JPH05506358A - 植物組織のエチレンレベルを変更する方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２３、請求項１２から１６のいずれか１項に記載の方法によって変更されたエチ レンレベルを有する植物細胞。

明細書 植　組織のエチレンレベルを変　する　法　び組成物本出願は、１９９０年４月 ２６日付の米国特許出願第０７１５１４．０２９号の一部継続出願である。

見１五ｊｆＪｆ 本発明は、エチレンレベルの変更によって植物組織の成長関連特性を変化させる ことに係わる。

１旦立１遣 エチレン（ＣＨ２＝　Ｃ１，）は、高等植物における組織の成長及び発育の自然 調節に関与するガス状ホルモンである。エチレンは植物細胞によって規則的に生 成され、二酸化炭素と同様にして植物組織外へ拡散する。植物細胞は常に低しベ な成長及び発育をもたらし得る。植物の成長段階に応じて様々な植物部分に、エ チレンへの暴露の結果として特定の効果が表われ得る。

植物発育の特定段階に、エチレン生成レベルの上昇が観察される。この急激なエ チレン増加は特定の植物過程、特に種子の発芽、受粉、傷害その他の様々なスト レスを被った時、果実の成熟、葉及び花弁の老化、並びに器官脱離と同時期に起 こると考えられる０通常、上記過程は総て加水分解酵素のレベル上昇を招く。果 実の成熟、花の老化、及び器官脱離などの過程でのエチレン生成は゛自己触媒的 ”と説明される。即ち、組織がエチレンに暴露されると該組織によって生成され るエチレンの量が甚だしく増加し、かつエチレン媒介作用に対する該組織の感受 性が甚だしく高まる。組織に′当てられる“エチレンは、エチレン生成が増加し 、かつ同時期に存在する他の植物組織からエチレンがエチレンガスとして、また はエチレンを放出する化学組成物として外部に当てられる結果として集積する放 出エチレンである。所与の“エチレン過敏”組織と無関係な組織は、増加したエ チレンに晒されても比較的影響されないままである。即ち、エチレン感受性に関 してはまず第一に、他のホルモン作用が関与すると仮定される。

最近の農業及び園芸では、エチレンの特性が成る程度実地に利用されている。高 レベルのエチレンを発する組織に対する暴露を回避することにより、残りのエチ レン過敏組織において望ましくない変化が共感的に惹起されるのを防止する。即 ち、切り花をチオ硫酸銀の形態の銀イオンで処理して、エチレン生成の増加によ って観察される老化を遅れさせる。同様に、未熟のクリマクテリツク型果実は使 用時まで十分な換気の下に貯蔵を継続する。トマトの場合、成熟が望ましければ 果実を外来エチレンで、即ちエチレンガスか、またはエテフォン（２−り四ロエ タンホスホン酸）などのエチレン放出化合物で処理する。

遺伝子工学の出現に伴い、植物におけるエチレン生成を、特に生成エチレンの増 加及び集積を防止するべく調節する様々な方策が提案された。特に、エチレンの 生合成に関与する様々な遺伝子のアンチセンスはエチレン生成を調節する機構を 提供し得る。しがし、アンチセンス技術では、所期の遺伝子に対して高度の相補 性を有するＤＮＡ配列を用いなければならない、様々な作物のエチレン合成経路 にみられる僅かな相違は、所望の表現型変化を最小限の労力で有効に実現する可 能性を潰しがねない、このような方法は（１種以上の）特定の遺伝子、また植物 そのものとしてもしばしば特定の種類にしが適用できないので、きわめて様々な 作物にあまねく適用可能な方法が必要となる。

１ニス１ 果実の成熟におけるエチレンの役割及びエチレン合成についてはＴｈｏｍｐｓｏ ｎ　ｅｔ　ａｌ、ｅｄ、、　Ｐｌａｎｔ　５ｅｎｅｓｃｅｎｅｅ：　Ｉｔｓ肚肚 ■凪躬コ」非Ｌ１３並ハ□、　ｐｐ、　１５６−１６６、１９８７に述べられて おり、植物発生の他の段階におけるエチレンの役割についてはＲｏｂｅｒｔｓ　 ａｎｄ　Ｔｕｃｋｅｒ　ｅｄ、、　Ｅｔｈ　Ｉｅｎｅ　ａｎｄ　ＰｌａｎｔＤｅ ｖｅｌｏ　ｗｅｎｔ、　１９８５に述べられている。　１９７９年に＾ｄａｍｓ 及びＹａｎｇはＰＮＡＳ　ＵＳ＾７６、　ｐｐ、　１７０−１７４．１９７９に おいて、エチレンが１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸（八ＣＣ）から 生合成されること、及び植物組織中の＾ＣＣのレベルがエチレン生成の速度を制 御することを報告した。八ＣＣをアンモニアとα−ケトブチレートとにする開裂 を触媒する＾ＣＣデアミナーゼが、八〇〇を単一窒素源として利用するＰｓｅｕ ｄｏｓａｓ種及び酵母Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　５ａｔｕｒｎｕｓがら精製された（ Ｈｏｎｗａ　ａｎｄＳｂｉｍｏｍｕｒａ、Ａ　ｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、４ ２．　ｐｐ、１８２５−１８３１゜１９７８）　。

１肌立１１ 花弁組織、葉組織、及び様々な果実組織など、所期の植物組織のエチレンレベル を変更する新規な組成物及び方法が提供される。前記方法は、エチレンの生成を 調節し得る酵素をコードするＤＮＡ配列に転写解読枠５′末端において結合され た転写翻訳開始調節領域と、翻訳転写終結領域とを含む、植物細胞内で機能する 発現カセットで所期の植物細胞を形質転換することを含む、上記酵素の発現は、 エチレン生合成に関与する酵素のための基質の濃度を変化させ、それによってエ チレン生成を減少させる。特に果実及び組織の老化、器官脱離及び／または成熟 に関連するエチレン生成の甚だしい増加を防止するべく、花、果実及び葉といっ た植物組織でのエチレン生成を選択制御することが特に重要である。

１１旦災皇ｌ且泗 第１図はアミノ酸配列（配列同定番号１〜４）と、ＰＣＲ反応のためのプライマ ーとして用いるオリゴヌクレオチド八ＣＣＤＩ〜４の、上記アミノ酸配列に対応 するＤＮＡ配列（配列同定番号５〜８）とを示す。

第２図は＾ＣＣデアミナーゼコード化領域の全ＤＮＡ配列（配列同定番号９）と 、翻訳されない５′末端領域の６２３ｂｐ、及びやはり翻訳されない３′末端領 域の１４３ｂｐとを示す。コード化領域の各コドンの下にアミノ酸が１文字表記 で示されている。

第３図は、＾ＣＣデアミナーゼゲノムクローンを取り込んだｐｃＧＮ１４７９の 部分制限地区を示す。

１定匠五且」 本発明は、所期の組織においてエチレン生合成のための基質の代謝を高めること によって植物生産品のエチレン濃度を変更し得る新規なりＮ＾配列、ＤＮ＾楕遺 体、方法及び組成物を提供する。植物細胞を、所期の組織中のエチレン生合成前 駆体の量を減少させ得る酵素をコードするＤＮＡ配列を含む発現カセットで形質 転換する。望ましくは、上記発現カセットの植物宿主ゲノムへの組み込みを実現 する組み込み楕遺体が製造され得る。所望用途次第では、代謝中間体を所期の組 織において選択的に発現させることが有用であり得る６組織特異性は、望ましい 発現プロフィールを有する転写頂部領域を用いることによって達成され得る。

即ち本発明は、エチレン生成の増加を制御して、エチレンの生成及びエチレンへ の暴露が増えることによってもたらされる有害な生理的変化を遅延させる手段を 実現し得る。

望ましくは、上記のような効果が維持されるのは常に所期に関連するホルモン活 性に影響することはない、換言すれば、他の植物過程への影響は最小限であるこ とが望ましい。

例えば、切り花の花弁及び／または葉のエチレン濃度を低下させれば、当該植物 はさほど急速には萎れなくなる。前記植物には、ペチュニア、バラ、カーネーシ ョン、センボンヤリ、キクその他のあらゆる所期の園芸作物が含まれる。

同様に野菜の品質も、特に本発明が黄ばみまたは萎れの作用を軽減するべくブロ ッコリー、クール、パセリ及びホウレンソウのような緑黄色野菜及び／または葉 菜、並びにニンジン、キュウリ、柑橘類果実及び穀物などの他の果実及び野菜に 適用された場合向上する。エチレンへの暴露を制御することによって、トマト、 キュウリ、キーウィーフルーツ、バナナ、メロン、リンゴ、アボカド及びナシの ような果実及び野菜の品質低下を防止できることも証明された。

エチレン生成増加に関連して生起する、花組織、葉組織、及び柑橘類果実のよう な、クリマクテリツク型であると看做されない果実を含めた果実組織全般の早期 退化、特にセイヨウアブラナ種に見られる莢片、及びワタの日英のような発生関 連果実構造に関する早期退化などに対して本発明を用いた場合も、エチレン制御 が有効であるはずである。

また、本発明を農作物に適用した場合、エチレン生成の制御によって葉の老化速 度が低下し、それによって穀物生産が増加し得る。このように、本明細書によっ て明確化され得る本発明の潜在的用途は、きわめて様々な農作物及び農業製品に 非常に多く存在する。そのうえ、組織によっては外来エチレンの適用を、エチレ ン生成の自然増加と共に観察される典型的“自己触媒”効果の惹起に用いて、例 えば同時成熟などの比較的明確な利益のために内在エチレン生成の減少を“無効 ”にし得る。

植物のエチレンレベルを低下させるべく植物細胞を、５′−３′転写方向に転写 翻訳開始調節領域と、エチレン生合成の前駆体のレベルを低下させ得る酵素をコ ードする構造遺伝子と、転写翻訳終結調節領域とを含む発現カセットで形質転換 する。上記開始及び終結調節領域は宿主植物細胞内で機能し、これらの領域は宿 主植物と同種であっても異種であってもよい。

後段で詳細に検討するように、調節領域は植物宿主、及び所望の発現プロフィー ル次第で様々である１本発明のＤＮＡＮ遺構の大部分は、植物全体で十分一様に （連続的に）発現するか、または選択的に（時点及び／または組織特異的に）発 現するように選択された植物的機能性の調節領域を含む、このようにして、エチ レンの付加的制御が実現さエチレン濃度を低下させる手段として特に興味深いの は、エチレン生合成のための基質の有効性及び／または濃度に直接影響する酵素 の使用である。Ｍ物組織においてエチレン生合成の前駆体を代謝させるべく特定 の酵素を用いる場合に考慮するべき要件には、当該酵素の最適ｐｉ、有効基質が 当該酵素のための単一基質であるかどうか、及び当該酵素が必要とする補因子が 含まれる。所期の酵素は、宿主植物細胞内に見いだされる生化学的環境に適合し 得る動力学的パラメーターを有するべきである６例えば、当該酵素は他の酵素と 基質について競合しなければならないかもしれない、従って、所与の酵素が所与 の宿主植物におけるエチレン生成の制限に適し得るかどうかの決定では問題の酵 素のに１及び比活性の分析が考慮されるべきである。

即ち、酵素は所望の標的組織に存在する諸条件下に機能し得るものでなければな らないであろうが、この点を除けば該酵素は、エチレン生合成に否定的影響を及 ぼし得るという所望の特性を有する任意の酵素であり得る６特に重要な酵素は、 １−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸（＾ＣＣ）を代謝させる酵素である 。植物において、八〇〇のレベルはエチレン生成のレベルと緊密に相関する。従 って、所期の植物組織におけるエチレンの生成は、該組織の＾ＣＣレベルを低下 させることによって減少可能である。　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の様々な細菌 、及びＨａｎｓｅｎｕｌａ　５ａＬｕｒｎｕｓなどの様々な酵母を非限定的に含 めた数種の微生物が八ＣＣを利用し得る。

