KR20060018817A - 스트레스 유도성 프로모터 및 그의 이용방법 - Google Patents

Abstract

단자엽 식물에서 효과적으로 작용할 수 있는 스트레스 유도성 프로모터, 이 프로모터를 사용한 환경 스트레스 내성 식물에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 이하의 (a) 또는 (b)의 DNA로 구성되는, 벼 유래의 프로모터:

(a) 서열번호 1 또는 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 구성된 DNA,

(b) 서열번호 1 또는 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 구성되는 DNA에 상보적인 염기서열로 구성되는 DNA와 스트린젠트 조건하에서 혼성화되고 또 스트레스 유도성 프로모터 활성을 갖는 DNA, 및 상기 프로모터를 도입한 환경 스트레스 내성 식물에 관한 것이다.

단자엽 식물, 스트레스 유도성 프로모터, 환경 스트레스 내성,

Description

스트레스 유도성 프로모터 및 그의 이용방법{Stress-induced promoter and method of using the same}

본 발명은 벼 유래의 스트레스 유도성 프로모터와 그의 이용방법에 관한 것이다.

식물은 건조, 고온, 동결, 염 등, 자연계에서 다양한 환경 스트레스에 대응하기 위한 내성 기구를 가지고 있다. 최근에는 이와 같은 스트레스 내성 기구가 분자 레벨에서 밝혀짐에 따라서, 바이오테크놀로지적 수법을 이용한 스트레스 내성 식물도 만들 수 있게 되었다. 예컨대 스트레스를 받은 세포내에는 LEA 단백질, 물 채널 단백질, 적응용질 합성효소 등의 스트레스 단백질이 유도되어, 세포를 스트레스로부터 방어한다. 그래서, 보리의 LEA 단백질이나 담배의 해독(detoxification) 효소 등의 유전자, 침투압 조절물질(당, 프롤린, 글리신베타인 등) 합성효소의 유전자를 식물에 도입하는 연구가 시도되어 왔다. 또한 세포막 지질의 수식효소인 아기장대의 w-3 지방산 데세추라제(desaturase)나 남조류의 D9desaturase의 유전자 등을 사용한 연구도 실시되었다. 이들 연구에서는 모두 1개의 유전자가 꽃양배추(cauliflower) 모자이크 바이러스의 35S 프로모터에 결합되어 식물에 도입되었다. 그러나, 형질전환 식물의 스트레스 내성도가 불안정하기도 하고, 도입 유전자의 발 현 수준이 낮은 등의 문제 때문에 실용화에 이른 것은 없었다.

한편, 스트레스 내성 기구에는 복수의 유전자가 복잡하게 관여하고 있음이 밝혀졌다(비특허문헌 1). 그래서, 이들의 발현을 동시에 활성화하는 전사성을 높이는 연구도 시도되었다(비특허문헌 2). 그러나, 복수의 유전자가 같은 시기에 활성화되면, 숙주 식물의 에너지가 해당 유전자 산물의 생성이나 상기 유전자 산물에 기인하는 세포내 대사에 집중되기 때문에 식물 자체의 성장이 지체되어 왜소화되는 문제가 있었다.

이에 대하여, 본 발명자들은 아기장대(Arabidopsis thaliana)로부터 스트레스 응답성 엘리먼트에 결합되어 이 엘리먼트 하류 유전자의 전사를 특이적으로 활성화하는 전사인자를 코드화하는 유전자, DREB1A, EREB1B, DREB1C, DREB2A, DREB2B 를 단리하였다 (특허문헌 1). 또한 이들 유전자를 스트레스 유도성 rd29A 프로모터에 연결하여 식물에 도입하는 것에 의해 왜소화되지 않는 스트레스 내성 식물을 작성할 수 있음을 보고하였다(특허문헌 2).

그러나, 쌍자엽 식물인 아기장대 유래의 rd29A 프로모터는 단자엽 식물 중에서 작용은 하여도 그 활성이 약하다. 따라서, 단자엽 식물에서 강한 활성을 갖는 스트레스 유도성 프로모터가 요망되고 있었다.

[특허 문헌 1] 일본 특허공개 2000-60558호 공보

[특허 문헌 2] 일본 특허공개 2000-116260호 공보

[비특허문헌 1] Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K., Plant Physiol. (1997) Oct; 115(2) p327-334

[비특허문헌 2] Liu et al., The Plant Cell, (1998) 10: p1391-1406

발명의 개시

본 발명은 벼 등의 단자엽 식물에서 효과적으로 작용할 수 있는 스트레스 유도성 프로모터를 발견하고, 이 프로모터를 사용하여 신규한 환경 스트레스 내성 식물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 상기 문제를 해결하기 위하여 예의 연구 검토한 결과, 벼 게놈으로부터 강한 스트레스 유도성 프로모터를 단리하는 것에 성공하였다. 이 프로모터를 사용하면, 단자엽 식물의 환경 스트레스 내성을 현저하게 향상시킬 수 있다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 벼 유래의 스트레스 유도성 프로모터에 관한 것이다. 이 프로모터는 구체적으로는 이하의 (a) 또는 (b)의 DNA로 구성된다:

(a) 서열번호 1 또는 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 구성된 DNA,

(b) 서열번호 1 또는 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 구성되는 DNA에 상보적인 염기서열로 구성되는 DNA와 스트린젠트 조건하에서 혼성화되고 또 스트레스 유도성 프로모터 활성을 갖는 DNA.

여기서, 스트레스라는 것은 건조 스트레스, 저온 스트레스 또는 염 스트레스이다.

또한 본 발명은 상기 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 이 벡터는 본 발명의 프로모터 지배하에 다른 구조 유전자나 조절 유전자를 포함하여도 좋고 특히 스트레스 내성을 향상시키는 구조 유전자 및/또는 조절유전자를 포함하는 것이 바람직하다.

스트레스 내성을 향상시키는 구조 유전자의 적합한 예로서는 프롤린 합성의 열쇠효소 P5CS 유전자 (Yoshiba Y. et al (1999) BBRC 261), 갈락티놀 합성 유전자 AtGolS3 유전자 (Taji T. et al (2002) Plant J. 29: 417-426)를 들 수 있다.

또한 스트레스 내성을 향상시키는 조절 유전자의 적합한 예로서는 아기장대 유래 전사인자 DREB 유전자 (일본 특허공개 2000-60558호 공보), 벼 유래 전사인자 OsDREB 유전자 (일본 특허공개 2001-358268호 공보, Dubouzet et al Plant J. in press) 및 식물 호르몬 ABA의 생합성의 열쇠효소 NCED 유전자 (Iuchi S et al (2001) Plant J. 27: 325-333) 등을 들 수 있다.

특히 아기장대 유래 전사인자 DREB 유전자, 벼 유래 전사인자 OsDREB 유전자가 바람직하고, 벼 유래 전사인자 OsDREB 유전자가 가장 바람직하다.

또한 본 발명은 본 발명의 벡터를 적당한 숙주에 도입하여 얻을 수 있는 형질전환체를 제공한다. 어떤 구체예에 있어서, 형질전환체는 본 발명의 벡터를 숙주 식물에 도입하여 얻을 수 있는 트랜스제닉 식물이다. 이 경우, 숙주 식물로서는 단자엽 식물이 바람직하고, 단자엽 식물로서는 벼가 바람직하다.

또한 본 발명은 본 발명의 프로모터를 식물에 도입하는 것에 의해 식물의 스트레스 내성을 향상시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 프로모터는 단자엽 식물에서 종래에 없는 강한 스트레스 유도성 프로모터 활성을 갖기 때문에 단자엽 식물의 스트레스 내성의 향상에 의해 적합하다.

본 명세서는 본원의 우선권을 기초인 특허출원 2003-80847호의 명세서에 기재된 내용을 포함한다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명의 프로모터는 저온, 건조, 염 등의 환경 스트레스에 대하여 특이적으로 유도되는 벼 유래의 프로모터이다.

1. 본 발명의 프로모터의 확인

본 발명의 프로모터는 스트레스를 부하한 식물 개체와 부하하지 않은 식물개체 사이에서 그 발현이 현저하게 상이한 유전자(스트레스 유도성 유전자)를 스크리닝하고, 이어 게놈 정보로부터 유전자의 프로모터로 생각되는 서열을 스크리닝하는 것에 의해 확인할 수 있다.

이하, 본 발명의 프로모터를 확인하는 과정에 대하여 설명한다.

1.1 mRNA의 조정

먼저, 스트레스 유도성 유전자를 스크리닝하기 위해 mRNA를 제조한다.

mRNA의 공급원으로서는 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 등 식물체의 일부 또는 전체중 어떤 것이어도 좋다. 또한 식물체는 그 종자를 GM 배지, MS 배지, #3 배지 등의 고체 배지에 파종하고, 무균 조건하에서 생육시킨 식물체를 사용하여도 좋고, 캘러스나 무균 조건하에서 생장한 식물체의 배양세포를 사용하여도 좋다.

