DE10115762A1 - Verfahren zur Herstellung von Leguminosen mit erhöhtem Proteingehalt bei verlängerter Samenfüllungsdauer - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Leguminosen mit erhöhtem Proteingehalt bei verlängerter Samenfüllungsdauer

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Leguminosen mit erhöhtem Proteingehalt im Samen bei verlängerter Samenfüllungsdauer durch Einbringen von rekombinanten DNA-Molekülen. In die Pflanze werden mittels eines Transformationssystems die rekombinanten DNA-Moleküle eingebracht, wobei sie eine pflanzeneigene DNA-Sequenz umfassen, die in Pflanzen zur Expression gebracht wird und deren Genprodukt im Samen ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer ADP-Glucose Pyrophosphorylase (AGP) und/oder einer plastidären Phosphoglucomutase (pPGM) hemmt sowie ggf. die regulatorische Sequenz eines samenspezifischen Promotors in Leguminosen. Des weiteren wird getrennt mindestens ein Selektionsmarkergen übertragen, welches anschließend wieder entfernt wird. Es werden die Pflanzen selektiert, die einen erhöhten Proteingehalt und eine längere Samenfüllungsdauer aufweisen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Leguminosen mit erhöhtem Proteingehalt im Samen bei verlängerter Samenfüllungsdauer durch Einbringen von rekombinanten DNA-Molekülen. In die Pflanze werden mittels eines Transformationssystems die rekombinanten DNA-Moleküle eingebracht, wobei sie eine pflanzeneigene DNA-Sequenz umfassen, die in Pflanzen zur Expression gebracht werden und deren Genprodukt im Samen ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer ADP- Glucose Pyrophosphorylase (AGP) und/oder einer plastidären Phosphoglucomutase (pPGM) hemmt und/oder wodurch ein Saccharosetransportergen zur Überexpression gebracht wird sowie ggf. die regulatorische Sequenz eines samenspezifischen Promotors in Leguminosen. Desweiteren wird getrennt mindestens ein Selektionsmarkergen übertragen, welches anschließend wieder entfernt wird. Es werden die Pflanzen selektiert, die einen erhöhten Proteingehalt und eine längere Samenfüllungsdauer aufweisen.
Bei Leguminosen, insbesondere bei Futtererbsen, ist die Erhöhung des Rohproteingehalts eines der wichtigsten Zuchtziele.
Leguminosenembryonen wachsen relativ normal in einfachen in vitro Kulturmedien, die Saccharose, eine Aminosäure und Mineralstoffe enthalten. Das heisst, die Synthese der Speicherstoffe wird hauptsächlich durch den Samen selbst reguliert und nicht über die Mutterpflanze. Jedoch kann die Zusammensetzung der Samenspeicherstoffe über die Bereitstellung von C und N reguliert werden. Veränderungen in den verfügbaren Nährstoffen beeinflussen sowohl Qualität als auch Quantität. So wird Proteinakkumulation über die Bereitstellung von Assimilaten und Spurenelementen wie Aminosäuren oder Schwefel reguliert. Die Speicherproteingene werden durch eine Reihe von cis- und trans-wirkenden Faktoren kontrolliert und sind deshalb stark auf der Transkriptionsebene reguliert (als Übersicht: Morton et al. 1995). Im Gegensatz dazu wird die Stärkebiosynthese hauptsächlich metabolisch reguliert (als Übersicht: Martin and Smith 1995). Generell wird also die Samenspeicherstoffsynthese von genetischen, sowie umweltspezifischen Faktoren beeinflusst (als Übersicht: Motto et al. 1997), wobei die meisten Änderungen im Assimilatstrom den Umweltfaktoren zuzuordnen sind.
