KR100770203B1

KR100770203B1 - 담배 유래의 인산수송자 유전자를 이용한 식물의 인산흡수증대 방법과 동 방법을 이용하여 인산흡수율이 증대된형질전환 식물체

Info

Publication number: KR100770203B1
Application number: KR1020050125445A
Authority: KR
Inventors: 윤성중; 박명렬; 백소현
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2005-12-19
Filing date: 2005-12-19
Publication date: 2007-10-25
Also published as: KR20070064876A

Abstract

본 발명은 식물의 인산흡수효율 증대를 가능하게 하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 담배(Nicotiana tabacum) 유래의 인산 수송자(Phosphate Transporter) NtPT(Nicotiana tabacum Phosphate Transporter) 유전자를 이용한 식물의 인산흡수 증대 방법과 동 방법을 이용하여 인산흡수율이 증대된 형질전환 식물체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법은 식물체의 인산흡수율을 증가시킴으로써 인산질 비료 저투입에 의한 재배가 가능한 환경학적으로 우수한 식물체를 제조 및 개발할 수 있는 장점이 있어, 식물종자 산업분야 등에 유용하게 이용될 수 있다.

니코티아나 타바쿰, 포스페이트 트랜스포터, NtPT, 벼, 형질전환식물체, 인산흡수율

Description

담배 유래의 인산수송자 유전자를 이용한 식물의 인산흡수 증대 방법과 동 방법을 이용하여 인산흡수율이 증대된 형질전환 식물체{Method to improve plants phosphate uptake by increased Nicotiana tabacum phosphate transporter transgene expression and plants with improved phosphate uptake developed by the application of the method}

도 1은 NtPT 유전자 발현 구조를 포함하는 식물유전자 발현용 바이너리 벡터(pMG-NtPT)의 부분 구성도이다.

도 2는 위 그림은 무균발아 배유 절편의 NtPT 재조합 유전자 벡터 함유 아그로박테리움과의 공동배양 후 항생제 하이그로마이신이 함유된 배지에서 유전자가 도입된 세포의 선발과 선발된 세포로부터의 신초와 뿌리의 분화 과정이고, 아래 그림은 재분화 식물체의 포트 순화 및 온실 순화와 개화식물체의 개화 결실과정이다.

도 3은 T2 세대 NtPT 동질형 계통 1-7-4, 1-7-6, 1-7-8, 10-2-7의 식물체로부터 추출한 DNA내에 삽입되어 있는 NtPT 전이유전자를 서던 블럿 분석을 통하여 확인한 결과이다.

레인 1:삽입유전자 NtPT의 1 사본에 해당하는 DNA양

레인 2:삽입유전자 NtPT의 2 사본에 해당하는 DNA양.

레인 3:형질전환과정을 거치지 않은 대조식물체.

레인 4:1-7-4

레인 5:1-7-6

레인 6:1-7-8

레인 7:10-2-7

도 4는 대조식물체와 형질전환 식물체(1-7-4, 1-7-6, 1-7-8, 10-2-7 계통)의 NtPT 전이유전자의 발현여부를 NtPT 탐침을 이용하여 노던 블럿에 의해 검출한 결과(A)와 인산흡수율을 분석한 결과(B)이다.

도 5는 대조식물체와 형질전환 식물체(1-7-4, 1-7-6, 1-7-8, 10-2-7 계통)의 인산함량을 분석한 결과이다.

본 발명은 식물의 인산흡수효율 증대를 가능하게 하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 담배(Nicotiana tabacum) 유래의 인산 수송자(Phosphate Transporter) NtPT(Nicotiana tabacum Phosphate Transporter) 유전자를 이용한 식물의 인산흡수 증대 방법과 동 방법을 이용하여 인산흡수율이 증대된 형질전환 식물체에 관한 것이다.

