CN1182455A - 用于产生可育纯合植株的转化的胚发生小孢子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及转化的胚发生小孢子和其子代,其特征在于其是被根癌土壤杆菌转化的,能够导致产生非嵌合的转化的单倍体或双单倍体胚(此胚在一个世代内长成可育的纯合植株),并且包含稳定地整合进它们的基因组的外源DNA,所说的DNA的特征在于包含至少一个兴趣基因和至少在土壤杆菌属T－DNA的右边缘序列内的碱基对。本发明还涉及将外源DNA掺入到小孢子染色体中的方法,该方法包括以下步骤:a)以土壤杆菌感染胚发生小孢子,所述土壤杆菌包含携带有兴趣基因的质粒,该兴趣基因在以至少一个T－DNA边缘为边界的起始和终止区调节控制下;b)在共培养后洗去并杀灭土壤杆菌。

Description

用于产生可育纯合植株的转化的胚发生小孢子
1.引言
利用不同的转化技术能产生转基因农作物植株。利用组织培养生长出植株是有效的方法，这种物种和品种的选择方法利用土壤杆菌属(Potrykus1993)。根癌土壤杆菌转化系统是廉价的，并且简单易行(DeBlock1993)。它是把外源DNA转移到寄主植株的最有效的方法(Thierfelder等，1993)。以有限数量的基因插入来获得植株，通常DNA的插入完全、专一地发生在两个限定的边缘序列之间(DeBlock1993)。根据对田间试验的用途和明显的进展来看，大多数转基因实验都包括土壤杆菌属系统也是不足为奇的(White 1993)。
高等植株的小孢子具有发育的潜力，在适当的条件下它直接进入单倍体或者是双单倍体植株。高等植株的小孢子在体内产生进入花粉粒(配子体途径)。小孢子培养物能引起一个选择的(孢子体的)途径，这个途径导致单倍体和双单倍体胚的形成。这些胚直接生长为正常的可育植株。容易误解的是这些胚有时被称作花粉胚。
生产每个转基因品种，如果利用培养小孢子转化体，工作量要比从杂合植株材料得到转化体的工作节省的时间估计为三年。这是因为这些基因在纯合双单倍体系中的立即固定。这允许更有效地选择农学和质量性状，同时能快速的检验生产杂交品种的配合力。
因为胚发生小孢子产生纯合的可育植株，同时又是单一的单倍体细胞，所以在理论上它们是大多数基因转移的合适的接受者(Huang和Keller1989)。
一些实验室(Potrykus 1991，Heberle-Bors 1995)曾试图用土壤杆菌属转化小孢子，但没有成功；Sangwanl等(1993)也得出结论：＂如果用土壤杆菌属感染花粉或原胚，可能获得转基因植株是很困难的＂。有趣的是Heberle-Bors(1995)总结他试图转变小孢子时描述：根癌土壤杆菌不适于把DNA转移到小孢子，这和他的1989年的专利相反。认为小孢子的厚细胞壁使土壤杆菌属难以进入(Stoger等1995，Jones-Villeneuve等1995)。
通常利用的是多细胞单倍体组织诸如小孢子衍生胚(Neuhaus等1987，Swanson和Erickson 1989，Huang 1992)或者是单倍体的茎段(Amoldo 1992)。
一种普遍的错觉是能得到双单倍体植株的小孢子和小孢子衍生胚之间的区别。小孢子是单一细胞，被刺激后能产生胚。小孢子的转化能产生非嵌合胚，进而产生植株。另一方面，小孢子衍生胚是多细胞组织。小孢子衍生胚片断的转化可以产生嵌合部分，从嵌合部分能选择嵌合径或次生胚。此外，体细胞克隆变异是很普通的，因为通常有一中间的愈伤组织阶段和由小孢子衍生胚片断的再生相联系。
先前本领域最相关的报道是关于土壤杆菌属的小孢子共培养的Pechan出版物(1989)。他声称对卡那霉素和潮霉素抗性植株的产生，但是没有证明转基因的DNA整合或性感染性，而且描述的方法没有被其他人重现出来(Huang 1992)。
一些报告描述了小孢子转化技术的用途。Huang(1992)报导在小孢子应用微型注射、粒子轰击和电穿孔，观察一些瞬时基因表达，但是没有得到稳定的转化体。这篇报告也描述了土壤杆菌属在小孢子上的用途和在所做的50个实验中在存在土壤杆菌的条件下在原胚期只得到仅一种植株的再生，而且结果也没有再现性。Jardinaud等(1993)报告了在实验中利用电穿孔，B.napus小孢子的只有瞬时的基因表达，同时还报告了玉米小孢子上利用biolistics(Jardinaud 1995)。试图在B.napus小孢子上利用微型注射，但是没有成功(Jones-Villeneuve等1995)。
粒子轰击是用在胚发生小孢子上得到稳定的转化植株的唯一方法，(Jahne等1994，Stoger等1995)，然而，在比较不同的转化方法后，Christou(1995)得出，以biolistics决定那一点，基因转移方法的基本的机理还不清楚，并且不可能控制DNA的含量，而且整合模型是主要的障碍。转化植株通常有多个副本(Jahne等1994)和可包含或不包含全部的兴趣基因的随机片段的DNA插入片段。