본 스크리닝에서는 스트레스를 부하한 식물 개체와 부하하지 않은 식물 개체의 사이에서 유전자 발현량의 상이를 비교하기 위하여 mRNA는 상기 양 개체의 각각에 대하여 조정할 필요가 있다. 스트레스의 부하 방법은 사용하는 식물에 따라서 적절히 선택할 수 있다. 일반적으로 건조 스트레스는 2~4 주간, 물을 주지 않고 키우는 것에 의해 부하할 수 있다. 또한 저온. 동결 스트레스는 15~-10℃에서 1~10일간 키우는 것에 의해 부하할 수 있다. 또한 염 스트레스는 100 내지 600 mM NaCl에서 1시간 내지 7일간 키우는 것에 의해 부하할 수 있다. 예컨대 벼의 경우, 수경 재배로 생육시킨 벼를, 저온 스트레스라면 10 내지 -4℃, 염 스트레스라면 150 내지 250 mM NaCl, 건조 스트레스라면 탈수 상태 등에 노출시킨다.

스트레스를 부하시킨 식물 개체와 부하하지 않는 식물개체는 각각 액체 질소로 동결시키고 모르타르 등으로 마쇄한 후 얻어지는 마쇄물로부터 글리옥살법, 구아니딘티오시아네이트 염화세슘법, 염화리튬-질소법, 프로테이나제 K-데옥시리보뉴클레아제법 등에 의해 조 RNA 분획을 추출한다. 이어서, 상기 얻은 조 RNA 분획으로부터 올리고 dT-셀룰로오스나 세파로오스 2B를 담체로 하는 폴리 U-세파로오스 등을 사용한 친화성 칼럼법 또는 뱃치법에 의해 폴리(A)⁺ RNA (mRNA)를 얻는다. 필요하면, 사카로오스 밀도구배 원심법 등에 의해 mRNA를 분획하여 사용하여도 좋다.

1.2 스트레스 유도성 유전자의 스크리닝

스트레스 유도성 유전자의 스크리닝은 스트레스를 부하한 식물 개체와 부하하지 않은 식물 개체 사이에서 그 유전자 발현량의 상이를 비교하는 것에 의해 실시한다. 유전자 발현량의 비교방법은 특히 한정되지 않고, 예컨대 RT-PCR법, 리얼타임 PCR법, 서브트렉션(subtraction)법, 차별적 디스플레이법, 차별적 혼성화법 또는 또는 크로스 혼성화법 등의 공지의 방법을 이용할 수 있다.

그 중에서도 유전자 칩, cDNA 마이크로어레이 등의 고상 시료를 사용한 방법은 수천 내지 수만의 유전자의 발현을 정성적으로 또 정량적으로 한번에 검출할 수 있는 점에서 상기 스크리닝의 실시에 적합하다.

(1) cDNA 마이크로어레이의 제조

상기 스크리닝에 사용되는 cDNA 마이크로어레이는 프로모터의 검출 대상인 단자엽 식물(예컨대 벼)의 cDNA가 지지되고 있는 것이면 특히 한정되지 않고, 기성의 것을 사용하여도 좋고, 공지의 방법에 기초하여 작제하여도 좋다(예컨대 The Plant Cell (2001) 13: 61-72 Seki et al 참조).

cDNA 마이크로어레이의 작제하기 위해서는 먼저 목적으로 하는 식물의 cDNA 라이브러리의 제조가 필요하다. cDNA 라이브러리는 (1)의 방법을 따라 제조한 mRNA를 주형으로 하여 공지의 방법에 따라 제조할 수 있다. 서포트되는 cDNA는 단자엽 식물 유래의 것이면 특히 한정되지 않지만, 나중의 게놈 데이터 베이스 분석의 편리성에서 벼 등의 게놈 분석이 진행된 단자엽 식물인 것이 바람직하다. 식물은 평상 상태(무처리)의 식물이면 좋지만, 바람직하게는 건조, 염, 저온 등의 스트레스에 노출된 식물이다.

cDNA 라이브러리의 제작에서는 먼저 시판되는 키트(ZAP-cDNA Synthesis Kit (STRATAGENE사 제조)등)를 사용하여 mRNA를 역전사하여 단일가닥 cDNA를 합성하고, 이것을 주형으로 하여 2중가닥 cDNA를 합성한다. 이어서 수득한 2중가닥 cDNA에 적합한 제한효소 절단부위를 포함하는 어댑터를 부가한 후, 람다 파아지 벡터의 클로닝 부위에 삽입한다. 이것을 시판 키트(예컨대 Gigapack III Gold packaging extract (STRARATGENE사 제조) 등)를 사용하여 in vitro 팩케이징하고, 숙주 대장균에 감염, 증폭시키면, 목적으로 하는 cDNA 라이브러리를 얻을 수 있다.

cDNA 라이브러리가 제작되면, 이 cDNA, 또는 이 cDNA 중 특이성이 높은 부분(예컨대 3'측의 반복서열을 포함하지 않는 UTR 영역)을 PCR 증폭시켜, 어레이 고정용 프로브를 제조한다. 이 작업을 반복하여 목적으로 하는 전체 유전자의 프로브를 제조하면, 이들을 시판 서포터 (예컨대 Amersham사 제조 등)을 사용하여 슬라이드 글래스 상에 스포팅한다. 이렇게하여 목적으로 하는 cDNA 마이크로어레이를 얻을 수 있다.

(2) 유전자 발현량의 검출

cDNA 마이크로어레이에 의한 유전자 발현량의 검출은 샘플 mRNA (또는 cDNA)를 적당한 시약으로 라벨링하고, 이것을 어레이 상의 cDNA 프로브와 혼성화시켰을 때의 시그널 강도로서 측정할 수 있다. 유전자의 발현량은 통상 어레이 상에 서포트된 cDNA 프로브양의 불균일을 고려하여, 적당한 대조용과의 비교치, 또는 비교하는 2 샘플 간의 발현량 비로서 구하는 것이 바람직하다. 본 스크리닝의 경우이면 스트레스를 부하하지 않은 무처리 식물 유래의 mRNA를 대조용으로 하여 스트레스를 부가한 식물 유래의 mRNA의 상대적 발현량을 검출하면 좋다.

검출은 대조용과 샘플의 mRNA (또는 그의 cDNA)를 각각 상이한 형광색소(예컨대 Cy3 및 Cy5)로 라벨링하고, 어레이상의 cDNA 프로브와 함께 혼성화시킨 것에 의해 실시한다. 예컨대 스트레스를 부하한 개체로부터 mRNA를 추출하고, Cy5 표식 dCTP 존재하 역전사하여 Cy5 표식 cDNA를 제조한다. 이어서 스트레스를 부가하지 않은 무처리 개체로부터 mRNA를 추출하고, 동일한 방법으로 Cy3 표식 cDNA를 제조한다. Cy5 표식 cDNA (샘플)과 Cy3 표식 cDNA (대조용)을 동량씩 혼합하고, 어레이상의 cDNA와 혼성화시킨다. 표식용 색소는 샘플에 Cy3을, 대조용으로는 Cy5를 이용하여도 좋고, 그 외의 적당한 표식시약을 사용하여도 좋다.

수득한 형광강도를 형광 시그널 검출기로 판독하고, 수치화하면, 이 값은 대조용에 대한 샘플의 유전자 발현량 비에 상당한다. 스캐너로 판독한 형광강도는 필요에 따라서 오차의 조정이나 각 시료 마다의 불균일의 정규화를 실시하여도 좋다. 정규화는 하우스 키핑 유전자 등 각 샘플에서 공통적으로 발현하고 있는 유전자를 기준으로 실시할 수 있다. 또한 신뢰성 한계 라인을 특정하여 상관성이 낮은 데이터를 제거하여도 좋다.

(3) 스트레스 유도성 유전자의 선택

스트레스 유도성 유전자는 상기 어레이에 의한 분석의 결과, 스트레스를 부하한 식물 개체와 부하하지 않은 식물 개체 사이에서 발현량이 현저하게 상이한 유전자로서 특정된다. 여기서 "현저하게 상이하다"는 것은 예컨대 인텐시티 1000 이상이고 양쪽의 발현량이 적어도 3배 이상 상이한 것을 의미한다.

(4) 노던. 블로팅에 의한 발현 분석

이와같이 선택한 유전자는 노던 분석법 등에 의해 스트레스 유도성에 해당 유전자의 발현이 높아지는 것을 확인한다. 예컨대 전술한 방법으로 각종 레벨의 염, 건조, 온도 등의 스트레스에 식물을 노출시킨다. 이렇게하여 각 식물로부터 RNA를 추출하고 이것을 전기영동에 걸어 분리한다. 분리된 RNA는 니트로셀룰로오스 막에 전사되고 상기 유전자에 특이적인 표식 cDNA 프로브와 혼성화시키면 그 발현량을 검출할 수 있다.

