CN111512963B - 小叶丁香的组织培养方法及快速获取小叶丁香大苗的方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及小叶丁香的组织培养方法及快速获取小叶丁香大苗的方法，组织培养方法包括以下步骤：(1)外植体选择及消毒：剪取当年生幼嫩枝条顶端部分，将其剪切为带有顶芽或1‑2个腋芽的茎段作为外植体，进行消毒处理；(2)启动培养：将外植体放入启动培养基中，使顶芽或腋芽刚好接触培养基，直至顶芽或腋芽萌发；启动培养基以MS培养基为基础培养基，同时添加蔗糖30g/L、琼脂6g/L、激素6‑BA1mg/L、激素NAA0.2mg/L，调节pH为5.8～6.2；(3)继代培养；(4)生根培养；(5)移栽，得到组培苗。该方法使小叶丁香外植体在启动培养过程中存活率高，不易出现愈伤组织，腋芽或顶芽诱导率高。

Description

小叶丁香的组织培养方法及快速获取小叶丁香大苗的方法

技术领域

本发明涉及小叶丁香无性繁殖领域，具体涉及一种小叶丁香的组织培养方法及快速获取小叶丁香大苗的方法。

背景技术

小叶丁香(Syringa microphylla Diels)，别名又叫四季丁香、二度梅、野丁香等。科属为木犀科丁香属，属于落叶灌木，高约2.5m，幼枝灰褐色，被柔毛。叶卵圆形或椭圆状卵形，全缘，有缘毛。圆锥花序疏松，侧生，淡紫红色。小叶丁香的叶子比普通丁香小，枝干也较低,枝条柔细，树姿秀丽，花色鲜艳，且一年二度开花，解决了夏秋无花的现状,为园林中优良的花灌木。适于种在庭园、居住区、医院、学校、幼儿园或其他园林、风景区。可孤植、丛植或在路边、草坪、角隅、林缘成片栽植，也可与其他乔灌木尤其是常绿树种配植。

小叶丁香无性繁殖方法目前主要有：嫁接、扦插、压条、分株等。上述无性繁殖方法对繁殖材料需求量大，不适用于材料有限的优良单株进行大量繁殖，且嫁接繁殖成活率低，扦插繁殖的繁殖系数小、周期长，受气候条件影响大、生产成本高、不利于工厂化育苗生产。

也有文献公开通过组织培养的方式繁殖小叶丁香，但现有的方法中，存在外植体启动培养较为困难，容易出现外植体褐化、坏死、生长停止，腋芽诱导率低且植株容易死亡、以愈伤组织分化为主，不出现丛生芽，或丛生芽诱导率低甚至死亡、增殖过程中继代苗生长势减弱等问题，且组培苗生长缓慢，形成商品大苗一般需要5年以上，不利于产品的供应。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的通过组织培养繁殖小叶丁香时腋芽诱导率低的缺陷，从而提供一种小叶丁香的组织培养方法。

本发明还提供一种快速获取小叶丁香大苗的方法。

为此，本发明提供一种小叶丁香的组织培养方法，包括以下步骤：

(1)外植体选择及消毒：

剪取当年生幼嫩枝条顶端部分，将其剪切为带有顶芽或1-2个腋芽的茎段作为外植体，进行消毒处理；

(2)启动培养：

将外植体放入启动培养基中，使顶芽或腋芽刚好接触培养基，直至顶芽或腋芽萌发；所述启动培养基以MS培养基为基础培养基，同时添加蔗糖30g/L、琼脂6g/L、激素6-BA1mg/L、激素NAA 0.2mg/L，调节pH为5.8～6.2；

(3)继代培养：

剪取步骤(2)中萌发的腋芽或顶芽并接种于继代培养基中进行培养，直至长出丛生芽；

(4)生根培养：

将新长出的丛生芽剪切为带有顶芽或1-2个腋芽的茎段，转移至生根培养基中进行培养直至生根得到生根苗；

(5)移栽：

将步骤(4)得到的生根苗用温水洗净根部的生根培养基，然后移栽至基质中进行培养，得到组培生根苗。

进一步地，所述启动培养过程中萌发的顶芽或腋芽长度为5mm～1cm；所述继代培养基以MS培养基为基础培养基，同时添加蔗糖30g/L、琼脂6g/L、激素6-BA 4mg/L，调节pH为5.8～6.2，继代培养过程中丛生芽长至3～6cm；所述生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，同时添加蔗糖30g/L、琼脂6g/L、激素IBA 1.5mg/L，调节pH为5.8～6.2，生根苗的根长为3～4cm，植株高5～6cm。

进一步地，步骤(1)中消毒为用次氯酸钠溶液浸泡然后用无菌水冲洗。

进一步地，所述次氯酸钠溶液中有效氯为1％，浸泡时间为20min，无菌水冲洗次数为3-5次。

进一步地，继代培养步骤中还包括一次或多次重复继代步骤：

将丛生芽剪切为带有顶芽或1-2个腋芽的茎段，重新转移至新的继代培养基中继续培养，直至重新长出丛生芽且丛生芽高至3～6cm。

进一步地，继代培养步骤后还包括继代苗复壮的步骤：

将重新长出的丛生芽转移至复壮培养基中直至丛生芽的增殖倍数不低于5，复壮培养基以MS培养基为基础培养基，同时添加蔗糖30g/L、琼脂6g/L、激素6-BA 2.4mg/L，调节pH为5.8～6.2。