特に重要であるのは、＾ＣＣを単一窒素源として用いる細菌Ｐｓｅｕｄｏｎｏｎ ａｓ種＾ＣＰである。八ＣＣを代謝させる酵素の特徴は十分明らかにされており 、該酵素は八ＣＣを、いずれも植物の通常の代謝中間体であるアンモニアとα〜 ケトブチレートとに変換する。植物において＾ＣＣデアミナーゼを発現させるの は、八ＣＣを除去し、それによって八ＣＣのエチレンへの転換を低減するためで ある。

Ｐｓｅｕｄｏｓｏｎａｓ種＾ＣＰ由来の＾ＣＣデアミナーゼは高いへＣＣ特異性 を有する（Ｋｍ＝１５ＩＩＭ）、　１１．５ａｔｕｒｎｕｓ由来の＾ＣＣデアミ ナーゼは上記デアミナーゼより大きい、即ち２．６ｍＭのに、値を有する。

デアミナーゼのための構造遺伝子は様々な方法で得ることができる。上記遺伝子 は、八〇〇を異化させ得る、Ｐｓｅｕｄｏ−シュ■属の細菌、酵母その他の微生 物を含めた様々な原核細胞などの天然源から取得可能である。

大体において、デアミナーゼ構造遺伝子の幾つか、または総ては天然源に由来す るか、またはそのような配列と少なくとも実質的に相同の遺伝子である。状況に よっては、例えば宿主にとって好ましいコドンを用いることによって発現を促進 するべくコドンの全部または一部を変更することが望ましい場合が有る０個々の 状況毎に様々な程度の困難が生じ得るが、所期の配列を同定する方法については 参考文献中に広範な例示がみられる。様々な技術の中に、ゲノムライブラリーま たはｃＤＮ＾ＤＭＡラリーに相補的配列をもとめる場合にプローブを用いること が含まれている。橘入するべき構造遺伝子が原核細胞に由来する場合は該原核遺 伝子の、コード化を行なわない３′末端領域を最小化することが望ましい、ｌ！ 訳されない上記領域が実質的に存在しないことによって、植物細胞におけるｍＲ Ｎ＾の転写、安定性、及び／、または翻訳に肯定的影響が及ぼされ得る。

特にＭ物にとって好ましいコドンを用意することが望ましい場合、遺伝子の全部 または一部を合成することも可能である。即ち、転写解読枠の全部または一部を 、植物宿主に好まれるコドンを用いて合成し得る６Ｍ物にとって好ましいコドン は、所期の特定植物種において最も多量に発現するタンパク質に関して最も頻繁 に出現するコドンがら決定し得る。配列合成方法、及び配列同士を連結する方法 は参考文献中で十分に確立されている。転写解読枠の一部が合成され、一部が天 然源に由来する場合１合成部分は二つの天然部分の連結部として機能し得、また は３′末端もしくは５′末端を構成し得る。特にシグナル配列と、デアミナーゼ をコードする転写解読枠とが異なる遺伝子に由来する場合は通常、合成アダプタ ーが用いられる。あるいはまた、様々な断片が異なる制限部位に抽入され得、ま たはポリリンカー中の配列と置換され得る場合はポリリンカーが用いられ得る。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発及び選択、特定部位の突然変異誘発、または他の 手段を用いて天然のデアミナーゼ遺伝子を突然変異させ、基質＾ＣＣへのより高 い親和性のような、植物細胞内で機能するうえでより望ましい物理学的及び動力 学的パラメーターを有する酵素を生成させることが可能である。

デアミナーゼ構造遺伝子は植物遺伝子でないので、この遺伝子を植物細胞内で発 現させるためには、植物細胞内で機能する転写翻訳開始調節領域（“プロモータ ー”）を設けなければならない、植物細胞内で機能する転写翻訳開始シグナルに は、植物宿主、または他の植物種が有する遺伝子に由来するもの、例えばタバコ などのりブロースビスリン酸カルボキシラーゼ小サブユニット転写開始領域、カ リフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）などのウィルスが有するもの、例えば ３５Ｓ転写開始領域：及び、例えばオクトビン。

マンノビン、アグロビン等のためのオバインシンターゼ転写開始領域のようにＴ −ＤＭＡと結合したものが含まれる。本発明で用いる転写翻訳開始領域は、互い に同じであるかまたは異なる（１個以上の）コード化を行なわない５′上上流部 領域から得ることができる。特に重要なのは、タンデムに位置する２個の３５Ｓ プロモーター（“二重３５Ｓプロモーター”とも呼称）を含む構造体の転写開始 領域、マンノビンシンターゼ／３５Ｓプロモーター構造体（１９９０年２月７日 付米国特許出願第４７７．０５５号及びＣｏｍａｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｌａｎ ｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１５゜ｐｐ、　３７３−３８１．１９９０参照）、 ３４Ｓプロモーター（１９８９年９月７日付米国特許出願第４０４，２８３号及 びＳａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　ＰｌａｎｔＭｏｌ、　Ｂｉｏｌ、　１４．　 ｐｐ、　４３３−４４３．１９９０参照）等である。

用途次第ではプロモーターを、組織及び／または時点特異的なプロフィールによ って選択的発現を示すｃＤＮ＾のゲノムクローンから得ることができる０例えば 、花弁特異的ｃＤＮ＾（Ｌａｗｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈ　５ ｉｏ１．９０．　ｐｐ、　６９０−６９６゜１９８９）、並びに葉（Ｄｕｎｓ＋ ５ｕｉｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

Ｉｌ、　ｐｐ、　４１７７−４１８３．１９８３）、板端（Ｐｏｋａｌｓｋｙ　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕ−（Ｐｅａｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｌａｎｔ　Ｎｏｔ、Ｂｉ ｏｌ、１３．ｐｐ、６３９−６５１．１９８９）において選択的に発現するｃｌ ）ＮＡ等を用い得る。このようにして得られるプロモーター頚では更に、比較的 普遍的な組織特異的プロモーターと非常に局所的、または時点特異的であるプロ モーターとへの分化が認められ得る０例えば、１９９０年７月２４日付米国特許 第４，９４３，６７４号、並びに同時係属出願である１９９０年９月１４日付米 国特許出願第５８２，２４１号（即ちＰＣＴ特許出願公開第８８０９３３４号） 、１９９０年７月１９日付米国特許出願第５５４，１９５号（即ちヨーロッパ特 許出願公開第０４０９８２９号）、及び１９９０年７月１９日付米国特許出願第 ５５５．７１１号（即ちヨーロッパ特許出願公開第０４０９６２５号）には、ト マト果実において異なる発現パターンを示す様々なプロモーターが開示されてい る。特定の用途に応じて、所望の発現パターンを有するプロモーターを選択する 。特定Ｍ織において別様に活性である他のプロモーターは、例えば米国特許第４ ，９４３，６７４号及びＰＣＴ特許出願公開第８８０９３３４号に開示されてい る方法を用いる当該組織の分画スクリーニングによって同定し得る。

調節領域は、植物宿主と同種（宿主植物種に由来）であっても異種（宿主植物種 以外の天然源、または合成りＮＡ配列に由来）であってもよい、“同種”という 語は、固有配列と内在配列との両方を包含する。（１個以上の）プロモーターを 構造遺伝子と結合するために、構造遺伝子上流の、コード化を行なわない５′末 端領域をエンドヌクレアーゼで制限して除去し得る６あるいは他の場合には、構 造遺伝子の５′末端付近の、適当な制限部位が存在するところを制限し、かつ構 造遺伝子の欠失したヌクレオチドを補うアダプターを用いて構造遺伝子とプロモ ーター領域とを連結し得る。

終結領域は、開始領域を得た遺伝子の３′末端領域に由来しても、別の遺伝子に 由来してもよい、終結領域は植物遺伝子、特に転写翻訳の開始に用いた植物遺伝 子に由来し得、タバコリブロースビスリン酸カルボキシラーゼ小サブユニット終 結領域：オクトビンシンターゼ終結領域のような、Ｔｉプラスミドと結合した遺 伝子；または匡終結領域その他の、当業者に公知である３′末端領域であり得る 。

発現カセットの開発では、調節領域及び転写解読枠に含まれる様々な断片を、連 結反応、制限酵素での消化、切断、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発、プライマー 修復、リンカ−及びアダプターの使用等のような異なるプロセッシング条件下に 置き得る。即ち、調節領域及び／または転写解読枠に用いる［ｌＮ＾においてヌ クレオチドトランジション、トランスバージョン、導入、欠失等を実現し得る。

従って発現カセットは、その全部または一部、が天然源に由来し得、またその全 部または一部が宿主細胞と同種または異種の供給源から取得され得る。そのうえ 、本発明の様々なりＮＡ楕遺体（ＤＮ＾配列、ベクター、プラスミド、発現カセ ット）は単離及び／または精製されるか合成され、即ち“自然に生じる”もので はない。

発現カセットを構成する際は普通様々なりＮＡ断片を、ＤＮＡの増幅、ＤＮＡの 修飾、または配列、リンカ−等の結合や除去によるマニピユレーションを可能に する適当なりローニングベクターでクローン化する１通常、ベクターは、複製が Ｅ、　ｃｏｌｉにおいて少なくとも比較的大きいコピー数で行なわれることを可 能にする。

幾つかのベクターがクローニング用として直ちに有効であり、それらの中にはｐ ＢＲ３ＺＺ、ｐＵＣシリーズ、８１３シリーズ等のようなベクターが含まれる。

クローニングベクターは、組み換え体の選択を可能にする１種以上のマーカーを 有する。マーカーは通常、抗生物質、重金属、毒素等のような細胞障害物質に対 して耐性である。ベクター及びカセットを適当に制限し、かつ端部をチューイン グパックやオーバーハングへの充填により適宜修飾してプラント末端とし、リン カ−と付加し、ティリングすることによって、ベクターを発現カセットまたはそ の構成要素と連結結合するための相補的端部を形成し得る。

発現カセットの開発でＤＮＡのマニピユレーションを終える度に１ラスミドをク ローン化し、その配列に関して適正配列が確実に得られたと分析できた特定のカ セット構成要素を必要に応じて単離する。マニピユレーションの方法次第では、 所望の配列を１ラスミドから切り取って別のベクターに導入したり、プラスミド を制限して発現カセット構成要素を適宜マニビュレートしたりすることが可能で ある。

クローニングのためにＥ、　ｃｏｌｉを様々なりＮ＾構遺体くプラスミド及びウ ィルス）で形質転換する方法は、本発明にとって重要でない。接合、形質導入、 トランスフェクション、または塩化カルシウムもしくはリン酸カルシウム媒介形 質転換などの形質転換を採用し得る。

発現構造体を植物に導入する方法によっては、上述以外の［ｌＮ＾配列が必要と なり得る。発現カセットは通常、該カセットのクローンの単離、配列決定、分析 等を可能するべく原核生物、特にＥ、　ｃｏｌｉにおいて機能する複製系と結合 させる。はとんどの場合ＤＮＡＮ遺構は、（１種以上の）宿主内での選択を可能 にし得る１種以上のマーカーを含み、これらのマーカーは普通、殺生物剤耐性、 即ち例えば抗生物質耐性；重金属耐性；毒素耐性；栄養要求宿主に対しての涙栄 養体性を実現する相補性；免疫等を有する。しばしば、植物宿主内で検出可能な マーカーが選択される。ＤＮＡを植物細胞に微量注射し、もしくは植物細胞内へ と押し込む場合は普通、その内部で注入ＤＮＡが組み込まれ、機能性となった細 胞を直接選択することを可能にするマーカーが選、択さ植物細胞の形質転換にＴ −ＤＮＡを用いることについては広範な研究が為されており、ヨーロッパ特許出 願公開第１２０．５１６号、Ｈｏｅｋｅａ＋ａ、　Ｔｈｅ　Ｂｉｎａｒ　Ｐｌａ ｎｔ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓ　ｓｔｅｍｓ。