선택한 유전자가 스트레스 의존적으로 발현이 향상되고 있으면, 이 유전자는 스트레스 유도성인 것을 확인할 수 있다. 이렇게하여 벼 cDNA 라이브러리로부터 선택한 스트레스 유도성 유전자의 예로서 본 발명에 걸리는 a0022 (LIP9: 서열번호 2) 및 a0066 (WSI724: 서열번호 8)을 들 수 있다. a0022 및 a0066은 마이크로어레이 상에 고정되어 있는 cDNA의 확인번호이다.

1.3 프로모터 서열의 스크리닝

(1) 유전자 데이터 베이스로부터의 추정

이어서, 기존의 유전자 데이터 베이스 (예컨대 DDBJ의 데이터 베이스 등)를 기초로하여 검색 소프트(예컨대 Blast 등)를 이용하여 스트레스 유도성 유전자의 프로모터 서열을 검색한다. 벼와 같이 거의 게놈이 해독되어 있는 식물에서는 특정된 스트레스 유도성 유전자를 지배하는 프로모터 서열의 탐색은 기존의 데이터 베이스를 사용하여 전부 가능하게 된다. 프로모터 서열은 게놈 상에서 상기 스트레스 유도성 유전자 (cDNA)와 상동성이 높은 게놈 유전자의 상류 영역으로부터 프로모터로 생각되는 영역으로서 선택된다. 예컨대 스트레스 유도성 유전자의 게놈 정보에 기초하여, 이들의 유전자의 개시 코돈으로 추정되는 위치로부터 약 1 내지 2 kb 상류 부근을 프로모터 영역이라 추정한다.

그런데, 공지의 스트레스 유도성 프로모터 중에는 그 서열중에 프로모터 활성에 관여하는 시스 엘리먼트; 예컨대 건조 스트레스 응답성 엘리먼트 (DRE; dehydration-responsive element), 앱시신산 응답성 엘리먼트(ABRE; abscisic acid responsive element), 저온 스트레스 응답성 엘리먼트 등을 갖는 것이 있다. 이 시스 엘리먼트에 스트레스 유도성의 전사인자가 결합되면, 상기 프로모터가 활성화되어 그 지배하에 있는 스트레스 유도성 부근 유전자를 발현시킨다. 따라서 검색된 상류 영역에 상기 시스 엘리먼트가 포함되어 있으면, 그 영역은 스트레스 유도성 프로모터인 가능성이 아주 높다고 말할 수 있다.

이렇게하여 상술한 a0022 (LIP9: 서열번호 2)와 상동성이 높은 유전자의 게놈 정보를 얻을 수 있고, 그의 1.1 kb 상류 영역으로부터 추정 LIP9 프로모터 서열 (서열번호 1)이 스크리닝되었다. 동일하게 하여 a0066 (WSI724: 서열번호 8)과 상동성이 높은 유전자의 상류 영역으로부터 추정 WSI724 프로모터 서열(서열번호 10)이 스크리닝되었다.

(2) 스트레스 유도성 프로모터의 작용 확인

다음에 추정 프로모터 서열에 관하여 스트레스 부하 시에 프로모터 활성의 변화에 의해 그 작용의 확인을 실시한다.

먼저, 상기 항목에서 추정된 프로모터 서열을 기본으로 하여 프라이머를 제작하고, 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR을 실시하여, 프로모터의 클로닝을 실시한다. 이어서 프로모터의 하류에 리포터 유전자를 연결하여 제작한 리포터 플라스미드를 식물에 도입하고 이 식물(바람직하게는 그의 T₂ 세대)의 스트레스 부하 시에 리포터의 발현을 조사한다. 리포터로서는 예컨대 β-글루쿠로니다제 (GUS: pBI121, Clontech 사 제조), 루시페라제 유전자, 녹색 형광 단백질 유전자 등을 들 수 있지만, 활성을 수치로 얻을 수 있는 점, 염색에 의해 발현을 시각적으로 관찰할 수 있는 점에서 GUS가 바람직하다.

1.4 본 발명의 프로모터

이상의 결과, 벼 게놈 유래의 LIP9 프로모터 서열(서열번호 1)은 건조, 저온, 염 등의 각 스트레스 의존적으로 높은 발현을 나타내는 스트레스 유도성 프로모터인 것이 확인되었다.

이와 같이, LIP9 프로모터는 전부 스트레스에 대하여 특이적으로 유도되는 프로모터이다. 이하에 그 구조적, 기능적 특징을 들 수 있다.

1) LIP9 프로모터는 그 구조 중에 건조 스트레스 유도에 관여하는 시스 엘리먼트 DRE를 2개 포함한다(도 2 참조).

2) LIP9 프로모터는 시스 엘리먼트 DRE에 결합되어 그 하류의 유전자의 전사를 활성화시키는 벼 유래의 전사인자: OsDREB1 유전자 (일본특허 출원 2001-358268호)의 과잉 발현체에서 고발현하고 있다.

3) LIP9 프로모터에는 OsDREB1 유전자가 결합되는 DRE 서열이 존재하는 점에서 OsDREB 유전자의 과잉발현의 최적 프로모터인 것이 예측된다.

한편, WSI724 프로모터도 그 구조 중에 DRE 서열이 2개 포함되어 있는 점, 및 a0066의 스트레스 부하시의 발현 패턴(건조, 염, 저온 유도성이고 저온에 의한 유도성이 건조, 염에 비하여 느림)으로부터 OsDREB 유전자의 타겟으로 되어 있는 것이 예상되었다.

본 발명의 프로모터는 서열번호 1 또는 서열번호 10으로 표시되는 서열번호를 갖는 DNA에 한정되지 않고, 서열번호 1 또는 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 구성된 DNA에 상보적인 염기서열로 구성되는 DNA와 스트린젠트 조건하에서 혼성화될 수 있는 DNA도, 스트레스 유도성 프로모터 활성을 갖는 한, 본 발명의 스트레스 유도성 프로모터에 포함된다. 여기서, 스트린젠트 조건이라는 것은 포름아미드 농도가 30 내지 50%, 37 내지 50℃, 6 X SSC 조건, 바람직하게는 포름아미드 농도가 50%, 42℃, 6 X SSC 조건을 말한다.

2. 재조합 벡터

본 발명의 재조합 벡터는 본 발명의 프로모터를 포함하는 벡터이다. 이 벡터는 본 발명의 프로모터의 하류에 다른 구조 유전자 또는 조절 유전자를 작용할 수 있는 형태로 포함하고 있어도 좋다. 이와 같은 유전자의 적합한 예는 스트레스 내성을 향상시키는 구조 유전자 및/또는 조절유전자이다. 또한 "작용할 수 있는 형태"라는 것은 다른 구조 유전자 또는 조절유전자가 본 발명의 프로모터의 지배하에서 적절하게 발현할 수 있는 것과 같은 형태를 의미한다.

여기서, 스트레스 내성을 향상시키는 구조 유전자라는 것은 건조 스트레스, 저온 스트레스 또는 염 스트레스 등의 환경 스트레스에 대한 식물의 내성을 높이는 작용을 담당하는 단백질을 코드화하는 유전자로서 예컨대 LEA 단백질, 물 채널 단백질, 적합용질 합성효소, 담배의 해독효소, 침투압 조절물질(당, 프롤린, 글리신베타인 등) 합성효소, 세포막 지질의 수식효소인 아기장대의 w-3 지방산 desaturase, 남조류의 D9desaturase의 유전자, 프롤린 합성의 열쇠 효소인 P5CS, 갈락티놀 합성 유전자 AtGolS3 유전자를 들 수 있다.

또한 스트레스 내성을 향상시키는 조절유전자라는 것은 스트레스 유도성 프로모터의 활성이나 스트레스 내성을 부여하는 유전자의 발현을 조절하는 것에 의해, 식물의 스트레스 내성을 향상시키는 유전자로서 예컨대 아기장대 유래의 전사인자: DREB1A, DREB2A, DREB1B 및 DREB1C 유전자 (일본 특허공개 2000-60558호 공보 참조), 벼 유래의 전사인자: OsDREB1A, OsDREB1B, OsDREB1C, OsDREB1D, 및 OsDREB2A 유전자 (일본 특허출원 2001-358268호) 및 식물 호르몬 ABA의 생합성의 열쇠효소인 NCED 유전자 등을 들 수 있다.