进一步地，启动培养、继代培养、生根培养和继代苗复壮过程中的培养条件为：温度：25±5℃；光照强度：2000～2200lx；光处理：12～14h/d，暗处理10～12h/d，培养20～30d。

进一步地，步骤(5)中移栽的基质为质量比为3:2:1的粗草炭土、粗蛭石和粗珍珠岩的混合物，移栽后浇水，使土壤湿度保持在65～80％直至长出新根，待新长出的根部生长健壮后，使土壤湿度保持在为70～80％。

具体地，步骤(5)中将生根苗移栽到基质中后，先浇水，利用育苗盖使土壤湿度保持在65～75％，直至生根苗长出新根，然后使土壤湿度保持在70～80％，待根部生长健壮后撤掉育苗盖，使其土壤湿度为70～75％，待生根苗完全适应外界环境之后，每2d浇次水，使其土壤湿度保持在70～80％。

本发明还提供一种快速获取小叶丁香大苗的方法，包括以下步骤：

(1)通过组织培养得到组培生根苗；

(2)剪取组培苗中带芽茎段作为嫁接穗条，以暴马丁香作为砧木进行嫁接。

进一步地，步骤(2)中，穗条的长度为8-10cm，粗0.2～0.5cm，带有2-3个芽，暴马丁香砧木为至少提前1年种植所得；嫁接前5-7天对砧木栽植地浇透水，利用劈接的方式进行嫁接，劈接口深度为1.5-2cm，嫁接后立即密封嫁接口，嫁接后10-15d再次进行浇水，随时抹除砧木萌芽。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的小叶丁香的组织培养方法，选择合适的外植体部位，和启动培养基，使小叶丁香外植体在启动培养过程中不易出现愈伤组织，腋芽或顶芽诱导率高，存活率高；选择带有顶芽或1-2个腋芽的茎段作为外植体，使外植体有合适的长度，保证外植体既在启动培养中能够有效繁殖，又能够减少病菌的感染几率。

2.本发明提供的小叶丁香的组织培养方法，继代培养和生根培养过程中通过选择合理的激素种类及其适宜的浓度，使得小叶丁香在组织培养过程中不易出现愈伤组织，丛生芽诱导率高，存活率高；通过丛生芽进行继代增殖，使小叶丁香成苗速度快、繁殖量大、可以使无性系后代保持原品种特性。

3.本发明提供的小叶丁香的组织培养方法，消毒方法为用次氯酸钠溶液浸泡、无菌水冲洗，使得外植体在启动培养过程中不易出现褐化、坏死、停止生长等问题，存活率可达80％以上。

4.本发明提供的小叶丁香的组织培养方法，还包括继代苗复壮的步骤，小叶丁香组织培养过程中，继代次数过多会出现继代苗生长势减弱、增殖倍数降低的现象，通过适当调整培养基中激素浓度，使得小叶丁香的苗高、粗度、增殖倍数存在显著增长。

5.本发明提供的小叶丁香的组织培养方法，通过选择合适的培养条件，使得培养得到的生根苗木质化程度高，适应性强，在移栽过程中不需要提前适应外界环境，可以直接移栽，移栽成活率高、缩短培养时间。

6.本发明提供的小叶丁香的组织培养方法，繁殖系数高，不受气候影响、有利于工厂化育苗、可以节约能源，减少占用可耕地面积、可以避免地域、气候及自然灾害的影响,从而达到提高产量、降低成本的目的。其次，组织培养能够将少量材料进行大量繁殖，解决材料稀缺植物品系无性繁殖；本方法培育小叶丁香能快速提高繁殖数量，且能有效缩短苗木培育的生长周期，节约成本；同时，为分子育种提供一种高效的繁殖方法，为快速大量繁殖稀有品种提供一种繁殖方法。

7.本发明提供的快速获取小叶丁香大苗的方法，通过组织培养和嫁接相结合的繁殖方式，可以有效缩短小叶丁香培育的生长周期。嫁接后的小叶丁香枝条由于能通过暴马丁香砧木的根从土地中大量吸收营养和水分，因此能够快速生长，增加粗度，嫁接当年可形成分枝4-5个，分枝平均长度约36cm，当年即可开花结果。嫁接后的穗条比未嫁接的植株能够提前1-2年进入开花和结果期，快速获得商品大苗。暴马丁香为小乔木，小叶丁香为小灌木，因此通过嫁接的方式能够实现小叶丁香灌木乔木化，提高绿化价值，且暴马丁香的生长速度较快，可以进一步提高小叶丁香的生长速度。

8.本发明提供的快速获取小叶丁香大苗的方法，嫁接后不能立即浇水，约10-15d后进行浇水，这样有利于伤口愈合。每周除砧木萌芽1-2次，保证砧木有足够多的营养提供给接穗。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