为达到育种目标，单一拷贝基因插入体是理想的，因为它们容易筛选，以后的生长也很容易，并且基因表达也好。此外，这种植株只需要转录必需的酶和现象，如协同抑制，即通过具有实质同源性的该基因的额外拷贝的基因副调节(WO 90/12084)，至于有价值的植株能量的浪费没有考虑在内。
允许单一拷贝并具有确定边界序列的基因插入最理想的转化载体是利用自然发生的根癌土壤杆菌转化方法。我们惊奇地发现由根癌土壤杆菌小孢子的转化是可行的，并且产生了的可育纯合植植株，此植株存在具有优势的单一拷贝插入片段，在芜菁和B.napus基因型中通过SOUTHERN印迹已经确认了此插入片段。利用胚发生小孢子和根癌土壤杆菌，仅在一个世代中就可产生具有单一拷贝插入片段的可育纯合植株。2.发明描述
本发明旨在研究转化的胚发生(embryogenic)小孢子。另外本发明为土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化提供了一种改进的方法。
本发明旨在研究转化的胚发生小孢子和子代，其具有的特征如下：
a)是被根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转化的，
b)能够产生非嵌合转化的单倍体或者双单倍体胚，并且此胚在一个世代(generation)内产生可育的纯合植株。
c)包含稳定地整合进它们的基因组的外源DNA，所说DNA的特征在于至少包括一个兴趣基因和在土壤杆菌属T-DNA的右边缘(border)序列内的碱基对。
本发明还涉及包含整合的外源DNA的小孢子，其包含整合的外源DNA，在其中的兴趣基因以至少在右边缘和部分或全部的左边缘序列内的碱基对为边界(bordered)，所说的边缘序列导致兴趣基因的特异性插入。尤其优选的是包含所说的至少一个外源DNA的插入片段的小孢子。
本发明也包括转化的胚发生小孢子，其能够通过以下包含如下步骤的方法产生：
a)用土壤杆菌感染胚发生小孢子。
b)在转化期间，在共培养后洗去并杀灭土壤杆菌。
优选的是，在共培养后用粘液溶解酶洗涤除去土壤杆菌，此方法包括在转化期间进一步加入细胞溶解酶。
本发明也涉及将外源DNA加入到小孢子染色体中的方法，其步骤如下：
a)用土壤杆菌感染胚发生小孢子，所述土壤杆菌包含携带有兴趣基因的质粒，该兴趣基因在以至少一个T-DNA边缘为边界的起始和终止区调节控制下。
b)在共培养后洗去并杀灭土壤杆菌。
特别优选的是一种在共培养后用粘液溶解酶洗涤除去土壤杆菌的方法(其中的兴趣基因是以至少一个T-DNA边缘为边界)和一种导致兴趣基因特异性插入的方法。
本发明还包括转基因小孢子的衍生植株，其包含用通过以上所述的方法插入到小孢子中的外源基因的构建体。
按照本发明，转化的胚发生小孢子在一个世代以内发展成为的转基因纯合可育植株。在本发明一个优选的实施方案中，小孢子携带极少拷贝的插入片段，尤其优选的是一至三个插入片段，最优选的是只有一个单一拷贝插入片段。
根据本发明，这种方法的主要的优点是确定序列的转移，此序列开始于T-DNA右边缘序列内。
更具体地说本发明包括转化的长成植株的胚发生小孢子，其具有的特征如下：
a.是由根癌土壤杆菌转化的
b.主要表达为单一拷贝插入片段
c.产生非嵌合转化的单倍体或者是双单倍体(纯合)胚，此胚在一个世代内长成可育的植株。
通过包含下列步骤的方法可获得转化的胚发生小孢子：
a用土壤杆菌感染胚发生小孢子
b在土壤杆菌属共培养期间加入细胞溶解酶
c在共-培养后用粘液溶解酶洗涤以杀灭土壤杆菌来增加存活的转化体数量。
此后所使用的术语“细胞溶解酶”指这样一些物质，这些物质溶解外植体的细胞壁组分以诱导愈伤反应或去污剂效应以利于基因转移，例如纤维素酶、半纤维素酶，果胶酶等。
此后所使用的术语“粘液溶解酶”指任何溶解原核细胞壁组分(胞壁质，肽葡聚糖)的物质，例如溶菌酶。
根据a)提高转化的效率(去污剂效率)和b)增加可重获的转化的小植株的产量的能力来选择共培养期间应用的细胞溶解酶。
除提高转化效率，它们还经有选择地溶解土壤杆菌属在培养期间产生的纤丝有助于克服在利用土壤杆菌进行的长时间的共培养的有害影响(外植体聚合和过份生长)。
本发明优选的实施方案包括通过使用纤维素酶和溶菌酶来提高转化效率的方法而产生的转基因的胚发生小孢子。
包含溶解酶的溶液含有的酶及含量：优选的含量大约0.0004至大约0.1％、更优选的大约0.004至大约0.01％的纤维素酶，优选的含量大约0.1％至大约10％、尤其优先选的大约0.5至大约5％，更优选地大约0.75％至大约1.5％的溶菌酶。
所使用的浓度取决于培养时间的长短。使用的纤维素酶浓度适用于3天的培养期。因此，如果培养期更短，就可以利用更高的浓度。