Erbsensamen synthetisieren Stärke und Proteine aus den Vorstufen Saccharose und Aminosäuren. Das erfordert eine koordinierte Regulation der beiden Stoffwechselwege. Stärke und Proteingehalt stehen in einem umgekehrten Verhältnis zueinander. Eine Reihe von Erbsen (schrumpelige Samenmutanten) haben einen Block im Stärkebiosyntheseweg und damit reduzierte Stärkegehalte. Gleichzeitig ist der Proteingehalt erhöht (Perez et al. 1993, Boutin et al. 1998). Diese Mutanten unterscheiden sich in den relativen Gehalten von Albuminen sowie 11 s und 7 s Globulinen. Oft ist der Albuminanteil erhöht, der einen höheren Anteil an essentiellen Aminosäuren besitzt. Der Grund für diese Verschiebungen ist unklar; eventuell können veränderte osmotische Bedingungen die Expression von manchen Speicherproteingenen oder deren mRNA-Stabilität beeinflussen (Turner et al. 1990). Viele dieser Mutationen wirken sich auch auf die vegetativen Pflanzenteile wie Blätter oder Samenschale aus (Lloyd et al., 1996). Dieser maternale Effekt ist aus ertragsphysiologischer Sicht ein Nachteil.
Die Mutanten betreffen z. B. Saccharose Synthase, ADP-Glucose Pyrophosphorylase (AGP), oder Verzweigungsenzym. Ein interessantes Enzym ist die plastidäre Phosphoglucomutase (pPGM). Sie katalysiert in den Amyloplasten die Reaktion Glc-1-P zu Glc-6-P. Das ist eine metabolisch wichtige Verzweigungsstelle zwischen dem Stärkebiosyntheseweg (Glc-1-P) und dem oxidativen Pentosephosphatzyklus (Glc-6-P). Letzterer ist bedeutsam für die Synthese aromatischer Aminosäuren und stellt Reduktionsäquivalente zur Verfügung. Im Gegensatz zu AGP katalysiert pPGM eine Gleichgewichtsreaktion, die aber in vivo vom Gleichgewicht verschoben und für die Stärkebiosynthese ratenlimitierend sein kann (Hattenbach et al. 1999, Tetlow et al. 1998). Erbsenmutanten, bei denen die pPGM ausgefallen ist, haben fast stärkefreie Samen. Jedoch ist auch die Stärkesynthese in den maternalen Pflanzenteilen und damit offensichtlich der Ertrag beeinträchtigt (Harrison et al. 1998).
Die Speicherstoffakkumulation in Samen ist abhängig von der Zellzahl im Embryo/Endosperm, der Dauer der Zellteilungsphase, der Geschwindigkeit der Samenfüllung und der Dauer der Samenfüllung (Hanson 1991). Samenwachstums sowie Ertragskomponenten werden also auf Ebene Samenwachstumsrate und Samenfüllungsdauer kontrolliert (Egli 1994). Samen sind groß, weil sie entweder schnell oder lange wachsen. Die Samenwachstumsrate ist abhängig von Assimilatverfügbarkeit, Aufnahme und Metabolismus. Zum Beispiel haben große Samen eine hohe Rate. Groß-Samigkeit ist jedoch kein ertragsbestimmender Parameter, sondern verhält sich reziprok zur Samenanzahl (Egli, 1998). So legen großsamige Genotypen von vornherein weniger Samenanlagen an oder der Blüten/Hülsenabwurf ist höher. Die Samenfüllungsdauer ist mit dem Ertrag korreliert, eine längere Samenfüllperiode bringt auch mehr Ertrag. Dabei ist offensichtlich die Zellgrösse von Bedeutung.
Mechanismen, welche die Dauer der Samenfüllperiode kontrollieren, sind bisher nur unzureichend beschrieben worden. Samenwachstum erfordert Zellexpansion und Assimilatverfügbarkeit. Eine wichtige Determinante ist die Verfügbarkeit von Wasser in den Speicherzellen. Eine Wasseraufnahme ist notwendig, damit das Zellvolumen kontinuierlich zunehmen kann. Speicherparenchymzellen wachsen nur, solange Wasser einströmt. Ist das nicht mehr der Fall, akkumuliert Trockenmasse, bis die metabolischen Aktivitäten wegen Wassermangel aufhören; der Same kommt in die Austrocknungspase (Egli 1994).
Wassereinstrom ist unter anderem abhängig vom osmotischen Gradienten zwischen Symplasten und Apoplasten. Dieser ist hoch, wenn die Konzentration an gelösten Substanzen in der Zelle hoch ist. Saccharose und Aminosäuren sind dabei die wichtigsten osmotisch aktiven Substanzen. Es ist bekannt, dass in vitro Samen die zweifache Grösse erreichen können. Hanson and Burton (1994) selektierten Sojagenotypen nach verlängerter Samenfüllperiode und fanden eine Assoziation mit verzögerter Samenreifung und verminderter Trockengewichtsakkumulation.