在对小叶丁香的组织培养过程中，外植体的选取以及灭菌剂的使用方法不当均容易造成小叶丁香外植体褐化、坏死、生长停止等问题：小叶丁香在外植体灭菌时容易有褐化或坏死现象，这与外植体的选取及灭菌剂的选择与使用时间有关。使用现有的外植体灭菌方法后，外植体存活率低。通过不断的探索研究得到：小叶丁香外植体应选择当年生幼嫩顶芽或腋芽，为探索小叶丁香的最适宜灭菌条件，做了以下的筛选试验，具体的灭菌剂、用量及消毒时间如表1所示，筛选时，每种处理方式选用15个外植体，重复3次。

表1小叶丁香外植体灭菌情况

在小叶丁香的启动培养过程中，启动培养较为困难，容易出现外植体褐化、坏死、生长停止，腋芽诱导率低且植株容易死亡，为探索小叶丁香的最适宜灭菌条件，做了以下的筛选试验，在启动培养过程中，启动培养基以MS为基础培养基，添加蔗糖30g/L、琼脂6g/L、激素、调节pH为5.8；培养条件为：温度：25℃；光照强度：2200lx；光处理：12h/d，暗处理10h/d，培养20d。每种处理方式选取100株外植体。具体激素添加情况如表2所示。

表2小叶丁香启动培养芽萌发情况统计

序号	激素浓度配比	新生芽平均高度(cm)	芽诱导率(％)	茎段生长情况
					1	6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L	0.52	46	茎细小，微黄
2	6-BA1.0mg/L+IAA 0.1mg/L	0.31	52	茎细小，微黄
					3	6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L	0.60	65	茎壮，嫩绿
4	6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L	0.87	85	茎壮，嫩绿

在建立小叶丁香无菌体系后进行继代培养，培养过程中发现小叶丁香以愈伤组织分化为主，不出现丛生芽，或者丛生芽诱导率低甚至死亡，对继代培养过程中适宜的激素进行筛选，探索适宜的继代培养基。具体筛选结果如表2所示。在继代培养过程中，将启动培养过程中萌发的长势相似的腋芽或顶芽接种于继代培养基中，继代培养基以MS为基础培养基，添加蔗糖30g/L、琼脂6g/L、激素、调节pH为5.8；培养条件为：温度：25℃；光照强度：2200lx；光处理：12h/d，暗处理10h/d，培养20d。每种处理方式选取100株新萌发的腋芽或顶芽。具体激素添加情况如表3所示。

表3小叶丁香丛生芽诱导及生长情况统计

序号	激素浓度配比	苗高(cm)	粗度(mm)	芽诱导率(％)	增殖倍数	茎段生长情况
							1	6-BA 2mg/L	2.4	1.40	70	2	茎细小，微黄
2	6-BA 3mg/L	2.13	0.81	75	1	茎细小，微黄
							3	6-BA 4mg/L	3.16	1.69	94	4	茎壮，嫩绿
4	6-BA 5mg/L	2.35	1.17	86	2	茎细小，微黄

小叶丁香工厂化育苗过程中，因继代次数过多而造成继代苗生长势减弱，增殖倍数降低，影响小叶丁香生产率的问题，因此需要对继代苗进行复壮，为探索最适宜复壮条件，做了以下的筛选试验。在复壮培养过程中，将经过继代9次的植株转移至复壮培养基中，复壮培养基以MS为基础培养基，添加蔗糖30g/L、琼脂6g/L、激素、调节pH为5.8；培养条件为：温度：25℃；光照强度：2200lx；光处理：12h/d，暗处理10h/d，培养20d。每种处理方式选取100株植株。具体激素添加情况如表4所示。

表4不同浓度6-BA对小叶丁香继代苗复壮的影响

序号	激素配比	苗高(cm)	粗度(mm)	芽萌发个数	增殖倍数
						1	无	2.77	1.22	1	1
2	6-BA 0.8mg/L	4.54	1.26	2	3
						3	6-BA 1.6mg/L	4.45	1.32	3	3
4	6-BA 2.4mg/L	6.29	1.44	4	5
						5	6-BA 3.2mg/L	4.40	1.31	2	3
6	6-BA 4mg/L	3.99	1.18	5	4

小叶丁香组培苗在生根过程中，也容易受到培养基中激素浓度的影响，为探索最适宜的生根培养条件，做了以下的筛选试验。在生根培养过程中，将继代培养过程中长出的丛生芽剪切为带有顶芽或1-2个腋芽的茎段，接种于生根培养基中，生根培养基以1/2MS为基础培养基，添加蔗糖30g/L、琼脂6g/L、激素、调节pH为5.8；培养条件为：温度：25℃；光照强度：2200lx；光处理：12h/d，暗处理10h/d，培养20d。每种处理方式选取100株。具体激素添加情况如表5所示。

表4生根培养生长情况统计

序号	激素浓度配比	生根率(％)	生根数
				1	IAA 1.0mg/L	92	10
2	IBA 1.0mg/L	72	7
				3	IBA 1.5mg/L	96	6
4	NAA 1.5mg/L	64	5

实施例1

步骤一：4月底剪取健壮无病虫害植株新生幼嫩枝条顶端部分7-8cm。将剪取的茎段全部去叶后流水下冲洗30min。酒精会对外植体造成一定程度的伤害，选取的茎段过于幼嫩，略过酒精灭菌，直接用有效氯为1％的次氯酸钠溶液浸泡20min后，用无菌水冲洗3次，将茎段剪至1～1.5cm并保证每个茎段都带有顶芽或1-2个腋芽，外植体存活率为80％；