按照本发明，使用的活性酶通常和一种或多种可接受的的添加物以组合物的形式一起使用，同时或者连续性地和其它的化合物一起应用于将要处理的胚发生小孢子。
这些化合物如同秋水仙碱或者是氟乐灵(Zhao和Simmonds 1995)一样，是抗微管的活性化合物(Mdller等1994)，其能直接导致单倍体小孢子基因组的离体复制，另外可以通过使小孢子的细胞周期同步而影响转化效率。
如果需要，在本发明的转化部分缓冲液物质或这些制剂的混合物与更多的培养基添加物通常一起使用。
合适的培养基可以是半固态或者是液态，并且是符合常规的用于转化技术的物质，如B5培养基(GAMBORG等1968)。
应用的数量和速率取决于土壤杆菌属菌株和其培养物、在共培养过程中的时间、温度、小孢子材料如物种或栽培种等。
本发明的另一个目的在于为转化胚发生小孢子提供一种新的方法，其中包括在用土壤杆菌属共培养后使用粘液溶解酶的至少一个附加的洗涤步骤。
洗涤过程可以优选地用材料和方法中描述的方法来完成。优选地，所说的洗涤重复一至两次。
可以用来洗涤胚发生小孢子的溶液可以如Sambrook，Fritsch和Maniatis(1989)所描述的Tris HCL(pH8.0)形式。
把核酸片断引入胚发生小孢子的一种优选的方法在于用携带插入的DNA构建体的根癌土壤杆菌感染小孢子(尤其参见US 5.188.958和EP 0270615 B1)。核酸片断或者是构建体可以引入适当的植株细胞，例如，借助于根癌土壤杆菌的Ti质粒。T-DNA转移到用根癌土壤杆菌感染的胚发生小孢子，并且稳定地整合进植株的基因组。在本领域熟知的适合的条件下，转化的胚发生小孢子进一步发展成为植株。
本领域的转化环节中，通常使用的土壤杆菌属菌株在White(1993)中有过描述。
Ti质粒包含两个对转化细胞的产物非常重要的区域。其中之一(命名为转移DNA(T-DNA))能引起肿瘤的形成。另外一个称之为致命区，对于T-DNA是导入植株必要的。把外源序列转移到植株基因组的转移DNA区在大小上由于外源核酸序列的插入而增加，但不影响其转移能力。通过除去造成肿瘤的基因，因此它们不再干扰修正的Ti质粒(＂解除装备的(disarmed)Ti载体)，Ti质粒可以作为把本发明的基因构建体转移到胚发生小孢子的载体。在二元系统中，为产生感染，需要两个质粒：T-DNA包含质粒和VIR质粒。大量的包含质粒的T-DNA任何一个都能够利用，唯一要求这种T-DNA能够独立地选择两种质粒之中的每一个(特别参见EP 116718 B1和EPI20516 B1)。
利用一个适当的表型标记可以选择带有整合的需要的DNA序列的胚发生小孢子。这些表型标记包括(但不限于)：抗生素抗性、除草剂抗性或者视觉观察。在本领域中已经熟知的其它表型标记也可以用于本发明。
用于本发明的DNA构建体是由转录开始区和在转录开始区的控制下的欲转录的DNA序列组成。DNA序列包括一种天然的、开放的、具有转录5和3的侧翼序列的阅读框架。另外，它可以包含一个反义序列，此反义序列用来编码RNA分子的补体或者是它的部分(如EP 140 308 B1和EP 223 399B1所述)。
开始区可以用于相关的变种及与变种的序列结合。基因的RNA编码序列可以是那些天然的基因中的一个，其包括编码蛋白质的开放阅读框架以及5和3未翻译序列。RNA翻译开始序列包含在构建体中，或者开始于启动子区域，或者起始于附着编码序列。
附着到上述序列上的是适合于转录终止和多腺苷酸化序列。
由本发明的构建体表达的上述序列或者基因的例子包括：
反义或者有义基因(用于基因抑制)；
重要的营养蛋白质的基因：生长促进因子，产量提高因子，例如天冬酰胺合成酶基因或蔗糖酶基因；
一定的环境条件下对植株给出保护的蛋白质的基因，例如对金属或其它毒性物质具有抗性的蛋白质；
胁迫蛋白(如在冰冻等极端温度产生耐性的蛋白质)的基因。
特异性的有经济价值的蛋白质的基因；
引起蛋白质水平增加的基因，例如代谢作用途径的酶；
造成增加宿主植物结构值的产物水平的基因，例如，对除草剂的抗性，对真菌的抗性，又如壳多糖酶基因、葡聚糖酶基因、蛋白质合成抑制剂基因、核蛋白体抑制蛋白基因，再如对病毒的抗性，核酶、病毒外壳蛋白基因。
使用克隆载体制备本发明的构建体，载体上的序列可以是天然产生的、突变的序列、合成的序列或者是它的结合物。克隆载体是公知的并且包括原核复制系统、用于选择转化的宿主细胞标记和用于插入或者是替代序列的限制性位点。对于转录和优化的表达，DNA可以转化进入胚发生小孢子，整合进基因组上，在基因组上本发明的构建体连接到选择的标记上或者和编码选择标记的DNA的共转化。
选择的标记基因(这种标记基因也是转移的)可以用来选择转化的胚发生小孢子。标志基因的表达赋予了能够选择的表型特点，这样基因的例子是那些编码对抗生素或者除草剂具有抗性的基因，例如对谷氨酰胺合成酶抑制因子产生抗性的基因，例如从吸水链霉菌或绿色产色链霉菌(BAR/PAT)分离的基因赋予的bialaphos或phosphinothricin抗性。其它的例子有新霉素磷酸转移酶或者是葡糖苷酸酶基因。
