aus Erwinia rhapontici (wie in SEQ ID No. 4 angegeben).
Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren ein rekombinantes Nukleinsauremolekul umfassend a) regulatorische Sequenzen eines in Antheren, im Tapetum und/oder in Pollen aktiven Promotors; b) daran in Sense- oder Antisense-Orientierung gebunden eine DNA- Sequenz, deren Transkription zu einer Hemmung der pflanzeneigenen
Invertase-, Hexosetransporter-, Hexokinase- und/oder Protonen- ATPase-Expression führt, und c) operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können.
Für die Expression der in den erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Molekülen enthaltenen DNA-Sequenz in pflanzlichen Zellen ist diese mit regulatorischen Sequenzen verknüpft, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten. Hier kommt jeder in pflanzlichen Zellen aktive Promotor in Frage. Da die Saccharoseisomerase erfindungsgemäß in Antheren-, Tapetum- und/oder Pollengewebe zur Expression gelangen muss, kommt hier jeder Promotor in Frage, der die Expression in Antheren, Tapetum oder Pollen, sei es u.a. in Antheren, Tapetum oder Pollen oder ausschließlich in diesen Geweben, gewährleistet.
Dabei kann der Promotor so gewählt sein, dass die Expression konstitutiv erfolgt oder nur in Antheren-, Tapetum- und/oder Pollen-spezifischem Gewebe, zu einem bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwicklung und/oder zu einem durch äußere Einflüsse, biotische oder abiotische Stimuli bestimmten Zeitpunkt (induzierte Genexpression). In Bezug auf die zu transformierende Pflanze kann der Promotor homolog oder heterolog sein. Bei Verwendung eines konstitutiven Promotors kann eine zell- bzw. gewebespezifische Expression auch dadurch erreicht werden, dass die Genexpression in den Zellen bzw. Geweben, in denen sie nicht erwünscht ist, gehemmt wird, bspw. durch die Ausprägung von Antikörpern, die das Genprodukt binden und somit seine Enzymaktivität unterbinden, oder durch geeignete Inhibitoren.
Im Rahmen der Erfindung besonders geeignete Promotoren sind Antheren-, Tapetum-und/ oder Pollen-spezifische Promotoren. Beispiele hierfür sind der Promotor des tapl-Gens aus Antirrhinum majus (Sommer et al. (1990)
EMBO J. 9:605-613; Sommer et al. (1991) Development, Suppl. 1 :169-176; z.B. als 2,2 kb EcoRI/ RαmHI-Restriktionsfragment); - der Promotor des TA29-Gens (Mariani et al. (1990) Nature 347:737-741 ;
Seurinck et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:3403; Genbank Acc. No.
X52283); der Promotor des RA8-Gens aus Oryza sativa L. (Jeon et al. (1999) Plant
Mol. Biol. 39:35-44, in dieser Veröffentlichung werden Εxpressionsstudien an RA8-Promotor/GUS-Konstrukten in transgenen Reispflanzen beschrieben);
- der Promotor des Bpl9-Gens aus Brassica napus (Albani et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:501-513);
- die Promotoren der LAT52- und LAT56-Gene aus Tomate (Twell et al. (1990) Development 109:705-713);
- der Promotor des BNA215-6-Gens aus Brassica campestris L. ssp. Pekinensis (Kim et al. (1997) Mol. Cells 7:21-27, hier werden Promotor/GUS-Expressionsanalysen in transgenen Tabakpflanzen beschrieben);
- der Promotor des NeIF-4A8-Gens aus Nicotiana tabacum (Brander and Kuhlemeier (1995) Plant Mol. Biol. 27:637-649, hier werden Promotor/ GUS- Expressionsstudien beschrieben);
- der Promotor des Bgpl-Gens aus Brassica campestris (Xu et al. (1993) Mol. Gen. Genet. 239:58-65, hier werden Deletionskonstrukte und deren Analyse in transgenen Arabidopsis thaliana-ΫiΛanzen beschrieben);
- der Promotor des APG-Gens aus A. thαliαnα (Roberts et αl. (1993) Plant J. 3:111-120;
- der Promotor des tap2-Gens aus Löwenmäulchen (Nacken et αj. (1991) FEBS Lett. 280:155-158, die die molekulare Analyse dieses Antheren-spezifischen Gens beschreiben); die Promotoren der chiA- und chiB-Gene aus Petunie (van Tunen et αl. (1990) Plant Cell 2:393-401); der Pollen-spezifische Promotor des Bnml-Gens aus Brassica napus (Treacy et al. (1997) Plant Mol. Biol. 34:603-61 1, in diesem Artikel werden Promotor/GUS-Expressionsanalysen in transgenen Rapspflanzen beschrieben); - der Promotor des Bp4-Gens aus Brassica napus und der Promotor des
NTM9-Gens aus Nicotiana tabacum (Custers et al. (1997) Plant Mol. Biol. 35:689-699) sind in den frühen Stadien der Pollenentwicklung aktive Promotoren; hier konnte mittels Promotor/Barnase-Fusionskonstrukten in transgenen Tabakpflanzen ein männlich steriler Phänotyp erzeugt werden; - der Pollen-spezifische Promotor des ZM13-Gens aus Mais (Hamilton et al.
(1998) Plant Mol. Biol. 38:663-669), hier wurden die zur Pollen-spezifischen Expression erforderlichen Sequenzbereiche durch Mutationsanalysen identifiziert und beschrieben; der Pollen-spezifische Promotor einer Invertase aus Kartoffel (Machray et al. (1999) „The role of invertases in plant carbohydrate partitioning and beyond", Abstracts Workshop Universität Regensburg, 3.-6. Okt. 1999; hier werden Promotor/GUS-Expressionsstudien beschrieben).
Weitere Antheren-spezifische Gene bzw. Promotoren kann der Fachmann dem Stand der Technik, insbesondere den einschlägigen wissenschaftlichen Journalen und Gendatenbanken entnehmen. Darüber hinaus ist der Durchschnittsfachmann in der Lage mittels Routinemethoden weitere geeignete Promotoren zu isolieren. So kann der Fachmann mit Hilfe gängiger molekularbiologischer Methoden, z.B.
Hybridisierungsexperimenten oder DNA-Protein-Bindungsstudien, Antheren- spezifische regulatorische Nukleinsäurelemente identifizieren. Dabei wird z.B. in einem ersten Schritt aus Antherengewebe des gewünschten Organismus, aus dem die regulatorischen Sequenzen isoliert werden sollen, die gesamte poly(A)+-RNA isoliert und eine cDNA-Bank angelegt. In einem zweiten Schritt werden mit Hilfe von cDNA-Klonen, die auf poly(A)+-RNA-Molekülen aus einem Nicht- Antherengewebe basieren, aus der ersten Bank mittels Hybridisierung diejenigen Klone identifiziert, deren korrespondierende poly(A)+-RNA-Moleküle lediglich in Antherengewebe akkumulieren. Anschließend werden mit Hilfe dieser so identifizierten cDNAs Promotoren isoliert, die über Antheren-spezifische regulatorische Elemente verfügen. Dem Fachmann stehen darüber hinaus weitere auf PCR basierende Methoden für die Isolierung geeigneter Antheren-spezifischer Promotoren zur Verfügung. Gleiches gilt natürlich auch für Pollen- bzw. Tapetum-spezifische Promotoren.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Antheren-spezifische Promotor der TA29-Promotor aus Tabak. Ferner sind Transkriptions- bzw. Terminationssequenz vorhanden, die der korrekten Beendigung der Transkription dient, sowie der Addition eines polyA-Schwanzes an das Transkript dienen kann, dem eine Funktion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben und beliebig austauschbar.
Die Erfindung betrifft weiterhin Vektoren und Mikroorganismen, die erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle enthalten und deren Verwendung die Herstellung männlich steriler Pflanzen ermöglicht. Dabei handelt es sich bei den Vektoren insbesondere um Plasmide, Kosmide, Viren, Bakteriophagen und andere in der Gentechnik gängige Vektoren. Bei den Mikroorganismen handelt es sich in erster Linie um Bakterien, Viren, Pilze, Hefen und Algen.
Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung männlich steriler Pflanzen, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, das folgende Sequenzen umfasst: regulatorische Sequenzen eines in Antheren. im Tapetum und/oder in Pollen aktiven Promotors; - operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert; und operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können; b) Übertragung des Nukleinsäuremoleküls aus a) auf pflanzliche Zellen und c) Regeneration transgener Pflanzen. Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung männlich steriler Pflanzen, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, das folgende Sequenzen umfasst: - regulatorische Sequenzen eines in Antheren, im Tapetum und oder in
Pollen aktiven Promotors; daran in Sense- oder Antisense-Orientierung gebunden eine DNA- Sequenz, deren Transkription zu einer Hemmung der pflanzeneigenen Invertase-, Hexosetransporter-, Hexokinase- und/oder Protonen- ATPase-Expression führt, und operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können, b) Übertragung des Nukleinsäuremoleküls aus a) auf pflanzliche Zellen und c) Regeneration von transgenen Pflanzen.
Des weiteren betrifft die Erfindung Pflanzenzellen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodieren, enthalten. Die Erfindung betrifft ebenfalls Ernteprodukte und Vermehrungsmaterial transgener Pflanzen sowie die transgenen Pflanzen selbst, die ein erfindungsgemäßes Nukleinsauremolekul enthalten. Die transgenen Pflanzen der Erfindung sind aufgrund der Einführung und Expression einer eine Saccharoseisomerase kodierenden DNA-Sequenz in den Antheren männlich steril.
Sämtliche hier unter Bezugnahme auf rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die ein Protein mit der Aktivität einer Saccharoseisomerase kodieren, gemachten Ausführungen, sei es im Zusammenhang mit der Herstellung von Vektoren, Pflanzenzellen, Wirtszellen, transgenen Pflanzen etc. gelten auch für die anderen, oben beschriebenen Ansätze zur Veränderung des Saccharosestoffwechsels mit dem Effekt einer Unterversorgung sich entwickelnder Pollen mit Kohlenhydraten.