步骤二：启动培养，选取带顶芽或1个腋芽的茎段，长度约1-1.5cm，接种时，芽要求刚好接触培养基，这样芽能有效吸收营养，使得后期继代过程中苗木强壮，分化数多。以MS为基础培养基，添加蔗糖30g/L、琼脂6g/L、激素6-BA 1mg/L、激素NAA 0.2mg/L、调节pH为5.8；培养条件为：温度：25℃；光照强度：2200lx；光处理：12h/d，暗处理10h/d，培养20d，顶芽和茎段腋芽萌发，新生芽平均高度为0.87cm，此阶段芽诱导率为85％，茎壮、嫩绿；

步骤三：将启动培养基中萌发的腋芽或顶芽接种于继代培养基中，继代培养基以MS培养基为基础培养基，同时添加蔗糖30g/L、琼脂6g/L、激素6-BA 4mg/L，调节pH为5.8；培养条件为：温度：25℃；光照强度：2200lx；光处理：12h/d，暗处理10h/d，培养20d，长出丛生芽，丛生芽的平均高度为3.16cm,平均粗度为1.69mm,芽诱导率为94％，增殖倍数为4，茎壮、嫩绿；

步骤四：将新长出的丛生芽剪切为带有顶芽或1-2个腋芽的茎段，长度约1-1.5cm，转移至生根培养基中进行培养，生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，同时添加蔗糖30g/L、琼脂6g/L、激素IBA 1.5mg/L，调节pH为5.8；培养条件为：温度：25℃；光照强度：2200lx；光处理：12h/d，暗处理10h/d，培养20d，生根数为6，根长为3～4cm，植株高为5～6cm，生根率为96％；

步骤五：将步骤四的生根苗用温水洗净根部的生根培养基，然后移栽至基质中，不要窝根露根，基质为：粗草炭土(<6mm)：粗蛭石(1mm～2mm)：粗珍珠岩(3mm～6mm)＝3:2:1混合物；移栽器皿选择规格为：50孔、上口径5*5cm、穴深8.5cm、下口径2*2cm的穴盘。育苗盖：55*30*15，带两个排气孔。移栽完成后当天，为避免伤害幼苗，利用喷雾器进行浇水，浇水至土壤湿度保持在65～75％(按压土壤水分明显挤出)，盖育苗盖，打开排气孔，培养期间每2d用喷雾器喷水使土壤湿度保持在65～75％直至生根苗长出新根，然后使土壤湿度保持在70～80％。培养15d后观察根部生长情况，根部生长健壮，揭盖，揭盖后第一次浇水，使其土壤湿度保持在70～75％；2d后生根苗完全适应外界环境，利用微喷管浇水，使其湿度保持在70～80％，之后每2d进行浇水工作，每次浇水保持土壤湿度为：70～80％，在此条件下培养2年；

步骤六：剪取培养两年的生根苗的带芽茎段作为嫁接穗条，穗条长度为8-10cm，粗0.2～0.5cm，带有2-3个芽，将穗条放置在熔点为60℃融化的石蜡中速蘸穗条，冷却后置于温度小于等于10℃的地窖中沙埋保存；

步骤七:在内蒙古中部地区，待到3月份，室外温度达到5-8℃，将穗条嫁接到暴马丁香砧木中。暴马丁香砧木提前1年栽植，栽植时，选择地径粗度为1.5cm的暴马丁香，选择透水透气且肥沃的地块进行整地，整地时深翻30～40cm，并将地里的杂物清除，然后按照株行距为2m×2m进行种植坑挖掘，挖50cm×50cm的种植坑，在种植坑内均匀填充500g腐熟有机肥作为底肥。栽植时，利用“三埋二踩一提苗”的方法进行栽种，栽植深度不宜过深，土壤与砧木原栽植土平行即可。栽植一年后的砧木春季发芽后，且芽长度达3～5cm时，进行嫁接工作。嫁接前5天对砧木栽植地浇透水，利用劈接的方式进行嫁接，在接穗生物学下端做削面，使削面呈对称偏楔形，长1.5～2.0cm，在距地10cm处截断砧木，在砧木中间部位顺木质部向下纵切，深度同削面；将接穗插入砧木剪口内，接穗削面厚端朝外，使接穗削面与砧木剪口形成层对齐，1个侧枝劈接1个穗条。嫁接后立即用3～4cm塑料条绕缠接穗表面及剪口，使接穗上芽外露。当接穗上萌发新梢长至15～20cm时，用利刀割断绑缠的塑料条。接穗上萌发新梢长到30cm时候，需要用嫁接固定装置进行固定，防止风折。嫁接后随时抹除砧木上萌生的新芽，以集中营养供给和满足接穗新梢生长。嫁接当年5月底6月初开花，6月底7月初结果。

实施例2

步骤一：5月初剪取健壮无病虫害植株新生幼嫩枝条顶端部分7-8cm。将剪取的茎段全部去叶后流水下冲洗30min。酒精会对外植体造成一定程度的伤害，选取的茎段过于幼嫩，略过酒精灭菌，直接用有效氯为1％的次氯酸钠溶液浸泡20min后，用无菌水冲洗5次，将茎段剪至1～1.5cm并保证每个茎段都带顶芽或1-2个腋芽，外植体存活率为82％；