특히, 본 발명의 프로모터가 특정 시스 엘리먼트를 포함하는 경우는 상기 시스 엘리먼트에 결합되고, 그 프로모터 활성을 향상시키는 전자인자의 유전자를 프로모터 하류에 연결시키는 것이 바람직하다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 걸리는 LIP9 프로모터는 그 구조 내에 DRE 서열을 2개 포함한다. 따라서 LIP9 프로모터의 하류에 연결시키는 유전자로서는 DREB 유전자 또는 OsDREB 유전자 (예컨대 OsDREB1A, OsDREB1B, OsDREB1C, OsDREB1D, OsDREB2A 유전자, OsDREB2B 유전자)가 바람직하고, 특히 OsDREB 유전자가 가장 바람직하다.

또한 WSI724 프로모터도 DRE 서열을 2개 포함하며, OsDREB의 타겟으로 되어 있는 것이 예상되고 있는 점에서 그 하류에 연결시키는 유전자로서는 DREB 유전자 또는 OsDREB 유전자 (예컨대 OsDREB1A, OsDREB1B, OsDREB1C, OsDREB1D, OsDREB2A 유전자, OsDREB2B 유전자)가 바람직하고, 특히 OsDREB 유전자가 가장 바람직한 것으로 생각된다.

본 발명의 벡터는 적당한 벡터에 본 발명의 프로모터 또는 상기 프로모터와 다른 조절유전자나 구조유전자를 작용할 수 있는 양태로 연결(삽입)하여 작성된다. 프로모터를 삽입하기 위한 벡터는 숙주 중에서 복제가능한 것이면 특히 한정되지 않지만, 예컨대 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등을 들 수 있다. 플라스미드 DNA로서는 pBR322, pBR325, pUC118, pUC119 등의 대장균 숙주용 플라스미드, pUB110, pTP5 등의 고쵸균용 플라스미드, YEp13, YEp24, YCp50 등의 효모 숙주용 플라스미드, pBI221, pBI121 등의 식물 세포 숙주용 플라스미드 등을 들 수 있다. 또한 디 DNA 로서는 λ 파아지 등을 들 수 있다. 또한 레트로바이러스 또는 백시니아 바이러스 등의 동물 바이러스, 배큘로 바이러스 등의 곤충 바이러스를 벡터로서 사용할 수 있다.

본 발명의 프로모터를 벡터에 삽입하는 것은 정제된 DNA를 적당한 제한효소로 절단하고, 이것을 벡터의 제한효소 부위 또는 멀티 클로닝 부위에 삽입하여 연결하면 된다.

본 발명의 재조합 벡터는 필요에 따라 스플라이싱 시그널, 폴리 A 부가 시그널, 선택 마커, 리포좀 결합 서열(SD 서열) 등을 함유할 수 있다. 선택 마커로서는 예컨대 디히드로 엽산 환원 효소 유전자, 암피실린 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자 등을 사용할 수 있다.

3. 형질전환체

본 발명의 형질전환체는 본 발명의 재조합 벡터를 프로모터 활성이 발현할 수 있는 양태로 숙주 중에 도입하는 것에 의해 구축될 수 있다.

여기서, 숙주는 본 발명의 프로모터가 작용할 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않지만, 식물이 바람직하고, 특히 벼 등의 단자엽 식물이 보다 바람직하다.

식물이나 식물 세포를 숙주로 하는 경우, 예컨대 벼, 옥수수, 밀, 아기장대, 담배, 당근 등으로부터 주화된 세포나 상기 식물로부터 조절된 프로토플라스트를 사용할 수 있다. 식물에 재조합 벡터를 도입하는 방법으로서는 Abel 등의 폴리에틸렌글리콜을 사용하는 방법 [Abel, H. et al., Plant J. 5: 421-427 (1994)]이나 엘렉트로포레이션법 등을 들 수 있다.

4. 스트레스 내성 트랜스제닉 식물

(1) 트랜스제닉 식물의 작성

본 발명의 프로모터의 지배하에 스트레스 내성을 향상시키는 구조유전자 및/또는 조절유전자를 작용시킬 수 있는 형태로 연결하여 식물에 도입하는 것에 의해 환경 스트레스, 특히 저온 스트레스, 동결 스트레스, 건조 스트레스 등에 대하여 저항성이 향상된 트랜스제닉 식물을 작성할 수 있다. 숙주 식물로서는 특히 단자엽 식물이 바람직하다.

본 발명의 프로모터 등을 식물 숙주에 도입하는 방법으로서는 아그로박테륨 감염법 등의 간접 도입법이나 파티클 건 법, 폴리에틸렌글리콜법, 리포좀법, 미량주입법 등의 직접 도입법 등을 들 수 있다. 종래, 벼와 같은 단자엽 식물에서는 아그로박테륨 감염법을 이용한 트랜스제닉 식물의 작제는 곤란하다고 말해졌으나, 아세토시린곤을 부가하는 것에 의한 아그로박테륨이 벼에 감염가능하게되어 단자엽 식물에서도 이용가능하게 되었다.

이하에 아그로박테륨을 사용한 트랜스제닉 식물의 작성에 관하여 설명한다.

먼저, 본 발명의 프로모터와 스트레스 내성을 향상시키는 구조 유전자 및/또는 조절유전자를 포함하는 DNA를 적당한 제한효소로 절단한 후, 필요에 따라서 적절한 링커를 연결하고, 식물세포용의 클로닝 벡터에 삽입하여 식물 도입용 재조합 벡터를 제작한다. 클로닝용 벡터로서는 pBI213Not, pBI2113, pBI101, pBI121, pGA482, pGAH, pBIG 등의 바이너리 벡터 계의 플라스미드나 pLGV23Neo, pNCAT, pMON200 등의 중간 벡터 계의 플라스미드를 사용할 수 있다.

바이너리 벡터계 플라스미드를 사용한 경우, 상기 바이너리 벡터의 경계 서열 (LB, RB) 사이에 목적 유전자를 삽입하고, 이 재조합 벡터를 대장균 중에서 증폭한다. 이어서, 증폭한 재조합 벡터를 아그로박테륨. 튜메파시엔스 C58, LBA4404, EHA101, C58C1Rif^R, EHA105 등에 동결융해법, 엘렉트로포레이션법 등에 의해 도입하여 식물에 대한 형질도입용으로 사용한다.

상기 방법 이외에, 삼자접합법 [Nucleic Acids Research, 12: 8711 (1984)]에 의해서도 식물 도입용 아그로박테륨을 제조할 수 있다. 즉, 목적 유전자를 포함하는 플라스미드를 갖는 대장균, 헬퍼-플라스미드 (예컨대 pRK2013 등)을 보유하는 대장균, 및 아그로박테륨을 혼합 배양하고, 리팜피실린 및 카나마이신을 포함하는 배지 상에서 배양하여 식물 도입용의 접합체 아그로박테륨을 얻을 수 있다. 식물체내에서 외래 유전자 등을 발현시키기 위하여 구조 유전자 후에 식물용 터미네이터 등을 배치시킬 필요가 있다. 본 발명에서 이용가능한 터미네이터 서열로서는 예컨대 꽃양배추 모자이크 바이러스 유래 터미네이터나 노팔린 합성 효소 유전자 유래의 터미네이터 등을 들 수 있다. 단, 식물체 내에서 작용하는 것이 알려져 있는 터미네이터이면 이들에 한정되지 않는다.

또한 효율적으로 목적으로하는 형질전환 세포를 선택하기 위하여, 유효한 선택 마커 유전자를 사용하는 것이 바람직하다. 이때에 사용하는 선택 마커로서는 카나마이신 내성 유전자 (NPTIII), 항생물질 하이그로마이신에 대한 저항성을 식물에 부여하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(htp) 유전자 및 비알라포스(bialaphos)에 대한 저항성을 부여하는 포스피노쓰리신 아세틸트랜스퍼라제(bar) 유전자 등으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자를 사용할 수 있다. 본 발명의 프로모터 및 선택 마커 유전자는 단일한 벡터에 일제히 조립하여도 좋고, 각각 별개의 벡터에 조립한 2종류의 재조합 DNA를 사용하여도 좋다.

이렇게하여 제조한 아그로박테륨을 채취한 식물 절편에 감염시키면 목적으로 하는 트랜스제닉 식물을 제작할 수 있다.

트랜스제닉 식물은 적절한 항생물질을 가한 배지에 파종하고, 목적하는 프로모터나 유전자를 보유하는 개체를 선택한다. 선택된 개체는 본솔 1호나 흑토 등을 넣은 화분에 갈아 심어서 생육시킨다. 일반적으로, 도입 유전자는 숙주 식물의 게놈 중에 동일하게 도입되지만, 그 도입 장소가 상이한 것으로부터 도입 유전자의 발현이 상이한 포지숀 인젝트로 불리는 현상이 보인다. 여기서, 프로브로서는 도입 유전자의 DNA 단편을 사용한 노던법으로 검정하는 것에 의해 보다 도입 유전자가 강하게 발현하고 있는 형질전환체를 선발할 수 있다.