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen bzw. deren Zellen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC- Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird dann für die Transformation von E. coli-ZeXXen verwendet. Transformierte E. coli-ZeXXen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet und anschließend geerntet und lysiert, und das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysenmethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch- molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA- Sequenzen verknüpft werden.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung, wobei der Fachmann die jeweils geeignete Methode ohne Schwierigkeiten ermitteln kann. Diese Techniken umfassen, wie bereits oben erwähnt, die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmedium, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die
Elektroporation, den direkten Gentransfer isolierter DNA in Protoplasten, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten die bereits seit mehreren Jahren gut etabliert sind und zum üblichen Repertoire des Fachmanns in der pflanzlichen Molekularbiologie bzw. Pflanzenbiotechnologie gehören.
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden per se keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Ähnliches gilt für den direkten Gentransfer. Es können einfache Plasmide, wie z.B. pUC-Derivate, verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens empfehlenswert. Dem Fachmann sind die gängigen Selektionsmarker bekannt, und es stellt für ihn kein Problem dar, einen geeigneten Marker auszuwählen.
Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z.B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muss mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der im Ti- bzw. Ri- Plasmid enthaltenen T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden. Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muss die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA-Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agro- bakterien transformiert werden. Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in allseits bekannten Übersichtsartikeln und Handbüchern zur Pflanzentransformation beschrieben worden. Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z.B. Blattstücke. Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden.
Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418. Bleomycin, Hygromycin, Methotrexat, Glyphosat, Streptomycin, Sulfonylharnstoff, Gentamycin oder Phosphinotricin u.a. vermittelt. Der individuell gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten. Hierzu sind auch alternative Marker geeignet, wie nutritive Marker, Screeningmarker (wie GFP, green fluorescent protein). Selbstverständlich kann auch vollkommen auf Selektionsmarker verzichtet werden, was allerdings mit einem ziemlich hohen Screening- bedarf einhergeht. Falls markerfreie transgenen Pflanzen erwünscht sind, stehen dem Fachmann auch Strategien zur Verfügung, die eine nachträgliche Entfernung des Markergens erlauben, z.B. Cotransformation, Sequenz-spezifische Rekombinasen.
Die Regeneration der transgenen Pflanzen aus transgenen Pflanzenzellen erfolgt nach üblichen Regenerationsmethoden unter Verwendung bekannter Nährmedien. Die so erhaltenen Pflanzen können dann mittels üblicher Verfahren, einschließlich molekularbiologischer Methoden, wie PCR, Blot- Analysen, auf Anwesenheit der eingeführten DNA, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert, untersucht werden.
Bei der transgenen Pflanze bzw. den transgenen Pflanzenzellen kann es sich um jede beliebige monokotyle oder dikotyle Pflanze bzw. Pflanzenzelle handeln, vorzugsweise handelt es sich um Nutzpflanzen bzw. Zellen von Nutzpflanzen. Besonders bevorzugt handelt es sich um Raps, Getreide, Zuckerrübe, Mais, Sonnenblume und Sojabohne. Prinzipiell ist jede Nutzpflanze für die Umsetzung der Erfindung erstrebenswert, für die Hybridsysteme besonders nützlich und wertvoll sind.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Vermehrungsmaterial und Ernteprodukte der erfindungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Früchte, Samen, Knollen, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge, etc.
Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise. Die resultierenden Pflanzen können normal angezogen werden. Phänotypisch unterscheiden sich die Pflanzen von Wildtyppflanzen durch den männlich sterilen Phänotyp. Die spezifische Expression der Saccharoseisomerase in den Antheren der erfindungsgemäßen Pflanzen bzw. in den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen kann mit Hilfe herkömmlicher molekularbiologischer und biochemischer Methoden nachgewiesen und verfolgt werden. Dem Fachmann sind diese Techniken bekannt und er ist problemlos in der Lage, eine geeignete Nachweismethode zu wählen, beispielsweise eine Northern Blot- Analyse zum Nachweise Saccharoseisomerase- spezifischer RNA bzw. zur Bestimmung der Höhe der Akkumulation von Saccharoseisomerase-spezifischer RNA, eine Southern Blot-Analyse zur Identifizierung von für Saccharoseisomerase-kodierende DNA-Sequenzen oder eine Western Blot-Analyse zum Nachweis des durch die erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen kodierten Saccharoseisomerase-Proteins. Selbstverständlich kann der Nachweis der enzymatischen Aktivität der Saccharoseisomerase auch vom Fachmann mittels in der Literatur erhältlicher Protokolle bestimmt werden.
Wie eingangs erwähnt ist neben einem System zur Erzeugung männlicher Sterilität in Pflanzen zusätzlich ein passendes Restorer-System wünschenswert. Im Fall der Erzeugung männlicher Sterilität durch Antheren-spezifische Expression von DNA- Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodieren, kann die männliche Fertilität auf folgende Weisen wiederhergestellt werden.
Zum einen können DNA-Sequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase kodieren, als Restorer-Gen eingesetzt werden. Die Palatinase, auch Palatinose-Hydrolase genannt, katalysiert die Spaltung des Disaccharids Palatinose in die Hexosen Fructose und Glucose. Zum anderen können zusätzlich oder alternativ zu den für eine Palatinase kodierenden DNA-Sequenzen Nukleinsäuresequenzen als Restorer-Gene eingesetzt werden, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase kodieren. Die Trehalulase, auch Trehalulose-Hydrolase genannt, katalysiert die Spaltung des Disaccharids Trehalulose ebenfalls in Fructose und Glucose.
So kann der männlich sterile Phänotyp durch die Kreuzung mit Pflanzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase und/oder ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase exprimieren, überwunden bzw. aufgehoben werden und somit ein vollständiges Hybridsystem, einschließlich Restorer-Funktion realisiert werden.
Palatinase-Gene sind im Stand der Technik bekannt. So offenbart PCT/EP 95/00165 die Sequenz eines Palatinase-Gens aus dem Bakterium Protaminobacter rubrum sowie die Sequenz eines Palatinase-Gens aus dem Bakterium Pseudomonas mesoacidophila MX-45.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird jetzt erstmals eine DNA-Sequenz aus Erwinia rhapontici offenbart, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase kodiert. Diese Sequenz ist im beigefügten Sequenzprotokoll unter SEQ ID No. 1 angegeben, die abgeleitete Aminosäuresequenz ist unter SEQ ID No. 2 bzw. 3 angegeben.
Ferner wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung erstmals eine DNA-Sequenz aus Erwinia rhapontici bereitgestellt, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase kodiert. Die Sequenz ist im beigefügten Sequenzprotokoll unter SEQ ID No. 7 angegeben, die abgeleitete Aminosäuresequenz ist unter SEQ ID No. 8 bzw. 9 angegeben.
Im Zusammenhang mit Palatinase- und Trehalulase-Sequenzen aus anderen Quellen und den Verfahren, mit denen der Fachmann solche Sequenzen isolieren bzw. herstellen kann, wird in vollem Umfang auf die obigen Ausführungen im Zusammenhang mit Saccharoseisomerase-Sequenzen verwiesen. Gleiches gilt für die Herstellung von rekombinanten Nukleinsäuremolekülen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase kodieren, für die Erzeugung von Pflanzen sowie für die Übertragung solcher Nukleinsäuremoleküle auf Pflanzenzellen und die Regeneration transgener Pflanzen. Ebenso wird auf alle obigen Ausführungen zur Hybridisierung, Homologie, zu Derivaten, Varianten und Fragmenten, regulatorischen Sequenzen etc. ausdrücklich Bezug genommen.
Die Erfindung betrifft somit auch die in SEQ ID No. 1 bzw. SEQ ID No. 7 angegebenen Nukleotidsequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase kodieren, sowie die Verwendung von Nukleinsäuremolekülen, die Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase bzw. Trehalulase kodieren, zur Wiederherstellung männlicher Fertilität in transgenen Pflanzen.
Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung männlich fertiler Hybridpflanzen, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellen einer ersten transgenen männlich sterilen Elternpflanze, umfassend ein Nukleinsauremolekul, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert, b) Herstellen einer zweiten transgenen Elternpflanze, umfassend ein
Nukleinsauremolekul, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase und/oder ein Nukleinsauremolekul, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase. kodiert, c) Kreuzen der ersten Elternpflanze mit der zweiten Elternpflanze zur Erzeugung einer Hybridpflanze, wobei die Hybridpflanze männlich fertil ist.
Für die Expression des Palatinase- bzw. Trehalulase-Gens sind natürlich die gleichen Promotoren geeignet, die für die Expression der Saccharoseisomerase nützlich sind. Die Palatinase- bzw. Trehalulase-DNA-Sequenzen können auch vorteilhaft unter Kontrolle konstitutiver Promotoren, wie bspw. dem 35S RNA-Promotor von CaMV, zur Expression gebracht werden. Sowohl die Palatinase- als auch die Trehalulase- Enzymaktivität habender se keinen Einfluss auf die Pflanzenzellen und somit auch keinen Einfluss auf das Pflanzenwachstum, auch bei Expression in allen Geweben der transgenen Pflanze.
Bevorzugt werden solche Palatinase-DNA-Sequenzen eingesetzt, die für ein Enzym mit hoher Affinität zu Palatinose kodieren. Entsprechend werden vorzugsweise solche Trehalulase-DNA-Sequenzen eingesetzt, die für ein Enzym mit hoher Affinität zu Trehalulose kodieren.
Wie oben ausgeführt, erfordert die Bereitstellung eines Restorer-Systems, also die Wiederherstellung der Fruchtbarkeit einer transgenen männlich sterilen Pflanze, die Herstellung einer zweiten, sog. Restorer-Linie von transgenen Pflanzen. Bei dieser Restorer-Linie kann es sich also um eine Linie handeln, die eine für ein Protein mit der Aktivität einer Palatinase bzw. einer Trehalulase kodierende DNA-Sequenz enthält. Daneben sind andere Ansätze zur Wiederherstellung der Fertilität möglich. So kann zur Wiederherstellung der Fruchtbarkeit in Saccharoseisomerase exprimierenden. männlich sterilen Pflanzen die Expression eines entsprechenden Saccharoseisomerase-Inhibitors in der Restorer-Linie dienen. Ein solcher Inhibitor kann z.B. ein gegen die Saccharoseisomerase gerichteter Antikörper sein, oder ein Inhibitor, wie er bspw. für Invertasen bekannt ist (Greiner et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:708-711).