步骤二：启动培养，选取带顶芽或2个腋芽的茎段，长度约1-1.5cm，接种时，芽要求刚好接触启动培养基，这样芽能有效吸收营养，使得后期继代过程中苗木强壮，分化数多。启动培养基以MS为基础培养基，添加蔗糖30g/L、琼脂6g/L、激素6-BA 1mg/L、激素NAA0.2mg/L、调节pH为6.2；培养条件为：温度：30℃；光照强度：2000lx；光处理：14h/d，暗处理12h/d，培养30d，顶芽和茎段腋芽萌发。新生芽平均长度为0.89cm，此阶段芽诱导率为87％，茎壮、嫩绿；

步骤三：将启动培养基中萌发的腋芽或顶芽接种于继代培养基中，继代培养基以MS培养基为基础培养基，同时添加蔗糖30g/L、琼脂6g/L、激素6-BA 4mg/L，调节pH为6.0；培养条件为：温度：30℃；光照强度：2000lx；光处理：14h/d，暗处理12h/d，培养30d，长出丛生芽,丛生芽的平均长度为3.20cm,平均粗度为1.71mm,芽诱导率为95％，增殖倍数为4，茎壮、嫩绿，将新长出的丛生芽剪切为带有顶芽或1-2个腋芽的茎段，继续放入新的继代培养基中，进行培养，培养条件与初次继代培养条件相同，如此进行重复继代，重复继代3次，经过3次继代后，丛生芽的平均长度为5.52cm,平均粗度为1.81mm,芽诱导率为95％，增殖倍数为5茎壮、嫩绿；

步骤四：将新长出的丛生芽剪切为带有顶芽或1-2个腋芽的茎段，长度约1-1.5cm，转移至生根培养基中进行培养，生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，同时添加蔗糖30g/L、琼脂6g/L、激素IBA 1.5mg/L，调节pH为6.2；培养条件为：温度：30℃；光照强度：2000lx；光处理：14h/d，暗处理12h/d，培养30d，生根数为7，根长为3～4cm，植株长为5～6cm，生根率为98％；

步骤五：将步骤四的生根苗用温水洗净根部的生根培养基，然后移栽至基质中，不要窝根露根，基质为：粗草炭土(<6mm)：粗蛭石(1mm～2mm)：粗珍珠岩(3mm～6mm)＝3:2:1混合物；移栽器皿选择规格为：50孔、上口径5*5cm、穴深8.5cm、下口径2*2cm的穴盘。育苗盖：55*30*15，带两个排气孔。移栽完成后当天，为避免伤害幼苗，利用喷雾器进行浇水，浇水至土壤湿度保持在65～75％(按压土壤水分明显挤出)，盖育苗盖，打开排气孔，培养期间每2d用喷雾器喷水，使土壤湿度保持在65～75％直至生根苗长出新根，然后使土壤湿度保持在70～80％。培养15d后观察根部生长情况，根部生长健壮，揭盖。揭盖后第一次浇水，使其土壤湿度保持在70～75％；2d后生根苗完全适应外界环境，利用微喷管浇水，使其湿度保持在70～80％，之后每2d进行浇水工作，每次浇水保持土壤湿度为：70～80％，在此条件下培养2年；

步骤六：剪取培养两年的生根苗的带芽茎段作为嫁接穗条，穗条长度为8-10cm，粗0.2～0.5cm，带有2-3个芽，将穗条放置在熔点为60℃融化的石蜡中速蘸穗条，冷却后置于温度小于等于10℃的地窖中沙埋保存；

步骤七:在内蒙古中部地区，待4月份，室外温度达到9-12℃，将穗条嫁接到暴马丁香砧木中。暴马丁香砧木为提前1年栽植，栽植时，选择地径粗度为1.5cm的暴马丁香，选择透水透气且肥沃的地块进行整地，整地时深翻30～40cm，并将地里的杂物清除，然后按照株行距为2m×2m进行种植坑挖掘，挖50cm×50cm的种植坑，在种植坑内均匀填充500g腐熟有机肥作为底肥。栽植时，利用“三埋二踩一提苗”的方法进行栽种，栽植深度不宜过深，土壤与砧木原栽植土平行即可。栽植一年后的砧木春季发芽后，且芽长度达3～5cm时，进行嫁接工作。嫁接前7天对砧木栽植地浇透水，利用劈接的方式进行嫁接，在接穗生物学下端做削面，使削面呈对称偏楔形，长1.5～2.0cm，在距地10cm处截断砧木，在砧木中间部位顺木质部向下纵切，深度同削面；将接穗插入砧木剪口内，接穗削面厚端朝外，使接穗削面与砧木剪口形成层对齐，1个侧枝劈接1个穗条。嫁接后立即用3～4cm塑料条绕缠接穗表面及剪口，使接穗上芽外露。当接穗上萌发新梢长至15～20cm时，用利刀割断绑缠的塑料条。接穗上萌发新梢长到30cm时候，需要用嫁接固定装置进行固定，防止风折。嫁接后随时抹除砧木上萌生的新芽，以集中营养供给和满足接穗新梢生长。嫁接当年5月底6月初开花，6月底7月初结果。