(2) 스트레스 내성의 확인

본 발명의 프로모터나 스트레스 내성을 향상시키는 구조 유전자 및/또는 조절유전자가 트랜스제닉 식물 및 그의 차세대에 조립되어 있는 것의 확인은 이들의 세포 및 조직으로부터 통상의 방법에 따라서 DNA를 추출하고 PCR법 또는 서던 분석 등을 이용하여 도입된 유전자를 검출하는 것에 의해 실시할 수 있다.

또한 트랜스제닉 식물에서 도입 유전자의 발현 레벨 및 발현부위의 분석은 각 식물의 세포 및 조직으로부터 통상의 방법에 따라서 RNA를 추출하고, RT-PCR법 또는 서던 분석을 이용하여 도입한 유전자의 mRNA를 검출하는 것에 의해 실시할 수 있다. 또는 도입한 유전자의 전사산물을, 항체를 사용한 웨스턴 분석 등에 의해 직접 분석하여도 좋다.

본 발명의 프로모터를 도입한 트랜스제닉 식물의 환경 스트레스에 대한 내성은 예컨대 버미큘라이트, 퍼얼라이트, 본솔 등을 포함하는 흙을 넣은 식목 화분에 트랜스제닉 식물을 심고, 또는 수경재배를 실시하여 각종 환경 스트레스를 부하한 경우의 생존을 조사하는 것에 의해 평가할 수 있다. 환경 스트레스로서는 저온, 건조, 염 등을 들 수 있다. 예컨대 건조 스트레스에 대한 내성은 2 내지 4주간, 물을 주지 않고 그 생존을 조사하는 것에 의해 평가할 수 있다. 또한 저온, 동결 스트레스에 대한 내성은 15 내지 -10℃에 1 내지 10일간 방치한 후 2일 내지 3주간, 20 내지 35℃에서 생육시켜 그의 생존율을 조사하는 것에 의해 평가할 수 있다. 염 스트레스는 100 내지 600 mM NaCl에 1 시간 내지 7일간 둔 후 1 내지 3주간 20 내지 35℃에서 생육시켜 생존율을 조사하는 것에 의해 평가할 수 있다. 이렇게 하여 본 발명의 프로모터를 사용하면 식물 (특히 단자엽 식물)을 왜소화시키지 않고 그 스트레스 내성을 현저하게 향상시킬 수 있다.

(3) 트랜스제닉 식물의 적합한 예

본 발명에 관련된 트랜스제닉 식물의 적합한 에로서는 LIP9 또는 WSI724 프로모터 지배하에 OsDREB 유전자를 작용할 수 있는 형태로 연결한 벡터를 벼, 밀 등의 단자엽 식물에 도입한 트랜스제닉 식물을 들 수 있다. LIP9 프로모터에는 DRE 영역이 2개 포함되어 있기 때문에, OsDREB 유전자는 상기 시스 엘리먼트에 결합하는 것에 의해 효율적으로 그 스트레스 내성 효과를 나타낼 수 있다. 마찬가지로, WSI724 프로모터에도 DRE 영역이 2개 포함되어 있기 때문에, OsDREB 유전자의 발현을 높여서 식물의 스트레스 내성을 향상시킬 수 있다.

도 1은 각 스트레스 부하 시에 a0022 (LIP9)의 노던 분석 결과를 도시한다.

도 2는 a0022 (LIP9)의 프로모터 영역의 염기서열을 도시한다.

도 3은 Gus 발현용 작성물(construct)의 구조를 도시한다.

(T_g7: g7 터미네이터, HPT: 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제, P_NOS: Nos 프로모터, T_NOS: Nos 터미네이터)

도 4는 각종 프로모터에 GUS 유전자를 연결하여 도입한 형질전환 담배 또는 벼에서 건조 스트레스 부하 시의 GUS 활성을 도시하는 그래프이다.

도 5는 LIP9 프로모터에 GUS 유전자를 연결하여 도입한 형질전환 벼에서 염 스트레스 부하 시의 GUS 염색 결과를 도시하는 사진이다.

도 6은 형질전환 벼와 야생주에서 도입 유전자 및 각 표적 유전자 (LIP9 (a0022), WSI724(a0066), sa1T (a2660)의 발현량을 노던법으로 비교한 결과이다. 도중에서, a, b, c는 각각 형질전환체의 라인을 도시한다.

도 7은 a0066 (WSI724)의 프로모터 영역의 염기서열을 도시한다.

도 8은 WSI724 프로모터에 GUS 유전자를 연결하여 도입한 형질전환 벼에서 건조 스트레스 부하 시의 GUS 활성을 도시하는 그래프이다 (우: 건조 스트레스 부하, 좌: 대조용).

도 9는 WSI724 프로모터에 GUS 유전자를 연결하여 도입한 형질전환 벼에서 건조 스트레스 부하 시의 GUS 염색 결과를 도시하는 사진이다.

이하, 실시예에 의해 본 발명에 관하여 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이들에 한정되지 않는다.

[실시예 1] 벼의 스트레스 유도성 유전자의 확인

cDNA 마이크로어레이와 노던 분석에 의해 벼의 스트레스 유도성 유전자를 탐색하였다.

1. 벼 cDNA 마이크로어레이의 제조

2 내지 3주간 수경재배한 벼(니혼바레)를 각각 건조, 염, 저온 처리를 실시하였다. 건조 처리는 실온에서 풍건하고, 염 처리는 250 mM의 NaCl 용액으로 재배 하며, 저온처리는 4℃에서 재배하였다. 각 스트레스 처리를 실시한 벼는 액체 질소로 동결시킨 후, 구아니딘 티오시아네이트-염화 세슘법에 의해 전체 RNA를 추출하고, Oligo(dt)-cellulose 칼럼을 사용하여 mRNA를 제조하였다. 수득한 mRNA를 주형으로 하여 HybriZAP-2.1 two-hybrid cDNA Gigapack cloning kit (STRATAGENE사 제조)를 사용하여 cDNA를 합성하고, HybriZAP-2.1 파지미드 벡터의 EcoRI-XhoI 절단부위에 삽입하고, 클로닝하였다. 이 파지미드 DNA를 Gigapack III Gold packaging extract (STRATAGENE사 제조)를 이용하여 팩케이징하였다. 수득한 cDNA를 포함하는 람다 파아지 입자를 숙주 대장균에 감염시켜 증폭시킨 후, 파아지 현탁액으로서 회수하였다.

상기 cDNA 클론의 염기서열을 시퀀싱(서열결정)하여 약 1500개의 독립한 클론을 선발하였다. 선발한 클론을 PCR법으로 증폭시켜 GTMASS System (Nippon Laser and Electronic Laboratory)을 이용하여 poly-L-lysine-coated 마이크로슬라이드 글래스(model S7444; Matsunami 제조)에 스탬핑한 후 UV 크로스 링크에 의해 고정하고 벼 cDNA 마이크로어레이를 제작하였다 (The Plant Cell (2001) 13: 61-72 Seki et al.).

2. 마이크로어레이 분석

앞의 항목과 동일한 건조, 염, 저온의 각 스트레스 처리, 또는 100 μM의 앱시딘산 처리 (5시간 또는 10시간)를 실시한 벼, 및 무처리 벼의 각각으로부터 mRNA를 정제하였다. 무처리 벼 유래의 mRNA를 대조용으로 하고, 각 스트레스 또는 앱시딘산 처리한 벼 유래의 mRNA를 샘플로 하여 각각 Cy3, Cy5를 사용한 2형광표식법을 이용하여 cDNA 마이크로어레이 분석을 실시하였다. 마이크로어레이 분석의 결과, 인텐시티: 1000 이상이고 대조용에 비교하여 3배 이상의 발현량이 확인된 유전자를 스트레스 유도성 유전자의 후보로서 선택하였다. 이렇게하여 a0022 (LIP9: 서열번호 2) 및 a0066 (WSI724: 서열번호 8)이 스트레스 유도성 유전자로서 선택되었다.

3. 노던 혼성법에 의한 발현 분석

상기 항목에서 선택한 유전자의 발현 특성을 노던 혼성법에 의해 분석하였다. 먼저, 벼를 앱시딘산, 건조, 저온, 염, 물의 각 스트레스에 노출시키고, 각각 0, 1, 2, 5, 10 시간 마다 샘플링하였다. 앱시딘산, 건조, 저온, 염 스트레스는 1.과 동일한 방법으로 부여하며, 물 스트레스는 순수에 담구는 것에 의해 부여하였다. 각각 샘플로 부터 전체 RNA를 제조하고, 전기영동을 실시하여 노던법에 의해 유전자의 발현을 보았다. 결과를 도 1에 나타낸다.