Ｃｈａｐｔｅｒ　Ｖ、　０ｆｆｓｅｔｄｒｕｋｋｅｒｉｊ　Ｋａｎｔｅｒｓ　Ｂ 、　Ｖ、、＾Ｉｂ１ａｓ−ｓｅｒｄａ（１９８５、Ｋｎａｕｆ　ｅｔ　ａｌ、、 Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆＨｏｓｔ　Ｒａｎｇｅ　Ｅｘｐｒｅｓ ｓｉｏｎ　ｂｙ　ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｌＩｌ”　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅ ｎｅｔｉｃｓ　ｏｒ　ｔｈｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ−Ｐｌａｎｔ　Ｉｎｔｅｒａｃ ｔｉｏｎ、Ｐｕｈｌｅｒ。

＾、　ｅｄ、、　ｐ、　２４５．　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　ＮＹ、 　１９８３、及び＾ｎ　ｅｔａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、　４．　ｐｐ、　２７７− ２８４．１９８５に詳細な記述が有る。

好ましくは、外植片、子葉その他の植物組織をＡ、　ｔｕｍｅ−ｆａｃｉｅｎｓ またはＡ、　７と共に培養して発現構造体を植物細胞に転移させ、この植物細胞 を選択のための適当な選択培地中に分散させ、増殖させてカルスとし、ルーティ ング培地での増殖により前記カルスから苗条を成長させて小植物を再生し得る。

仕ｒｏｂａｅｔｅ亘」宿主は、Ｔ−ＤＮへの植物細胞への転移に必要な會遺伝子 を含むプラスミドを有し、その際当該宿主自体はＴ−ＤＮＡを有しても有しなく ともよい。

発現構造体を宿主細胞に、注入または電気穿孔によって挿入するべきである場合 は、（腫瘍遺伝子、特にＴ−ＤＮＡ領域を欠失させた）無力のＴｉプラスミドを 用い得る。

植物細胞内に存在する所望のＤＮ＾配列がゲノムに組み込まれ、転写されている かどうかを決定する技術は、様々なものが存在する。ノーザンブロッティングの ような技術を用いれば、デアミナーゼをコードするメ・ンセンジャーＲＮへを検 出することができる。また、生起した発現の検出は、酵素活性に関するアッセイ やタンパク質産物に関するイムノアッセイなどの様々な方法で可能である。その 際、望ましい表現型は、所期の植物組織、特に果実における低下したエチレン含 量である。

形質転換の済んだ細胞は植物において、通常の方法で増殖させ得る０例えば、Ｍ ｅＣｏｒｍｉｃｋ　ｅＬ　ａｌ、、　Ｐ！ａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ−肚コｓ　５ ．　ｐｐ、　８１−８４．１９８５を参照されたい、その後、植物を成長させ、 同じ形質転換株か、または異なる株で受粉させ、結果として得られる、所望の表 現型特性を有するハイブリッドを同定し得る。２世代またはそれ以上の世代を成 長させて、上記表現型特性が安定に維持継承されることを確認してから、所望の 植物組織で発現した新しい表現型特性、特にエチレン合成前駆体の代謝に起因す る低いエチレンレベルを有する植物を得るべく用いる種子を収穫し得る。

以下の実施例は本発明の説明のためのもので、本発明を限定するものではない。

叉１皿−ユ ローン　ｆ−Ａ　ＣＣ−ア≧ナーゼ　の−Ｐｓｅｕｄｏｎｏｎａｓ　ｓ　、Ａ　 ＣＰか　のＤＮＡのＰｓｅｕｄｏｎｏｎａｓ　ｓｐ、Ａ　ＣＰ　（Ｈｏｎｍａ及 びＳｈｉｍｏｍｕｒａ、　７Ｂｉｏ１．Ｃｂｅｍ、（１９７８）　４Ｚ：１８２ ５４８３１）を、２％グルコース、０．５％バクトベプトン及び０．３％酵母抽 出物からなる培地で３０°Ｃで１４時間培養した。細胞を遠心分離によって回収 し、１０ＸＴＥ緩衝？ｆｉ　（１０ｍＭ　ｌ−リス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５、ｌｆ ｆ１Ｍ　ＥＤＴΔ）に再懸濁させた。次いでドデシル硫酸ナトリウム及びプロナ ーゼ（Ｐｒｏｎａｓｅ）　（ＳｉＨｍａ、ＳＬ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をそれぞれ １％及び０．５Ｂ／ｍｌで加えた。静かに混合した後、細胞溶解物（ｌｙｓｉｓ ）を３７℃で３０分間インキュベートした。この溶解物（ｌｙｓｉｔｅ）の上に ２０μｍのエタノールを重ね（ｏｖｅｒｌａｙｉｎｇ）、ガラス棒を用いてエタ ノール／溶解物間の界面からＤＮＡをスプール（ｓｐｏｏ　ｌ　）することによ りＤＮＡを取り出した。このＤＮＡを１０＋＊Ｍ　トリス、ｐＨ７，５，１ｍＭ 　ＥＤＴ＾（ＴＥ）中に４℃で長時間にわたり溶解した。この溶液又はその一部 分をフェノール／クロロホルムで抽出し、２．５ｖｏｌの１００％エタノール中 で一８０℃で沈澱させた。ＤＮＡを遠心分離によってベレット化し、ＴＥ中に再 懸濁させた。

Ｐｓｅｕｃｌｏｍｏｎａｓ　ｓ　、Ａ　ＣＰ　Ｄ　Ｎ　Ａ−イブ−１−の５前述 のようにして単離したＰｓｅｕ＋（ｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、Ａ　ＣＰＤＮＡから、 ＥｃｏＲＩ／ラムダＺｉｐＨ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、Ｃ＾ ）ライブラリーを、製造業者により指示されている手順に従って形成した。ＤＮ ＡをＥｃｏＲＩで完全に消化し、１．０％アガロースゲルを用いて電気泳動にか けた。長さ約３〜７ｋｂのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　Ｄ　Ｎ　Ａを含む領域を切 り取り、透析膜上に電気溶離した（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｅｄ）。このＤＮＡ をＴＥ中でエタノール沈澱させ、製造業者の指示に従ってラムダＺａｐ［（Ｓｔ ｒａｔａｇｅｎｅ、［、ａ　Ｊｏｌｌａ、Ｃ＾）の脱ホスホリル化ＥｃｏＲ１部 位に連結した。このＤＮＡをで生育可能な（ｖｉａｂｌｅ）ファージ粒子中にｉ ｎ　ｖｉｔｒｏでバラゲージングした。このＥｃｏＲＩラムダＺａｐ［ライブラ リーは約５ｘｌＯ’個のプラーク形成単位を含む。

ＡＣＣ−アζナーゼプローブの 完全長ＡＣＣＤ遺伝子の…ＲＩ／ラムダＺａｐライブラリーをプローブすべく　 、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、Ａ　ＣＰ由来のＡＣＣデアミナーゼ（Ａ　Ｃ ＣＤ　）遺伝子の３６９塩基対ＤＮＡフラグメントを単離し、［３２Ｐ］ｄＡＴ Ｐ及び［”Ｐ］ｄＣＴＰで（又は［３２ＰコｄｃＴＰで）標識した。　Ｐｓｅｕ ｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、Ａ　ＣＰから単離したＡＣＣＤタンパク質のＮ末端から のペプチドのアミノ酸配列＜ＳＥｏ　１０　ＮＯ５：１〜４）をＤｒ、Ｉ’ｌｏ ｎｍａ　（北海道大学）から入手し、図１に示す４つの合成オリゴヌクレオチド フラグメント（ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯＳ：５　ヘ８＞を、Ｐｓｅｕｄｏｓｏｎａｓ 　ｓｐ、から単離したＤＮＡを鋳型として用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ ’）でプライマーとして使用するために、＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ｓｍｏｄｅｌ　３８０Ａ　ＤＮＡシンセサイザーで、最小の重複性を有する配列 に統合した。制限酵素部位をクローニング用のオリゴヌクレオチドの両端に統合 した。オリゴヌクレオチドの４つの異なる組合わせを５°−又は３′−７ライマ ーとして使用し、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｇｅｎｅ＾■ｐキット）及びＤＮＡサー マルサイクラ−（ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ 　Ｃｅｔｕｓ）を用いてＰＣＲ反応を生起させた。ＤＮＡ産生物を１％アガロー スゲルにかけ、ＰＣＲ反応でＡ　ＣＣＤ−１プライマー（ＡＴＧ領域に対して相 補的な３２−ｍｅｒ＋　ＸｂａＩ部位）及びＡ　ＣＣＤ−３プライマー（３′領 領域列に対して相補的な３２−＋＊ｅｒ＋ＥｅｏＲＩ部位）を用いて約３６０塩 基対のＤＮＡフラグメントを得た。この３６０塩基対フラグメントを旧ｕｅｓｃ ｒｉｐｔベクター（ＳＬｒａｔａｇｅｎｅ。

Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、Ｃ＾）のＥｅｏＲｉＸｂａ１部位に連結してプラスミドｐＣ ＧＮ２３３２を得た。　５ｅｑｕｅｎａｓｅ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　２　Ｅｎｚｙｍ ｅを含む７−Ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ試薬キット（ｌＪｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ 　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅａｌ　Ｃｏｒｐ、。

Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、Ｈ）を用いて、Ｓａｎｇｅｒらのジデオキシ鎖終結方法（ Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、υＳ＾（１９７７）７４：５４６３ −５４６７）によりＡＣＣデアミナーゼフラグメントのＤＮＡ配列を決定した。

分子プログラムＧｅｌ及びＳＥＱのＩｎｔｅｌｌｉＧｅｒ＋ｅｔｉｃｓ　５ｕｉ ｔｅを用いて配列データを分析した。配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９）を第２図 に示す。

一イブー１−のス　１−ニン　ブー−のＥ、ＣｏｌｉＣｏｌｌｉＸＬＩ−Ｂｌｕ ｅ（Ｓｔｒａｔａ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、Ｃ＾）での組換えファージをＮＺＹ（１ リツトｌし当たり５ｇのＮａＣＩ、２ｇの８ｇＣＩ２．１０ｇのＮＺａｍｉｎｅ タイプ＾（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、５ｇの酵母抽出物及び１ ５．の寒天）プレートにブレーティングし、３７℃で一晩インキユベートするこ とにより、ＡＣＣデアミナーゼをコードするＤＮＡについて、６Ｘ１０’個のＥ ｃｏＲｒ／ラムダＺａｐＩＩプラーク形成単位をスクリーニングした１次いで、 プラークをニトロセルロースフィルター上に二組とり、ＤＮＡを変性させ（１， ５８ＮａＣｌ、　０．５８　ＨａＯＩ（）、中和しく３８Ｍａｉｌ、０．５Ｍ　 ）リス−ＨＣｌ、ｐＩ１７．５）、２ＸＳＣＣですすぎ（Ｍａｎｉａｔｉｓら、 　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　１ＬＬａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ （１９８２）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ） 、真空下８０℃で１．５時間加熱した１次いでフィルターをプレハイブリダイゼ ーション溶液（５０％ホルムアミド、２０ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ、０．０２５ Ｍ　ＮａＰＯ，、ｐｌ（６，５，５ｘＳＳＣ５１００，ｕ　ｇ／ｍｌ変性サケ精 液ＤＮＡ、５＊Ｎ　ＥＤＴ＾及び０．１％５ＤＳ）中で４２℃で３時間インキュ ベートした。［コ２Ｐ］ｄＡＴＰ及びコ［２Ｐ］ｄＣＴＰ又は［３２ＰコｄＣＴ Ｐのみを用いて製造業者（ＢＲＬ）の指示に従い３６９ｂｐＡ　ＣＣＤ　Ｄ　Ｎ 　Ａプローブフラグメントを比活性〜１０’ｃｐｍ／μｇまでニックトランスレ ーションし、煮沸し、１０？コデキストラン硫酸を含むプレハイブリダイゼーシ ョン溶液中で４２℃で一晩フイルターにハイブリダイズさせた。次いでフィルタ ーを、ｌ×５ＳＣ１０，１％ＳＯＳ中５０〜５５℃で１５分間の洗浄に４回がけ な。フィルターを乾燥し、増感板を用いて一８０℃でＫｏｄａｋ　ＸＡＲフィル ムに暴露した。前記条件下で５時間暴露した後では、少なくとも６つのプラーク がＡＣＣＤ遺伝子プローブにハイブリダイズしていた。クローンＥ１１を採取し 、放射性プローブを用いて再プローブした。クローンＥｌｌは、製造業者の指示 に従いイムノスクリーニングシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製ＡＣＣＤ に対してウサギ体内で産生じたポリクローナル抗体での再スクリーニングにもか けた。クローンＥｌｌはＡＣＣＤ抗体に対して陽性反応を示した。このクローン をイムノスクリーニングシステムを用いてプラーク精製し、次いでＥ、ｃｏｌｉ 　Ｓｕｒｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、Ｃ＾）中で１ラスミド に変換した。得られたプラスミドをｐＣＧＮ１４７９と命名した。ρＣＧＮ１４ ７９の部分的制限地図を第３図に示す。