本发明所要求的方法提供了较多的有效地转化的胚发生小孢子。转化的效率大约是2-15％。至于我们这里定义的转化效率，转化的胚(植株)的数量与所有置于选择培养基上的胚(植株)的数量有关。
相对于其它胚发生小孢子培养系统，利用土壤杆菌属的转化方法比较简单，其具有高度再生性的和高的可推知的可能性。在所有的小孢子能产生胚(单雄生殖)的物种中，经过一步步的程序这种方法有希望产生转基因单倍体或者是双单倍体植株。
本发明所涉及到的转基因胚发生小孢子种类一般扩展到易于单雄生殖的高等植物纲(从小孢子产生胚，由胚生长为植株)和刺激包括单子叶和双子叶植株两种形式的单雄生殖的成熟技术。公知的，在理论上所有植株都能从培养胚发生小孢子再生，包括(但不限于)所有的农作物物种，如甘蔗、甜菜、棉花、水果和其它树、豆科植株和蔬菜等。
因此，胚发生小孢子将有助于在农作物和现在被认为是难以对付的豆科植物的物种的遗传型上产生转化的植株。虽然在小麦、水稻、玉米等已经表明能够用土壤杆菌属转化，但是在指导基因转移到能够再生的植物细胞有很大困难，因此大大地阻止大范围内的成功(VanRordragen和Dons1992)。随着生物学上关于土壤杆菌属感染方法的知识的不断增长(Smith和Hood 1995)和农作物小孢子培养的迅速发展，胚发生小孢子的应用将尤其适合于单子叶植物的转化(Jaihne和Lorz 1995)。同时已经表明即使是酵母也能用根癌土壤杆菌转化。(Piers等1996)。
有特殊的兴趣的科的例子是禾本科，还有茄科和芸苔科。
例如，一些合适的物种包括：
草莓属、百脉根属、苜蓿属、驴豆属、三叶草属。胡芦巴属、豇豆属、柑桔、亚麻属、天竺葵属、木薯属、胡萝卜属、拟南芥属、芸苔属，萝卜属、芥属、颠茄属、辣椒属、莨菪属、番茄属、烟草属、茄属、Petunial、毛地黄属、Majorana、Ciohorium、向日葵属、莴苣属、雀麦属、芦笋属、金鱼草属、Hererocallis、Nemesia，天竺葵属的植物、黎属、狼尾草、毛茛属、美狗舌草属、茄科植物的一种、黄瓜属、Browaalia、大豆属、毒麦属、玉米属、小麦属、高粱属和Datura。
可以保护的有商业利益的物种的例子包括：-烟草，Nicotiana tabacum L.-番茄，Lycopersicon esculentum Mill，-马铃薯，Solanum tuberosum L，-油菜，Canola/Rapeseed，-芸苔，Bras sica napus L，-甘蓝，broccoli，kale etc.，-卷心菜Brassica oleracea L.，-芥菜，mustards Brassica juncea L.，-幽芥，Brassica nigra L.，-欧白芥，Sinapis alba L.(十字花科)，-碧冬茄，Petunia hybrida(茄科)-甜菜，Beta vulgaris，(藜科)，-黄瓜，Curcurbita sp.(Curcurbitaceae)，-棉花，Gossypium sp.，(锦葵科)，-向日葵，Helianthus annuus，-莴苣，lettuce Lactuca sativa，(菊科)，-豌豆，Pisum satiyum，-大豆，Glycine max and alfaifa，Medicago sp.(豆科)-芦笋，Asparagus officinalis；-唐菖蒲，Gladiolus sp.，(鸳尾科)；-玉蜀黎，Zea mays；-稻，Oryza sativa(禾本科)；-小麦，Triticum aestivum(禾本科)；和-大麦，Hordeum vulgare(禾本科)。
在本发明的一个优选的实施方案涉及芸苔属中的转化的胚发生小孢子，例如B.napus，芜菁，B.juncea，B.oleracea，B.carinata，还有另外的一些。
另外，本发明涉及按照本发明的方法转化的胚发生小孢子再生的芸苔属植物。本发明的研究目的是用胚发生小孢子产生新的单倍体转化系统。小孢子指新分离的至分离72小时之间的小孢子，其主要由单细胞组成，因为第一次细胞分裂小孢子通常在培养后的三天才能看到。小孢子系统提供了利用其它外植体的方法，在这些方法中由再生产生的单倍体植株或者是纯合二倍体植株。这简化基因研究，并且一步固定了饲养的目的基因。
用于转化的胚发生小孢子的应用，可以象材料和方法以及实施例中描述的那样进行。
一般地，利用标准的方法是进行质粒DNA的制备、限制性内切酶的提取、DNA的凝胶电泳、SOUTHERN印迹、DNA连接和细菌转化。(Sambrook I等  (1989)，本文称作＂Maniatis＂且一并参考)。3.材料和方法