In einem anderen Ansatz kann die Restorer-Linie ein gegen die Saccharoseisomerase-mRNA gerichtetes Ribozym exprimieren. Ribozyme können in der Weise hergestellt werden, dass sie eine gegen eine bestimmte mRNA gerichtete Endonuclease-Aktivität besitzen (siehe z.B. Steinecke et al. (1992) EMBO J. 11 :1525).
In einem ähnlichen Ansatz kann die Fertilität durch die Expression einer entsprechenden Antisense-RNA wiederhergestellt werden. Die Bindung der Antisense-RNA an die Ziel-RNA führt zur Inhibierung deren Translation (Paterson et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74:4370). Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung würde man also eine durch Expression der Saccharoseisomerase männlich sterile Pflanze mit einer Restorer-Linie kreuzen, in der die entsprechenden Saccharoseisomerase-Sequenzen in der Antisense- Orientierung unter Kontrolle geeigneter Promotoren stehen, so daß Antisense- Transkripte für Saccharoseisomerase entstehen. Hierdurch wird die Antheren- spezifische Sense-Expression, die den männlich sterilen Phänotyp herbeiführt, gehemmt bzw. aufgehoben, so dass männlich fertile Kreuzungsprodukte entstehen. Alternativ kann auch das Phänomen der Cosuppression in analoger Weise zur Antisense-Technik zur Wiederherstellung der männlichen Fertilität eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung steht die Expression der Antisense- oder Cosuppressions-RNA unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors, dessen Aktivierung die gezielte Wiederherstellung der männlichen Fertilität erlaubt. Eine weitere Alternative beinhaltet die Expression eines RNA-Transkriptes, welches die RNAse-P vermittelte Spaltung von Saccharoseisomerase-mRNA-Molekülen bewirkt. Bei diesem Ansatz wird eine externe Führungssequenz konstruiert, welche die endogene RNAse-P zur Saccharoseisomerase-mRNA geleitet und schließlich die Spaltung dieser mRNA vermittelt (Altman et al., US-Patent No. 5,168,053; Yuan et al. (1994) Science 263:1269). Vorzugsweise beinhaltet die externe Führungssequenz 10 bis 15 zur Saccharoseisomerase komplementäre Nukleotide und eine 3'-NCCA- Nukleotid-Sequenz, wobei N vorzugsweise ein Purin ist. Die Transkripte der externen Führungssequenz binden an die Ziel-mRNA über die Ausbildung von Basenpaaren, was die Spaltung der mRNA durch die RNAse-P am Nukleotid 5' von der gepaarten Region ermöglicht.
Ein weitere Ansatz zur Wiederherstellung der männlichen Fertilität sind transgene, männlich sterile Pflanzen, welche zusätzlich zu einem mit einer Promotorsequenz operativ verknüpften Saccharoseisomerase-Gen eine prokaryontische Kontrollregion in der selben Expressionskassette enthalten. Zusätzlich werden transgene, männlich fertile Pflanzen produziert, die ein prokaryontisches Polypeptid unter der Kontrolle eines entsprechenden Promotors exprimieren. In den FI -Hybriden bindet das prokaryontische Polypeptid an die prokaryontische Kontrollregion und reprimiert die Expression der Saccharoseisomerase. Konkret kann das LexA-Gen/LexA-
Operatorsystem benutzt werden, um die Kontrolle der Genexpression zu erreichen (US-Patent No. 4,833,080; Wang et al. (1993) Mol. Cell Biol. 13:1805). Dies würde bedeuten, dass die Expressionskassette der männlich sterilen Linie die LexA- Operatorsequenz enthält, während die Expressionskassette der männlich fertilen Restorer-Linie die kodierende Region des LexA-Repressors enthält. In den Fl-
Hybriden bindet der LexA-Repressor an die LexA-Operatorregion und unterbindet dadurch die Transkription des Saccharoseisomerase-Gens. LexA-Operator-DNA- Moleküle können z.B. durch die Synthese von DNA-Fragmenten erhalten werden, welche dem Fachmann aus der Literatur wohl bekannte LexA-Operator-Sequenzen enthalten, so z.B. von Garriga et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 236: 125 beschrieben. DNA-Sequenzen, die für den LexA-Repressor kodieren, können z.B. durch Synthese solcher DNA-Moleküle erhalten werden oder durch DNA-Klonierungstechniken wie sie dem Fachmann bekannt sind und z.B. bei Garriga et al., vide supra, beschrieben sind. Alternativ können für den LexA-Repressor kodierende Sequenzen zum Beispiel von Plasmid pRB500 (ATTC 67758) entnommen werden.
Der im Zusammenhang mit dem LexA-Repressor/Operator-System erklärte Ansatz zur Wiederherstellung der männlichen Fertilität lässt sich natürlich auch mit anderen Repressor/Operator-Systemen realisieren, wie sie dem Fachmann aus der Literatur in vielfaltiger Weise bekannt sind, z.B. das Lac-Repressor/lac-Operator-System oder das trp-Repressor/trp-Operator-System.
Schließlich kann die Fertilität durch Applikation von chemischen Verbindungen oder Substanzen während der Pollenentwicklung wiederhergestellt werden, die die Saccharoseisomerase in ihrer Aktivität hemmen.
Die Erfindung basiert auf der erfolgreichen Herstellung neuer Pflanzen, die aufgrund der Einführung und Expression einer für eine Saccharoseisomerase kodierende Nukleinsäuresequenz in den Antheren männlich steril sind, was in den nachfolgenden Beispielen, die nur der Veranschaulichung der Erfindung dienen und in keiner Weise als Einschränkung zu verstehen sind, erläutert wird. Beispiele
Gentechnische Verfahren, die den Ausführungsbeispielen zugrunde liegen:
1. Allgemeine Klonierungsverfahren
Klonierungsverfahren wie z.B.: Restriktionsspaltungen, DNA-Isolierung, Agarose- Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylon Membranen. Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien. Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden nach Sambrook et al. (1989, vide supra) durchgeführt. Die Transformation von Agrobacterium tumefaciens wurde entsprechend der Methode von Höfgen und Willmitzer (1988, Nucl. Acids Res. 16:9877) ausgeführt. Die Anzucht der Agrobacterien erfolgte in YEB Medium (Vervliet et al. (1975) Gen. Virol. 26:33).
2. Erzeugung einer genomischen Bank von Erwinia rhapontici Zur Herstellung einer genomischen Bank aus Erwinia rhapontici (DSM 4484) wurde chromosomale DNA aus den Zellen einer 50 ml-Übernachtkultur nach Standardprotokoll isoliert. Anschließend wurden ca. 300 μg der DNA mit dem Restriktionsenzym Sau3A partialverdaut und auf einem präparativen Agarosegel aufgetrennt. Fragmente zwischen 5 und 12 kb wurden mittels Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) aus dem Gel eluiert. Die so erhaltenen DNA- Fragmente wurden in BamHI-verdaute Lambda ZAP-Express-Arme (Stratagene, La Jolla, USA) ligiert und anschließend in vitro verpackt (Gigapack III Gold Packaging Extract. Stratagene, nach Herstellerangaben). E. co//-Bakterien des Stammes XL- MRF' (Stratagene) wurden mit rekombinanten Lambda-Phagen infiziert, der Titer der Bank bestimmt und schließlich die Bank amplifiziert. 3. Durchmusterung einer genomischen Bank
Zur Isolierung von genomischen Klonen wurden ca. 105 Phagen plattiert. Nach Transfer der Phagen auf Nylonfilter (Genescreen, NEN) wurden die Filter mit einem radioaktiv markierten DNA-Fragment hybridisiert. Positive Signale wurden mittels Autoradiographie sichtbar gemacht und vereinzelt.
4. Bakterienstämme und Plasmide
E. coli (XL-1 Blue. XL-MRF' und XLOLR)-Bakterien wurden von der Firma
Stratagene bezogen. Erwinia rhapontici (DSM 4484) wurde von der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Braunschweig,
Deutschland) bezogen. Der zur Pflanzentransformation eingesetzte Agrobacterium-
Stamm (C58C1 mit dem Plasmid pGV 3850kan) wurde von Debleare et al. (1985,
Nucl. Acids Res. 13:4777) beschrieben.
Zur Klonierung wurden die Vektoren pCR-Blunt (Invitrogen, Niederlande), pMAL- c2 (New England Biolabs), pUC 19 (Yanish-Perron (1985) Gene 33:103-119) und
Binl9 (Bevan (1984) Nucl. Acids Res. 12:8711-8720) verwendet.
5. Tabaktransformation
Zur Transformation von Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum L. cv. Samsun NN) wurden 10ml einer unter Selektion gewachsenen Übernachtkultur von
Agrobacterium tumefaciens abzentrifugiert, der Überstand verworfen, und die Bakterien im gleichen Volumen Antibiotika-freien Mediums resuspendiert. In einer sterilen Petrischale wurden Blattscheiben steriler Pflanzen (Durchmesser ca. 1cm) in dieser Bakterienlösung gebadet. Anschließend wurden die Blattscheiben in Petrischalen auf MS-Medium (Murashige und Skoog (1962) Physiol. Plant 15:473) mit 2% Saccharose und 0,8% Bacto-Agar ausgelegt. Nach 2-tägiger Inkubation im Dunkeln bei 25°C wurden sie auf MS-Medium mit 100 mg/1 Kanamycin. 500 mg/1 Claforan, lmg/1 Benzylaminopurin (BAP), 0,2mg/l Naphthylessigsäure (NAA), 1,6% Glukose und 0,8% Bacto-Agar übertragen und die Kultivierung (16 Stunden Licht / 8 Stunden Dunkelheit) fortgesetzt. Wachsende Sprosse wurden auf hormonfreies MS- Medium mit 2% Saccharose, 250 mg/1 Claforan und 0,8%) Bacto-Agar überführt.