ＡＣＣ−アミナーゼ　ローンの　 ρＣＧＮ１４７９の配列決定を行うために、デアミナーゼ遺伝子の３°末端に位 置するＣ１ａｌフラグメントを除去してプラスミドＡＣＣＤ／ＣＬＡを得た。、 Ｈｅ１ｎｋｏｆｆの方法（ヒ旦」洸■−畦（１９８７）　１５５：１５６−１８ ５）に従いＡＣｃＤ／ｃＬＡをＳａｃ　１及びＥｃｏＲ（で消化し、ＥｘｏＥＩ Ｔ／Ｓｌ欠失を生起させた。他方の鎖の配列を決定すべく、ＡＣＣＤ／ＣＬＡを −Ｉ及び山■で消化し、前述のようにＥｘｏｌｌｌ／Ｓｌ欠失を生起させた。こ のような欠失部分を有するグラスミドを、５ａｎｄｈｕらの方法（Ｂｉｏｔｅｅ ｈｎｉ　ｕｅｓ　（１９８９）　ｚ：６８９−６９０）に従いポリメラーゼ連鎖 反応を用いてスクリーニングし、適当な大きさの欠失を選択した。　５ｅｑｕｅ ｎａｓｅ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列決定キットを製造業者（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ 　８ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ　Ｈ）の指示通りに使用して 、選択したクローンの微小予備Ｄ　Ｎ　Ａ　（−ｉｎｉ−ｐｒｅｐ　ＤＮＡ）（ 前出のＭａｎｉａｔｉｓらの方法で単離）の配列決定を行った。

ＡＣＣを　小声　での ＡＣＣを唯一の窒素源として使用する能力について、グラスミドｐＣＧＮ１４Ｂ ７及びｐＣに８１４６８を含むＥ、ｃｏｌｉを検査した。

０．１％ＡＣＣｔ−含ンタ最少培地（８９塩−ＮＦｌ、、０．２％　クルーｔ− ス、１１１ＭＭｇＳ０４．０．１ｍＭ　ＣａＣｌ□、２５ｇｇ／ＩＩＩチアミン 及び２゜ｇ／ｌ純寒天）に形質転換細菌をブレーティングした。

ｐＣ［；Ｎ１４６７及びｐＣにＮ１４６８のいずれがを含むＥ、ｃｏｌｉの増殖 が、ＩＰＴ（、を含む±プロモーターの誘導を伴って又は伴わずに、且つ匡プロ モーターに対するクローンの配向に関係なく観察された。

衷」１九ユ ＾ＣＣデアミナーゼの　４ 堕譚１及葬 プロモーター ｔｅｌ　３’転写終結領域の上流に配向された二重３５５１０モーターと、その 中の適切な制限部位とを有する発現力セラ）−ｐｃＧＮ１４３１を同時係属中の 米国特許出願第０７／３２９，０１８号に記載の方法に基づいて後述する如く製 造し得る。ｐｃＧＮ１４３１は二重カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ） ３５Ｓプロモーターとｔｍｌ　３′領域を含み、これらの間には多数のクローニ ング部位がある。このプロモーター／ターミネータ−カセットはｐ［ｌｃ誘導ベ クターに含まれ、このベクターはクロラムフェニコールに対する耐性を与え、ま た簡単な除去のために多数の制限部位に隣接する領域を含んでいる。

匹迷切り１１ ｐＣＣＮ９８６ハカリフラワーモサイクウイルス３５Ｓ（ＣａＭＶ３５）７０モ ーターとＴ−ＤＮＡ　ｔ＋５ｌ−３’領域を含み、これらの間には多数ノ！１１ 限部位がある。ｐｃＧＮ９８６ハ、ＣａＨＶ３５Ｓ７０　モー　９−ト異なる３ °領域のＣａＭＶ領域ＶＩ３’−末端とを含んでいる他のカセットｐＣＧＮＺＯ ６がら誘導される。　ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを＾ｌｕｌフラグメント（ｂ ｐ　７１４４−７７３４）（Ｇａｒｄｎｅｒ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｎｕｃｌ。

＾ａｉｄｓ　Ｒｅｓ、　（１９８１）　９：２８７１−２８８８）として８１３ ｍｐ７（Ｍｅｓｓｉｎｇ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　（１９８１）　９：３０９ −３２１＞のＨｉｎｃ１１部位内でクローニングして、Ｃ６１４を産生じた。Ｃ ６１４のＥｃｏＲｒ消化物は、３５Ｓプロモーターを含むＣ６１４からＥｃｏＲ ｒフラグメントを産生し、このフラグメントをｐＵＣ８（Ｖｉｅｉｒａａｎｄ　 Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｇｅｎｅ（１９８２）　１９：２５９−２６８）のＥｃｏＲ ｒ部位内で部位−ニングして、ｐｃＧＮ１４７を産生した。

（後述する）　ｐＣ（：Ｎ５２８をＢ、ｌＴＩでダイジェストし、ｐｃＧＮ１４ ７からのＢａ＋＊ＨＩ−Ｂｇｌ　ＩＩプロモーターを挿入して、プロモーター領 域と、選択可能マーカー（２つのＡＴＣを含むカナマイシン）と、３°領域とを 含むｐｃＧＮ１４８ａを製造した。

Ｂｇ１１１部位がカナマイシン遺伝子に隣接するようにこのフラグメントをｐＣ ＧＮ５２８の１３６１１１部位内でクローニングした。

この構築物ｐｃＧＮ５２Ｂで使用するシャトルベクターを以下のように製造する 。カナマイシン遺伝子（Ｊｏｒｇｅｎｅｎ　ｅｔ　ａｔ、。

Ｍａｔ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　（１９７９）　１７７：６５）を有するＴ ｎ５を含んでいるプラスミドをＨｉｎｄｌＩ−ＢａｍＨＩでダイジェストし、カ ナマイシン耐性遺伝子を含むＨｉｎｄｌＴＴ−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＡｃ Ｙｃ１８４（Ｃｈａｎｇ　ａｎｄ　Ｃｏｈｅｎ、　Ｊ、　Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、 　（１９７８）１３４：１１４１−１１５６＞のテトラサイクリン遺伝子のＨｉ ｎｄｒｌｌ−ＢａｍＨＴ部位内に挿入して、ｐｃｃＮ５２５を製造した。Ｓｍａ １部位内に挿入したＸｈｏｌリンカ−で修飾したｐＴｉ＾６（Ｔｈｏｍａｓｈｏ ｗ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ（１９８０）１９ニア２９−７３９）の１９のＢ ａｍ［フラグメントをｐＣＧＮ５２５のＢＩＩ１１旧部位に挿入してｐｃｔｌ： Ｎ５２６を製造した。小さいχｈｏＩフラグメントを欠失させ、再連結して、ｐ ｃＧ８５２８を得た。

ｐＨＢ９ＫａｎＸＸｒがらのＢａｗｆｌｌカナマイシン遺伝子フラグメントをｐ ｃｃ、Ｎ１４８ａのＢａ＋＊ＨＩ部位内でクローニングしてｐｃＧＮ１４９ａを 製造する。ｐＭＢ９ＫａｎＸχ■はｐＵＣ４に変異型（Ｖｉｅｉｒａ　ａｎｄＭ ｅｓｓｉｎｇ、　Ｇｅｎｅ　（１９８２）　１９：２５９−２６１？）であり、 Ｘｂｏｌｌｌｊ位が欠如しているが、Ｔｉ２Ｏ３からの機能性カナマイシン遺伝 子を含んでおり、＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ−の効果的な選択が可能である。

ｐｃＧＮ１４９ａをｆｆ１ｎｄｒｒｌ及びＢａｍｆｌ　Ｉでダイジェストし、Ｈ ｉｎｄｌＴＴ及びＢＪＬＩＩ（Ｉ　テダイシェストしりｐＵＣ８Ｇ：ｌ：連結し て、ｐｃＧＮ１６９を産生する。これでＴｎ９０３カナマイシンマーカーが除去 される。　ｐＣにＮ５６５及びｐｃＧＮ１６９を共にＨｉｎｃｌｌｌｌ及びＰｓ ｔｌでダイジェストし、連結して、ｐｃｃＮ２０３を産生した。これは、ＣａＭ Ｖ３５Ｓプロモーターと、ＴＮ５カナマイシン遺伝子の５゛−末端部分（Ｐｓｔ １部位まで（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、　（１９７９０７７：８５））とを含むプラスミトテある、Ｈｉｎ ｃｌｒｌＩ及びＰｓｔｒでダイジェストし、連結して、ｐＵｃ１８（Ｇａｒｄｎ ｅｒ、　ｅｔ　Ａ＋、、　Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　（１９８１）９： ２８７１−２８８８）内でクローニングした領域ＶＩ３’を含んでいるｐｃＧＮ ２０４　（ＣａＭＶのＥｃｏＲＩフラグメント（ｂｐ　４０８−６１０５））か らのρＣＣＮ２０３に３°調節領域を加えた。得られたカセットｐｃｔ；Ｎ２０ ６はｐｃＧＮ９８６構築の基本であった。

ｐＴｉ＾６　Ｔ−ＤＮＡ　ｔｍｌ　３’−配列をＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグ メント（ヌクレオチド９０８２〜１２，８２３、（Ｂａｒｋｅｒ、　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　（１９８３）２：３３５−３５０）に記載の如く番号付け）として Ｂａｍ１９　Ｔ−ＤＮＡフラグメント（Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ、　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｃｅ１ｌ（１９８０）１９　ニア２９−７３９）からサブクローニングし、Ｅ ｃｏＲＩ−ＨｉｎｄｌＩフラグメントとしての複製源ｐＡｃＹｃ１８４（Ｃｈａ ｎＢ　ａｎｄ　Ｃｏｈｅｎ、　Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　（１９７８）１３４：１１４１−１１５６）及びＢａｍ ＨＩ−Ｈｉ’ｎｄｌｌフラグメントとしてのゲンタマイシン耐性マーカーと組み 合わせて、ｐｃＧＮ４１７を産生する。

リンカ−を使用して、ｐｃｔ、Ｎ４１７のユニークＳｍａ　Ｉ部位（Ｂａｍ１９ フラグメントのヌクレオチド１１，２０７）をＳａｃ１部位に変え、Ｂａａ＋Ｈ ＩＳａｃｌフラグメントをｐＣに８５６５内でサブクローニングして、ｐＣにＮ ９７１を得た。　Ｉ）ＣＧＮ５６５は、ｐＵＣ８−Ｃｍ（Ｋ。