下列公开的内容描述胚发生小孢子的的用途和转化方法。当描述完胚发生小孢子转化后，本公开也将结束，并且只是通过实施例的方式作些非限制性说明。
根癌土壤杆菌的细胞(具有MH90RK的Phoe6Ac，见图1)(从0.9 0.D分光光度标准稀释的10-4-10-7倍)加入新分离的小孢子或培养72小时的小孢子。10-5的稀释液相当于大约每ml中有10,000个土壤杆菌的浓度。把cellolytic酶添加到培养物中，按照Baillie等描述的温度体系(1992)培养72小时。
对于一个实验，通常从大约三个植株获得的小孢子充满5个培养皿。一个培养皿含有来自大约10个花芽的小孢子。
随后(在培养三天后)，培养物用废弃的上清液轻轻地洗涤，并且加入包含500mg/l的羧苄青霉素(或300 mg/l的Timentin)的10％蔗糖溶液的新鲜的NLN培养基。在感染时期，当小孢子紧紧地粘在培养皿底部时，小孢子的损失非常少。
轻轻地刮下粘在培养皿底部的小孢子，然后用柔软的橡皮淀帚从培养皿的底部松散开(Fisher科学)。然后把新鲜的培养基和小孢子转移到50mlFalcon管离心。
在200g下两次离心，每次三分钟。小孢子在溶菌酶和10mM Tris HCL pH值为8的缓冲液中悬浮和离心至少各一次。最后加入带有10％蔗糖和500mg/l的羧苄青霉素(或300 mg/l的Timentin)的新鲜的NLN培养基，根据Bailliel等1992的方法培养培养物。
培养物一直保持在24℃，直到它们长到4周，这时生长的胚通常比没有感染的对照胚慢1周。
当胚能够看见的时候，就可以开始选择真正的转化体了。优选的是，在胚开始变为绿色后才进行选择。
在温室中从小孢子分离直到转化的小植株大约需要三个月的时间。
以下的实施例只是用来进一步说明本发明，并无意限制在权利要求书中所限定的本发明的范围。4.实验数据4.1.为提高胚的回收和转化效率优化共培养条件材料：芜菁CV2的新芽DNA构建体：在35S启动子和35S终止子控制下的
glufosinate(Phosphinothricin L-PPT)抗性基因(质粒pRD
320和pRD420有相同的序列(Datla等1992)，但是具有PAT基因)。预培养：培养箱(10/5℃、16小时光期)
处理 A(对照) B C D  E
 0天 小孢子培养开始 用纤维素酶感染 未用纤维素酶感染 用纤维素酶感染 未用纤维素酶感染
 2天   转移   转移   转移   转移   转移
 3天 离心洗涤 离心洗涤 手工洗涤 离心洗涤 手工洗涤
 23天 490个胚/皿 12个胚/皿 16个胚/皿 18个胚/皿 24个胚/皿
 30天 呈绿色 呈绿色 呈绿色 呈绿色 呈绿色
39天 铺板 铺板 铺板 铺板 铺板
54天 生根分析 生根分析 生根分析 生根分析 生根分析
59天  0  10   4  11  6
A：对照(未感染)B：+纤维素酶+土壤杆菌属(10-6)C：-纤维素酶+土壤杆菌属(10-6)D：+纤维素酶+土壤杆菌属(10-7)E：-纤维素酶+土壤杆菌属(10-7)第0天：在Baillie(1992)后，小孢子培养开始，但是没有氨基酸。
用根癌土壤杆菌感染和在适当的时候加入纤维素酶。
在32℃培养两天。第2天：平板转移到24℃培养箱。第3天：培养基变为NLN10。在200g离心洗涤两次。第23天：计算胚的数量。第30天：在75/rpm摇动器、22℃、连续的光照之下胚变绿色。第39天：平板在OB5固体培养基上。第54天：开始L-PPT分析(在20mg/l L-PPT上选择)。第59天：推定的转化体转移到OB5固体培养基上。
回收的胚和推定的转化体总结在附图上。结果显示纤维素酶的加入不仅溶解了土壤杆菌的纤丝以便能离心洗涤，而且通过溶解植物材料的纤维素，明显地增加了转化效率。另一方面，在每一个测验的土壤杆菌属浓度的水平内，纤维素酶稍微减少了回收胚的数量。4.2.用根癌土壤杆菌感染后不同的洗涤的过程对胚的影响的比较材料：芜菁CV2的芽DNA构建体：pHoe6Ac(参见图1，AC代表5-羟色胺N-乙酰转移酶，即PAT)预培养：培养箱(10/5℃，16小时光期)，在小孢子培养前花芽在4℃储藏2天。
A(对照)     B     C     D     E
0天 开始+   开始   开始   开始   开始
3天 转移 感染和转移 感染和转移 感染和转移 感染和转移
5天     -     -     -  +纤维素酶  +纤维素酶
6天 离心洗涤改变培养基 离心洗涤改变培养基溶菌酶处理 手工洗涤改变培养基(许多相连的纤丝) 离心洗涤改变培养基(纤丝溶解) 离心洗涤+溶菌酶培养基改变(纤丝溶解)
22天 484个胚/皿 390个胚/皿   没有胚   27个胚/皿 58个胚/皿