6. Nachweis von Palatinose in Pflanzenextrakten
Zum Nachweis von Saccharoseisomerase-Aktivität in Pflanzenextrakten wurden Blattscheiben mit einem Durchmesser von ca. 0,8 cm für 2 h bei 70 °C mit 100 μl 80 % Ethanol und 10 mM HEPES-Puffer (pH 7,5) extrahiert. Für die Analyse eines Aliquots dieser Extrakte wurde ein HPLC-System der Firma Dionex verwendet, welches mit einer PA-1 (4 x 250 mm)-Säule und einem gepulsten elektrochemischen Detektor ausgestattet war. Vor der Injektion wurden die Proben für 2 Minuten bei 13.000 rpm abzentrif giert. Zucker wurden anschließend mit einem lOminütigen Gradienten von 0 bis 1 M Natriumacetat nach 4 Minuten bei 150 mM NaOH und einer Durchflussrate von 1 ml/min eluiert. Zur Identifizierung und Quantifizierung der Zucker wurden die entsprechenden Standards der Firma Sigma verwendet.
Beispiel 1
PCR-Amplifikation eines Subfragments der Saccharoseisomerase aus Erwinia rhaponitici
Die Klonierung eines Subfragments der Saccharoseisomerase erfolgte mittels Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR). Als Matrizenmaterial diente genomische DNA aus E. rhapontici (DSM 4484), die nach Standardprotokoll isoliert wurde. Die Amplifizierung erfolgte unter Verwendung der spezifischen Primer
• FB 83 5'-GGATCCGGTACCGTTCAGCAATCAAAT-3' und
• FB 84 5'-GTCGACGTCTTGCCAAAAACCTT-3\ die von einer Saccharoseisomerase-Sequenz des Standes der Technik abgeleitet wurden. Primer FB 83 umfaßt die Basen 109 - 127 und Primer FB 84 die Basen 1289 - 1306 der kodierenden Region des Saccharoseisomerase-Gens von E. rhapontici. Das PCR- Reaktionsgemisch (100 μl) enthielt chromosomale Bakterien DNA (1 μg), Primer FB 83 und FB 84 (jeweils 250 ng), Pfu DNA-Polymerase-Reaktionspuffer (10 μl, Stratagene), 200 μM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und 2,5 Einheiten Pfu DNA-Polymerase (Stratagene). Vor Beginn der Amplifikationszyklen wurde das Gemisch für 5 min auf 95 °C erhitzt. Die Polymerisierungsschritte (30 Zyklen) wurden in einem automatischen T3-Thermocycler (Biometra) nach folgendem Programm durchgeführt: Denaturierung 95 °C (1 Minute), Anlagerung der Primer bei 55 °C (40 Sekunden), Polymerase-Reaktion bei 72 °C (2 Minuten). Das erhaltene Fragment wurde in den Vektor pCR-Blunt (Invitrogen) kloniert. Die Identität der amplifizierten DNA wurde mittels Sequenzanalyse verifiziert.
Das amplifizierte Subfragment kann gut als Hybridisierungssonde für die Isolierung weiterer Saccharoseisomerase-DNA-Sequenzen aus anderen Organismen oder als Sonde bei der Analyse transgener Zellen und Pflanzen eingesetzt werden.
Beispiel 2
Isolierung und Sequenzierung des Palatinose-Operons aus E. rhapontici
Zur Isolierung des Palatinose-Operons wurde eine genomische Bank mit einem Subfragment der Saccharoseisomerase (siehe Beispiel 1) durchmustert. Dabei wurden mehrere positive Klone isoliert. Durch vollständige Sequenzierung und Zusammensetzen dieser Klone konnten mehrere offene Leserahmen identifiziert werden, welche für Enzyme des Palatinose-Stoffwechsels kodieren (siehe unten stehende Übersicht der Gene des Palatinose-Operons und der dazugehörigen 59135
39
Genprodukte). Die untenstehende Skizze zeigt eine schematische Übersicht des klonierten Palatinose-Genclusters aus Erwinia rhapontici. Die Position der offenen Leserahmen und die Richtung der Transkription sind durch Pfeile dargestellt.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 12 13 14 15 kb
1 I I I I I I I I I I I I I I 1
[<t_____ 4_ palZ palQ palK palH palG palF palE palR pall
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Beispiel 3
PCR-Amplifikation einer Saccharoseisomerase aus Erwinia rhaponitici
Die Klonierung des voUständingen offenen Leserasters der Saccharose-Isomerase erfolgte mittels Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR). Als Matrizenmaterial diente genomische DNA aus E. rhapontici (DSM 4484), die nach Standardprotokoll isoliert wurde. Die Amplifizierung erfolgte unter Verwendung der spezifischen Primer • FB 96 5'-GGATCCACAATGGCAACCGTTCAGCAATCAAAT-3' und • FB 97 5'-GTCGACCTACGTGATTAAGTTTATA-3' für pCR-SucIsol . Primer FB 96 umfaßt die Basen 109 - 127 und beinhaltet zusätzlich ein Startkodon, Primer FB 97 die Basen 1786 - 1803 der kodierenden Region des Saccharoseisomerase-Gens. Zur Herstellung des Konstruktes pCR- SucIso2 wurde als 5'-Primer FB 83 (5'-
GGATCCGGTACCGTTCAGCAATCAAAT-3'), welcher kein zusätzliches ATG enthält, verwendet. Zur Klonierung der amplifizierten DNA in Expressionsvektoren tragen die Primer zusätzlich folgende Restriktonsschnittstellen: Primer FB 96 bzw. FB 83, BamHI; Primer FB 97, Sall. Das PCR-Reaktionsgemisch (100 μl) enthielt chromosomale Bakterien-DNA (1 μg), Primer FB 96 und FB 97 für pCR-SucIsol, bzw. Primer FB 83 und FB 97 für pCR-Sudso2 (jeweils 250 ng), Pfu DNA- Polymerase-Reaktionspuffer (10 μl, Stratagene), 200 μM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und 2,5 Einheiten Pfü DNA-Polymerase (Stratagene). Vor Beginn der Amplifikationszyklen wurde das Gemisch für 5 min auf 95 °C erhitzt. Die Polymerisierungsschritte (30 Zyklen) wurden in einem automatischen T3-
Thermocycler (Biometra) nach folgendem Programm durchgeführt: Denaturierung 95 °C (1 Minute), Anlagerung der Primer bei 55 °C (40 Sekunden), Polymerase- Reaktion bei 72 °C (2 Minuten). Das amplifizierte Saccharoseisomerase-Fragment wurde in den Vektor pCR-Blunt (Invitrogen) kloniert, wodurch das Plasmid pCR- Suclsol (mit Translationsstart) bzw. pCR-SucIso2 (ohne Translationsstart) erhalten wurde (siehe Abbildung 1). Die Identität der amplifizierten DNA wurde mittels Sequenzanalyse verifiziert.
Das Fragment A beinhaltet die Sequenz einer Saccharoseisomerase aus E. rhapontici. die sich von Nukleotid 109 - 1803 des Saccharoseisomerase-Gens erstreckt. Die Nukleotidsequenz der verwendeten Primer wurde jeweils hervorgehoben. Die DNA-Sequenz ist unter SEQ ID No. 4 angegeben.
Beispiel 4
PCR-Amplifikation einer Palatinase aus Erwinia rhaponitici
Die Klonierung des voUständingen offenen Leserasters der Palatinase erfolgte mittels Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR). Als Matrizenmaterial diente genomische DNA aus E. rhapontici, die nach Standardprotokoll isoliert wurde. Die Amplifizierung erfolgte unter Verwendung der spezifischen Primer
• FBI 80 5'-GAGATCTTGCGCAGCACACCGCACTGG-3' • FBI 76 5 ' -GTCGACTC AC AGCCTCTC AATAAG-3 '
Primer FB 180 umfaßt die Basen 2 - 21, Primer FB 176 die Basen 1638 - 1656 der kodierenden Region des Palatinase-Gens. Zur Klonierung der DNA in Expressionsvektoren tragen die Primer zusätzlich folgende Restriktonsschnittstellen: Primer FB 180 Bglll; Primer FB 176 Sall. Das PCR Reaktionsgemisch (100 μl) enthielt chromosomale Bakterien DNA (1 μg), Primer FB 180 und FB 176 (jeweils 250 ng), Pfu DNA Polymerase Reaktionspuffer (10 μl, Stratagene), 200 μM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und 2,5 Einheiten Pfu DNA Polymerase (Stratagene). Vor Beginn der Amplifikationszyklen wurde das Gemisch für 5 min auf 95 °C erhitzt. Die Polymerisierungsschritte (30 Zyklen) wurden in einem automatischen T3-Thermocycler (Biometra) nach folgendem Programm durchgeführt: Denaturierung 95 °C (1 Minute), Anlagerung der Primer bei 55 °C (40 Sekunden), Polymerase-Reaktion bei 72 °C (2 Minuten). Das entsprechende Fragment wurde in den Vektor pCR-Blunt (Invitrogen) kloniert. wodurch das Plasmid pCR-PalQ erhalten wurde (Abb. 2). Die Identität der amplifizierten DNA wurde mittels Sequenzanalyse verifiziert. Das Fragment A beinhaltet die Sequenz einer Palatinase aus E. rhapontici, die sich von Nukleotid 2 - 1656 des Palatinase-Gens erstreckt (siehe SEQ ID No. 1).