实施例3

步骤一：5月初剪取健壮无病虫害植株新生幼嫩枝条顶端部分7-8cm。将剪取的茎段全部去叶后流水下冲洗30min。酒精会对外植体造成一定程度的伤害，选取的茎段过于幼嫩，略过酒精灭菌，直接用有效氯为1％的次氯酸钠溶液浸泡20min后，用无菌水冲洗5次，将茎段剪至1～1.5cm并保证每个茎段都带有顶芽或1-2个腋芽，外植体存活率为82％；

步骤二：启动培养，选取带顶芽或2个腋芽的茎段，长度约1-1.5cm，接种时，芽要求刚好接触启动培养基，这样芽能有效吸收营养，使得后期继代过程中苗木强壮，分化数多。启动培养基以MS为基础培养基，添加蔗糖30g/L、琼脂6g/L、激素6-BA 1mg/L、激素NAA0.2mg/L、调节pH为6.2；培养条件为：温度：20℃；光照强度：2000lx；光处理：14h/d，暗处理12h/d，培养30d，顶芽和茎段腋芽萌发，新生芽平均长度为0.89cm，此阶段芽诱导率为87％，茎壮、嫩绿；

步骤三：将启动培养基中萌发的腋芽或顶芽接种于继代培养基中，继代培养基以MS培养基为基础培养基，同时添加蔗糖30g/L、琼脂6g/L、激素6-BA 4mg/L，调节pH为6.0；培养条件为：温度：20℃；光照强度：2000lx；光处理：14h/d，暗处理12h/d，培养30d，长出丛生芽，丛生芽的平均长度为3.20cm,平均粗度为1.71mm,芽诱导率为95％，增殖倍数为4，茎壮、嫩绿，将新长出的丛生芽剪切为带有顶芽或1-2个腋芽的茎段，继续放入新的继代培养基中，进行培养，培养条件与初次继代培养条件相同，如此进行重复继代，重复继代9次，经过9次重复继代后，丛生芽增殖倍数为4，平均长度为3.99cm，平均粗度为1.18mm。

步骤四:将经过9次继代后的丛生芽转移至复壮培养基中，复壮培养基以MS培养基为基础培养基，同时添加蔗糖30g/L、琼脂6g/L、激素6-BA 2.4mg/L，调节pH为6.0；培养条件为：温度：20℃；光照强度：2000lx；光处理：12h/d，暗处理10h/d，培养20d，丛生芽的增殖倍数由4增加为5，苗高从平均高度3.99cm增高到平均高度为6.29cm、粗度由平均粗度为1.18mm增加到1.44mm。

步骤五：将经过复壮新长出的丛生芽剪切为带有1-2个顶芽或腋芽的茎段，转移至生根培养基中进行培养，生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，同时添加蔗糖30g/L、琼脂6g/L、激素IBA 1.5mg/L，调节pH为6.2；培养条件为：温度：20℃；光照强度：2000lx；光处理：14h/d，暗处理12h/d，培养30d，生根数为7，根长为3～4cm，植株长为5～6cm，生根率为97％；

步骤六：将步骤五的生根苗用温水洗净根部的生根培养基，然后移栽至基质中，不要窝根露根，基质为：粗草炭土(<6mm)：粗蛭石(1mm～2mm)：粗珍珠岩(3mm～6mm)＝3:2:1混合物；移栽器皿选择规格为：50孔、上口径5*5cm、穴深8.5cm、下口径2*2cm的穴盘。育苗盖：55*30*15，带两个排气孔。移栽完成后当天，为避免伤害幼苗，利用喷雾器进行浇水，浇水至土壤湿度保持在65～75％(按压土壤水分明显挤出)，盖育苗盖，打开排气孔，培养期间每2d用喷雾器喷水使土壤湿度保持在65～75％直至生根苗长出新根，然后使土壤湿度保持在70～80％。培养15d后观察根部生长情况，根部生长健壮，揭盖。揭盖后第一次浇水，使其土壤湿度保持在70～75％；2d后生根苗完全适应外界环境，利用微喷管浇水，使其湿度保持在70～80％，之后每2d进行浇水工作，每次浇水保持土壤湿度为：70～80％，在此条件下培养2年；

步骤七：剪取培养两年的生根苗的带芽茎段作为嫁接穗条，穗条长度为8-10cm，粗0.2～0.5cm，带有2-3个芽，将穗条放置在熔点为60℃融化的石蜡中速蘸穗条，冷却后置于温度小于等于10℃的地窖中沙埋保存；