인산은 식물 생육에 요구되는 필수 영양소중 하나로, 에너지 전달, 신호 변환, 고분자의 생합성, 광합성, 호흡 등 식물의 모든 물질대사 과정에서 중요한 조절자로서 관여한다 (Plaxton WC, Carswell MC, 1999, Plant Responses to Environmental Stresses: From Phytohormones to Genome Reorganization. (HR Lerner, ed.), M. Dekker Inc., N.Y. pp. 349-372; Raghothama KG, 1999, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50: 665-693). 토양중의 무기인산은 생화학 에너지를 소비하여 세포막을 가로질러 뿌리세포 내로 흡수되며(Marschner H, 1995, Mineral Nutrition of Higher Plants. Academic Press), 식물체에 이용되는 인산의 흡수와 이동은 세포막과 미소기관의 막에 존재하는 인산 수송자(phosphate transporter)를 통하여 능동적으로 이루어진다. 뿌리의 세포막에서 인산을 흡수하는 작용을 하는 인산수송자(phosphate transporter) 유전자는 아기장대(Muchhal US, Pardo JM, Raghothama KG, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10519-10523), 감자(Leggewie G, Willmitzer L, Riesmeier JW, 1997, Plant Cell 9: 381-392), 토마토(Liu C, Muchhal US, Uthappa M, Kononowicz AK, Raghothama KG, 1998, Plant Physiol. 116: 91-99), 담배(Baek SH, Chung IM, Yun SJ, 2001, Mol. Cells 11: 1-6) 등에서 분리되어, 이들 유전자의 구조, 구성, 발현 조절 특성이 밝혀지고 있다. 뿌리 세포막의 고친화성 인산 수송자 중 친화도가 상대적으로 낮은 동위형은 항시적으로 발현되며 인산부족시 발현이 더 높아지는 반면, 친화도가 더 높은 수송자는 주로 뿌리에서 인산부족 조건에서만 발현되는 것으로 밝혀지고 있다(Schachtman DP, Reid RJ, Ayling SM, 1998, Plant Physiol. 116: 447-453). 이는 식물이 인산 농도가 현저히 감소할 경우에는 인산에 대한 친화도가 더 높은 수송자를 발현하여 낮은 인산 농도에서 효과적으로 생존하는 것으로 생각되어 진다.

아기장대 인산 수송자가 과발현된 현탁배양 담배 세포는 인산농도가 낮은 조건에서 인산흡수율이 높아졌고, 세포의 생장은 대조구와 비교하여 생체중이 42%, 건물중은 55% 증가되었다고 보고했다(Mitsukawa N, Okamura S, Shirano Y, Sato S, Kato T, Harashima S, Shibata D, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 7098-7102). 이것은 외래 유전자의 도입에 의해 세포막에 더 많은 인산 수송 단백질이 만들어짐으로써, 식물체 전체에서 인산의 흡수를 증가시켰다는 흥미로운 결과이다. 결과적으로 유전공학기법에 의해 작물의 인산 흡수를 증가시킬 수 있음을 의미하는 결과이다.

작물의 양분 이용 효율 개선 연구는 주요 식량 작물인 벼를 대상으로 많이 수행되고 있으며, 고친화성 담배 인산 수송 유전자를 이용한 형질전환 벼의 개발이 이루어 졌다(Yoo NH, Yun SJ, 2000, Korean J. Plant Tissue Culture 27(6): 441-445). 최근의 연구 결과로는 보리인산수송 유전자가 형질전환된 벼의 세포 현탁배양을 통한 연구(Anne L. Rea, Janine M. Jarmey, Stephen R. Mudge and Frank W. Smith, 2003, Plant Molecular Biology. 53, 27-36)와 보리에 보리의 인산수송유전자를 형질전환시킨 연구가 발표되었다(Anne L. Rea, Janine M. Jarmey, Stephen R. Mudge and Frank W. Smith., 2004, Functional Plant Biology. 31, 141-148).

