CN117024544A - 白菜型油菜Bra023796基因在提高白菜型油菜耐高温胁迫能力中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物基因工程技术领域，更具体而言，涉及白菜型油菜Bra023796基因在提高白菜型油菜耐高温胁迫能力中的应用。本发明利用白菜型油菜(菜心45)Bra023796基因的核苷酸序列996bp和pCAMB IAsuper1300‑EGFP构建过表达载体，并通过转基因技术将该基因片段转入白菜型油菜，相比于野生型植株，过表达Bra023796转基因植株能显著增强白菜型油菜的高温胁迫耐受性，表明白菜型油菜Bra023796基因能够作为白菜型油菜耐高温胁迫的正调控因子。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及白菜型油菜Bra023796基因在提高白菜型油菜耐高温胁迫能力中的应用。
背景技术
高温会对植物的生长和生产力产生不利影响，贯穿植物的整个生育过程，而花期高温则对产量影响较大，是导致减产的重要因素之一。
多年来对DMC1的研究发现，DMC1基因不仅在植物生殖生长的减数分裂阶段发挥重要作用，而且还发现DMC1在小麦中为温度候选基因，在白菜型油菜中能够响应盐胁迫。目前，已经证明DMC1在温度和盐胁迫中具有抗逆性，而且利用基因工程来提高植物的抗逆性和生产力是非常理想的，Bra023796(DMC1基因)可作为不同抗逆性植物的候选基因。
而且白菜型油菜在我国种植历史悠久，品种资源丰富，产销稳定，是日常一种主要的叶菜类蔬菜，其常受高温胁迫的影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种白菜型油菜Bra023796基因在提高白菜型油菜耐高温胁迫能力中的应用。
为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
白菜型油菜Bra023796基因在提高白菜型油菜耐高温胁迫能力中的应用，所述白菜型油菜Bra023796基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述白菜型油菜Bra023796基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；应用时，包括如下步骤：
S1：选用白菜型油菜为实验材料，pCAMBIAsuper1300-EGFP载体、大肠杆菌DH5α以及农杆菌GV3101作为实验对象；
S2：取新鲜的白菜型油菜叶片100mg，加入液氮并充分研磨，提取白菜型油菜总RNA，反转录合成cDNA第一链；
S3：根据白菜型油菜v1.5参考基因组上Bra023796基因的核苷酸序列，设计特异性引物，在上游引物5'端加上内切酶XbaI及保护碱基，在下游引物5'端添加内切酶KpnI及保护碱基，形成F1和R1引物，用所述引物通过PCR扩增目的片段并进行琼脂糖凝胶电泳，回收所述目的片段；
S4：使用内切酶XbaI和内切酶KpnI对胶回收的目的片段和表达载体pCAMBIAsuper1300-EGFP进行双酶切，通过2×Universal Ligation Mix将步骤S3中双酶切的目的片段与双酶切后的线性表达载体pCAMBIAsuper1300-EGFP进行连接,获得过表达白菜型油菜Bra023796基因的表达载体；
S5：将所述表达载体转化大肠杆菌DH5α，37℃下倒置培养12h后，挑取单克隆在含有5ml LB培养基(已加入Kana抗生素，浓度为100μg/mL)的试管中摇菌12h，质粒抽提后进行测序验证；
S6：将测序正确的所述表达载体转化农杆菌GV3101，挑取单克隆在试管中摇菌24h后转大摇：将菌液接种入100mL的YEB培养基(已加入Kana和Rif抗生素，Kana浓度为100μg/mL，Rif的浓度为50μg/mL)中，继续摇菌至OD600＝0.8-1.0；
S7：将培养好的菌液分装于50mL离心管中，在室温下以5000rpm转速离心10分钟，弃去上清液，用配好的重悬液对50mL离心管中沉淀的菌体进行重悬浮，并用所述重悬液调整菌液浓度至OD600＝0.8-1.0；所述重悬液的配置方法为含5％蔗糖的1/2MS液体培养基，加入50mg/L的乙酰丁香酮(AS)和0.02％表面活性剂Silwet L-77；
S8：使用步骤S7得到的菌液对白菜型油菜花苞浸染；
S9：过表达Bra023796基因的白菜型油菜的筛选和鉴定；
S10：对高温胁迫下的所述转基因白菜型油菜的表型及耐高温能力分析。
进一步地，所述步骤S1中，所述OE-Bra023796转基因白菜型油菜中插入Bra023796的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，长度为996bp，与白菜型油菜v1.5参考基因组上Bra023796基因的核苷酸序列相比，缺少终止密码子，且在210bp和270bp位置均有一个A转换为G，但不改变氨基酸序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