Ｂｕｃｋｌｅｙ、　Ｐｈ、　Ｄ、　Ｔｈｅｓｉｓ、　ＵＣＳａｎ　Ｄｉｅ８ｏ　 １９８５）に基づくが、ｐＵｃ１８（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｇｅｎｅ（１９８５）５３：１０３−１１９）が）　らのポリリンカー を含んでいるクローニングベクターである。　リンカ−を使用して、ｐｃＧＮ９ ７１のＢａｔｓＨ１部位をＥｃｏ８１部位に変えて、ｐｃｃＮ９７１Ｅを産生し た。　ＥｅｏＲＩ及びＳａｃ　Ｉでダイジェストすることによって、　ｔｍｌ　 ３’調節配列を含んでいるｐｃＧＮ９７１ＥのＥｃｏＲｒ−Ｓａｅｆフラグメン トをｐｃＧＮ２０８に結合しズ　て、ｐｃＧＮ９７５を産生した。　５ａｌｔ及 びＢｇｌｒＩでダイジェストし、末端をプラントし、５ａｉｌリンカ−で連結し て、少部分のＴｎ５カナマイシン耐性遺伝子をＣａＮｖ３５Ｓプロモーターの３ °−末端から欠失させり、ｉ！に終発現カセットｐＣにＮ９８６？、ｔＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを含み、それに続いて２つの５ａｌｔ部位、Ｘｂａ　ｒ部位 、Ｂａ＋＊［ｆｆ部位、５ｅｔ１部位、ＫｐｎＩ部位及びｔｍｌ　３°領域（Ｔ −ＤＮＡのヌクレオチド１１２０７−９０２３）を含んでいた。

６郊」ｌΔ盪月 ＾ｌｕＩでダイジェストしてＣａＮＶの＾Ｉｕｌフラグメント（ｂｐ７１４４− ７７３５）（Ｇａｒｄｎｅｒ、　ｅｔ　ａｔ、、　（１９８１）前記参照）を製 造し、このフラグメントをＭ１３ｍｐ７（Ｖｉｅｉｒａ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎ ｇ。

（１９８２）前記参照）の旧ｎｃ１１部位内でクローニングして、Ｃ６１４を産 生する。　Ｃ６１４のＥｃｏＲＩ消化物は、３５Ｓプロモーターを含んでいるＣ ６１４からＥｃｏＲＩフラグメントを産生したにのフラグメントをｐｌＪｃ８（ Ｖｉｅｉｒａ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　（１９８２）前記参照）のＥｃｏＲ １部位内で部位−ニングして、ｐｃＧＮ１４６を産生した。プロモーター領域を 切断するために、Ｂｇ１１１部位（ｂｐ７６７０）をＢｇｌ及びＢａ１３１で処 理し、そのｆ＊Ｂｇ目Ｉリンカ−をＢａ１３１処理したＤＮＡに付着させて、ｐ ｃＧＮ１４７を産生した。

ｐＣ［；Ｎ１４７をＥｃｏＲＩ及び１（ｐｈ　Ｉでダイジェストして、３５Ｓプ ロモーターを含んでいる得られたＥｃｏＲＩ−ｆｆｐｈｒフラグメントを、Ｅｃ ｏＲＩ−ＳｍａｌｌでダイジェストしたＭ１３ｓｐ８（Ｖｉｅｉｒａ　ａｎｄＭ ｅｓｓｉｎｇ、　（１９８２）前記参照）内で連結して、ｐＣにＮ１６４を産生 じた。

延びμ追Δ徂Ｉ ＣａＮＶｌｏ（Ｇａｒｃｌｎｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｅｌ、＾ｅｉｄｓ　 Ｒｅｓ、　（１９８１）９：２８７１−２８８８）のＢｇｌｌＴ消化物は、３５ Ｓプロモーター領域を含むＢｇＩ１１フラグメント（ｂ９６４９３−７６７０） を産生じ、これをｐＵｃ１９（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎ ｅ（１９８３）２８：１０１−１０６）のＢａｍＨＩ部位内で連結して、ｐｃｃ Ｎ６３８を産生した。

匹堕旦旦五Ｊ１ ｐｃＧＮ１６４をＥｃｏＲＶ及びＢａ論［でダイジェストして、３５Ｓプロモー ターの一部分（ｂｐ７３４０−７４３３）を含んでいるＥｅｏＲＶ−ＢａＩＩ旧 フラグメントを遊離した。　ｐＣＧＮ６３８をＦｌｉｎｄｌｌＩ及びＥｅｏＲＶ でダイジェストして、３５Ｓプロモーターの異なる部分（ｂｐ６４９３−７３４ ０＞を含んでいる１（ｉｎｄｌｒｌ−ＥｃｏＲＶフラグメントを遊離した。　Ｈ ｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩでダイジェストしたｐＣＧＮ９８６内でこれら２つ のフラグメントを連結して、３５Ｓプロモーターを含むＨｉｎｃｌｌｌＩ−Ｂａ …ｌ（Ｉフラグメントを除去した。この連結によってｐＣＧＮ６３９が産生した 。このｐＣＣ：Ｎ６３９はＤＣＧＮ９８Ｂからのバックボーン及びｔｍｌ−３’ 領域と、ｐｃｃＮ１６４．ｐｃｃＮ６３８からの２個の３５Ｓプロモーターフラ グメントとを含んでいた。

、ＣにＮ６３８をＥｃｏＲＶ及びＤｄｅｌでダイジェストして、３５Ｓプロモー ターの７ラグメント（ｂｐ７０７０−７３４０）牙遊離した。このフラグメント をＤＮＡポリメラーゼエのフレノウフラグメントで処理して、プラント末端を産 生じ、またｐＣにＮ６３９のＥｃｏＲＶ部位内で連結して、フラグメントを適切 な配向で有するｐｃｃ：Ｎ２１１３を産生した。

匹堕貝旦五１】 プロモーター−ポリリンカー−３′の全カゼ・ｌトを含んでいたｐｃＧＮ２１１ ３の鎮Ｉ−腟Ｒ１断片を、江月−膿Ｒ１消化によって除去し、　Ｓａｌ　Ｉ　− ＥｃｏＲ１消化したｐｃＧＮ５６５にクローニングしてｐｃＧＮＺ１２０を作製 した。　ｐｃＧＮ２１２０を匡Ｉで完全消化し、次に再結合させた。３′末端領 域から８５８ｂｐのＰｓｔ　ｌ　−Ｐｓｔ　（断片（９２０７〜１００６５、Ｂ ａｒｋｅｒら、（１９８３）、証正）だけが欠失したクローンを選択してｐＣに ８１４３１を作製した。

ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子をｐｃＧＮ１４３１に挿入し得る適当な制限部位を調 製するために、ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子の５′末端及び３′末端に相補的なオ リゴヌクレオチドを、＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３８０＾の ＤＮＡシンセサイザー（＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｓｓ　；　Ｆｏｓｔ ｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ　）によって合成した。第１のオリゴヌクレオチドは図 ２に示すようにデアミナーゼ配列の６９２〜６７２ｂｐに相補的であり、更に５ ′末端にＢａｍＦＩ　１部位を有している。第２のオリゴヌクレオチドは、ＡＣ Ｃデアミナーゼ構造道伝遺伝子６１５〜１６３５ｂＰに相補的な配列から成り、 更に、５′末端にＳｓｔ　ｌ制限部位を有している。上記オリゴヌクレオチドを プライマーとして用い、ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子を含むＤＮＡを鋳型として用 い、製造業者（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　；Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌ ｅ、　ＣＡ　）の指示に従ってＰＣＲ反応を行なうと、販す１部位とＡＣＣデア ミナーゼコーディング領域と鋤１部位とを含む断片がＰＣＲ反応生成物として得 られるであろう。この断片は、Ｂａｗｌ　Ｉ及び５ｓｔｌによる消化、及び、Ｂ ａｍＨＩ　−Ｓｓｔ　Ｉ消化したｐｃＧＮ１４３１へのクローニングに好適、ブ ロモ−−ＤＮＡ ２＾１１の３′転写末端領域の上流に配向された２＾１１プロモーターを有し、 その間に適当な制限部位を有している発現カセットｐｃＧＮ１２４０は、同時係 属出願である米国特許出願第０７１５５５．７１１号の教示に従って調製できる 。　ｐｃＧＮＩＺ４０は、２＾１１の３．８　ｋ　ｂの５′非コーディング配列 と２＾１１の２ｋｂの３′非コーディング配列とを含み、その間に多数のクロー ニング領域が存在する。カセットの５′末端側に酵素…Ｉ、跡１、ＤｒａＩ［、 珈Ｉ、塚Ｉ、Ｈｉ昶■及び膿ＲＩの制限部位が存在し、３′末端側に酵素上述Ｉ 　、　ＬＬＩＩ　Ｉ、Ｎｏｔ　Ｉ　、Ｓａｃ　Ｕ　、ＢｓｔＵ及びＳａｃ　Ｉの 制限部位が存在している。

主鎖は、クロラムフェニコール耐性を与える領域を含む。

ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子をｐＣ（８１２４０に挿入し得る適当な制限部位を調 製するために、ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子の５′末端及び３′末端に相補的なオ リゴヌクレオチドを、＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３８０Ａの ＤＮＡシンセサイザー（＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　；　Ｆｏｓｔ ｅｒ　Ｃ１ｔｙ、ＣＡ　）によって合成した。第１のオリゴヌクレオチドは図２ に示すようにデアミナーゼ配列（配列番号　９）の６９２〜６７２ｂｐに相補的 であり、更に５′末端にＢａｍＨＩ部位を有している。

第２のオリゴヌクレオチドは、ＡＣＣデアミナーゼ構造遺伝子の１６１５〜１６ ３５ｂｐに相補的な配列から成り、更に、５′末端にＰｓｔｌ制限部位を有して いる。上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ＡＣＣデアミナーゼ遺 伝子を含むＤＮＡを鋳型として用い、製造業者（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｓｅｒ　Ｃ ｅｔｕｓ　；　Ｅ＋＊ｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ　）の指示に従ってＰＣＲ反応を 行なうと−Ｂａ＋Ｊ（部位とＡＣＣデアミナーゼコーディング領域とＰｓｔ　１ 部位とを含む断片がＰＣＲ反応生成物として得られるであろう、この断片は、Ｂ ａｍｆｌ　Ｉ及び注口による消化、及び、Ｂａｗ■Ｉ　Ｓｓｔ　Ｉ消化したｐＣ ＧＮ１２４０へのクローニングに好適である。

ニーベクターの 発現カセットを夫々構築し、該カセットをｐｃＧＮ１５４７　（後述）のような 適当な二元ベクターに入れるとよい１例えば、上記の３５Ｓ　ＣａＭＶ構成的プ ロモーターカセットを匡Ｉで消化し、二重の３５５−５”／ＡＣＣデアミナーゼ ／３′末端領域を含む断片を、Ｐｓｔ　Ｉ消化したｐｃＧＮ１５４７に結合させ る。更に、追加の実施例としては、上記の果実特異的プロモーターカセットをＥ ｃｏＲｌで消化し、２Ａ１１−５′／ＡＣＣデアミナーゼ／２Ａ１１−３′を含 む断片を、■Ｒｉ消化したｐｃＧＮ１５４７に結合させる。これらの結合の結果 として、紐皿り坦ｅｒｉｕｍ±Ｖ吐旺亘胚に導入するための適当な二元ベクター が得られる。

ｐＣに８１５４７　（ＭｃＢｒｉｄｅ　＆　Ｓｕｍｍｅｒｆｅｌｔ、Ｐｌａｎｔ 　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ。