Weltweit gesehen ist die Ernährung zu einem hohen Anteil von der Samenproduktion abhängig. Samen speichern die Reservestoffe Stärke, Protein und Öl. Darunter gehören die Leguminosensamen zu den wichtigsten pflanzlichen Proteinlieferanten. Leguminosen versorgen sich durch Symbiose mit stickstofffixierenden Bakterien selbst; der Anbau kann deshalb ohne zusätzliche Stickstoffdüngung und damit umweltschonend erfolgen. Unter den gemäßigten klimatischen Bedingungen in Mitteleuropa ist der Anbau von Erbsen am wichtigsten. Entsprechende Hochleistungssorten sind verfügbar; effektive Anbau, Ernte- und Verarbeitungsverfahren sind etabliert. Die strenge Selbstbefruchtung der Erbse z. B. schränkt die unerwünschte Verbreitung von transgenen Pflanzen weitestgehend ein. Da für den Erbsenanbau kein Hybridsaatgut verwendet wird, Sorten diploid sind, ist der Aufbau transgener homozygoter Linien ohne Probleme möglich. Viele dikotyle Pflanzenarten können heute durch eine Agrobakterien vermittelte Standardmethode effizient transformiert werden. Die Transformation von Leguminosen ist jedoch immer noch schwierig und zeitaufwendig.
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, in Leguminosen, insbesondere in Körnererbsen, das Stärke- und Speicherproteinverhältnis sowie die Proteinqualität gentechnisch gezielt zu verändern. Dazu sollen bestimmte pflanzeneigene Gene in antisense oder sense Orientierung exprimiert werden, Fremdgene soll die transgene Pflanze nicht enthalten. Ein weiteres Ziel ist, die Transformationstechnologie unter dem Aspekt der direkten Anwendung für den Züchter weiterzuentwickeln.
Es wurde festgestellt, dass durch gentechnische Manipulation eine Verschiebung der Stoffproduktion zugunsten von Protein möglich ist. So ist es erfindungsgemäß gelungen, ein effizientes Transformationsprotokoll auf der Basis von Agrobacterium zu etablieren und am Beispiel der Erbse homozygote transgene Erbsenlinien zu erzeugen, die industrielle Enzyme oder Antikörper im Samen exprimieren. Dieses Transformationssystem hat den großen Vorteil, dass es auf verschiedene aktuelle Sorten anwendbar ist.
Erfindungsgemäß werden in den Samen der Pflanze durch ein Transformationssystem rekombinante DNA-Sequenzen pflanzeneigener Gene eingebracht. Die rekombinanten DNA-Sequenzen umfassen eine DNA-Sequenz, die in den Pflanzen zur Expression gebracht werden kann und deren Genprodukt in Samen ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer ADP-Glucose Pyrophosphorylase (AGP) und/oder einer plastidären Phosphoglucomutase (pPGM) hemmt und/oder es wird ein Saccharosetransportergen zur Überexpression gebracht. Darüber hinaus enthalten sie ggf. die regulatorische Sequenz eines samenspezifischen Promotors in Leguminosen. Das Verfahren ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass unabhängig mindestens ein Selektionsmarkergen übertragen wird, welches anschließend in der 1. Generation wieder entfernt wird. Es werden die Pflanzen selektiert, die einen erhöhten Proteingehalt und eine längere Samenfüllungsdauer aufweisen (vgl. Abb. 2).
In einer bevorzugten Ausführungsvariante der Erfindung erfolgt eine antisense Inhibierung von Proteinen, die die Aktivität der ADP-Glucose Pyrophosphorylase besitzen, in den Samen. Bevorzugt konnten transgene Pflanzen erzeugt werden, welche insbesondere die kleine Untereinheit der ADP-Glucosepyrophosphorylase (AGPC, Weber et al. 1995), einem Schlüsselenzym der Stärkebiosynthese, in antisense Orientierung vorzugsweise unter Kontrolle eines samenspezifischen Promotors, insbesondere des Legumin B4 Promoters, exprimieren.