Beispiel 5
Herstellung von Plasmid p35S-cwIso
Eine DNA Sequenz, die für eine Saccharose-Isomerase kodiert, wurde aus dem Plasmid pCR-Sudso2 isoliert und mit dem 35S-Promotor des Cauliflower Mosaik Virus, der eine konstitutive Expression in transgenen Pflanzenzellen vermittelt, einem für die Aufnahme in das Endoplasmatische Retikulum notwendige Signalpeptid eines pflanzlichen Gens (Proteinase-lnhibitor II-Gen aus Kartoffel (Keil et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:5641-5650; Genbank Accession X041 18), sowie einem pflanzlichen Terminationssignal verbunden. Dazu wurde das Saccharoseisomerase-Fragment aus dem Konstrukt pCR-SucIso2 (siehe Abb. 1) über die Restriktionsschnittstellen BamHI und Sall herausgeschnitten und in einen BamHI/Sall-geöffneten pMA- Vektor ligiert. Der Vektor pMA stellt eine modifizierte Form des Vektors pBinAR (Höfgen und Willmitzer (1990) Plant Sei. 66:221-230) dar, welche den 35S-Promotor des Cauliflower Mosaik Virus, der eine konstitutive Expression in transgenen Pflanzen vermittelt, ein Signalpeptid des Proteinase-Inhibitors II aus Kartoffel, welches die Zielsteuerung des Fusionsproteins in die Zellwand vermittelt, sowie ein pflanzliches Terminationssignal enthält. Das pflanzliche Terminationssignal beinhaltet das 3 '-Ende der Polyadenylierungsstelle des Octopin-Synthase Gens. Zwischen der Teilsequenz des Proteinase-Inhibitors und dem Terminationsignal befinden sich Schnittstellen für die Restriktionsenzyme BamHI, Xbal, Sall, PstI und SphI (in dieser Reihenfolge), welche die Insertion entsprechender DNA-Fragmente ermöglichen, so dass ein Fusionsprotein zwischen dem Proteinase-lnhibitor und dem eingefügten Protein entsteht, welches dann in die Zellwand von transgenen Pflanzenzellen befördert wird, die dieses Protein exprimieren (Abb.3).
Das Fragment A beinhaltet den 35S-Promotor des Cauliflower Mosaik Virus (CaMV). Es enthält ein Fragment, welches die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV umfaßt (Franck (1980) Cell 21 :285. Das Fragment B enthält die Nukleotide 923 - 1059 eines Proteinase-lnhibitor II- Gens aus der Kartoffel (Keil et al., supra), welcher über einen Linker mit der Sequenz ACC GAA TTG GG an das Saccharoseisomerase Gen aus Erwinia rhapontici, welches die Nukleotide 109 - 1803 umfaßt, fusioniert ist. Dadurch wird ein für die Aufnahme von Proteinen in das Endoplasmatische Retikulum (ER) notwendige Signalpeptid eines pflanzlichen Proteins N-terminal an die Saccharoseisomerase Sequenz fusioniert.
Das Fragment C enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti- Plasmids pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3:835), Nukleotide 1 1749 - 11939.
In p35S-cwIso (35S = 35S-Promotor, cw = Zellwand, Iso = Saccharoseisomerase) steht die kodierende Region der Saccharoseisomerase aus E. rhapontici unter konstitutiver Kontrolle, das Genprodukt wird in das ER aufgenommen. Beispiel 6
Herstellung von Plasmid pTA29-cwIso
In analoger Weise wie unter Beispiel 5 beschrieben, jedoch mit der Modifikation, dass die Expression des Fusionsproteins aus Proteinase-Inhibitor-Signalpeptid und der Saccharoseisomerase unter die Kontrolle des Antheren-spezifischen Promotors TA29 aus Tabak gestellt ist, wurde das Plasmid pTA29-cwIso hergestellt. Die Funktionalität des Antheren-spezifischen TA29-Promotors wurde bereits demonstriert (Mariani et al. (1990) Nature 347:727-741). Das pflanzliche
Terminationssignal beinhaltet das 3 '-Ende der Polyadenylierungsstelle des Octopin- Synthase-Gens. Das Plasmid pTA29-cwIso beinhaltet drei Fragmente A, B und C, die in die Schnittstellen für Restriktionsenzyme des Polylinkers von pUC18 kloniert wurden (siehe Abbildung 3). Fragment A beinhaltet den TA29-Promotor aus Nicotiana tabacum. Das Fragment beinhaltet die Nukleotide -1477 bis +57 relativ zur Transkriptionsinitiationsstelle des TA29-Gens (Seurinck et al. (1990) Nucl. Acids. Res. 18:3403). Es wurde mittels PCR aus genomischer DNA von Nicotiana tabacum Var. Samsun NN amplifiziert. Die Amplifizierung erfolgte unter Verwendung der spezifischen Primer • FB158 5'-GAATTCGTTTGACAGCTTATCATCGAT-3' und • FB159 5'-GGTACCAGCTAATTTCTTTAAGTAAA-3'. Zur Klonierung der DNA in die Expressionskassette tragen die Primer zusätzlich folgende Restriktionsschnittstellen: Primer FB158, EcoRI; Primer FB159, Asp718. Das PCR-Reaktionsgemisch (lOOμl) enthielt genomische Tabak-DNA (2 μg), Primer FB 158 und FB 159 (jeweils 250 ng), Pf DNA-Polymerase-Reaktionspuffer (10 μl, Stratagene), 200 μM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und 2,5 Einheiten Pfü DNA-Polymerase (Stratagene). Vor Beginn der Amplifikationszyklen wurde das Gemisch für 5 min auf 95 °C erhitzt. Die Polymerisierungsschritte (35 Zyklen) wurden in einem automatischen T3-Thermocycler (Biometra) nach folgendem Programm durchgeführt: Denaturierung 95 °C (1 Minute), Anlagerung der Primer bei 55 °C (40 Sekunden), Polymerase-Reaktion bei 72 °C (2 Minuten). Das Amplikon wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRA und Asp718 verdaut und in die entsprechenden Restriktionsschnittstellen des Polylinkers von pUC 18 kloniert. Die Identität der amplifizierten DNA wurde mittels Sequenzanalyse verifiziert. Das Fragment B enthält die Nukleotide 923 bis 1059 eines Proteinase-lnhibitor II- Gens aus der Kartoffel (Keil et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:5641-5650; Genbank Acc.No. X041 18), welche über einen Linker mit der Sequenz ACC GAA TTG GG an das Saccharoseisomerase-Gen aus E. rhapontici. welches die Nukleotide 109 bis 1803 umfasst, fusioniert sind. Dadurch wird ein für die Aufnahme von Proteinen in das ER notwendiges Signalpeptid eines pflanzlichen Proteins N-terminal an die Saccharoseisomerase-Sequenz fusioniert. Das Fragment B wurde als Asp718/Sall- Fragment aus dem oben beschriebenen Konstrukt p35S-cwIso (Beispiel 5) herausgeschnitten und zwischen die Restriktionsschnittstellen Asp718 und Sall der Polylinkerregion von pUC 18 kloniert.
Das Fragment C enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti- Plasmids pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3:835), Nukleotide 11749 - 11939, welches als PvuII/Hindlll-Fragment aus dem Plasmid pAGV 40 (Herrera- Estrella et al. (1983) Nature 303 :209) isoliert und nach Addition von Sphl-Linkern an die PvuII-Schnittstelle zwischen die SphI- und Hindill-Schnittstelle des Polylinkers von pUC 18 kloniert worden ist.
Das chimäre Gen wurde anschließend als EcoRI/ Hindlll-Fragment zwischen die EcoRI- und Hindlll-Schnittstelle des Plasmids pBIN19 (Bevan (1984) Nucl. Acids Res. 12:8711) kloniert.
In pTA29-cwIso (TA29 = Promotor des TA29-Gens aus Tabak, cw = Zellwand, Iso = Saccharoseisomerase) steht die kodierende Region des Saccharoseisomerase-Gens aus E. rhapontici unter Antheren-spezifischer Kontrolle, das Genprodukt wird in das ER aufgenommen.
Tabakpflanzenzellen wurden wie oben beschrieben mittels Agrobacterium- vermitteltem Gentransfer mit dem Konstrukt pTA29-cwIso transformiert und ganze Tabakpflanzen wurden regeneriert. Die erhaltenen pTA29-cwIso-Transformanten zeigten einen männlich sterilen Phänotyp, ansonsten waren keine Unterschiede zum Wildtyp erkennbar.
Beispiel 7
Herstellung von Plasmid pTA29-cwPalQ
In analoger Weise wie unter Beispiel 6 beschrieben, wurde die kodierende Region der Palatinase aus E. rhapontici, fusioniert mit einem für die Aufnahme in das ER notwendigen Signalpeptid eines pflanzlichen Gens (Proteinase-lnhibitor II-Gen aus Kartoffel, Keil et al. (1986) vide supra), unter die Kontrolle des Antheren- spezifischen Promotors des TA29-Gens aus Tabak gestellt. Das so erhaltene Konstrukt pTA29-cwPalQ besteht aus drei Fragmenten A, B und C (vgl. Abbildung 5) und ermöglicht die Expression der Palatinase in der Zellwand von Tapetumzellen.
Fragment A beinhaltet den TA29-Promotor aus Nicotiana tabacum. Das Fragment beinhaltet die Nukleotide -1477 bis +57 relativ zur Transkriptionsinitiationsstelle des TA29-Gens (Seurinck et al. (1990) Nucl. Acids. Res. 18:3403). Es wurde mittels PCR aus genomischer DNA von Nicotiana tabacum Var. Samsun NN amplifiziert. Die Amplifizierung erfolgte unter Verwendung der spezifischen Primer
• FBI 58 5'-GAATTCGTTTGACAGCTTATCATCGAT-3' und
• FB159 5'-GGTACCAGCTAATTTCTTTAAGTAAA-3\ Zur Klonierung der DNA in die Expressionskassette tragen die Primer zusätzlich folgende Restriktionsschnittstellen: Primer FB158, EcoRI; Primer FB159, Asp718. Das PCR- Reaktionsgemisch (lOOμl) enthielt genomische Tabak-DNA (2 μg), Primer FB 158 und FB 159 (jeweils 250 ng), Pf DNA-Polymerase-Reaktionspuffer (10 μl, Stratagene), 200 μM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und 2,5 Einheiten Pfü DNA-Polymerase (Stratagene). Vor Beginn der Amplifikationszyklen wurde das Gemisch für 5 min auf 95 °C erhitzt. Die Polymerisierungsschritte (35 Zyklen) wurden in einem automatischen T3-Thermocycler (Biometra) nach folgendem Programm durchgeführt: Denaturierung 95 °C (1 Minute), Anlagerung der Primer bei 55 °C (40 Sekunden), Polymerase-Reaktion bei 72 °C (2 Minuten). Das
Amplikon wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRA und Asp718 verdaut und in die entsprechenden Restriktionsschnittstellen des Polylinkers von pUC18 kloniert. Die Identität der amplifizierten DNA wurde mittels Sequenzanalyse verifiziert.