（１９９０）　１４（２７）　：２６９〜２７６）は、同時係属出願である米国 特許出願第０７／　４９４　、７２２号の教示に従って調製し得る。

ｐｃＧＮ１５４７は、蝕三肋じ旦６！Ｌ廊ｍｅｆａ二恒匣オクトビンＴｉ　−５ ｅｈ　＆　Ｂｅｒｉｎｇｅｒ、　Ｐｌａｓｍｉｄ　（１９８４）　９：　２Ｂ７ １〜２８９０）のゲンタマイシン耐性遺伝子、ｐＬＪｂＢｌｌ　（Ｊｏｕａｎｉ ｎら、Ｍｏ１．Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、　（１９８５）　２（す、：　３７０〜３７４）に由来の＾ｒｏｂ ａｃｔｅｒｉｕｍ７　Ｒｉプラスミドの複製起点、Ｔｎ５　（Ｊｏｒｇｅｎｓｅ ｎら、阿ｏ１．Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　（１９７９）　１７７：　８５）のカ ナマイシン耐性遺伝子を伴うｐＴｉ＾６のｗａｓプロモーター領域及びｍａｓ３ ’領域、ｐＢＲ３２Ｚ　（Ｂｏｌ　１ｖａｒら、Ｇｅｎｅ　（１９７１）　２　 ：　９５〜１３３　）に由来のＣｏ１Ｅ１複製起点、及び、ｐＵｃ１８　（Ｎｏ ｒｒａｎｄｅｒら、Ｇｅｎｅ（１９８３）　２６：１０１〜１０６）に由来の１ ａｃＺ”スクリーニング可能なマーカー遺伝子を含むＭ物形質転換用二元ベクタ ーである。

＾ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｎ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓへの二−ベ　−のＨｏ１ｓ ｔｅｒｓ他によって、Ｎｏ１．ｌｌ：ｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　（１９７８）　１６ 針１８１〜１８７に記載された方法を使用して、二元ベクターをｕ匹−ｂａｃｔ ｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌ＬＡＢ４４０４株（Ｈｏｒｓｃｈら、Ｓ ｃ　１ｅｎｃｅ（１９８５）　に：　１２２９〜１２３１）に導入し得る６次い で、形質転換された紐匹り処μ山□±２吐□匡ユを、トランスジェニック植物を 再分化させるための適当な宿主植物組織に感染させる。

ｍユ ベ　ユニ　多 ＭＳ塩（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　＆　５ｋｏｏＨ，ｕ夏ｊ主ｏｆ、ヱ土課口、、（ １９６２）１５　：　４７３〜４９８）　、Ｂ　５ビタミン（にａｍｂｏｒＨら 、旺り販ユ」ｅｓ、　（１９６８）　５０　：　１４Ｅｌ−１５１）　、０．７ ％植物寒天（ｐｈｙｔａｇａｒ）、３　％　ｙ　ｘｉ　ｌ、０　、１　ｍｇ／ｌ ノ＋　７９　！Ｊ　’、ｙ酢酸、１−０ｍｇ／ｌのベンジルアデニンと共に固体 培地を含むフィーダープレートを調製し、プレートの表面に０．５１の７日齢の タバコ細胞懸濁液を塗布する。プレートを集め、弱照明下（はぼ３０ｒｎＥｔａ −２５す）に置く、約２４時間後、滅菌した１号ＷｈａｔｍａｎＰ紙（Ｗｈａｔ ｍａｎ　Ｌｔｄ、、Ｍａｉｄｓｅｏｎｅ、　Ｅｎｇｌａｎｄ）をフィーダープレ ート培地に載せる。２５℃の育成室において、照明下に１６時間／暗黒中に８時 間、光量２１５Ｕε「２５りで育成した４〜１２週齢のＮ１ｔｃｈｅｌｔペチユ ニア植物の葉を採集し。

水中実験室に移し、７０％エタノールに４５秒間、５０％（ｖ　／　ｖ　）漂白 剤に４５秒秒間状浸漬し、滅菌水で３回濯ぐことによって表面滅菌する。滅菌し た葉を次に、はぼ５〜１０ｍｍＸ５〜１０ｍｍ長さの外植体に裁断し、フィルタ ーと共にフィーダープレートにプレートし、暗黒中または弱照明下に２４℃で２ ４時閉インキュベートする。

１００＋＊ｇ／ｌの硫酸ゲンタマイシンと１００ｍｇ／Ｉの硫酸ストレプトマイ シンとを含む固体ＡＢｊ！ｌ小培地（ＨａＬｓｏｎら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ 、（１９７５）　１２３：２５５〜２８４）でｆ上りを４〜５日間増殖させる。

単個コロニーを５−１のＭＧ／Ｌブイヨン（５０％のルリアブイヨンと５０％の マンニトール−グルタミン酸塩培地（Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ　＆　Ｎｅ５ｔｅｒ、 Ｊ、Ｂａｃｔｅ−Ｌ辷１ユ（１９８０）　出ニア３２〜７４３）に接種し、同時 栽培する前に３０℃及び１８０Ｒ，Ｐ、Ｍ、のｇｍ機で一夜インキユベートする 。

プレインキュベーシュン期間後に、外植体を５．０×３．０’、１ｌｊｌ胞７　 ｍ　ｌのａ閉息濁液に約３分間浸漬し、滅菌した紙タオルにプロットし、同じプ レートに再プレートする。

４８時間後に、上記と同じプレート培地（但しフィーダー細胞及びフィルターを 含まない）に３００ｍｇ／Ｉのカナマイシンを加え、更に３５０ｎ＋ｇ／Ｉのセ フォタキシム丈たは５００ｍｇ／Ｉのカルベニシリンを加えた選択培地に外植体 を載せる。２週間毎に外植体を新しい培地に移す。２週間目の移植のときに培地 のカナマイシンレベルを３００ｍｇ／Ｉがら１００ｍｇ／ｌに減らし、その後こ のレベルに維持する。同時栽培後約４週目の始めに苗条を収穫し、ＭＳ塩、Ｂ５ ビタミン、０．７％バクトアガール、３％ショ糖、ＩＢ／Ｉのインドール−３− 酪酸、１００ｍｇ／ｌのカナマイシン、及び、２００ｍｇ／ｌのセフォタキシム または３５０ｍｇ／Ｉのカルベニシリンを含む発根用培地のプレートに入れる。

苗条は約２週間で発根する０次にこれを土に移植し、育成室に置く。

全ｉｎ　ｖｉｔｒｏ組織を２４〜２８℃で、照明下に１６６時間暗黒中に８時間 、光量８０〜１００μＥ＋１−２Ｓ−’で育成する。

育成室の植物は６〜８週間で開花し、人工授粉の８〜１２週後に種子が得られる 。トランスジェニック植物から同時栽培開始の１４〜１８週後に種子が得られる 。

実施例４ に　ＧるへＣＣ−アミナーゼ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種＾ｃｐ由来の＾ＣＣデアミナーゼを使用して、植物に 於けるへＣＣデアミナーゼの発現に関するプラスミドベクターを構築した。ΔＣ Ｃデアミナーゼを、電気穿孔したタバコプロトプラスト及び形質転換したペチュ ニア葉で免疫学的に検出した。形質転換した植物組織の抽出物中に、へＣＣデア ミナーゼ活性があった。形質転換体の一つからのｆｆ１ｌ！は、ｉｎ　ｖｉｔｒ ｏ分析で＾ＣＣをエチレンに転換しにくかった。

１１べ又ヱ二 発現カセット、ｇｃＧＮ２１８７を、ｐｃＧＮ１４３１のＥｅｏＲＶ−Ｂａ＋＊ ＨＩフラグメントを除去しく実施ＰＡ２参照）　、ｐＣＧＮ９８６のＥｃｏＲＶ −む１虹フラグメントと置き換えて（実施例２参照）　＋　ｐｃＧＮ１４３１に ある２ｂｐの代わりにｍＲＮ＾キャップ部位に対し未翻訳のリーダー配列の１１ ２ｂ、を有する「二重」の３５５プロモーターを産生じた。へ〇Ｃデアミナーゼ 遺伝子のＢａｍ）ＩＩ−５ａｃｌフラグメント（ＩＩｃに８１４３１への挿入に 関して記載の如（ＰＣＢにより製造）をｐｃＧＮ２１８７に挿入してｐｃＧＮ１ ４９２を製造した。ｐｃｃＮ１４９２を以下に記載の如くタバコプロトプラスト に電気穿孔しり、　ｐｃＧＮ１４９２由来ノｒ’５１１７ラグメントをｐｃＧＮ １５４７１．：挿入して二元のベクターｐＣにＮ１４９３を製造した。　ｐｃＧ Ｎ１鴫９３を使用して実施例３に記載の如くペチュニアを形質転換した。

（λ見工エニ１ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　Ｌａｂａｅｃｕｍ（Ｘａｎｔｈｉ）のプロトプラストドナ ー植物を、Ｆａｃｃｉｏｔｔｉ及びＰｉｌｅｔ　［Ｆａｃｅｉｏｔｔｉ、Ｄ、及 びＰｉｌｅｔ、Ｐ、Ｅ。

Ｐｌ、Ｓｃｉ、Ｌｅｔ、　（１９７９）　１５Ｊ］による記載の如く無菌条件下 ガラスジャー内で成長させた。先端の新芽をＭＳ塩、３０ｔｔ／１蔗糖、１．Ｏ ｚｙ／４　Ｉ＾＾及びＯ，Ｌ５ｘｇ／ｌカイネチン（ｐＨ５，５５）を含む０． ７＄　ｐｈｙｔａｇａｒ培地１００ｚｊ！に設置した。Ｘａｎｔｈｉ培養物を１ ２時間の暗／明しジメ下で２３±３℃で成長させた。

暗サイクル時、３〜４週齢の植物から若い葉を選択した。

葉の部分を、０．０４＄ペクチナーゼ（Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ　Ｙ−２３，５ｅ ｉｓｈｉｎＰｈａｒ＋＊ａｃｅｕｔｉｅａｌ　Ｃｏ、、Ｌｔｄ、、Ｊａｐａｎ） 、０．４５＄セルラーゼ（Ｏｎｏｚｕｋａ　ＲＳ、Ｙａｋｕｌｔ　Ｐｈａｒｍａ ｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ　Ｃｏ、、Ｊａｐａｎ）及び０．５ｇデキ ストラン硫酸カリウム（ｐＨ５，５５）を含む６ｚソルビトール溶液に３０ミリ トールで真空浸潤させた。

植物物質を、５０ｒｐｍで緩やかに振蕩して３〜４時間消化させた。解離物（＋ ａｃｅｒａｔｅ）を５２μ輸メツシユナイロンスクリーンを通過させることによ り、プロトプラストを破片から分離した。プロトプラストを１５０Ｘ、で５分間 遠心分離することによりベレット化し、１ｉＭ　ＣａＣｊ！及び１０ｍＭ　ｈｅ ｐｅｓを含む７ｚソルビトール溶液を使用して３回洗浄した。プロトプラストを 密度２〜３ｘｌＯ’で、６ｚソルビトール、１０ｍＮｈｅｐｅｓ、１４０Ｊ　Ｎ ａＣｊ！、５−ＭＣａｌＪ（ｐＨ７，１）及び濃度１７５μｇ／ｚｌのキャリヤ ＤＮＡ（ρ［１Ｃ１９またはサケ精液ＤＮＡ）を含む電気穿孔Ｍ衝液に懸濁させ た。

Ｐｏｔｔｅｒら［Ｐｏｔｔｅｒ、Ｈ，Ｊｅｉｒ、Ｌ及びＬｅｄｅｒ、Ｐ、、　Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

＾ｅａｄ、ｓｅｉ、　ＵＳ＾、（１９８４）８１　：　７１８１−７１６５］の 記載の如く電気穿孔キュベツト中で電気穿孔を実施した。適当なプラスミドＤＮ Ａを電気穿孔緩衝液中のプロトプラストの１ｚ１アリコートに添加し、次いで１ ２５０ｕｆキヤパシターからシングルパルス６００Ｖ／ＣＩが放電されている電 気穿孔キュベツトに移した。電気穿孔後、プロトプラストをＭＳ塩、３０ｇ／ｌ 蔗糖、０．６ｍｇ７Ｉ　Ｎ＾＾、Ｏ，Ｚｚｇ／ｌ　２，４−Ｄ、　０．８ｘｇｌ ｅカイネチン及び５．５ｚソルビトールを含む培地９ｗｌに移し、光なしで２５ ℃４８時間インキュベートさせた。５０Ｘｇで８分間遠心分離することによりサ ンプルを収穫した。上清を捨て、ベレットを液体窒素中で冷凍し、分析するまで 一７０℃で貯蔵した。