이에 따라, 본 발명에서는 담배(Nicotiana tabacum) 유래 NtPT 유전자를 식물유전자 발현 운반체에 재조합하여 아그로박테리움 투메파시엔스를 이용하여 벼 세포에 삽입하고 유전자가 전이된 세포로부터 완전한 벼 식물체를 분화시키고 세대를 진전하여 인산흡수효율이 증가한 벼 계통을 획득하였다. 상기의 방법과 상기 방법을 이용하여 얻어진 벼 계통은 전통적인 교잡과 선발을 이용하는 방법과 그에 따라 얻어지는 다수의 유전자가 조합되는 품종과 그 특성이 다르다. 즉, 본 발명에 의하여 얻어진 벼 품종은 본 발명에 사용한 재료 품종의 우수한 형질을 그대로 유지하면서 단지 인산흡수율만 증가한 것으로 벼에서 인산흡수효율이 향상된 것이다.

본 발명은 식량, 원예, 화훼 및 기타 환경정화용 식물의 인산흡수효율을 향상시켜 인산질 비료의 저투입이 가능하고 환경학적으로 우수한 식물체를 제조 및 개발할 수 있는 장점이 있어, 식물종자 산업분야 등에 유용하게 이용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 담배(Nicotiana tabacum) 유래 NtPT 유전자를 이용하여 식물의 인산흡수효율이 향상시키는 방법과 이 방법을 이용하여 인산흡수효율이 향상된 조직 배양에 의해 무성번식되는 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명은 담배(Nicotiana tabacum) 유래 NtPT 유전자를 식물 유전자 발현용 운반체인 pGA1611에 재조합하여 작성한 유전자 재조합체(pMG-NtPT)를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)에 도입하고 유전자 재조합체가 도입된 아그로박테리움 투메파시엔스를 벼의 1-2mm 지름의 캘러스(callus)와 공동배양하여 인산흡수율이 증가한 벼 계통을 개발하고, 인산흡수효율을 증가시켜 식물체내에 생체대사에 이용 가능한 인산함량을 증가시킨 형질전환 벼 식물체을 이용하여 인산질 비료 저투입 고효율의 환경학적으로 우수한 벼 식물체를 제공함으로써 화학비료에 의한 환경오염을 최소화시키는 뛰어난 실질적 효과가 있으며, 동 발명을 이용하여 벼 이외의 식물체에서도 인산흡수효율이 증가한 품종을 개발할 수 있는 방법을 제공함으로서 식물종자산업의 발전에도 유용할 수 있어 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 담배(Nicotiana tabacum)로부터 유래된 인산 수송자 NtPT 유전자를 pGA16118에 재조합하여 작성한 식물 유전자 발현용 바이너리 벡터 pMG-NtPT를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 벡터 pMG-NtPT를 이용하여 NtPT가 발현되어 인산흡수효율을 증가시켜 식물체내에 생체대사에 이용 가능한 인산함량을 증가시킨 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 벡터 pMG-NtPT를 이용하여 NtPT가 발현되는 식물의 인산흡수 증대 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 담배(Nicotiana tabacum) 유래 NtPT 유전자를 식물 유전자 발현용 운반체인 pGA16118에 재조합하여 작성한 유전자 재조합체(pMG-NtPT)를 작성하는 단계; 상기 유전자 재조합체를 아그로박테리움 투메파시엔스에 도입하는 단계; 상기 유전자 재조합체가 도입된 아그로박테리움 투메파시엔스를 벼의 캘러스(callus)와 공동 배양하여 유전자를 벼 세포에 전이하고, 유전자가 전이된 세포를 선발한 다음, 완전한 식물체로 재분화시키는 단계; 상기 재분화 식물체의 세대를 진전시키고 유전적 특성과 인산흡수율을 분석하여 독특한 특성을 가진 계통을 선발하는 단계로 구성된다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시 예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리 범위는 이들에만 한정되는 것은 아니다.