도 1로부터 분명한 바와 같이, a0022는 앱시딘산, 건조, 저온, 염의 각 스트레스로 부터 발현이 유도되고, 특히 앱시딘산, 건조, 염으로는 이른 시간대에 발현의 상승이 보였고, 저온에서는 느린 시간대에 발현의 상승이 보였다. 또한 a0066은 그 스트레스 부하시의 발현 패턴(건조, 염, 저온 유도성이고 저온에 의한 유도성이 건조, 염에 비하여 느림)으로부터 OsDREB의 타겟으로 되어 있는 것이 예상되었다.

[실시예 2] 프로모터 서열의 분석

1. 벼 게놈 데이터 베이스의 스크리닝

실시예 1에서 스트레스 유도성 유전자로서 선택된 cDNA: a0022 (LIP9: 서열번호 2)에 관하여, DDBJ의 벼 게놈 데이터 베이스를 이용하여 blast에 의해 상동부 위의 검색을 실시하였다. 그 결과, 상동성이 확인된 유전자의 개시 코돈으로부터 5'측으로 향하여 1.1 kb 상류의 서열을 프로모터 서열(서열번호 1)로서 선택하였다. 또한 a0066(WSI724: 서열번호 8)에 관하여 동일한 검색을 실시하여 그 프로모터 서열(서열번호 10)이 선택되었다.

도 2에 LIP0 프로모터 영역의 구조를 도시한다. 도 2로부터 명확한 바와 같이, LIP9은 그 구조 중에 2개소의 시스 서열 DRE (A/G) CCGAC)를 가진 것이 확인되었다. 또한 도 7에 WSI724의 프로모터 영역의 구조를 나타낸다. WSI724 프로모터에 관해서도 그 구조 중에 2개소의 시스 서열 DRE ((A/G)CCGAC)를 갖는 것이 확인되었다.

2. 클로닝

선택된 프로모터 서열을 기초로 프라이머를 설계하고, 벼의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR을 실시하여 클로닝을 실시하였다. 사용한 프라이머 서열 및 PCR 조건은 이하와 같다.

LIP9 프로모터용 프라이머 서열:

Forward primer: 5'-CACGAAGCTTTCATCAGCTATTCATCAA-3' (서열번호 3)

Reverse primer: 5'-CCGGATCCTCGATCGATGGATTCAGCTA-3' (서열번호 4)

WSI724 프로모터용 프라미어 서열:

Forward primer: 5'-CCATTGGATCCAGCCGTGGAAGTCCAAC-3' (서열번호 11)

Reverse primer: 5'-GCCGGGGATCCTTGGCGCCTCTCTCTCT-3' (서열번호 12)

PCR 조건: 95℃ 1분, 55℃ 1분, 68℃ 2분, 30 사이클

[실시예 3] 스트레스에 대한 LIP9 프로모터 활성

(1) 트랜스제닉 식물의 제조

pBIG29APHSNot의 프로모터 부위를 옥수수의 유비퀴틴 프로모터로 치환하여 제작한 G-ubi 플라스미드를 BamHI-HindIII으로 절단하고, 동일하게 절단시킨 LIP9 프로모터의 단편과 연결시켰다. LIP9 프로모터를 편입한 플라스미드를 BamHI-EcoRI으로 절단하고, 동일하게 pBI221 (Clontech)을 BamHI-EcoRI으로 절단한 Gus 유전자와 연결하여 Gus 발현 작성물(G-LIP9:GUS)를 제작하였다(도 3). 플라스미드 G-LIP9: GUS를, 배양후 10% 글리세롤로 세정한 아그로박테륨 EHA105에 일렉트로포레이션법에 의해 도입하여 아그로박테륨 EHA105 (G-LIP9:GUS)를 제작하였다. 이 아그로박테륨 EHA105 (G-LIP9: GUS)를 이하와 같이 하여 벼에 감염시켜 형질전환체를 작성하였다.

벼의 종자를 70% 에탄올에 1분간 침지시키고, 2% 아염소산 나트륨에 1시간 침지하는 것에 의해 멸균시키고, 이어서 멸균수에 의해 수세한 후 N6D 고형배지(1 리트당 CHU[N6] Basal Salt Mixture (Sigma 사 제조) 3.98 g, 수크로오스 30 g, 미오이노시톨 100 mg, 카사미노산(casamino acid) 300 mg, L-프롤린 2878 mg, 글리신 2 mg, 니코틴산 0.5 mg, 피리독신염산 0.5 mg, 티아민염산 1mg, 2,4-D mg, 겔라이트 4 g, pH 5.8)의 플레이트에 9개 입자씩 파종하고 24일간 배양하여 캘러스를 유도하였다. 형성된 종자 약 20입자 분의 캘러스를 새로운 N6D 고형 배지에 이식하고, 또한 3일간 배양하였다.

한편, 상기 아그로박테륨 EHA105 (G-LIP9:GUS)를 5 ml의 리팜피실린 100 mg/l 및 카나마이신 20 mg/l을 포함하는 YEP 배지 (1리터당 Bactopeptone 10 g, Bacto yeast 10 g, NaCl 5g, MgCl₂·6H₂O 406 mg, pH 7.2), 28℃에서 24시간 배양하였다. 이 아그로박테륨을 20 mg/l의 아세토시린곤을 포함하는 AAM 배지 (1리터당: MnSO₄·5H₂O 10 mg, H₃BO₃ 3mg, ZnSO₄·7H₂O 2mg, Na₂MoO₄·2H₂O 250 ㎍, CuSO₄·5H₂O 25 ㎍, CoCl₂·6H₂O 25 ㎍, KI 750 ㎍, CaCl₂·2H₂O 150 mg, MgSO₄·7H₂O 250 mg, Fe-EDTA 40 mg, NaH₂PO₄·2H₂O 150 mg, 니코틴산 1 mg, 티아민염산 10 mg, 피리독신염산 1mg, 미오이노시톨 100 mg, L-아르기닌 176.7 mg, 글리신 7.5 mg, L-글루타민 900 mg, 아스파라긴산 300 mg, KCl 3 g, pH 5.2)에서 O.D.₆₆₀ 가 0.1로 되도록 하기 위해 희석시켜, 20 ml의 아그로박테륨 현탁액을 제조하였다.

이어서, 상술한 3일간 배양한 캘러스에 아그로박테륨 현탁액을 부가하여, 1분간 혼합하였다. 그 후에 캘러스를 멸균한 페이퍼 타올에 놓고 여분의 아그로박테륨 현탁액을 제거한 후, 멸균된 여과지를 배치한 2N6-AS 고형배지 (1리터당: CHU[N₆] Basal Salt Mixture 3.98 g, 수크로오스 30 g, 글루코오스 10 g, 미오이노시톨 100 mg, 카사미노산 300 mg, 글리신 2 mg, 니코틴산 0.5 mg, 피리독신염산 0.5 mg, 티아민염산 1 mg, 2,4-D 2 mg, 아세토시린곤 10 mg, 겔라이트 4 g, pH 5.2) 위에서 25℃ 3일간 암흑하에서 배양하였다. 3일간의 배양 후, 카르베니실린 500 mg/l을 포함하는 3% 수크로오스 수용액으로 백탁되지 않을 때 까지 충분히 세정하고, 카르베니실린 500 mg/l 및 하이그로마이신 10 mg/l을 포함한 N6D 고형배지 상에서 1주간 배양하였다. 그 후 카르베니실린 500 mg/l 및 하이그로마이신 50 mg/l을 포함한 N6D 고형 배지에 이식하여 18일간 배양하였다. 또한 이 캘러스를 재분화 배지 (1 리터당: 무라시게-스쿠그 배지용 혼합염류 (일본 제약사 제조) 4.6 g, 수크로오스 30 g, 소르비톨 30 g, 카사미노산 2 g, 미오이노시톨 100 mg, 글리신 2 mg, 니코틴산 0.5 mg, 피리독신염산 0.5 mg, 티아민염산 0.1 mg, NAA 0.2 mg, 카이네틴 2 mg, 카르베니실린 250 mg, 하이그로마이신 50 mg, 아가로오스 8 g, pH 5.8)에 이식하였다. 1주간 마다 새로운 배지에 새로 이식하고 재분화시켜 싹이 1 cm 정도 생장한 것은 호르몬을 갖지 않는 배지 (1리터당: 무라시게-스쿠스 배지용 혼합염류 (일본 제약사 제조) 4.6 g, 수크로오스 30 g, 글리신 2 mg, 니코틴산 0.5 mg, 피리독신염산 0.5 mg, 티아민염산 0.1 mg, 하이그로마이신 50 mg, 겔라이트 2.5 g, pH 5.8)에 이식하였다. 호르몬을 갖지 않는 배지상에서 8 cm 정도로 생장한 식물체를 합성 입상배토 본솔 1호 (스미토모 카가쿠사 제조)를 넣은 식목화분으로 옮기고 형질전환식물체의 종자를 얻었다.