进一步地，所述步骤S3中，所述引物F1和R1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示。
进一步地，所述步骤S6中，测序验证的方法为选取单克隆菌落摇菌、提质粒，在载体上所述目的片段插入位置的两端设计引物，PCR验证目的基因是否成功连入载体，并对重组质粒进行测序验证。
进一步地，所述步骤S8中浸染方式包括：用镊子将每个花苞拨开一个开口，把花序逐次浸入菌液中20秒，期间上下晃动花序，浸染完成后用清水喷洒花序并进行套袋处理，套袋完成后把浸染过的植株避光24h，24h后恢复正常培养条件，一周之后，把不适合浸染的花苞去除，并对新出现的待开花苞拨开小口，然后按照同样的方法进行第二次浸染。
本发明还提供了白菜型油菜Bra023796基因过表达载体在提高白菜型油菜耐高温胁迫能力中的应用，所述过表达载体是通过pCAMBIAsuper1300-EGFP载体构建获得，所述白菜型油菜Bra023796基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；或白菜型油菜Bra023796基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明还提供了一种调控白菜型油菜耐高温胁迫的方法，所述方法包括：调控白菜型油菜Bra023796基因的活性，所述白菜型油菜基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；或白菜型油菜Bra023796基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步地，所述方法包括：通过pCAMBIAsuper1300-EGFP构建白菜型油菜Bra023796基因过表达载体，使Bra023796基因的表达量升高；所述白菜型油菜基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；或白菜型油菜Bra023796基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明与现有技术相比，具有的有益效果是：
1、本发明通过白菜型油菜中耐高温Bra023796基因，构建全长基因过表达载体，通过转基因技术将该基因片段转入白菜型油菜，获得的OE-Bra023796转基因白菜型油菜，能有效地增强植株在高温胁迫下的耐受性。
2、本发明表明白菜型油菜Bra023796基因能够作为白菜型油菜耐高温胁迫因子，为研究植物耐高温机制提供借鉴，同时获得的耐高温转基因白菜型油菜是耐受非生物胁迫、适应环境变化的良好株型品种。
附图说明
图1为本发明中OE-Bra023796转基因白菜型油菜中Bra023796基因的表达量验证；
图2为本发明中OE-Bra023796转基因白菜型油菜在22℃和38℃人工培养箱中处理24h的整体表型；
图3为本发明中OE-Bra023796转基因白菜型油菜在22℃和38℃人工培养箱中处理24h时的花粉育性和可染率统计分析；
图4为本发明中OE-Bra023796转基因白菜型油菜在22℃和38℃人工培养箱中处理24h时的花器官表型；
图5为本发明中OE-Bra023796转基因白菜型油菜在22℃和38℃人工培养箱中处理24h时花器官各部分统计分析；
图6为本发明中OE-Bra023796转基因白菜型油菜在22℃和38℃人工培养箱中处理24h时雄配子减数分裂中粗线期的染色体联会行为；
图7为本发明中OE-Bra023796转基因白菜型油菜在22℃和38℃人工培养箱中处理24h时雄配子中其他减数分裂期的染色体行为；
图8为本发明中OE-Bra023796转基因白菜型油菜在22℃和38℃人工培养箱中处理24h时减数分裂异常的细胞百分比统计分析；
图9为本发明中OE-Bra023796转基因白菜型油菜在22℃和38℃人工培养箱中处理24h时花药的石蜡切片图；
图10为本发明中OE-Bra023796转基因白菜型油菜在22℃和38℃人工培养箱中处理24h时从四分体到小孢子形成的发育过程；
图11为本发明中OE-Bra023796转基因白菜型油菜在22℃和38℃人工培养箱中处理24h时活性氧含量和抗氧化酶类的含量变化；
图12为本发明中OE-Bra023796转基因在22℃和38℃人工培养箱中处理24h时DSB形成和修复、联会复合体组分、减数分裂细胞周期转变等相关基因的表达量分析。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
OE-Bra023796转基因白菜型油菜的创制
S1：选用白菜型油菜(菜心45)为实验材料，pCAMBIAsuper1300-EGFP载体、大肠杆菌DH5α以及农杆菌GV3101作为实验对象。
S2：取新鲜的白菜型油菜(菜心45)叶片100mg加入液氮并充分研磨，提取白菜型油菜总RNA，反转录合成cDNA第一链；