步骤八:在内蒙古中部地区，待4月份，室外温度达到12-15℃，将穗条嫁接到暴马丁香砧木中。暴马丁香砧木提前1年栽植，栽植时，选择地径粗度为1.5cm的暴马丁香，选择透水透气且肥沃的地块进行整地，整地时深翻30～40cm，并将地里的杂物清除，然后按照株行距为2m×2m进行种植坑挖掘，挖50cm×50cm的种植坑，在种植坑内均匀填充500g腐熟有机肥作为底肥。栽植时，利用“三埋二踩一提苗”的方法进行栽种，栽植深度不宜过深，土壤与砧木原栽植土平行即可。栽植一年后的砧木春季发芽后，且芽长度达3～5cm时，进行嫁接工作。嫁接前7天对砧木栽植地浇透水，利用劈接的方式进行嫁接，在接穗生物学下端做削面，使削面呈对称偏楔形，长1.5～2.0cm，在距地10cm处截断砧木，在砧木中间部位顺木质部向下纵切，深度同削面；将接穗插入砧木剪口内，接穗削面厚端朝外，使接穗削面与砧木剪口形成层对齐，1个侧枝劈接1个穗条。嫁接后立即用3～4cm塑料条绕缠接穗表面及剪口，使接穗上芽外露。当接穗上萌发新梢长至15～20cm时，用利刀割断绑缠的塑料条。接穗上萌发新梢长到30cm时候，需要用嫁接固定装置进行固定，防止风折。嫁接后随时抹除砧木上萌生的新芽，以集中营养供给和满足接穗新梢生长。嫁接当年5月底6月初开花，6月底7月初结果。

实施例4

步骤一：剪取4月底5月初健壮无病虫害植株新生幼嫩枝条顶端部分7-8cm。将剪取的茎段全部去叶后流水下冲洗30min。酒精会对外植体造成一定程度的伤害，选取的茎段过于幼嫩，略过酒精灭菌，直接用有效氯为1％的次氯酸钠溶液浸泡20min后，用无菌水冲洗3次，将茎段剪至1～1.5cm并保证每个茎段都带有顶芽或1-2个腋芽，外植体存活率为81％；

步骤二：启动培养，选取带顶芽或1个腋芽的茎段，长度约1-1.5cm，接种时，芽要求刚好接触培养基，这样芽能有效吸收营养，使得继代苗木强壮，分化数多。以MS为基础培养基，添加蔗糖30g/L、琼脂6g/L、激素6-BA 1mg/L、激素NAA 0.2mg/L、调节pH为6.0；培养条件为：温度：20℃；光照强度：2100lx；光处理：14h/d，暗处理12h/d，培养25d，顶芽和茎段腋芽萌发，新生芽平均长度为0.86cm，此阶段芽诱导率为88％，茎壮、嫩绿；

步骤三：将启动培养基中萌发的腋芽或顶芽接种于继代培养基中，继代培养基以MS培养基为基础培养基，同时添加蔗糖30g/L、琼脂6g/L、激素6-BA 4mg/L，调节pH为6.0；培养条件为：温度：20℃；光照强度：2100lx；光处理：14h/d，暗处理12h/d，培养25d，长出丛生芽,丛生芽的平均长度为3.36cm,平均粗度为1.75mm,芽诱导率为94％，增殖倍数为4，茎壮、嫩绿，将新长出的丛生芽剪切为带有顶芽或1-2个腋芽的茎段，继续放入新的继代培养基中，进行培养，培养条件与初次继代培养条件相同，如此进行重复继代，重复继代6次，经过6次继代后，丛生芽的平均长度为5.79cm,平均粗度为1.86mm,芽诱导率为95％，增殖倍数为5，茎壮、嫩绿；

步骤四：将新长出的丛生芽剪切为带有顶芽或1-2个腋芽的茎段，长度约1-1.5cm，转移至生根培养基中进行培养，生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，同时添加蔗糖30g/L、琼脂6g/L、激素IBA 1.5mg/L，调节pH为6.2；培养条件为：温度：20℃；光照强度：2100lx；光处理：14h/d，暗处理12h/d，培养25d，生根数为6，根长为3～4cm，植株长为5～6cm，生根率为97％；

步骤五：将步骤四的生根苗用温水洗净根部的生根培养基，然后移栽至基质中，不要窝根露根，基质为：粗草炭土(<6mm)：粗蛭石(1mm～2mm)：粗珍珠岩(3mm～6mm)＝3:2:1混合物；移栽器皿选择规格为：50孔、上口径5*5cm、穴深8.5cm、下口径2*2cm的穴盘。育苗盖：55*30*15，带两个排气孔。移栽完成后当天，为避免伤害幼苗，利用喷雾器进行浇水，浇水至土壤湿度保持在65～75％(按压土壤水分明显挤出)，盖育苗盖，打开排气孔，培养期间每2d用喷雾器喷水使土壤湿度保持在65～75％直至生根苗长出新根，然后，使土壤湿度保持在70～80％。培养15d后观察根部生长情况，根部生长健壮，揭盖，揭盖后第一次浇水，使其土壤湿度保持在70～75％；2d后生根苗完全适应外界环境，利用微喷管浇水，使其湿度保持在70～80％，之后每2d进行浇水工作，每次浇水保持土壤湿度为：70～80％，在此条件下培养2年；

步骤六：剪取培养两年的生根苗的带芽茎段作为嫁接穗条，穗条长度为8-10cm，粗0.2～0.5cm，带有2-3个芽，将穗条放置在熔点为60℃融化的石蜡中速蘸穗条，冷却后置于温度小于等于10℃的地窖中沙埋保存；