Die transgenen Linien weisen einen um 10-15% höheren Proteingehalt auf, desweiteren ist der Stärkebiosyntheseweg herunterreguliert und die Verteilung von Kohlenstoff zugunsten der Speicherproteinbiosynthese erhöht. Die Samenfüllungsdauer, ein wichtiger Ertragsparameter, wird durch eine Veränderung der Samen-Wasserverhältnisse verlängert. Es werden Pflanzen erzeugt, die die DNA nicht gekoppelt an das Markergen enthalten und vorzugsweise an verschiedene loci integrieren und demzufolge eine Aussegregation des Markergens ermöglichen. Das vorgestellte Verfahren kann grundsätzlich auf Samen aller Kulturpflanzenarten angewendet werden, die Stärke speichern.
Für die Transformation erwiesen sich folgendes Genkonstrukt als besonders geeignet:
VfAGPC × 76 940 (Weber et al., Planta 195, 352-361). Als samenspezifische Promotoren fungieren bevorzugt der Legumin B4 Promotor (LeB4) und der Saccharose Bindeprotein Promotor (SBP).
Die Erfindung wird beispielhaft anhand der Herstellung von transgenen Pflanzenlinien, die ADP-Glucose Pyrophosphorylase in antisense Orientierung (AGP-as) exprimieren.
1. Konstrukte
  • a) AGP-as unter Kontrolle des LeB4 Promotors in einem Plasmid, das keinen Selektionsmarker enthält,
  • b) das entsprechende Plasmid, welches nur einen Selektionsmarker (z. B. bar-Gen) enthält und
  • c) ein Plasmid, welches beides, AGP-as und Selektionsmarker enthält.
2. Transformation und Herstellen von stabilen Linien
Um die antisense- Linien mit entsprechend starken Phänotyp zu erhalten (mindestens 90-95% Reduktion der AGP-Aktivität) wurde eine größere Anzahl transgener Pflanzen regeneriert, wobei etwa 10 unabhängige Linien nötig waren, um 1-2 starke antisense-Phänotypen zu erhalten. Die Kotransfektion erfordert jedoch noch eine höhere Anzahl unabhängiger transgener Linien, da nicht alle Transformanden beide Gene an unabhängigen loci enthalten. Nach der Selbstung enthielten später etwa 18% der F1-Samen das Nutzgen ohne Selektionsmarker.
Alternativ wurde parallel auch ein Konstrukt transformiert, das beides, Nutzgen und Selektionsmarker, auf einem Plasmid enthält. Die Herstellung der stabilen Linien erfolgt durch Selbstung und anschliessendes Selektieren der Samen per Hand. Das ist relativ einfach möglich, weil die AGP antisense Samen einen schrumpeligen Phänotyp aufweisen und deshalb von den runden und glattsamigen Wildtypsamen leicht zu unterscheiden sind.
Erfindungsgemäß wurde festgestellt, dass sich nur Linien, in denen das Nutzgen und der Selektionsmarker unabhängig voneinander übertragen wurden, für das anschließende Herausselektieren des Selektionsmarkers eignen.
3. Molekular-physiologische Analyse
Entwicklungsaspekte wie Dauer und Veränderung der Samenentwicklung und der Samenfüllperiode, Genexpressionsprogramme während der Samenentwicklung. Inhaltsstoffe: steady state level von Zucker/Stärke/Proteinen/ Samenqualitätsmerkmale: i) C/N Verhältnis, ii) Gesamtschwefelgehalt, iii) relative Zusammensetzung der Samen hinsichtlich Proteinklassen (Globuline/Albumine) sowie Stärke(struktur), Amylose zu Amylopektinverhältnis, lösliche Zucker und Lipide.
In einer weiteren Ausführungsvariante der Erfindung erfolgte zur Herstellung von transgenen Pflanzenlinien eine Antisense-Expression der plastidären Phosphoglucomutase (pPGM), bevorzugt unter Kontrolle des LeB4- oder des SBP-Promoters. Bei den antisense-Pflanzen wurden ähnliche Effekte wie bei den AGP-antisense-Pflanzen erzielt, wobei der Stärkegehalt noch weiter herabgesetzt ist.