ウェス　ンプロット 電気穿孔したタバコ細胞または形質転換したペチュニア葉細胞のサンプルを液体 窒素中で凍結し、凍結粉砕した。

サンプルｗＬ衝液［２Ｘ　、Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｎａｔｕｒｅ（１９７０）２２ ７：６８０−６８５］を１００℃に加熱し、粉砕サンプルに添加し、次いで少な くとも５分間沸騰水浴中でインキュベーションした。サンプルを１０１ポリアク リルアミドゲルに充填し、電気泳動（Ｌａｅｍｍｌｉ）により分割した。蛋白質 をニトロセルロース上に電気プロットし、＾ＣＣＤ抗体（実施例１参照）と反応 させた。＾ＣＣＤは、業者（Ｐｒｏｍｅｇａ；ＭａｄｉｓｏｎＪＩ）により記載 の如くアルカリ性ホスファターゼ免疫スクリーニングシステムにより識別した。

ｐＣ［、Ｎ１４９２をタバコプロトプラストに電気穿孔すると、免疫検出により 視覚化した際に八ＣＣＤに対して予想された大きさの蛋白質バンド（約３６ｋＤ ａ）となった、八ＣＣＤに対応する蛋白質バンドも、形質転換細胞１４９３−１ １を含むｐｃＧＮ１４９３で形質転換したペチュニア葉抽出物中に検出された。

ｌ聚上上 形質転換したペチュニア組織を、グラウンドグラスホモジナイザー中、不溶性ポ リビニルポリピロリドン（“ｐｖｐｐ“）の０．５１ｘ／ｇｗ植物組織を含む１ ００ｍＭ　Ｂ１５−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６，５）、５＋ａＭＥＤＴ＾、１０ｍＭ　Ｂ ＭＥ及び１０μＨロイペプチンの４容量でホモジナイズした。ｐｖｐｐ及び不溶 性１ｆ物物質を、マイクロヒュージ中遠心分離により除去した。粉末化硫酸アン モニウム（上清の０．１３７ｇｚ／ｚＩりを溶液と混合し、次いで氷上で１．５ 時間インキュベートした。沈澱した物質を遠心分離により除去し、追加の硫酸ア ンモニウム（上清０．１ｈａ７ｘ１）を添加し、氷上で一晩インキユベートした 。ベレットを遠心分離により回収し、１００ｍＭ　ＫＰＯ，（ｐＨ７，５＞、１ ｍＭ　ＥＤＴ＾、１　ｍＮ　ＢＭＥ及び１μＭロイペプチンの１５０μｌ中に再 懸濁させ、ロイペプチンを含まない同一＃１１衝液で透析した。

へＣＣデアミナーゼ活性を、へＣＣ由来のα−ケトブチレートを集積することに より測定した。α−ケトブチレートの測定は、Ｈ，Ｋａｔｓｕｋｉ、　Ｔ、Ｙｏ ｓｈｉｄａ、Ｃ，Ｔａｎｅｇａｓｈｉ＋＊ａ及びＳ、Ｔａｎｋａ［＾ｎａ１．Ｂ ｉｏｃｈｅ＋＊、（１９７１）４３：３４９−３５６コの方法を、反応が１００ ｍＨＴｒｉｓ（ｐ）１８．５）、５０ｍＭ八ＣＣへび蛋白質抽出物を最終容量０ ．１〜０．２ｘ１で含むように変形して使用した。３０℃でインキュベーション 後、メタノール中の飽和ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＩ’ｌ）の等容量 と０−１ｚｊ！ＤＮＰＨ当たり濃１（Ｃ１１０μｌを添加し、５０℃で３０分間 インキュベーションした。　０．２ｘｌ容量当たりＳＯＳメタノール中１０＄Ｋ Ｏｆｆ４　ｗｅを添加し、４８０ｎｍ４．：於ける吸光度とα−テクトブチレー ト濃度尺度として測定した。

あるいは、＾ＣＣデアミナーゼ活性を、以下の方法に従って測定してもよい。

形質転換したペチュニア葉組織を、液体窒素中で凍結し、粉末に粉砕し、２００ ｍＮＴｒｉｓ（ｐＨ８，５）、２−ＭＥＤＴ＾、１．５ｚ不溶性ＰＶＰＰ、１ｎ Ｍβ−メルカプトエタノール、２μｇ７ｘ１０イベブチン、２００．Ｍフェニル メチルスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ）及び６．Ｆｈｇ／ｘｌジエチルジチオカ ルバメートの等容量で抽出した。不溶性物質を遠心分離により除去し、透明な抽 出物９８μｉを８〜１６ｎＣｉ［”　Ｃ］ＡＣＣを含む５０ｎＭ　１−アミノシ クロプロパン−１−カルボキシレート（八ＣＣ）の最終混合物に添加した。

反応を３０℃で１時間インキュベートし、次いでＡＣＣを吸着するがα−ケトブ チレートは吸着しないＤｏｗｅｘ−５０１１１＜水素型）のカラムを通過させた 。カラムを１０ＩａＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８，０＞１００μｍで洗浄し、溶離液を プールし、液体シンチレーションカウンターを使用して放射活性を測定した。活 性は、反応中に形成し且つカラムから放出した放射性α−ケトブチレートの量と して測定した。

円板型の葉をコルクボーダーを使用して裁断し、計量し、２００μ！水と一緒に ４ｘｌバイアル中に設置した。サンプルを真空デシケータ−内に設置し、５分間 脱気した。バイアルをゴム製隔壁を含むキャップでシールした。室温でさらにイ ンキュベーション後、サンプルをシリンジで取り出し、エチレンを測定するため にフレームイオン化ガスクロマトグラフに注入した。

へ〇〇デアミナーゼ活性の証拠は、１４９３−１１からの抽出物中に観察された が、ｇｕｓマーカー遺伝子で形質転換した対照の植物組織中には知見されなかっ た。

；土に之１１ 形質転換したペチュニア植物の葉サンプルを、ネオプレン製隔壁でシールした４ ｚ１バイアル中の１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐ）１８．０）、１０μＭ　ＡＣＣの溶 液中でインキュベートした。インキュベーション後、アルミナカラムを備えたガ スクロマトグラフフレームイオン化検出システム中に１ｉ＋１ガスサンプルを注 入した。エチレンのピークを識別し、一連のエチレン標準量を注入することによ り定量した。　１４９３−１１由来の葉組織は、対照植物組織と比較してＡＣＣ をエチレンにそれほど転化しなかった。

上記の結果は、八ＣＣＤをコードするＤＮＡ配列を識別し、配列を隔離し且つこ れらを操作し、配列を転移する能力、つまり、ＰｓｅｕｃｌｏｍｏｎａｓからＥ 、ｃｏｌｉに八ｃｃを代謝させる能力を示している。これらの配列から、当該植 物組織中でエチレン生合成前駆体を代謝させる酵素（例えば、八〇ＣＤ）を発現 させる発現カセットを産生じ得る。従って、特定の植物部分のエチレン濃度は、 発現カセット中に酵素（例えば、＾ＣＣデアミナーゼ）の分化した細胞を産生さ せ得る誘導制御配列を含むことにより変えられる。従って、特定の植物部分のエ チレン濃度は、植物に悪影響を与えることなく変えることができる０作用を受け た植物部分は、後に、特に外因性エチレンの適用時にエチレンの作用に応答でき るようになっている。

本明細書中に記載した総ての文献及び特許出願は、当業者のレベルで表されてい る。本明細書中に含まれる総ての文献及び特許出願は、個々の文献または特許出 願が参照として含まれるということが記載されている場合、参照として含まれる 。

本発明を完全に記載したが、当業者には、付記請求項の趣旨及び範囲を逸脱する ことなく変形し得ることが明らかである。

配列リスト （１）一般情報： （ｉ＞出願人：　５ｈａｎｋ　Ｆａ　Ｙａｎ）１１１ｉ１１ｉａｎ　Ｒ，旧ａｔ ｔ （ｉｉ）発明の名称：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ　 ＦｏｒＭｏｄｕｌａｔｉｎｇ　Ｅｔｈｙｌｅｎｅ　Ｌｅｖｅｌｓ　ＩｎＰｌａｎ ｔ　Ｔｉ５ｓｕｅｓ （ｉＴｉ）配列の数：９ （ｉｖ）該当する住所： （＾）住所：　Ｃａｌｇｅｎｅ、ｆｏｅ。

（Ｂ）通り：　１９２０　Ｆｉｆｔｈ　５ｔｒｅｅｔ（Ｃ）市：　Ｄａｖｉｓ （Ｄ）州二Ｃ＾ （Ｅ）国：ｕＳ＾ （Ｆ）郵便番号：　９５６１６ （ｖ）コンピューター読取形： （＾）媒介型：　Ｄｉｓｋｅｔｔｅ、　３．５０インチ、　１．０ＭＢ（Ｂ）コ ンピューター：＾ｐｐｌｅ　Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ（Ｃ）操作システム：　Ｍａｃ ｉｎｔｏｓｈ　６．０（Ｄ）ソフトウェア：　Ｍｉｅｒｏｓｏｆｔ　Ｗｏｒｄ　 ４．０（ｖｉ）現出願データ： （＾）出願番号：未指定 （Ｂ）出原日： （Ｃ）分類： （ｖｉ）先出願データ： （＾）出願番号：　ＵＳＳＮ　０７１５１４，０２９（Ｂ）出願日：　１９９０ 年４月２６日（帽）出願人／エージェント情報： （＾）名前：　Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ　Ｌａ５ｓｅｎ（Ｂ）登録番号：　３１，８ ４５ （＾）名前：　Ｄｏｎｎａ　Ｅ、５ｃｈｅｒｅｒ（Ｂ）登録番号：　Ｐ−３４， ７１９ （Ｃ）参照／処理番号：　Ｃ（：ＮＥ　６７−Ｉ　ＭＯ（ｉｘ）遠距離通信情報 ： （＾）電話：　９１６−７５３−６３１３（Ｂ）ファックス：　９１６−７５３ −１５１０（２）ＳＥｏ　１０　ＮＯ：１の情報 （ｉ）配列の特徴： （＾）長さ＝８アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直顕状 （ｉｉ）配列の種顕：ペプチド （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＴＤ　ＮＯ＋１：Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　 Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ＾ｒｇ　８（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋２の情報 （ｉ）配列の特徴： （＾）長さ＝８アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：之：Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　 Ｖｉｌ＾ｓｎ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　８（２）ＳＥｏ　１０　ＮＯ：３の情報 （ｉ）配列の特徴： く＾）長さ：８アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （Ｘｌ）配列：　ＳＥｏ　１０　ＮＯ：３：Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　 Ｉｌｅ　Ｇｌｎ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　８（２）ＳＥＱ　ｒＤ−ＮＯ：４　ノ情報（ ｉ）配列の特徴： （＾）長さ；７アミノ酸 ＜Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：４：Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　 Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　７（２）ＳＥｏ　１０　ＮＯ：５の情報 （ｉ）配列の特徴： （＾）長さ＝３２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数、−重鎖 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉｉ＞配列の種類：他の核酸 （ｘｉ）配列＋　ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：５：ＣＧＴ八ＴへＴＡＧＡ　ＴＧ＾＾Ｙ ＹＴＮＣＡ　ＲＭＧＮＴＴＹＣＣＮ　ＭＧ　３２（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６ の情報 （ｉ）配列の特徴： （＾）長さ：３４塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：他の核酸 （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６：ＧＣＡＴＧＴＣ［ｌ；ＡＣＡＲＧＡ Ｒ＾＾ＹＴに　ＧＧＴＮ＾＾ＹＴＡＹ　阿ＳＮＧ　３４（２＞ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏニアの情報 （ｉ）配列の特徴： （＾）長さ：３２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー；直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：他の核酸 （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア：ＣＡＮＣ’：ＮＴＴＲＴ＾ＤＧＴＹ ＴＡＣＷＳ　ＮＫＣＴＴ＾＾ＧＣＡ　ＣＴ　３２（２）ＳＥｏ　１０　ＮＯ＋８ の情報 （ｉ）配列の特徴： （＾）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃｏｇの数ニー木調 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種顕：他の核酸 （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８：ＣＡＮにＧＮＣＴＲＴ　ＧＮ＾＾Ｒ ＣＴＲＴＧ　ＴＴＣＧ＾＾ＴＡＣＣ３０（２＞ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：９の情報 （ｉ）配列の特徴： （＾）長さ：　１７７８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ｇの数ニー木調 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡゲノム （ｘｌ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９：ＧλＡＴＴＣ丁ＣＣＧ　Ａ？ＣＴＣ ＧＣＡＴＧ　ＴＣＧ（：ＧＡＧＧＡＧ　ＧＧ丁丁子ＴＧＧＧＴ　ＴＣＧＣＣＣＡ Ａ（４ＣＣＣＧＣＡ＾Ａ■r　ＧＯ ＣＴＴτ丁ＡＣＣＧＡ　ＴＣ八へＣＣλＧＣ丁　ＧＣＣＡＴＣ入へＣＣτＧ　Ｃ ＡＡ　ＣＣＡ　ＴＴＣＣＧＴ　ＣＧＴ　丁ＡＣＣｏコ　６５R Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ａ：ｇ　Ｔｙｔ　 Ｐｒ。