S3：获取白菜型油菜v1.5中Bra023796基因的参考序列为999bp，在参考序列上设计产物为996bp的引物(不包含终止密码子TAA)，在上游引物5'端分别加上内切酶Xba I及保护碱基，下游引物5'端添加内切酶Kpn I及保护碱基，形成F1和R1引物(SEQ ID NO:3-4)，用该引物通过PCR扩增目的片段并进行琼脂糖凝胶电泳；
其中引物序列如下：
PCR反应体系如下：
PCR反应程序如下：
S4：使用内切酶Xba I和内切酶Kpn I对胶回收的目的片段和表达载体pCAMBIAsuper1300-EGFP进行双酶切，通过2×Universal Ligation Mix将步骤S3中双酶切的目的片段与双酶切后的线性表达载体pCAMBIAsuper1300-EGFP进行连接,获得过表达白菜型油菜Bra023796基因的表达载体；
其中连接体系如下：
S5：将表达载体连接产物转化大肠杆菌DH5α，37℃下倒置培养12h后，挑取单克隆在含有5ml LB培养基(已加入Kana抗生素，浓度为100μg/mL)的试管中摇菌12h，质粒抽提后进行测序验证，得到OE-Bra023796载体中插入序列为SEQ ID NO:1；
S6：将测序正确的所述表达载体转化农杆菌GV3101，挑取单克隆在试管中摇菌24h后转大摇：将菌液接种入100mL的YEB培养基(已加入Kana和Rif抗生素，Kana浓度为100μg/mL，Ri f的浓度为50μg/mL)中，继续摇菌至OD600＝0.8-1.0；
S7：将培养好的菌液分装于50mL离心管中，在室温下以5000rpm转速离心10分钟，弃去上清液，用配好的重悬液对50mL离心管中沉淀的菌体进行重悬浮，并用重悬液调整菌液浓度至OD600＝0.8-1.0；
S8：使用步骤S7得到的菌液对白菜型油菜花苞浸染；
S9：对OE-Bra023796转基因白菜型油菜进行筛选和鉴定：首先将种子播种在抗性培养基上进行初步筛选，再将初筛后的转基因幼苗移入常规营养土中培养，注意移苗时要将幼苗根部的培养基清洗干净，不要伤到根系。提取阳性土培苗的DNA，用pCAMBIAsuper1300-EGFP的EGFP序列和Bra023796的全长序列设计引物进行PCR检测。再将筛选到的5棵OE-Bra023796转基因白菜型油菜(菜心45)提取RNA，反转录成DNA作为模板，通过实时荧光定量PCR检测Bra023796基因的表达量，结果如图1所示，Bra023796基因的表达量升高，即OE-Bra023796转基因白菜型油菜创制成功，表型如图2所示。
实施例2
转Bra023796基因白菜型油菜耐高温胁迫的细胞遗传学实验分析
在高温胁迫下，将处于花期的野生型菜心45以及OE-Bra023796转基因白菜型油菜(菜心45)的三个株系处理24h，在正常条件和高温胁迫下观察植株的表型、花粉育性、减数分裂过程、绒毡层发育和小孢子发育过程，如图2-10所示，观察各植株的细胞学过程并统计各植株的花粉可染率和减数分裂过程中不正常的染色体行为。结果表明，与野生型相比，OE-Bra023796转基因植株生长发育及生殖期间减数分裂过程对高温胁迫的适应性更强。
实施例3
转Bra023796基因白菜型油菜耐高温胁迫的分子生化实验分析
在高温胁迫下，将处于花期的野生型菜心45以及OE-Bra023796转基因白菜型油菜(菜心45)的三个株系处理24h，在正常条件和高温胁迫下对植株的活性氧含量(超氧阴离子、过氧化氢和羟自由基)、抗氧化酶活性(超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶)和不同基因(DSB形成和修复、联会复合体组分、减数分裂细胞周期转变等相关基因)的表达量进行检测，如图11-12所示，与野生型植株相比，OE-Bra023796转基因植株的活性氧含量显著降低，抗氧化酶活性显著升高，DSB形成和修复、联会复合体组分、减数分裂细胞周期转变等相关基因表达水平均有不同程度的增强。这表明，与野生型植株相比，OE-Bra023796转基因植株的抗氧化能力增强，可以更好的应对高温胁迫，Bra023796基因能够正向调控植株的高温胁迫耐受性。
上面仅对本发明的较佳实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化，各种变化均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.白菜型油菜Bra023796基因在提高白菜型油菜耐高温胁迫能力中的应用，其特征在于：所述白菜型油菜Bra023796基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述白菜型油菜Bra023796基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.如权利要求1所述的白菜型油菜Bra023796基因在提高白菜型油菜耐高温胁迫能力中的应用，其特征在于：包括如下步骤：
S1：选用白菜型油菜为实验材料，pCAMBIAsuper1300-EGFP载体、大肠杆菌DH5α以及农杆菌GV3101作为实验对象；
S2：取新鲜的白菜型油菜叶片100mg，加入液氮并充分研磨，提取白菜型油菜总RNA，反转录合成cDNA第一链；