Das Fragment B enthält die Nukleotide 923 - 1059 eines Proteinase-lnhibitor II Gens aus der Kartoffel (Solanum tuber sum, Keil et al. 1986, vide supra), welcher über einen Linker mit der Sequenz ACC GAA TTG GG an das Palatinase Gen aus Erwinia rhapontici. welches die Nukleotide 2 - 1656 umfaßt, fusioniert ist. Dadurch wird ein für die Aufnahme von Proteinen in das endoplasmatische Retikulum notwendige Signalpeptid eines pflanzlichen Proteins N-terminal an die Palatinase Sequenz fusioniert.
Zur Klonierung von Fragment B wurde der Bereich des Proteinase-lnhibitor II Gens umfassend die Nukleotide 923 bis 1059 über die Restriktionsenzyme Asp718 und BamHI aus dem pMA-Vektor isoliert und zwischen die entsprechenden
Schnittstellen des Polylinkers von pUC 18 kloniert. Anschließend wurde das über Bglll und Sall aus dem Konstrukt pCR-PalQ herausgeschnittene Palatinase- Fragment über die zu Bglll kompatible BamHI-Schnittstelle mit der Sequenz des Proteinase-Inhibitors fusioniert.
Das Fragment C enthält das Polyadenylienmgssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti- Plasmids PTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3:835), Nukleotide 11749 - 11939, welches als PvuII/ Hindill-Fragment aus dem Plasmid pAGV 40 (Herrera- Estrella et al. (1983) Nature 303:209) isoliert und nach Addition von Sphl-Linkern an die PvuII-Schnittstelle zwischen die SphI- und Hindlll-Schnittstelle des Polylinkers von pUC 18 kloniert worden ist. Das chimäre Gen wurde anschließend als EcoRI/Hindlll-Fragment zwischen die EcoRI- und Hindlll-Schnittstelle des Plasmids pBIN19 (Bevan (1984) Nucl. Acids Res. 12:8711) kloniert.
In pTA29-cwPalQ (TA29 = Promotor des TA29-Gens aus Tabak, cw = Zellwand, PalQ = Palatinase) steht die kodierende Region des Palatinase-Gens aus E. rhapontici unter Antheren-spezifischer Kontrolle, das Genprodukt wird in das ER aufgenommen.
Transgene Pflanzen, die mit pTA29-cwPalQ mittels Agrobacterium-vermitteltem Gentransfer transformiert wurden, zeigten im Vergleich zum Wildtyp keinen unterschiedlichen Phänotyp. Die aus Kreuzungen dieser Pflanzen mit den männlich sterilen Pflanzen aus Beispiel 6 hervorgegangenen Tochterpflanzen zeigten wieder den männlich fertilen Phänotyp der pTA29-cwPalQ-Elternpflanzen.
Beispiel 8
Herstellung von Plasmid p35S-cwPalQ Die DNA-Sequenz, die für eine Palatinase kodiert, wurde mit einem für die Aufnahme in das endoplasmatische Retikulum notwendigen Signalpeptides eines pflanzlichen Gens (Proteinase Inhibitor II Gen aus Kartoffel (Solanum tuberosum, Keil et al (1986, vide supra)) fusioniert und unter die Kontrolle des 35S RNA- Promotors gebracht, wodurch das Plasmid p35S-cwpalQ entstand.
Dazu wurde das Palatinase-Fragment aus dem Konstrukt pCR-palQ über die Restriktionsschnittstellen Bglll und Sall herausgeschnitten und in einen BamHI/Sall geöffneten pMA-Vektor ligiert. Der Vektor pMA stellt eine modifizierte Form des Vektors pBinAR (Höfgen und Willmitzer (1990) Plant Sci.66: 221 - 230) dar, welche den 35S-Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus, der eine konstitutive Expression in transgenen Pflanzen vermittelt, ein Signalpeptid des Proteinase Inhibitors II aus Kartoffel (Keil et al. 1986, vide supra)), welches die Zielsteuerung des Fusionsproteins in die Zellwand vermittelt, sowie ein pflanzliches Terminationssignal enthält. Das pflanzliche Terminationssignal beinhaltet das 3'- Ende der Polyadenylierungsstelle des Octopin-Synthase-Gens. Zwischen der Teilsequenz der Proteinase-Inhibitors und dem Terminationsignal befinden sich Schnittstellen für die Restriktionsenzyme BamHI, Xbal, Sall, PstI und SphI (in dieser Reihenfolge), welche die Insertion entsprechender DNA-Fragmente ermöglichen, so dass ein Fusionsprotein zwischen dem Proteinase-lnhibitor und dem eingefügten Protein entsteht, welches dann in die Zellwand von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen befördert wird, die dieses Protein exprimieren (siehe Abbildung 5).
Das Fragment A beinhaltet den 35S RNA-Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus (CaMV). Es enthält ein Fragment, welches die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV umfaßt (Franck (1980) Cell 21, 285. Das Fragment B enthält die Nukleotide 923 - 1059 eines Proteinase Inhibitor II- Gens aus der Kartoffel (Solanum tuberosum, Keil et al. 1986, vide supra), welcher über einen Linker mit der Sequenz ACC GAA TTG GG an das Palatinase-Gen aus Erwinia rhapontici, welches die Nukleotide 2 - 1656 umfaßt, fusioniert ist. Dadurch wird ein für die Aufnahme von Proteinen in das endoplasmatische Retikulum notwendige Signalpeptid eines pflanzlichen Proteins N-terminal an die Palatinase Sequenz fusioniert.
Das Fragment C enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti- Plasmids pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3, 835), Nukleotide 11749 - 11939.
In p35S-cwPalQ (35S = 35S RNA-Promotor des CaMV, cw = Zellwand, PalQ = Palatinase) steht die kodierende Region des Palatinase-Gens aus E. rhapontici unter konstitutiver Kontrolle, das Genprodukt wird in das ER aufgenommen.
Transgene Pflanzen, die mit p35S-cwPal mittels Agrobacterium-vermitteltem Gentransfer transformiert wurden, zeigten im Vergleich zum Wildtyp keinen unterschiedlichen Phänotyp. Die aus Kreuzungen dieser Pflanzen mit den männlich sterilen Pflanzen aus Beispiel 6 hervorgegangenen Tochterpflanzen zeigten wieder den männlich fertilen Phänotyp der p35S-cwPal-Elternpflanzen.
Beispiel 9 Herstellung des Plasmids pMAL-SucIso
Zur Herstellung des Plasmids pMAL-Suciso wurde das Saccharoseisomerase- Fragment aus dem Konstrukt pCR-Suc!so2 über die Restriktionsenzyme BamHI und Sall herausgeschnitten und in einen ebenfalls so geschnittenen pMAL-c2 Vektor (New England Biolabs) ligiert, wodurch das Konstrukt pMAL-SucIso (Abbildung 4) erhalten wurde. Dieses ermöglicht eine Expression des Enzyms als Fusionsprotein mit dem Maltose-bindenden Protein unter der Kontrolle des durch IPTG induzierbaren tac-Promotors.
Fragment A beinhaltet den tac-Promotor, der eine durch IPTG induzierbare Genexpression ermöglicht.
Fragment B beinhaltet einen Teil des malE-Gens mit Translationsstart. Fragment C beinhaltet die kodierende Region der Saccharoseisomerase. Fragment D beinhaltet den rrnR-Terminator aus E. coli.
Mit pMAL-Suciso transformierte Bakterienzellen zeigen IPTG-induzierbare Expression der Saccharoseisomerase aus E. rhapontici.
Beispiel 10
Funktioneller Nachweis der Saccharoseisomeraseaktivität in E. coli
Die funktionelle Charakterisierung des Saccharoseisomerase-Gens erfolgte durch Expression in E.coli. Dazu wurde das Plasmid pMAL-Suciso in E. coli (XL-I blue, Stratagene) transformiert. Die Expression des Fusionsproteins zwischen dem Maltose-bindenden Protein und der Saccharoseisomerase erfolgte nach Herstellerangaben in einem Kulturmaßstab von 50 ml. Nach Ernte der Zellen wurde das Pellet in 1 ml 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,0) resuspendiert und die lösliche Proteinfraktion durch Ultraschallbehandlung freigesetzt. Ein Aliquot des Rohextraktes wurden mit dem gleichen Volumen 600 mM Saccharose gemischt und für 24 Stunden bei 30 °C inkubiert. Zum Nachweis der entstandenen Palatinose wurde ein Aliquot des Ansatzes einer HPLC-Analyse unterzogen. Das Chromatogramm bestätigte die Produktion von Palatinose durch die rekombinante Saccharoseisomerase in E. coli.
Beispiel 1 1
In vivo-Nachweis der Saccharoseisomeraseaktivität in transgenen Pflanzen
Der Nachweis der in vivo-Funktionalität der Saccharoseisomerase in transgenen Pflanzen wurde wie folgt durchgeführt: von 0,5 cm2 großen Blattscheiben von untransformierten Tabakpflanzen und den Transformanten 35S-cwIso (aus Beispiel 5) wurden ethanolische Extrakte hergestellt und durch HPLC analysiert und die Zucker anhand der entsprechenden Standards identifiziert. Wie die Chromatogramme zeigten, führte die Expression der Saccharoseisomerase in der Zellwand zu einer substantiellen Akkumulation von Palatinose in den untersuchten p35S-cwIso-Pflanzen. Der Wildtyp enthält keine Palatinose, wie ebenfalls aus den Chromatogrammen deutlich zu erkennen war.