A：未感染对照B：未感染对照，在培养基变化期间应用溶菌酶C：在第6天手工洗涤D：在第5天加入纤维素酶并且在第6天离心洗涤E：与D相同，但在第6天加入溶菌酶处理第0天：在Baillie(1992)后，小孢子培养开始，但是没有氨基酸，在32
℃培养两天。第3天：用根癌土壤杆菌感染和把培养皿转移到24℃的培养箱。第5天：加入纤维素酶。第6天：洗涤在适当的时候在200g使用离心洗涤。只要可行，用溶菌酶
处理。所有处理培养基变为NLN10。第22天：胚的计算：溶菌酶处理的回收胚增加一倍。E处理的胚的平均数
与C处理对比差异显著(每处理测验8个重复)。4.3携带抗病基因转化体的生长材料：Brassica napus Topaz 4079DNA构建体：pGJ57(葡聚糖酶，壳多糖酶，每个都有35S终止子和35S启
动子PAT，参见图2)预培养：(10/5℃，16小时光期)，花芽在小孢子开始培养前在4℃储藏2天。
    A(对照)     B
    0天 小孢子培养X1开始 小孢子培养X1开始
    1天       - 用土壤杆菌属感染
    3天     转移     转移
    4天     离心洗涤 手工洗涤+溶菌酶处理
    22天   422个胚/皿     70个胚/皿
    60天 50个健康的植株   50个健康的植株
    66天       0     2x2
X1每个处理有5个培养皿。每个培养皿大约能收获10个花芽
X2把50个健康的植株转移到选择培养基上。从50个植株中选择两个独立的转化体。这表明了转化的频率为4％。通过Southern分析确认这两个转化体。A：未感染对照。只要可行，用根癌土壤杆菌感染B：与A同，但是用根癌土壤杆菌感染第0天：小孢子培养开始。在32℃培养两天。只要可行，用根癌土壤杆菌
感染并且加入秋水仙碱第3天：把培养皿转移到24℃的培养箱中第4天：在200g进行离心洗涤2次。溶菌酶处理。培养基变为NLN10。第22天：计算胚。第60天：开始L-PPT生根分析(20ml/l L-PPT)。第66天：推定的转化体转移到OB5固体培养基上。
应当理解只是通过说明的方式给出上面的详尽描述，在不背离本发明的宗旨和范围的情况下可以进行修改和改变。5参考文献1.Arnoldo，M.(1992)在Brassica napus中一种有效的土壤杆菌属介导的
转化系统的发展。加拿大：多伦多大学；论文。2.Baiilie，A.M.R.，Epp，D.J.，Hutcheson，D.，Keller，W.
A.(1992)分离的小孢子的离体培养和野生芸苔属植株的再生，植物细胞
报告：234-237.3.Christou Paul(1995)利用粒子轰击进行重要的农作物、豆科和木本物
种的独立的品种基因转化的策略。Euphytica，85，13-27。4.Creissen，G.，Smith，C.，Francis，R.，Reynolds，H.，
Mullineaux，P.(1990)土壤杆菌属和微型投影介导的病毒DNA转移到
衍生的大麦小孢子培养物，植物细胞报告，8，680-683。5.Datla R.S.S.，J.Hammerlindl，B.Panchuk，L.Pelcher，W.
Keller(1992)具有野生型编码NPTII的基因的修饰的二元植株转化载
体，基因，2(11)，383-384。6.Fennell，A.，Hauptmann，R.(1992)利用电穿孔和PEg运送DNA到玉
米的小孢子，植物细胞报告.，11，567-570。7.Heberle-Bors E.(1989)EP O 301 316(Chemie Holding AG)。8.Heberle-Bors Erwin(1995)由小孢子的胚发生转化，水稻生物技术季
刊，vol.2 3，17-18。9.Huang，B.(1992)小孢子和小孢子衍生胚的遗传操作。离体细胞发育
生物学。28P，53-58(综述)。10.Jardinaud，M-F.，Souvre，A.，Alibert，G.(1993)在Brassica
napus电穿孔的小孢子中的瞬时GUS基因表达。植物科学93，177-
184。11.Jardinaud M.F.，.Souvre，G.Alibert，M.Beckert(1995).利用
biolistic方法在玉米小孢子中的uidA基因转移和表达，原生质，
187(14)，138-143。12.Jahne.和H.Lorz(1995)农作物小孢子培养，植物科学，109，1-12。13.Jahne A.，D.Becker，R.Brettschneider和H.Lorz(1994)转基因
的小孢子衍生的可育大麦的再生，(Theor.Appl.Genet.，89，525
533)。14.Jones-Willenuve，Bin Huang，I.Prudhomme，S.Bird，R.