S3：根据白菜型油菜v1.5参考基因组上Bra023796基因的核苷酸序列，设计特异性引物，在上游引物5'端加上内切酶XbaI及保护碱基，在下游引物5'端添加内切酶KpnI及保护碱基，形成F1和R1引物，用所述引物通过PCR扩增目的片段并进行琼脂糖凝胶电泳，回收所述目的片段；
S4：使用内切酶XbaI和内切酶KpnI对胶回收的目的片段和表达载体pCAMBIAsuper1300-EGFP进行双酶切，通过2×Universal Ligation Mix将步骤S3中双酶切的目的片段与双酶切后的线性表达载体pCAMBIAsuper1300-EGFP进行连接,获得过表达白菜型油菜Bra023796基因的表达载体；
S5：将所述表达载体转化大肠杆菌DH5α，37℃下倒置培养12h后，挑取单克隆在含有5mlLB培养基的试管中摇菌12h，质粒抽提后进行测序验证；
S6：将测序正确的所述表达载体转化农杆菌GV3101，挑取单克隆在试管中摇菌24h后转大摇：将菌液接种入100mL的YEB培养基中，继续摇菌至OD600＝0.8-1.0；
S7：将培养好的菌液分装于50mL离心管中，在室温下以5000rpm转速离心10分钟，弃去上清液，用配好的重悬液对50mL离心管中沉淀的菌体进行重悬浮，并用所述重悬液调整菌液浓度至OD600＝0.8-1.0；所述重悬液的配置方法为含5％蔗糖的1/2MS液体培养基，加入50mg/L的乙酰丁香酮(AS)和0.02％表面活性剂Si lwet L-77；
S8：使用步骤S7得到的菌液对白菜型油菜花苞浸染；
S9：过表达Bra023796基因的白菜型油菜的筛选和鉴定；
S10：对高温胁迫下的所述转基因白菜型油菜的表型及耐高温能力分析。
3.如权利要求2所述的白菜型油菜Bra023796基因在提高白菜型油菜耐高温胁迫能力中的应用，其特征在于：所述步骤S1中，所述OE-Bra023796转基因白菜型油菜中插入Bra023796的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，长度为996bp，与白菜型油菜v1.5参考基因组上Bra023796基因的核苷酸序列相比，缺少终止密码子，且在210bp和270bp位置均有一个A转换为G，但不改变氨基酸序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
4.如权利要求2所述的白菜型油菜Bra023796基因在提高白菜型油菜耐高温胁迫能力中的应用，其特征在于：所述步骤S3中，所述引物F1和R1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQID NO:4所示。
5.如权利要求2所述的白菜型油菜Bra023796基因在提高白菜型油菜耐高温胁迫能力中的应用，其特征在于：所述步骤S6中，测序验证的方法为选取单克隆菌落摇菌、提质粒，在载体上所述目的片段插入位置的两端设计引物，PCR验证目的基因是否成功连入载体，并对重组质粒进行测序验证。
6.如权利要求2所述的白菜型油菜Bra023796基因在提高白菜型油菜耐高温胁迫能力中的应用，其特征在于：所述步骤S8中浸染方式包括：用镊子将每个花苞拨开一个开口，把花序逐次浸入菌液中20秒，期间上下晃动花序，浸染完成后用清水喷洒花序并进行套袋处理，套袋完成后把浸染过的植株避光24h，24h后恢复正常培养条件，一周之后，把不适合浸染的花苞去除，并对新出现的待开花苞拨开小口，然后按照同样的方法进行第二次浸染。
7.白菜型油菜Bra023796基因过表达载体在提高白菜型油菜耐高温胁迫能力中的应用，其特征在于，所述过表达载体是通过pCAMBIAsuper1300-EGFP载体构建获得，所述白菜型油菜Bra023796基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；或白菜型油菜Bra023796基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
8.一种调控白菜型油菜耐高温胁迫的方法，其特征在于，所述方法包括：调控白菜型油菜Bra023796基因的活性，所述白菜型油菜基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；或白菜型油菜Bra023796基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
9.一种调控白菜型油菜耐高温胁迫的方法，其特征在于，所述方法包括：通过pCAMBIAsuper1300-EGFP构建白菜型油菜Bra023796基因过表达载体，使Bra023796基因的表达量升高；所述白菜型油菜基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；或白菜型油菜Bra023796基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
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