Beispiel 12
Funktioneller Nachweis und biochemische Charakterisierung der Palatinaseaktivität in E. coli
Die funktionelle Charakterisierung des Palatinase-Gens erfolgte durch Expression des rekombinanten Proteins in E. coli. Dazu wurde das Plasmid pQE-palO in E. coli (XL-I blue, Stratagene) transformiert. Die Expression des rekombinanten Proteins erfolgte nach Herstellerangaben (Qiagen, Hilden, Deutschland) in einem Kulturmaßstab von 50 ml. Nach Ernte der Zellen durch Zentrifugation wurde das Pellet in 1 ml 30 mM HEPES (pH 7,5) resuspendiert und die lösliche Proteinfraktion durch Ultraschallbehandlung freigesetzt. 20 μl des Rohextraktes wurden mit 80 μl 100 mM Palatinose gemischt und für 40 Minuten bei 30 °C inkubiert. Zum Nachweis der Palatinaseaktivität wurde in einem Aliquot des Ansatzes die freigesetzte Glucose durch einen gekoppelten optisch-enzymatischen Test bestimmt. Dabei konnte die Palatinaseaktivität des rekombinanten Enzyms eindeutig nachgewiesen werden. In weiteren Experimenten wurde gezeigt, daß das Enzym seine höchste Aktivität bei einer Reaktionstemperatur von 30 °C und einem pH von 7,0 entfaltet. Bei der Untersuchung der Reaktionsgeschwindigkeit in Abhängigkeit von der Substratkonzentration konnte ein Km-Wert für Palatinose von 10 mM und eine maximale Reaktionsgeschwindigkeit bei einer Substratkonzentration von 90 mM Palatinose bestimmt werden.
Beispiel 13
PCR-Amplifikation einer Trehalulase aus Erwinia rhapontici
Die Klonierung des vollständigen offenen Leserasters der Trehalulase erfolgte mittels Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR). Als Matrizenmaterial diente genomische DNA aus E. rhapontici, die nach
Standardprotokoll isoliert wurde. Die Amplifizierung erfolgte unter Verwendung der spezifischen Primer
• FB184 5'-GGGATCCGTGCAAACTGGTGGAAAGAG-3' • FB185 5'-GTCGACTTACCGCTGATAAATTTGTGC-3'
Die Primer FBI 84 und FBI 85 umfassen die Basen 4 - 23 bzw. 1638 - 1659 der kodierenden Region des Trehalulase-Gens. Zur Klonierung der DNA in Expressionsvektoren tragen die Primer zusätzlich folgende Restriktionsschnittstellen: Primer FB96 bzw. FBI 84: BamHI; Primer FBI 85: Sall. Das PCR- Reaktionsgemisch (100 μl) enthielt chromosomale Bakterien DNA (1 μg), Primer FB184 und FB185 (jeweils 250 ng), Pfu DNA Polymerase Reaktionspuffer (10 μl, Stratagene), 200 μM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und 2,5 Einheiten Pfü DNA Polymerase (Stratagene). Vor Beginn der Amplifikationszyklen wurde das Gemisch für 5 min auf 95 °C erhitzt. Die Polymerisierungsschritte (30 Zyklen) wurden in einem automatischen T3- Thermocycler (Biometra) nach folgendem Programm durchgeführt: Denaturierung 95 °C (1 Minute), Anlagerung der Primer bei 55 °C (40 Sekunden), Polymerase- Reaktion bei 72 °C (2 Minuten). Das Amplikon wurde mit BamHI und Sall verdaut und das Fragment in den Vektor pCR-Blunt (Invitrogen) kloniert, wodurch das Plasmid pCR-PalZ erhalten wurde (siehe Abbildung 6). Die Identität der amplifizierten DNA wurde mittels Sequenzanalyse verifiziert.
Das Fragment A beinhaltet die Sequenz einer Trehalulase aus E. rhapontici, die sich von Nukleotid 4 - 1659 des Trehalulase Gens erstreckt.
Beispiel 14
Herstellung des Plasmids pTA29-cwPalZ
In analoger Verfahrensweise wie unter Beispiel 7 beschrieben, wurde die kodierende Region des Trehalulase-Gens aus Erwinia rhapontici, fusioniert mit einem für die Aufnahme in das endoplasmatische Retikulum notwendigen Signalpeptides eines pflanzlichen Gens (Proteinase-lnhibitor II Gen aus Kartoffel (Solanum tuberosum, Keil et al. (1986), vide supra), unter die Kontrolle des Antheren-spezifischen Promotors des TA-29 Gens aus Tabak gestellt. Das so erhaltene Konstrukt TA29- 53
cwPalZ besteht aus drei Fragmenten A, B und C (siehe Abbildung 3) und ermöglicht die Expression der Trehalulase in der Zellwand von Tapetumzellen.
Fragment A beinhaltet den TA29-Promotor aus Nicotiana tabacum. Das Fragment beinhaltet die Nukleotide -1477 bis + 57 relativ zur Transkriptionsinitiationsstelle des TA29-Gens (Seurinck et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 3403). Es wurde mittels PCR aus genomischer DNA von Nicotiana tabacam Var. Samsun NN amplifiziert. Die Amplifizierung erfolgte unter Verwendung der spezifischen Primer
• FBI 58 5'-GAATTCGTTTGACAGCTTATCATCGAT-3' und • FB159 5'-GGTACCAGCTAATTTCTTTAAGTAAA-3\
Zur Klonierung der DNA in die Expressionskassette tragen die Primer zusätzlich folgende Restriktionsschnittstellen: Primer FB158, EcoRI, Primer FB159, Asp 718. Das PCR- Reaktionsgemisch (100 μl) enthielt genomische Tabak-DNA (2 μg),
Primer FBI 58 und FBI 59 (jeweils 250 ng), Pfu DNA-Polymerase Reaktionspuffer (10 μl. Stratagene). 200 μM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP. dTTP) und 2,5 Einheiten Pfu DNA-Polymerase (Stratagene). Vor Beginn der Amplifikationszyklen wurde das Gemisch für 5 min auf 95°C erhitzt. Die Polymerisierungsschritte (35 Zyklen) wurden in einem automatischen T3 -Thermocycler (Biometra) nach folgendem
Programm durchgeführt: Denaturierung 95°C (1 Minute), Anlagerung der Primer bei 55°C (40 Sekunden), Polymerase-Reaktion bei 72°C (2 Minuten). Das Amplikon wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Asp 718 verdaut und in die entsprechenden Schnittstellen des Polylinkers von pUC 18 ligiert. Die Identität der amplifizierten DNA wurde mittels Sequenzanalyse verifiziert.
Das Fragment B enthält die Nukleotide 923 - 1059 eines Proteinase-lnhibitor II Gens aus der Kartoffel (Solanum tuber osam) (Keil et al (1986), vide supra), welcher über einen Linker mit der Sequenz ACC GAA TTG GG an das Trehalulase-Gen aus Erwinia rhapontici, welches die Nukleotide 4 - 1659 umfaßt, fusioniert ist. Dadurch wird ein für die Aufnahme von Proteinen in das endoplasmatische Retikulum notwendiges Signalpeptid eines pflanzlichen Proteins N-terminal an die Trehalulase- Sequenz fusioniert.
Das Fragment C enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti- Plasmids pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3, 835), Nukleotide 1 1749 - 11939, welches als PvuII-Hindlll Fragment aus dem Plasmid pAGV 40 (Herrera- Estrella et al. (1983) Nature 303, 209) isoliert worden ist und nach Addition von Sphl-Linkern an die PvuII-Schnittstelle zwischen Sphl-Hindlll Schnittstellen des Polylinkers von pUC 18 kloniert war.
Das chimäre Gen wurde anschließend als EcoRI-Hindlll-Fragment zwischen die EcoRIHindlll-Schnittstellen des Plasmids pBIN 19 (Bevan ( 1984) Nucleic Acid Res. 12. 871 1) kloniert.
In PTA29-cwPalZ (TA29 = Promotor des TA29-Gens aus Tabak, cw = Zellwand, PalZ = Trehalulase) steht die kodierende Region des Trehalulase-Gens aus E. rhapontici unter Antheren-spezifischer Kontrolle, das Genprodukt wird in das ER aufgenommen.
Transgene Pflanzen, die mit pTA29-cwPalZ mittels Agrobacterium-vermitteltem Gentransfer transformiert wurden, zeigten im Vergleich zum Wildtyp keinen unterschiedlichen Phänotyp. Die aus Kreuzungen dieser Pflanzen mit den männlich sterilen Pflanzen aus Beispiel 6 hervorgegangenen Tochterpflanzen zeigten wieder den männlich fertilen Phänotyp der pTA29-cwPalZ-Elternpflanzen. Beispiel 15
Ortsgerichtete Mutagenese der Palatinase aus E. rhapontici zur Optimierung der Palatinase-Expression in transgenen Pflanzen
Um eine Glykosylierung der Palatinase aus E. rhapontici in transgenen Pflanzen zu vermeiden wurden geeignete Aminosäuren im Bereich potentieller Glykosylierungsstellen durch ortsgerichtete Mutagenese ausgetauscht. Als Template diente das Plasmid pQE-palO. pQE-palO entspricht, was die Palatinase-Sequenz betrifft, pCR-palQ, ist aber für die Expression der Palatinase-Sequenz in E. coli geeignet. Der Reaktionsansatz (50 μl) zur PCR-gestützten Mutagenese war wie folgt zusammengesetzt: 50 ng pQE-palQ DNA, jeweils 250 ng 5'- bzw. 3'-Primer, Pfü- DNA-Polymerase-Reaktionspuffer (5 μl, Stratagene), 200 μM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und 2.5 Einheiten Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene). Die Polymerisierungsschritte (15 Zyklen) wurden in einem automatisierten T3- Thermocycler (Biometra) nach folgendem Programm durchgeführt: Denaturierung 95 °C (30 Sekunden), Anlagerung der Primer bei 55 °C (1 Minute), Polymerasereaktion bei 72 °C (15 Minuten). Nach Beendigung der Reaktion wurde die parentale DNA mit 1 Einheit Dpnl-Restriktionsenzym für 1 Stunde bei 37 °C verdaut. Anschließend wurde 1 μl des Ansatzes zur Transformation von E. coli eingesetzt.
Für die Mutation 1 wurde Threonin an Position 105 gegen Alanin ausgetauscht, wodurch das Plasmid pQE-palQ TI 05 A erzeugt wurde.