Kemble，J.Hattori，B.Miki(1995)利用微注射把DNA引入油菜籽
的单核小孢子的评估，植株细胞组织及器官培养，40，97-100。15.Moeller C.，M.Iqbal和G.Roebellen(1994)用秋水仙碱处理的小孢
子的双单倍体Brassica napus植株的有效产生，Euphytica 75(1-2)，
95-104。16.Neuhaus，G.，Spangenberg，G.，Mittelsten Scheid，0.，
Schweiger，H-G.(1987)通过把DNA微注射到小孢子的衍生胚获得的转
基因油菜植株Theor Appl.Genet 75，30。17.Pechan，P.M.(1989)Brassica napus的小孢子和土壤杆菌属原胚的成
功培养。植物细胞报告P8：387-390。18.Potrykus.1(1991)植株的基因转移：公开的方法和结果的评估，植物
生理，年度综述。植物分子生物学，42，205-225。19.Potrykus.(1993)植物的基因转移：方法和现有技术，在Hayward等编
辑的“植物育种原则和展望”，Chapman和Hall，126-137。20.Piers K.L.，J.D.X.Liang，K.M.Stephens和E.W.Nester(1996)
根癌土壤杆菌-介导的酵母的转化，微生物学，93，1613 1618。21.Sambrook I.，E.F.Fritsch，T.Maniati s(1989)分子克隆：实验室
手册。冷泉港实验室出版。22.Sangawan R.S.，C.Ducrocq，B.Sangwan-Noorreel(1993)土壤杆
菌属-介导的Datura innoxia和Nicotiana Tabacum的花粉胚的转化：
转基因单倍体和可育纯合二倍体植株的产生，植物科学，95，99-
115。23.Smith，R和E.Hood(1995)单子叶植株的根癌土壤杆菌转化，作物科
学，35(2)，301-309。24.Swanson，E.B.，Erickson，L.R.(1989)利用产生章鱼碱的根癌土壤
杆菌的菌株Brassica napus单倍体转化。Theor.Appl.Genet.78，
831-835。25.Sttjger E.，C.Fink，M.Pfosser和E.Herberle-Bors(1995)利用
胚发生花粉的粒子轰击进行的植物转化，植物细胞报告，14，273-
278。26.Thierfelder A.，W.Luhs W.Friedt(1993)借助于生物技术繁育工业
石油作物：评论，工业化的作物和产品，1，261-271。27.White F.F.(1993)用于高等植物基因转移的载体，在Kung S.和R.Wu
编辑的“转基因植物”，vo1.1，1548。28.Wordragen van M.F.和H.J.M.Dons(1992)根癌土壤杆菌属介导的顽
固的作物的转化，植物分子生物学报告，10(1)，12-36。29.Zhao J.，D.H.Simmonds(1995)在Brassica napus上应用氟乐灵产生
双单倍体植株的胚发生小孢子的培养。Physiologia Plantarum，
95(2)，304-309。6.图2-图例说明pGJ57(11370 BPS环状DNA)
分子特征
类型 开始 结束 Compl   名称     描  述
基因 790  1758  Sm/Sp  strep/spec腺苷酰转移酶
基因 5611  5634     LB 真蛸碱Ti ACH5的左边缘
基因 6123  5917   (C)   T-35S   35S终止子
基因 6693  6142   (C)   PAT   合成的PAt基因
基因 7251  6722   (C)   P-35S   35S启动子
基因 7519  7324   (C)   T-35S   35S终止子
基因 8506  7706   (C)   壳多糖酶   壳多糖酶
基 9000  8582   (C)   P-35S   35S启动子
因
基因   9216   9021  (C)   T-35S     35S终止子
基因   10483   9467  (C)   葡聚糖酶     葡聚糖酶
基因   10949   10531  (C)   P-35S     35S启动子
基因   11173   11196    Rb  从pTiT37的右边缘

Claims (16)

1.转化的胚发生小孢子和其子代，其特征在于其是被根癌土壤杆菌转化的，能够导致产生非嵌合的转化的单倍体或双单倍体胚，并且包含稳定地整合进它们的基因组的外源DNA，所说的胚在一个世代内长成可育的纯合植株，所说的DNA的特征在于包含至少一个兴趣基因和至少在土壤杆菌属T-DNA的右边缘序列内的碱基对。
2.按照权利要求1的小孢子，其包含整合的外源DNA，其中所说的兴趣基因以至少在右边缘和部分或全部左边缘序列内的碱基对为边界，所说的边缘序列导致兴趣基因的特异性插入。
3.按照权利要求1的小孢子，其包含至少一个以上所述外源DNA的插入片段。
4.转化的胚发生小孢子，其能按照包括下列步骤的方法产生：
a)用土壤杆菌感染胚发生小孢子；
b)在转化期间的共培养后洗去并杀灭土壤杆菌。
5.按照权利要求4的转化的胚发生小孢子，其中所说的土壤杆菌在共培养后用粘液溶解酶洗涤除去。
6.按照权利要求4或5小孢子，其中所说的方法还包括在转化期间加入纤维细胞溶解酶的步骤。
7.按照任何权利要求4至6任一之胚发生小孢子，其来源于芸苔科。
8.一种将外源DNA掺入到小孢子染色体中的方法，该方法包括以下步骤：a)以土壤杆菌感染胚发生小孢子，所述土壤杆菌包含携带有兴趣基因的质粒，该兴趣基因在以至少一个T-DNA边缘为边界的起始和终止区调节控制下。
b)在共培养后洗去并杀灭土壤杆菌。
9.按照权利要求8的方法，其中所说的土壤杆菌在共培养后用粘液溶解酶洗涤除去。
10.按照权利要求8的方法，其中所说的兴趣基因以至少一个T-DNA边缘为边界。
11.按照方法权利要求10的方法，该方法导致兴趣基因的特异性插入。
12.按照权利要求8或9的方法，该方法还包括在土壤杆菌属共培养期间加入细胞溶解酶的步骤。
13.按照权利要求8的方法，其中所说的细胞溶解酶是纤维素酶。
14.按照权利要求8的方法，其中所说的粘液溶解酶是溶菌酶。
15.由权利要求8的方法产生的转化的胚发生小孢子。
16.转基因小孢子衍生的植株，其包含用权利要求8的方法插入到小孢子中的外源基因构建体。
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6812028B1 (en) 1999-12-10 2004-11-02 University Of Guelph Embryogenesis and plant regeneration from microspores
ES2277592T3 (es) 2000-08-03 2007-07-16 Japan Tobacco Inc. Metodo para estimular la eficacia de introduccion de genes en celulas vegetales.