동일하게하여, rd29A 프로모터 (Nature Biotechnology (1999) 17, 287-291) 또는 35S 프로모터, salT 프로모터 (서열번호 5)를 GUS 유전자 상류에 결합시킨 작성물을 작성하고 벼 및/또는 담배에 도입하였다.

salT 프로모터는 LIP9 프로모터와 동일한 스크리닝에 의해 벼 게놈 중으로부터 단리된 스트레스 유도성 프로모터이다. salT 프로모터에 대응하는 마이크로어레이 상의 cDNA의 서열번호는 a2660 앱시딘산, 건조, 저온, 염의 각 스트레스에 의한 발현이 유도되는 것이 확인되고 있다 (일본 특허출원 2002-377316호 참조).

(2) 건조 스트레스에 대응하는 프로모터 활성

수득한 GUS 발현 형질전환 벼의 T₂ 세대는 2주간 수경재배하고, 실시예 1과 동일하게하여 건조 스트레스에 노출시켰다.

Gus 발현 형질전환 담배의 경우, T₁ 세대는 재생된 식물체를 플랜트콘 내에서 3 내지 5주간 생육시키고 생장한 잎을 2등분하여 한쪽을 대조용으로 하고 다른 한 쪽을 실온에서 풍건하여 건조 스트레스에 노출시켰다.

각 형질전환 벼 및 담배에 관하여 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루쿠로니드의 분해에 의한 형광강도의 변화로부터 GUS 활성을 측정하였다. 도 4에 건조 스트레스 부하시에서 각종 프로모터 도입 형질전환 식물의 GUS 활성을 나타낸다.

도 4로부터 분명한 바와 같이, 단자엽 식물인 벼에서는 rd29A 프로모터로부터도 salT 프로모터나 LIP9 프로모터가 보다 강한 스트레스 유도성을 나타내었다. 특히 LIP9 프로모터는 salT의 약 2배의 강한 활성을 나타내었다. LIP9 프로모터는 쌍자엽 식물인 담배이어도 스트레스 유도성 프로모터 활성을 나타내었으나, 벼에 비교하여 그 활성은 약하였다.

(3) 염 스트레스에 대한 프로모터 활성

이어 LIP9 프로모터 GUS 작성물 도입 벼의 식물체 전체를 염수에 침지시키고, GUS 염색을 실시했더니, 식물체 전체가 염색되었다(도 5). 이 점으로 보아 LIP9 프로모터는 스트레스를 부하된 식물체 전체에서 작용하는 것이 확인되었다.

[실시예 4] 스트레스에 대한 WSI724 프로모터 활성

실시예 3과 동일하게하여 WSI724 프로모터로 형질전환시킨 벼를 제조하고 그 스트레스 내성을 확인하였다.

(1) 트랜스제닉 식물의 작성

pBIG29APHSNot의 프로모터 부위를 옥수수의 유비퀴틴 프로모터로 치환하여 제작한 G-ubi 플라스미드를 BamHI-HindIII로 절단하고, 동일하게 절단한 WSI724 프로모터의 단편과 연결시켰다. WSI724 프로모터를 조작한 플라스미드를 BamHI 로 절단하여 말단을 평활화시킨 후 pBIG 벡터의 SmaI 로 절단한 부위에 연결시켜 GUS 발현 작성물(WSI724: GUS)를 제작하였다. 이어서, 플라스미드 WSI724:GUS를, 배향후 10% 글리세롤로 세정한 아그로박테륨 EHA105에 엘렉트로포레이션법에 의해 도입하고, 아그로박테륨 EHA105 (WSI724:GUS)를 제조하였다. 이 아그로박테륨 EHA105 (WSI724:GUS)를 벼에 감염시켜 형질전환체를 제조하였다.

(2) 건조 스트레스에 대한 프로모터 활성

수득한 GUS 형질전환체 벼를 실시예 3과 동일하게하여 건조 스트레스에 노출시키고, 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루쿠로니드의 분해에 의한 형광강도의 변화로부터 GUS 활성을 측정하였다. 그 결과, 건조 스트레스를 부하(절취하여 24시간 방치)한 형질전환 벼의 잎에서는 대조용(절취하여 곧 동결)의 잎과 비교하여 높은 GUS 활성이 확인되었다. 또한 건조 스트레스 (24시간) 부하한 후의 형질전환 벼를 GUS 염색해보니 뿌리와 잎의 모두에서 GUS 활성이 확인되었다.

[실시예 5] 형질전환 벼 중의 도입 유전자와 LIP9 및 WSI724 유전자의 발현

실시예 3과 동일하게하여, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터, 또는 35S 프로모터 지배하에 OsDREB1A 유전자 (서열번호 6) 또는 DREB1C 유전자(서열번호 8)를 벼에 도입한 형질전환체를 제조하였다. 그리고 형질전환체의 도입 유전자 OsDREB1A 및 DREB1C를 도입유전자가 발현을 변화시킨 것으로 생각되는 LIP9 (a0022), WSI724(a0066), salT(a2660)의 mRNA 레벨을 노던 분석에 의해 조사하였다.

프로브로서는 OsDREB1A 유전자 (서열번호 6), DREB1C 유전자 (서열번호 7), LIP9 유전자 (a0022: 서열번호 2), WSI724 유전자 (a0066: 서열번호 8), salT 유전자 (a2660: 서열번호 9)를 이용하였다(서열번호 6, 7에 관해서는 서열표 중의 각 코딩 영역의 서열을 프로브로 하여 사용). 대조용으로서는 벡터만을 형질전환시킨 벼를 동일하게 분석하였다.

형질전환 벼는 5일간 30 mg/ml 하이그로마이신을 포함하는 0.1% 벤레이트 용액 중에서 선발한 후 본솔 1호가 들어있는 화분에 갈아심어서 12일간 생육시켰다. 야생주도 동일하게 생육하였다. 각 식물로부터 전체 RNA를 제조하고, 전기영동을 실시하여 실시예 1과 동일하게 노던법으로 각 유전자의 발현을 관찰하였다. 결과를 도 6에 나타낸다. 도 중, a, b, c는 각각 형질전환체의 라인을 나타낸다.

이 결과, OsDREB1A, DREB1C 유전자를 도입한 형질전환 벼에서는 프로모터 영역에 DRE 서열을 가진 LIP9의 발현은 유도되었지만, 프로모터 영역에 DRE 서열을 갖지 않는 salT의 발현은 도입 유전자 (OsDREB1A나 DREB1C)의 발현과 일치하지 않았다. 또한 LIP9 과 동일하게 프로모터 영역에 DRE 서열을 갖고, OsDREB의 타겟으로 되어 있는 것으로 예상되는 WSI724 유전자의 발현도 이들 형질전환체에서 유도되었다.

LIP9나 WSI724 프로모터 상에는 DRE 서열이 존재하고, OsDREB1A 유전자의 과잉발현체에서는 LIP9 유전자나 WSI724 유전자가 고발현하고 있다. LIP9나 WSI724는 OsDREB1A를 필두로하는 OsDREB 유전자의 표적유전자로 생각되며, 따라서 LIP9나 WSI724 프로모터는 OsDREB 유전자를 과잉발현하기 위한 최적 프로모터로 추정된다.

[참고예 1] pBE35S: OsDREB1A, G-ubi:OsDREB1A 및 G35S-Sh△:OsDREB1A의 제조

먼저, G-ubi, G35S-Sh△는 이하와 같이 제조하였다. 먼저, pBIG 플라스미드 (Nucleic Acids Research 18: 203 (1990))를 BamHI으로 절단. 평활화 처리한 후 연결시켜 BamHI 절단 부위를 부수고, 또한 HindIII과 EcoRI으로 절단하였다. 이 단편과 pBE2113Not 플라스미드를 동일하게 절단하여 얻을 수 있는 약 1.2 kb의 단편을 연결하여 pBIG2113Not 플라스미드를 제조하였다.

이어서, pBIG2113Not를 HindIII와 BamHI으로 절단하고, 동일하게 절단된 rd29A 프로모터의 단편 (약 0.9 kb, Nature biotechnology 17: 287-291 (1999))와 연결하여 pBIG29APHSNot 플라스미드를 제조하였다. 또한 이 pBIG29APHSNot 플라스미드를 HindIII와 SalI으로 절단한 후, 동일하게 절단된 옥수수의 유비퀴틴 유전자 (ubi-1)의 프로모터의 단편(약 2.0 kb, Plant Molecular Biology 18: 675-689 (1992)) 또는 p35S-sh△-stop의 CaMV 35S 프로모터와 옥수수의 수크로오스 신타제 유전자(sh1)의 인트론의 일부를 포함한 단편(약 1.6 kb, Proceeding National Academy of Science USA 96: 15348-15353 (1999))과 연결하여 G-ubi 플라스미드 또는 G35S-Sh△플라스미드를 제조하였다.