5'-Primer: SL 365'-CTG GTG GTC AAC CAT GCC TCT GAC GAA CAT CCC-
3' 3'-Primer: SL 375'-GGG ATG TTC GTC AGA GGC ATG GTT GAC CAC CAG-
3'
Für die Mutation 2 wurde Threonin an Position 248 gegen Alanin ausgetauscht, wodurch das Plasmid pQE-palQ T248A entstand.
5'-Primer: SL 395'-GAG ACG TGG AGC GCA GCG CCA GAA GAC GCC CTG-
3'-Primer: SL 405'-CAG GGC GTC TTC TGG CGC TGC GCT CCA CGT CTC-3"
Für die Mutation 3 wurde Threonin an Position 502 gegen Alanin ausgetauscht, wodurch Plasmid pQE-palQ T502A entstand.
5'-Primer: SL 425"-G GTG ATC AAT AAC TTC GCG CGA GAC GCT GTG ATG C-3' 3'-Primer: SL 435'-G CAT CAC AGC GTC TCG CGC GAA GTT ATT GAT CAC C-3'
Das Mutationsereignis wurde jeweils durch Sequenzierung des entsprechenden Bereiches der Palatinase- Sequenz verifiziert. Durch funktionelle Expression des mutagenisierten Enzyms in E. coli konnte in allen Fällen gezeigt werden, daß sich die jeweilige Aminosäure-Substitution nicht nachteilig auf die enzymatische Aktivität auswirkt. Anschließend wurden die Mutationen durch oben beschriebene Strategie mit einander kombiniert, so daß letztendlich eine Palatinase erzeugt wurde, welche keine putativen Glykosylierungsstellen mehr aufweist. Auch dieses Enzym wies nach Expression in E. coli keine nachteiligen katalytischen Eigenschaften auf.
(a) palQ Wildtyp 100 105 110 Aminosauresequenz Leu Val Val Asn His Thr Ser Asp Glu His Pro
Nucleotidsequenz CTG GTG GTC AAC CAT ACC TCT GAC GAA CAT CCC
(b) palQ T105A
Aminosauresequenz • • • • • Ala • • • • •
Nucleotidsequenz GCC (c) /__/ρ Wildtyp 243 248 253
Amino acid sequence Glu Thr Trp Ser Ala Thr Pro Glu Asp Ala Leu
Nucleotide sequence GAG ACG TGG AGC GCA ACG CCA GAA GAC GCC CTG
(ά) palQ T248A
Aminosauresequenz • • • • • Ala • • • • • Nucleotide sequence GCG
(e)palO Wildtyp 497 502 507
Aminosauresequenz Val Ile Asn Asn Phe Thr Arg Asp Ala Val Met
Nucleotidsequenz GTG ATC AAT AAC TTC ACG CGA GAC GCT GTG ATG
(f) palQ T502A Aminosauresequenz • • • • • Ala • • • • •
Nucleotidsequenz GCG
Die mutierte Palatmase-Sequenz wurde anschließend in einen Vektor für Pflanzentransformation umkloniert und in Pflanzen expπmiert.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Beeinflussung der Pollenentwicklung in transgenen Pflanzen durch Veränderung des Kohlenhydratstoffwechsels, insbesondere des Saccharosestoffwechsels, in den Antheren der transgenen Pflanzen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Veränderung des Kohlenhydratstoffwechsels derart ist, dass es zu einer Unterversorgung sich entwickelnder Pollen mit Kohlenhydraten, insbesondere Saccharose und Hexosen, kommt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Veränderung des Kohlenhydratstoffwechsels zu einem männlich sterilen Phänotyp der transgenen Pflanzen führt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, das folgende Sequenzen umfasst: regulatorische Sequenzen eines in Antheren, im Tapetum und/oder in
Pollen aktiven Promotors; operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert; und operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als
Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in
Pflanzenzellen dienen können; b) Übertragung des Nukleinsäuremoleküls aus a) auf pflanzliche Zellen und c) Regeneration transgener Pflanzen.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, das folgende Sequenzen umfasst: regulatorische Sequenzen eines in Antheren, im Tapetum und/oder in Pollen aktiven Promotors; - daran in Sense- oder Antisense-Orientierung gebunden eine DNA-
Sequenz, deren Transkription zu einer Hemmung der pflanzeneigenen Invertase-, Hexosetransporter-, Hexokinase- und/oder Protonen- ATPase-Expression führt, und operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in
Pflanzenzellen dienen können, b) Übertragung des Nukleinsäuremoleküls aus a) auf pflanzliche Zellen und c) Regeneration transgener Pflanzen.
6. Rekombinantes Nukleinsauremolekul, umfassend a) regulatorische Sequenzen eines in Antheren, im Tapetum und/oder in Pollen aktiven Promotors; b) operativ damit verknüpft eine DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert; und c) operativ damit verknüpft regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können.
7. Rekombinantes Nukleinsauremolekul nach Anspruch 6. worin die DNA- Sequenz aus Erwinia rhapontici stammt.
8. Rekombinantes Nukleinsauremolekul nach Anspruch 6 oder 7, worin der Promotor der T29-Promotor ist.
9. Vektor, umfassend ein rekombinantes Nukleinsauremolekul nach einem der Ansprüche 6 bis 8.
10. Mikroorganismus, enthaltend ein rekombinantes Nukleinsauremolekul oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 6 bis 9.
11. Verfahren zur Erzeugung männlich steriler Pflanzen, umfassend die Übertragung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls oder Vektors nach einem der Ansprüche 6 bis 9 auf Pflanzenzellen.
12. Transgene Pflanzenzellen, enthaltend ein rekombinantes Nukleinsauremolekul oder einen Vektors nach einem der Ansprüche 6 bis 9 oder hergestellt nach einem Verfahren nach Anspruch 11.
13. Transgene Pflanzen, enthaltend eine Pflanzenzelle nach Anspruch 12 oder hergestellt nach Anspruch 11 , sowie Teile dieser Pflanzen, transgene Ernteprodukte und transgenes Vermehrungsmaterial dieser Pflanzen, wie Protoplasten, Pflanzenzellen. Kalli, Samen, Knollen, Stecklinge, sowie die transgenen Nachkommen dieser Pflanzen.
14. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert, zur Erzeugung männlich steriler Pflanzen.
15. Rekombinantes Nukleinsauremolekul, enthaltend eine DNA-Sequenz aus
Erwinia rhapontici oder Teile dieser DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase kodieren.
16. Rekombinantes Nukleinsauremolekul nach Anspruch 15, worin die DNA- Sequenz die in SEQ ID No. 1 angegebene ist.
17. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase kodiert, zur Wiederherstellung männlicher Fertilität in transgenen Pflanzen.
18. Rekombinantes Nukleinsauremolekul, enthaltend eine DNA-Sequenz aus Erwinia rhapontici oder Teile dieser DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase kodieren.
19. Rekombinantes Nukleinsauremolekul nach Anspruch 18, worin die DNA-
Sequenz die in SEQ ID No. 7 angegebene ist.
20. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase kodiert, zur Wiederherstellung männlicher Fertilität in transgenen Pflanzen.
21. Verfahren zur Erzeugung männlich fertiler Hybridpflanzen, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellen einer ersten transgenen männlich sterilen Eltempflanze, umfassend ein Nukleinsauremolekul, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert, b) Herstellen einer zweiten transgenen Eltempflanze, umfassend ein Nukleinsauremolekul, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer
Palatinase und/oder ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase kodiert, c) Kreuzen der ersten Eltempflanze mit der zweiten Eltempflanze zur Erzeugung einer Hybridpflanze, wobei die Hybridpflanze männlich fertil ist.
22. Verfahren zur Erzeugung männlich fertiler Hybridpflanzen, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellen einer ersten transgenen männlich sterilen Eltempflanze, umfassend ein Nukleinsauremolekul, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer
Saccharoseisomerase kodiert, b) Herstellen einer zweiten transgenen Eltempflanze, umfassend ein Nukleinsauremolekul. das ein Protein mit der biologischen Aktivität eines Saccharoseisomerase-Inhibitors kodiert, c) Kreuzen der ersten Eltempflanze mit der zweiten Eltempflanze zur Erzeugung einer Hybridpflanze, wobei die Hybridpflanze männlich fertil ist.
23. Verfahren zur Erzeugung männlich fertiler Hybridpflanzen, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellen einer ersten transgenen männlich sterilen Eltempflanze, umfassend ein Nukleinsauremolekul, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert, b) Herstellen einer zweiten transgenen Eltempflanze, umfassend ein Nukleinsauremolekul, das ein gegen Saccharoseisomerase-mRNA gerichtetes Ribozym kodiert, c) Kreuzen der ersten Eltempflanze mit der zweiten Eltempflanze zur Erzeugung einer Hybridpflanze, wobei die Hybridpflanze männlich fertil ist.
24. Verfahren zur Erzeugung männlich fertiler Hybridpflanzen, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellen einer ersten transgenen männlich sterilen Eltempflanze, umfassend ein Nukleinsauremolekul, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Saccharoseisomerase kodiert, b) Herstellen einer zweiten transgenen Eltempflanze, umfassend ein Nukleinsauremolekul, das für eine Saccharoseisomerase- Antisense- oder Sense-RNA kodiert, c) Kreuzen der ersten Eltempflanze mit der zweiten Eltempflanze zur Erzeugung einer Hybridpflanze. wobei die Hybridpflanze männlich fertil ist.
25. Verfahren zur Erzeugung männlich fertiler Hybridpflanzen nach
Anspruch 21, wobei in dem Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase und/oder dem Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Trehalulase durch mindestens einen Aminosäureaustausch gegenüber dem Wildtyp-Protein eine Glykosylierungsstelle inaktiviert ist.
26. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach Anspmch 17, wobei in dem Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase durch einen Aminosäureaustausch gegenüber dem Wildtyp-Protein mindestens eine Glykosyliemngsstelle inaktiviert ist.
27. Rekombinantes Nukleinsauremolekul nach Anspmch 15, wobei in dem Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Palatinase durch mindestens einen Aminsosäureaustausch gegenüber dem Wildtyp-Protein eine Glykosyliemngsstelle inaktiviert ist.
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