US20040210959A1 (en) * 2003-03-19 2004-10-21 Monsanto Technology Llc A Novel Method for Production of Transformed Dihaploid Corn Plants
US7572635B2 (en) * 2004-06-25 2009-08-11 Monsanto Technology Llc Method for agrobacterium transformation for dihaploid corn plants
CN100506244C (zh) * 2007-04-25 2009-07-01 于忠军 治疗扁平疣的外用中药药液
IN2012DN02333A (zh) * 2009-10-16 2015-08-21 Dow Agrosciences Llc
UY33139A (es) 2009-12-23 2011-07-29 Bayer Cropscience Ag Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de las hppd
EP2516633B1 (en) 2009-12-23 2017-11-15 Bayer Intellectual Property GmbH Plants tolerant to hppd inhibitor herbicides
EA201290559A1 (ru) 2009-12-23 2013-01-30 Байер Интеллектуэль Проперти Гмбх Растения, устойчивые к гербицидам - ингибиторам hppd
AR079882A1 (es) 2009-12-23 2012-02-29 Bayer Cropscience Ag Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de las hppd
BR112012015692A2 (pt) 2009-12-23 2015-08-25 Bayer Intelectual Property Gmbh Plantas tolerantes a herbicida inibidor de hppds.
CN103052713A (zh) 2010-07-07 2013-04-17 陶氏益农公司 官能化线性dna盒的生成及植物中量子点/纳米颗粒介导的投递
CA3065095C (en) 2010-07-07 2023-02-14 Dow Agrosciences Llc Method for introgressing a trait into a plant
EP3334831A1 (en) * 2015-08-13 2018-06-20 Forrest Innovations Ltd. Formulations and compositions for delivery of nucleic acids to plant cells
CN113881698B (zh) * 2021-10-29 2023-04-25 上海市农业科学院 一种利用农杆菌转化大麦小孢子愈伤组织的方法
CN114982632A (zh) * 2022-04-21 2022-09-02 安徽农业大学 一种降低乌菜小孢子再生植株褐化率的方法
CN116098059B (zh) * 2023-02-09 2024-01-26 泉脉农业科技有限公司 洋桔梗游离小孢子与花药共培养诱导愈伤的方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8513787D0 (en) * 1985-05-31 1985-07-03 Cocking E C D Utilisation of plant protoplasts
US5188958A (en) * 1986-05-29 1993-02-23 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in brassica species
CA1327173C (en) * 1987-07-21 1994-02-22 Erwin Heberle-Bors Method of gene transfer into plants
NL8801444A (nl) * 1988-06-06 1990-01-02 Solvay Werkwijze voor het genetisch transformeren van cellen van een multicellulair eukaryotisch organisme.
US5445961A (en) 1990-06-26 1995-08-29 Dekalb Genetics Corporation Isolated microscope and anther culture of maize
AU643563B2 (en) * 1990-11-01 1993-11-18 Sapporo Breweries Limited Method for preparing transformed plant
CA2096843C (en) * 1990-11-23 2007-08-07 Kathleen D'halluin Process for transforming monocotyledonous plants
US5384253A (en) * 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
WO1992014828A1 (en) * 1991-02-14 1992-09-03 Svalöf Ab Method for genetic transformation of tissue organs from monocotyledonous plants

Also Published As

Publication number Publication date
US6316694B1 (en) 2001-11-13
WO1996029419A1 (en) 1996-09-26
EP0737748A1 (en) 1996-10-16
EP0832259B1 (en) 2006-10-11
DE69636622T2 (de) 2007-08-30
CN1110562C (zh) 2003-06-04
AU5109996A (en) 1996-10-08
AU710201B2 (en) 1999-09-16
EP0832259A1 (en) 1998-04-01
DE69636622D1 (de) 2006-11-23

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