步骤七:待4月份，室外温度达到12-15℃，将穗条嫁接到暴马丁香砧木中。暴马丁香砧木提前1年栽植，栽植时，选择地径粗度为1.5cm的暴马丁香，选择透水透气且肥沃的地块进行整地，整地时深翻30～40cm，并将地里的杂物清除，然后按照株行距为2m×2m进行种植坑挖掘，挖50cm×50cm的种植坑，在种植坑内均匀填充500g腐熟有机肥作为底肥。栽植时，利用“三埋二踩一提苗”的方法进行栽种，栽植深度不宜过深，土壤与砧木原栽植土平行即可。栽植一年后的砧木春季发芽后，且芽长度达3～5cm时，进行嫁接工作。嫁接前6天对砧木栽植地浇透水，利用劈接的方式进行嫁接，在接穗生物学下端做削面，使削面呈对称偏楔形，长1.5～2.0cm，在距地10cm处截断砧木，在砧木中间部位顺木质部向下纵切，深度同削面；将接穗插入砧木剪口内，接穗削面厚端朝外，使接穗削面与砧木剪口形成层对齐，1个侧枝劈接1个穗条。嫁接后立即用3～4cm塑料条绕缠接穗表面及剪口，使接穗上芽外露。当接穗上萌发新梢长至15～20cm时，用利刀割断绑缠的塑料条。接穗上萌发新梢长到30cm时候，需要用嫁接固定装置进行固定，防止风折。嫁接后随时抹除砧木上萌生的新芽，以集中营养供给和满足接穗新梢生长。嫁接当年5月底6月初开花，6月底7月初结果。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (7)

1.一种小叶丁香的组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)外植体选择及消毒：

剪取当年生幼嫩枝条顶端部分，将其剪切为带有顶芽或1-2个腋芽的茎段作为外植体，进行消毒处理；消毒为用次氯酸钠溶液浸泡然后用无菌水冲洗；所述次氯酸钠溶液中有效氯为1％，浸泡时间为20min，无菌水冲洗次数为3-5次；

(2)启动培养：

将外植体放入启动培养基中，使顶芽或腋芽刚好接触培养基，直至顶芽或腋芽萌发；所述启动培养基以MS培养基为基础培养基，同时添加蔗糖30g/L、琼脂6g/L、激素6-BA 1mg/L、激素NAA 0.2mg/L，调节pH为5.8～6.2；

(3)继代培养：

剪取步骤(2)中萌发的腋芽或顶芽并接种于继代培养基中进行培养，直至长出丛生芽；继代培养步骤后还包括继代苗复壮的步骤：将重新长出的丛生芽转移至复壮培养基中直至丛生芽的增殖倍数不低于5，复壮培养基以MS培养基为基础培养基，同时添加蔗糖30g/L、琼脂6g/L、激素6-BA2.4mg/L，调节pH为5.8～6.2；

(4)生根培养：

将新长出的丛生芽剪切为带有顶芽或1-2个腋芽的茎段，转移至生根培养基中进行培养直至生根得到生根苗；

(5)移栽：

将步骤(4)得到的生根苗用温水洗净根部的生根培养基，然后移栽至基质中进行培养，得到组培生根苗。

2.根据权利要求1所述的小叶丁香的组织培养方法，其特征在于，所述启动培养过程中萌发的顶芽或腋芽长度为5mm～1cm；所述继代培养基以MS培养基为基础培养基，同时添加蔗糖30g/L、琼脂6g/L、激素6-BA 4mg/L，调节pH为5.8～6.2，继代培养过程中丛生芽长至3～6cm；所述生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，同时添加蔗糖30g/L、琼脂6g/L、激素IBA 1.5mg/L，调节pH为5.8～6.2，生根苗的根长为3～4cm，植株高5～6cm。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的小叶丁香的组织培养方法，其特征在于，继代培养步骤中还包括一次或多次重复继代步骤：

将丛生芽剪切为带有顶芽或1-2个腋芽的茎段，重新转移至新的继代培养基中继续培养，直至重新长出丛生芽且丛生芽高至3～6cm。

4.根据权利要求1-2中任一项所述的小叶丁香的组织培养方法，其特征在于，启动培养、继代培养、生根培养和继代苗复壮过程中的培养条件为：温度：25±5℃；光照强度：2000～2200lx；光处理：12～14h/d，暗处理10～12h/d，培养20～30d。

5.根据权利要求1-2中任一项所述的小叶丁香的组织培养方法，其特征在于，步骤(5)中移栽的基质为质量比为3:2:1的粗草炭土、粗蛭石和粗珍珠岩的混合物，移栽后浇水，使土壤湿度保持在65～80％直至长出新根，待新长出的根部生长健壮后，使土壤湿度保持在为70～80％。

6.一种利用权利要求1-5中任一项所述的小叶丁香的组织培养方法快速获取小叶丁香大苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)通过组织培养得到组培生根苗；

(2)剪取组培生根苗中带芽茎段作为嫁接穗条，以暴马丁香作为砧木进行嫁接。

7.根据权利要求6所述的快速获取小叶丁香大苗的方法，其特征在于，步骤(2)中，穗条的长度为8-10cm，粗0.2～0.5cm，带有2-3个芽，暴马丁香砧木为至少提前1年种植所得；嫁接前5-7天对砧木栽植地浇透水，利用劈接的方式进行嫁接，劈接口深度为1.5-2cm，嫁接后立即密封嫁接口，嫁接后10-15d再次进行浇水，随时抹除砧木萌芽。