<실시예1>담배(Nicotiana tabacum) 유래 NtPT 유전자의 벼 세포내 삽입 및 형질전환

(제1단계)담배(Nicotiana tabacum) 유래 NtPT 유전자와 식물 유전자 발현용 운반체인 pGA1611의 유전자 재조합체 작성

제작한 pMG-NtPT에 사용된 백본벡터는 pGA1611(포항공과대학(포항, 한국) 안진흥 교수로부터 분양받아 사용함)로써, 본인의 실험실에서 확보한 담배(Nicotiana tabacum) 유래 NtPT 유전자(2003년도 대한민국 특허, 등록번호 10-0401007)의 완전한 판독틀의 5‘상류와 3’하류를 각각 Hind III와 Sac I 제한효소로 제한하여 얻은 완전한 판독틀이 포함된 1.67 kb 단편을 pGA1611에 재조합하여 형질전환용 유전자 재조합체(pMG-NtPT)를 작성하였다(도 1). 도 1에 사용된 약어는 다음과 같다: pUbi, maize ubiquitin promoter: Hyg, Hygromycin phosphotransferase: Tnos, polyadenylation signal of the nopaline synthase gene: CaMV35S, 35S promoter of cauliflower mosaic virus: NtPT, Nicotiana tabacum Phosphate Transporter: 7', polyadenylation signal of the gene 7 of pTiA6: RB, T-DNA right border: LB, T-DNA left border.

(제2단계) 벼 세포내로 재조합 유전자 운반체의 도입 및 운반체가 도입된 세포의 선발

냉해동방법(freezing-thawing, An G, Ebert PR, Mitra A, Ha SB, 1988, Plant Molecular Biology Manual A3: 1-19. (Gelvin., S.B., Schilperoort, R., and Verma, D. P., Eds.), Kluwer Academic Pub., The Netherlands)을 이용하여 상기 제1단계에서 제작한 pMG-NtPT를 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA 4404에 도입하고, 하이그로마이신 배지에서 재조합 유전자 운반체가 도입된 균주를 선발하였으며, 선발된 균주를 배양하여 pMG-NtPT를 분리한 다음, 제한효소 처리 등을 통하여 pMG-NtPT가 균주내로 도입되었음을 확인하였다.

pMG-NtPT 유전자 재조합체가 도입된 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA 4404를 50 mg/L 하이그로마이신이 포함된 YEP(1% yeast extract, 1% peptone, 0.5% NaCl) 액체배지에 접종한 다음 28℃, 암상태에서 48시간 이상 250 rpm으로 진탕 배양하였다. 아그로박테리움 배양액의 OD₆₀₀가 0.6일 때 배양액을 AAM 액체배지에 10배 희석하였고 희석액을 이용하여 지름이 1-2mm 크기인 캘러스(callus)를 10분간 접종하였다. 아그로박테리움을 접종한 캘러스(callus)는 2,4-D(2 ㎎/L), 세포탁심(cefotaxime, 250 mg/L), 하이그로마이신(40 mg/L)이 첨가된 N6 기본배지에서 1차 선발한 캘러스(callus)를 다시 2,4-D(2 ㎎/L), 세포탁심(cefotaxime, 250 mg/L), 하이그로마이신(40 mg/L), BA(0.5 mg/L)가 첨가된 N6 기본배지에서 2차 선발하였다(도 2).