Es wurde eine V. faba kotyledonenspezifische cDNA-Bank mit einer heterologen pPGM- Sonde von Kartoffel abgesucht (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Eva Tauberger, MPI, Golm). Es konnten cDNA-Klone isoliert werden, die nach ersten Sequenzvergleichen die V. faba pPGM kodieren. Sie wiesen u. a. die Sequenz gemäß Abb. 1 auf.
Die Transformation in die Pflanzen und die Analyse der transgenen Pflanzen wurde in Analogie durchgeführt.
Eine weitere Variante der Erfindung zur Herstellung von transgenen Pflanzenlinien mit verlängerter Samenfüllungsdauer besteht darin, ein Genkonstrukt für einen Saccharosetransporter in sense Orientierung zu exprimieren. Samenwachstum erfordert Zellexpansion und eine wichtige Determinante dafür ist die Verfügbarkeit von Wasser. Sein Einstrom ist abhängig von einem hohen osmotischen Gradienten zwischen Symplasten und Apoplasten. Bevorzugt wurde ein Saccharosetransporter unter Kontrolle des LeB4-Promoters überexprimiert, wodurch eine Erhöhung des Saccharosegehalts eintrat, was wiederum zur Verlängerung der Samenreifungsdauer führte, die ein Parameter ist, der mit dem Ertrag hochkorreliert. Die Stärkebiosynthese wird im Gegensatz zu den AGP-as und pPGM-as Samen nicht beeinflusst.
Bevorzugt wurde die cDNA Sequenz des Vicia faba sucrose transport protein 1 (VfSUT1)- Gens (Weber et al. 1997) unter Kontrolle des LeB4-Promotors zur Transformation eingesetzt.
Molekular-physiologische Analyse
Die Analyse erfolgte zur Überprüfung, inwieweit die Zuckeraufnahme in Stadium 7 Kotyledonen im Vergleich zum Wildtyp verändert ist. Dazu wurden isolierte Kotyledonen, die den Saccharosetransporter exprimieren, mit 14C-Saccharose inkubiert. Mit den Inhibitoren PCMBS und CCCP konnte gezeigt werden, dass eine mögliche höhere Saccharoseaufnahme von einem Carrier-vermittelten energieabhängigen Mechanismus katalysiert wird.
So wurde gefunden, dass eine erniedrigte Stärkebiosyntheseaktivität, wie z. B. in den Vicia narbonensis AGP-antisense-Linien, zu höheren Saccharosegehalten verbunden mit einer fortgesetzten Wasseraufnahme und letztlich zu einer längeren Samenfüllperiode führte.
Mit der vorliegenden Erfindung konnte die konventionelle, durch Agrobakterien vermittelte Transformation dahingehend erweitert werden, dass Selektions- und Nutzgen auf verschiedenen Binärvektoren unabhängig voneinander übertragen werden. Dadurch kann der für die Transformation zunächst notwendige, aber für die Anwendung unerwünschte Selektionsmarker (z. B. bar-Gen) ausselektiert werden.
Es wird die aktuelle wissenschaftliche Erkenntnis über die Physiologie der Samenentwicklung mit neuen Techniken der Pflanzentransformation kombiniert.
Die erfindungsgemäße Herstellung selektierbarer markerfreier Pflanzen durch Agrobakterium vermittelten Gentransfer ist am Beispiel der Erbse gezeigt und neben den Leguminosen auf alle durch Samen vermehrte Kulturpflanzen übertragbar.
Beispiel 1
Für Vicia narbonensis konnten mehrere stabile Linien etabliert werden, bei denen sowohl die AGPC-Transkripte als auch die AGP-Enzymaktivität in Stadium 7 Kotyledonen um 80 bis 95% reduziert sind (die Vicia Samenentwicklung wurde in die Stadien 1-7 unterteilt, Borisjuk et al. 1995). Gleichzeitig ist Saccharose zweifach erhöht. Trockene transgene Samen sind schrumpelig (wrinkled), haben jedoch ein unverändertes Trockengewicht und keimen normal. Auf einer per Gramm Basis ist in reifen Samen Stärke um etwa 10-30% erniedrigt. Die extrahierbaren Proteinen der Albumin- und der Globulinfraktion sind signifikant höher. Trockene Samen haben deshalb einen signifikant höheren Gehalt an Gesamtstickstoff, interessanterweise ist der Gesamtkohlenstoff jedoch nicht erniedrigt.