상기 pBE2113Not, G-ubi 및 G35S-Sh△는 각각 BamHI으로 절단한 후 동일하게 절단한 벼의 전사인자를 코드하는 OsDREB1A 유전자 단편과 ligation high (동양방적사 제조)를 이용하여 연결하고, 수득한 연결물에 의해 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 형질전환체를 배양한 후 배양물로부터 플라스미드 pBE35S:OsDREB1A, G-ubi:OsDREB1A 및 G35S-Sh△:OsDREB1A를 각각 정제하였다. 이어서, 이들의 염기서열을 결정하고, OsDREB1A 유전자가 센스 방향으로 결합한 것을 선발하였다.

상기 플라스미드 pBE35S:OsDREB1A를 가진 대장균 DH5α와 헬퍼 플라스미드 pRK2013을 가진 대장균 HB101 및 아그로박테륨 C58을 함께 LB 한천 배지를 이용하여 28℃에서 24시간 혼합 배양하였다. 생성한 콜로니를 저어서 취하고, 1 ml의 LB 배지에 현탁시켰다. 이 현탁액 10 ㎕를 리팜피실린 100 mg/l, 및 카나마이신 20 mg/l를 포함하는 LB 한천배지에 도포하고, 28℃에서 2일간 배양하여 접합체 아그로박테륨 C58 (pBE35S: OsDREB1A)를 얻었다. 한편, 상기 플라스미드 G-ubi:OsDREB1A 과 G35S-Sh△:OsDREB1A의 플라스미드를 배양 후 10% 글리세롤로 세정한 아그로박테륨 EHA105에 엘렉트로포레이션법에 의해 도입하고 아그로박테륨 EHA105 (G-ubi:OsDREB1A)와 아그로박테륨 EHA015(G35S-Sh△:OsDREB1A)를 각각 얻었다.

본 명세서 중에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고로서 본 명세서 중에 포함하는 것으로 한다.

본 발명에 의하면, 단자엽 식물에서 효과적으로 작용할 수 있는 스트레스 유도성 프로모터가 제공된다. 이 프로모터는 DRE 서열을 포함하고, 따라서 그 지배하 에 OsDREB 유전자 등을 연결하여 식물에 도입하면, 벼 등의 단자엽 식물에서 강한 스트레스 내성 트랜스제닉 식물을 제작할 수 있다.

서열표 설명

서열번호 3 - 인공서열의 설명: 프라이머

서열번호 4 - 인공서열의 설명: 프라이머

서열번호 11 - 인공서열의 설명: 프라이머

서열번호 12 - 인공서열의 설명: 프라이머

SEQUENCE LISTING <110> Japan International Research Center for Agricultural Sciences Incorporated Administrative Agency, National Agriculture and Bio-oriented Research Organization <120> Stress Inducible Promoter and Its Uses <130> PH-2004-PCT <140> <141> <150> JP 2003-80847 <151> 2003-03-24 <160> 12 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1066 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <223> Inventor: Shinozaki, Kazuko; Katsura, Koji; Ito, Yusuke <400> 1 tcatcagcta tcatcaaagc gaaggaaaga aagaaaaata aaaggaaaag aactggctgg 60 aaattagaga agccccggac gactcgatct gggggtggca aattaatcag tgtgatcaac 120 agggataact tatcccgtcc gaccaaatcc accaaccaaa ccaagacccg atttgttagg 180 ctgtgaaaga cggatcagtg ggaccctgat ctacggaccc catatgtcac cgtccaggtc 240 tctggatctc tcccgtcgtc ctaatcagac accgcgcgcg cggtgccgtc gctctcgagc 300 cgtgtcccgc tcccaactcg tcacaaaagc gatcacagac tcttccttcc tctgctggga 360 gagaagaaaa attggccgcg atgatgccga taaagaggaa aaagggatga gaatccgatg 420 gaaaaaaact gatgttaatc tatcgctact gctgcgcact aagacgaatc gtatccgaac 480 aagaaacgct tacgttactg ttcctaaatg gatcgctccg ctcatcactt aaccaaaaat 540 cgattaggaa attgacggac agcgacgccc gaagccaagt gtctcgtcgc gtaggcgtcg 600 aggcctcgaa gcagagggag cggagaggcg gacgcgccgc ccacgcctcc tctccctcgg 660 tgacacggcc gtctggctcc acatggcgcc gacctctccc gatgcgtcca cccgtcccga 720 ggcaccgcca cgtcggaacc agccggccgc cccacgcgat tgccgacacg cgtcgcggcg 780 ccactggctc acccgctgcc tgcctctgcc tgccccccat ctcgtcgcca tttcccgccc 840 acgcttcttg tcctcgcgtc gcctacgcgt acgtacgata caaacgccgc acctttcgat 900 cccctccgct atataaggag ggcatctgcc tcgccacctt cttcatccga aagcaaaagc 960 gactcgtcac agctcaaaca agtcaagagc gaatagttct tgctgatctg ttgtttgatt 1020 actttagttc tcgagaggct ttagctgaat ccatcgatcg aggatg 1066 <210> 2 <211> 1245 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 2 gctagcagag ctcgtcacag ctcaaacaag tcaagagcga atagttcttg ctgatctgtt 60 gtttgattac tttagttctc gagaggcttt agctgaatcc atcgatcgat catggaggat 120 gagaggaaca cggagagcca ccagggtggc gaggctgcag agcaggtgga ggtgaaggac 180 aggggcctct tcgacaacct ccttggcagg aagaaggacg atcagccgga ggagaagaag 240 catgaggagg agcttgtcac cggcatggag aaggtctccg tggaagagcc aaagaaggag 300 gagcaccacg ccgagggcga gaagaaggag agcctcctct ccaagctgca ccgatccagc 360 tccagctcca gctcgtcgag tgatgaggaa gaggaggtga tcgatgacaa cggcgaggtg 420 gtcaagagga agaagaagaa ggggctcaag gagaagatca aggagaagct gcccggccac 480 aaggaccatg ccggtgagca tgctcctccg cccgcggcga cgggcttccc gcgccggctc 540 cgctgcatcc gtggtgacgg ccgcgcccac gccactcctg ctcccgtggt gactcacggc 600 gatcaccacc acgacaccgc cgtccccgtg gaaaagatcg agggtgatca cgccagacgg 660 aggcgaccct gccacgtgca cccgaggagg aaaaaagggc ttcctcgaca agatcaagga 720 gaagctgccc ggcggccaca agaagccgga agacgcaact gctgtgccgc cgccggccgc 780 ctcaccggct gctcctgcca ctactccggc gccagcacac ccaccgccgg ctacagagga 840 agtgagcagc ccggatggga aggagaagaa gggtatactg ggcaagatca tggagaaact 900 gcccggttac cacaagggct ccggcgagga agacaagacc gccgccgccg ccaccggcga 960 gcacaagagc agcgcttaat tggggcgtgt gtgagaccag gccatggttg gaatttggaa 1020 gtgtttggcg tgtgttagtt tggtgctttt tctgcactgc 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Claims (10)

1. 이하의 (a) 또는 (b)의 DNA로 구성되는, 벼 유래의 프로모터:

   (a) 서열번호 1 또는 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 구성된 DNA,

   (b) 서열번호 1 또는 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 구성되는 DNA에 상보적인 염기서열로 구성되는 DNA와 스트린젠트 조건하에서 혼성화되고 또 스트레스 유도성 프로모터 활성을 갖는 DNA.
2. 제 1항에 있어서, 상기 스트레스가 건조 스트레스, 저온 스트레스 또는 염 스트레스인 프로모터.
3. 제 1항 또는 제 2항에 기재된 프로모터를 포함하는 재조합 벡터.
4. 제 3항에 있어서, 제 1항 또는 제 2항에 기재된 프로모터 지배하에서 스트레스 내성을 향상시키는 구조 유전자 및/또는 조절유전자를 작용할 수 있는 상태로 포함하는 벡터.
5. 제 4항에 있어서, 스트레스 내성을 향상시키는 구조 유전자 및/또는 조절유전자가 프롤린 합성의 열쇠 효소 P5CS 유전자, 갈락티놀 합성유전자 AtGolS3 유전자, 아기장대 유래 전사인자 DREB 유전자, 벼 유래 전사인자 OsDREB 유전자 및 ABA 합성효소 NCED 유전자로부터 선택되는 벡터.
6. 제 5항에 있어서, 스트레스 내성을 향상시키는 구조유전자 및/또는 조절유전자가 벼 유래 전사인자 OsDREB 유전자인 벡터.
7. 제 3항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 기재된 벡터를 숙주에 도입하여 얻을 수 있는 형질전환체.
8. 제 7항에 있어서, 숙주가 식물인 형질전환체.
9. 제 8항에 있어서, 숙주가 단자엽 식물인 형질전환체.
10. 제 1항 또는 제 2항에 기재된 프로모터를 식물에 도입하는 것에 의해 식물의 스트레스 내성을 향상시키는 방법.

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