ＣＴＧ　ＡＣ？　ＴＴＣＧＧＧ　ｃＣＧ　ＡＣＧ　ＣＣＡ　ＡＴＣＣＡＡ　ＣＣ Ｇ　ＣＴＡ　ａｃａ　ＣＧＴ　ＩＪＧ　ＡＧＣＡＡＧ　７０I Ｌ＠ｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　ｆ’ｒｏ　丁ｈｅ　Ｐｒｏ　工ｉｓ　Ｇｉｎ 　Ｐｒｏ　Ｌｓｕ　へ工蟲　ｋｒｑ　Ｌｓｕ　５ｅｒ　Ｌｙ■ ＣＡＣＣＴＣＧＧＣＧＧＣＡＡＡ　ＧＴＧ　Ｃへτ　ＣＴＧ　ＴＡＴ　ＧＣＧ　 ＡＡＡ　ＣＧＣＧＡＡ　ＧＡＣ丁にＣＡＡＣ７４９Ｈｉｓ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｇ ｌｙ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　）ｌｉｇ　Ｌ備ｕ　Ｔｙｔ　入１ａ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　 ＧＬｕ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　＾５■ ＡＧＣＧＧＣＣＴＧ　ＧＣＧ　ＴＴＣＧＧＴ　ＧＧＣＡＡＣ入＾Ｇ　ＡＣＡ　Ｃ ＧＣＡＡＧ　ＣＴＣＧＡＡ　丁へ丁　ＣＴＧ　フ９７５ｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　 八ｌａ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌ、ｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ 　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　丁ｙｒ　Ｌａ■ ＡＴＣＣＧＴ　ＧＡＡ　ＧＣＧ　Ｃ７丁　ＧＣＴ　ＣＡＧ　００丁　丁ＧＣＧＡ ＣＡＣＯＣＴＣＣＴＧ　ＴＣＧ　ＡＴｃ　ＧＧＣ８４５工ｌｅ　Ｐｒｏ　ＧＬｕ 　Ａ１ａ　Ｌ＠ｕ　入１ａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　ｋｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌ＠ｕ 　Ｖａｌ　Ｓｅｘ　工１＠　ＧｌｙＣＡＧ　Ｇｅｅ　ＧＧＣＡＴＧ　（ａＴＧ　 ＧＴＧ　ＧＧＡ　丁ＴＣＧ（ＣＧＣＴ　ＧＡＧ　ＧＧＣＣＧＮ　ＧＣＣＧＡＴ　 ＣＧＣ１２７７Ｇｉｎ　入１ａ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｐ ｈ＠　入１ａ　入１晶　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ　八３Ｐ　八ｒ９ＧＴ Ｇ　ＡＴＣＧＧＣＧＴＣＧＡＣＧＣＴ　丁ＣＧ　ＧＣＣＡＡＡ　ＣＣＣＧＣＧ　 ＣＡＧ　ＡＣＧ　ＣＧＣＧＡＧ　ＣＡＧ　１３２５■１上　Ｘ↓＠　ｃｌｙ　Ｖ ａｌ　八ｓｐ　Ａｌａ　Ｓａｒ　八ｌａ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　入ｌａ　Ｇｉｎ　Ｔ ｈｒ：　Ａｒｇ　ＧＬｕ　Ｇｉ■ 入丁ＣＡＣＣＣＮＣＡＴＣＧＣＧ　へ〇ＡＣ入Ｇ　ＡＣＣＧＣＧ　ＧＡＧ　入入 ＾　ＧＴＣＧＧＣＣ’ＴＧ　ＣＡＧ　ＣＧＣ１３７３ＸＬｅ　Ｔｈｒ　Ｘａａ　 工ｌ＠　Ａ１１　人ｒｑ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　ＡＬａ　ＧＬｕ　Ｌｙｓ　ｌ／ａｌ 　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　八ｒ■ ＧＡＡ　ＴＡＧ　ＧＧＡ　Ｔ丁Ｇ　ＣＣＧ　ＡＡＣＧＭ　ＧＧＣＡＣＧ　ＣＴＧ 　ＧＡＡ　ＧＣＧ　ＡＴＣＣＧＣ丁τＧ　ＴＧＣ１４６９Ｇ↓ｕ　Ｔｙｔ　Ｇｌ ｙ　Ｌ＠ｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　ＧＬｕ　Ｇｌｙ　丁ｈｒ　Ｌａｕ　ＧＬｕ　へ１ 晶　工１・　八ｔｑ　Ｌａｕ　ＣｙｓＣ丁丁τ丁子丁へＧＴ　ＧＣＧＣ丁丁τ丁 子τへＣＧＴＧ（ＧＣ丁丁子　八ＣＴＣＧＴＧＣＧＧ　ＴＴＧＣＡＣＣＧＧ＾　 丁　１７７８Ｔ　Ｔ ＡＡ　Ａ ＦＺＧＵＲＥ　： ■　Ｉ＋ｏ　マ　ヘ　０　ロ ａ）　Ｍ　ｃＤ　會　の　〜 へ　の　ｎ　？　マ　い ＦＩＧＵＲＥ　３ ！Ｌ 花弁組織、葉組織、及び様々な果実組織など、所期の植物組織のエチレンレベル を変更する新規な組成物及び方法が提供される。前記方法は、エチレンの生成を 調節し得る酵素をコードするＤＮＡ配列に転写解読枠５′末端において結合され た転写翻訳開始調節領域と、翻訳転写終結領域とを含む、植物細胞内で機能する 発現カセットで所期の植物細胞を形質転換することを含む。上記酵素の発現は、 エチレン生合成に関与する酵素のための基質の濃度を変化させ、それによってエ チレン生成を減少させる。特に果実及び組織の老化、器官脱離及び／または成熟 に関連するエチレン生成の甚だしい増加を防止するべく、花、果実及び葉といっ た植物組織でのエチレン生成を選択制御することが特に重要である。

国際調査報告 ＰＣＴ　／ＵＳ９４１０２９１０ ２９５８Ａｔｔａｃｈ　ｔｏ　Ｆ＜ゴ／ＩＳＡ／２１０ＡＣＣｄｅａｍｉｎａｓ ｅ　ａｎｄ　ｇｙｎｏｎｙｔｎｓｓｅｑｕｅｎｃｅ　５ｅａｒｃｈ　ｏｎ　Ｆｉ ｇｕｒｅ　２ＰＣＴ／ＵＳ９１１０ｌ１０２ ９５ＢＡＬＬａＣｈ口ＯＰＣ’ｒ／ＩＳＡ／２１０　（Ｓｅｃｔｉｏｎ　ＶＴ） １　゛′

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．５′−３′転写方向に次の構成要素、即ち転写翻訳開始領域と、エチレン生 合成の前駆体を代謝させ得る酵素をコードするＤＮＡ配列と、転写終結領域とを 含み、これらの構成要素は操作可能に連結されており、前記開始及び終結領域の 少なくとも一方は前記ＤＮＡ配列と自然に結合する領域でないＤＮＡ構造体。
2. ２．前記前駆体が１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸（ＡＣＣ）である ことを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ構造体。
3. ３．前記酵素がＡＣＣデアミナーゼであることを特徴とする請求項１に記載のＤ ＮＡ構造体。
4. ４．ＡＣＣデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａ ｓ種ＡＣＰから取得可能であることを特徴とする請求項３に記載のＤＮＡ構造体 。
5. ５．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種ＡＣＰ　ＡＣＣデアミナーゼを含むことを特徴と する請求項４に記載のＤＮＡ構造体。
6. ６．広域スペクトル原核複製系をも含むことを特徴とする請求項５に記載のＤＮ Ａ構造体。
7. ７．請求項１に記載のＤＮＡ構造体に結合された、前記植物ゲノムヘの組み込み を実現するのに十分な寸法を有する少なくとも右側のＴ−ＤＮＡ境界のホモロジ ー領域をも含むことを特徴とする請求項６に記載のＤＮＡ構造体。
8. ８．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種から取得可能な、１−アミノシクロプロパン−１ −カルボン酸（ＡＣＣ）デアミナーゼをコードするＤＮＡ配列を異種ＤＮＡ配列 と結合した形態で含むＤＮＡ構造体。
9. ９．前記異種ＤＮＡ配列が、植物細胞内で機能する転写翻訳開始領域であること を特徴とする請求項８に記載のＤＮＡ構造体。
10. １０．前記転写翻訳開始領域が二重３５Ｓ　ＣａＭＶプロモーターを含むことを 特徴とする請求項９に記載のＤＮＡ構造体。
11. １１．前記転写翻訳開始領域が、特定の植物組織において選択的に発現するプロ モーターを含むことを特徴とする請求項９に記載のＤＮＡ構造体。
12. １２．植物組織のエチレンレベルを変更する方法であって、エチレン生合成の前 駆体を代謝させ得る酵素をコードするＤＮＡ配列を有する植物細胞を、前記遺伝 子が発現して植物組織のエチレンレベルを低下させる条件下に増殖させること を含む方法。
13. １３．前記前駆体がＡＣＣであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
14. １４．前記酸素がＡＣＣデアミナーゼであることを特徴とする請求項１２に記載 の方法。
15. １５．前記酸素がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種ＡＣＰから取得可能であることを特 徴とする請求項１４に記載の方法。
16. １６．前記ＤＮＡ配列の転写翻訳の開始が、特定の植物組織において選択的に発 現するプロモーターによって制御されることを特徴とする請求項１２に記載の方 法。
17. １７．請求項１から７のいずれか１項に記載の、エチレン生合成の前駆体を代謝 させ得る酵素をコードする組み換え体ＤＮＡ配列を有する植物細胞。
18. １８．細菌由来のＡＣＣデアミナーゼを有する植物細胞。
19. １９．エチレン生合成の前駆体を代謝させ得る酵素の産生を実現する方法であっ て、 請求項１から７のいずれか１項に記載の構造体を有する宿主細胞またはその前駆 細胞を、前記酵素の産生を可能にする条件下に増殖させること を含む方法。
20. ２０．前記宿主細胞が植物細胞であり、前記構造体はこの植物細胞のゲノムに組 み込まれていることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
21. ２１．前記植物細胞がｉｎ　ｖｉｖｏであることを特徴とする請求項２０に記載 の方法。
22. ２２．請求項１９に記載の方法によって得られる酵素を有する植物細胞。
23. ２３．請求項１２から１６のいずれか１項に記載の方法によって変更されたエチ レンレベルを有する植物細胞。