Eine detailliertere Analyse während der Samenentwicklung zeigte, dass AGPC-Transkripte, AGP-Enzymaktivität sowie Stärkegehalt bis etwa 20 Tage nach Befruchtung nicht verschieden vom Wildtyp sind und erst im weiteren Verlauf der Entwicklung abfallen. Das Muster spiegelt das Aktivitätsprofil des verwendeten Legumin-B4-Promoters wieder und zeigt, dass die AGPC-antisense-Inhibierung erst nach 20 DAP wirksam wird und zu niedrigeren Stärke, aber höheren Saccharose und Proteingehalten führt.
Transgene Embryonen haben im Stadium 7 signifikant höhere Frischgewichte und eine höhere Zellgrösse. Die Samenreifung ist um etwa 3-4 Tage verlängert. Eine histologische Analyse zeigte, dass transgene Speicherparenchymzellen im Vergleich zum Wildtyp desselben Alters einen geringeren Differenzierungsgrad haben. Dieser Unterschied ist jedoch in den reifen Samen wieder aufgehoben. Möglicherweise wird durch eine Änderung der Stärkebiosynthese auch das Samenentwicklungsprogramm beeinflusst.
Eine Analyse des samenspezifischen Genexpressionsprogramms ergab, dass die Enzyme des KH-Metabolismus (AGPL, SUS, SPS, PEPC) sowie für Zucker- und Aminosäuretransport (SUT1, AAP2, H+-ATPase) auf der Transkriptionsebene kaum verändert sind. Speicherproteine dagegen reagieren uneinheitlich. Die mRNA-Spiegel von Legumin A waren unverändert, die von Legumin B erniedrigt und die von Vicilin und einem Vicilin­ ähnlichen Speicherprotein leicht erhöht.
Eine Analyse der Glykolyse-Metaboliten zeigte, dass in Stadium 7 Kotyledonen ADP- Glukose um bis zu 95% reduziert ist. Hexose-P und Fru 1, 6-P2 sind deutlich höher, nicht jedoch 3PGA, PEP und Pyr.
Diese Ergebnisse verdeutlichen folgendes:
Die stark erniedrigte AGP in Stadium 7 vermindert den Stärkegehalt nur wenig, während Saccharose ansteigt und der Gesamtkohlenstoffgehalt fast unverändert bleibt.
Kohlenstoffassimilate werden offenbar in lösliche Zucker und Proteine umverteilt. Die Samenreifung und damit die Samenfüllperiode ist signifikant verlängert, was offensichtlich durch den höheren Saccharosegehalt ausgelöst wird. Saccharose induziert einerseits speicherungs-assoziierte Genexpression und beeinflusst die Kohlenstoffverteilung. Andererseits erhöht sie den osmotischen Gradienten zwischen Zytoplasma und Apoplasten und bewirkt so, dass Wasser einströmt und die Zellen expandieren. Auf diese Weise kann der Speicherstoffsynthesemetabolismus aufrecht erhalten werden.
Beispiel 2
Aufbauend auf der Methode von Schroeder et al. (1993) wurde eine Methode für die Erbsentransformation etabliert. Als selektiver Marker wurde das bar-Gen, das Resistenz gegen Phosphinotricin vermittelt, verwendet.
Die Effizienz für transgene R0-Pflanzen beträgt etwa 3-4%.
Mit dieser Methode wurden stabile transgene Pflanzen erzeugt, die das Transgen in die Nachkommenschaft vererben. Bis jetzt liegen über 30 Linien mit verschiedenen Transgenen vor. Unter anderem sind homozygote Erbsenlinien, die industrielle Enzyme im Samen produzieren vorhanden. Es liegen 4 unabhängige Linien vor, die ein Amylasegen aus Bacillus licheniformis in den Samen stabil über mehrere Generationen exprimieren. Eine Xylanase aus Chlostidium thermocellum wird in den Samen von 8 Linien hergestellt.
Ausführungsbeispiel 3
Bei einer Vektorkombination von pGPTV-bar (Becker et al., 1992) mit pPZP200 (Hajdukiewicz et al., 1994) in den supervirulenten Agrobakterienstämmen EHA 101 bzw. EHA 105 wird bei Pisum sativum eine Co-Transformatonseffizienz von etwa 50% erreicht, davon ist in mindestens 10% das Markergen nicht am gleichen Locus wie das Nutzgen integriert und kann heraussegregiert werden. Als cotransformiertes Nutzgen wurde hier das α-Amylase-Gen aus Bacillus licheniformis verwendet. Vorliegende erste AGP-antisense-Linien wurden ebenfalls mit einer Effizienz von 50% Cotransformation erhalten.
Durch Co-Transformation wurden 12 unabhängige transgene Erbsenlinien erzeugt; Linien 5-12 sind in Abb. 3b dargestellt. Von diesen 12 Linien sind 8 mit dem α-Amylasegen co­ transformiert (Abb. 3a). Die Nachkommenschaftsanalyse ergab 2 Linien mit nichtgekoppelten Inserts (Abb. 4).
Literatur
Becker, D., Kemper, E., Schell, J. and Masterson, R. (1992) New plant binary vectors with selctable markers located proximal to the left T-DNA border. Plant Molecular Biology 20, 1195-1197.
Borisjuk, L. Weber, H. Panitz, R. Manteuffel, R. and Wobus, U. (1995) Embryogenesis of Vicia faba L.: Histodifferentiation in relation to starch and storage protein synthesis. J. Plant Physiol. 147, 203-218.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims (11)

1. Verfahren zur Herstellung von Leguminosen mit erhöhtem Proteingehalt bei verlängerter Samenfüllungsdauer, dadurch gekennzeichnet, dass man Pflanzengewebe mit zwei unabhängigen Binärvektoren transformiert, wobei der eine
  • a) rekombinante DNA-Sequenzen einbringt, die Sequenzen pflanzeneigener Gene umfassen, mit denen Proteine exprimiert werden, die die enzymatische Aktivität der ADP-Glucose Pyrophosphorylase (AGP) und/oder der plastidären Phosphoglucomutase (pPGM) hemmen und/oder das Saccharosetransportergen zur Überexpression bringen, und der andere
  • b) ein Selektionsmarkergen einbringt, wobei a) und b) an einem Locus oder an verschiedenen Loci integrieren,
    danach unter selektiven Bedingungen regeneriert und Pflanzen mit dem Genotyp rekombinante DNA+Selektionsmarkergen selektiert,
    das Selektionsmarkergen bei nicht gekoppelter Integration eliminiert und schließlich
    auf der Basis der phänotypischen Veränderungen des Samens die Pflanzen sortiert, die einen erhöhten Proteingehalt im Samen und eine längere Samenfüllungsdauer aufweisen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die rekombinanten DNA-Sequenzen die regulatorische Sequenz eines samenspezifischen Promotors in Leguminosen, vorzugsweise von LeB4 oder SBP, aufweisen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass DNA-Sequenzen eingebracht werden, deren Genprodukte die Proteine hemmen, die die Aktivität der kleinen Untereinheit der AGP aufweisen.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass DNA-Sequenzen eingebracht werden, deren Genprodukte die Proteine hemmen, die die Aktivität der plastidären Phosphoglucomutase (pPGM) aufweisen.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass DNA-Sequenzen eingebracht werden, deren Genprodukte das Saccharosetransportergen zur Überexpression bringen.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass das Transformationssystem ein Agrobakterienkonstrukt in Form eines Plasmides ist, das antisense AGP-Genkonstrukte und mindestens eine regulatorische Sequenz des samenspezifischen Promotors LeB4 aufweist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass das Transformationssystem ein Vektor ist.
3. Rekombinante DNA-Sequenzen zur Transformation in eine Leguminosen-Pflanze umfassend eine die Sequenz gemäß Abb. 1, sowie zu 95% homologe Fragmente oder Mutanten, die die gleichen Eigenschaften aufweisen, deren Genprodukte die enzymatische Aktivität der plastidären Phosphoglucomutase (pPGM) bzw. deren Unterheiten und Proteine mit gleichen Eigenschaften hemmen.
9. Rekombinante DNA-Sequenzen nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine regulatorische Sequenz eines samenspezifischen Promotors umfassen.
10. Transgene Leguminosen-Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine der Sequenzen gemäß einem der Ansprüche 8 bis 9 aufweisen.
11. Transgene Leguminosen-Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, dass es Erbsenpflanzen sind.
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