(제3단계) 운반체가 도입된 세포로부터 식물체의 재분화

상기 2단계에서 선발하여 분화된 신초를 NAA(0.1 mg/L), 케네틴(2.0 mg/L), 세포탁심(125 mg/L)이 첨가된 MS 기본배지에 이식하여 발근을 유도한 유식물체를 토양에 이식하여 정상적으로 성장 발달하여 개화 결실한 벼 식물체로 육성(도 2)한 다음, 중합효소 연쇄반응(PCR)방법을 통해 전이유전자의 삽입을 확인하였다. 개화 결실을 유도하고 채종하여 192계통의 T0세대 종자를 확보하였다. 전이유전자의 삽입이 확인된 T0세대 모두를 시험포장에 파종하여 T0종자를 채종하였다. T0종자를 파종하여 육성한 1-7-4, 1-7-6, 1-7-8, 10-2-7계통 T1 식물체에 대한 전이유전자조성을 확인하여 전이유전자가 동질개체를 선발하여 T1 종자를 수확하였다. T1종자로부터 전이유전자가 동질상태인 T2식물체를 육성하여 서던분석, 노던분석, 인산흡수율과 인산함량조사를 실시하였다.

(제4단계) 재분화 식물체 내의 NtPT 전이유전자 존재 및 발현 여부 확인

선발된 형질전환 식물체 내에 NtPT 유전자 삽입여부를 확인하기 위하여 서던 분석을 실시하였다. 선발된 벼 잎으로부터 통상의 방법에 의해 추출한 유전체 DNA(염색체 DNA)에 대해 제한효소(EcoR I)를 처리하고 아가로스전기영동을 실시하여 나이론 막에 전이시키고 화학발광효소가 결합된 NtPT탐침을 이용하여 염색체 DNA 내의 전이유전자 존재를 조사하였다. 형질 전환시킨 계통의 T2세대 식물체(1-7-4, 1-7-6, 1-7-8, 10-2-7 계통)내에 NtPT 유전자가 전달되었고, 대조식물체에는 전이유전자가 존재하지 않음을 확인하였다(도3).선발된 형질전환 식물체 내에 NtPT 유전자 발현여부를 확인하기 위하여 노던 분석을 실시하였다. T2세대 형질전환계통 식물체에서만 전이유전자가 안정적으로 발현되고 있으며 인산흡수율도 비형질전환 대조 식물체에 비하여 증가하였다(도4).

<실시예2> 인산흡수효율이 증가한 벼 계통의 개발

(제1단계) 재조합 유전자의 삽입이 확인된 재분화 벼 식물체 계통의 인산흡수 효율조사

재조합 유전자의 도입이 확인된 형질전환 벼 계통 중 1-7-4, 1-7-6, 1-7-8, 10-2-7계통과 비형질전환 동진벼 식물체의 인산흡수율을 동위원소(Phosphorus³² )를 이용하여 분석하였다. 각 실험계통의 T1세대 종자를 25℃ 암조건에서 3일간 발아시킨 후, 발아된 종자를 2주간 요시다 수경액(Yoshida S, Forno DA, Cock JH, Gomez KA, 1976, The international rice research institute, Philippines. pp. 61-66)으로 재배하여 T2세대 식물체를 육성하였다.

인산충분조건(정상 양액:NH₄NO₃(11.4mg/L), NaH₂PO₄ㆍ2H₂O(50.4mg/L), K₂SO₄(89.3mg/L), CaCl₂ㆍ2H₂O(110.8mg/L), MgSO₄ㆍ7H₂O(405mg/L), MnCl₂ㆍ4H₂O (1.88mg/L), (NH₄)₆ㆍMO₇O₂₄ㆍ4H₂O(0.09mg/L), H₃BO₃(1.17mg/L), ZnSO₄ㆍ7H₂O(0.04mg/L), CuSO₄ㆍ5H₂O(0.04mg/L), FeCl₃ㆍ6H₂O(9.63mg/L), Citric acid (monohydrate, 14.9mg/L))에서 2주간 자란 식물체를 각각 정상 양액(인산충분조건)과 인산 부족 양액(정상 양액의 인산의 1/10, 인산부족조건:NH₄NO₃(11.4mg/L), NaH₂PO_4ㆍ2H₂O(5.04mg/L), K₂SO₄(89.3mg/L), CaCl₂ㆍ2H₂O(110.8mg/L), MgSO₄ㆍ7H₂O(405mg/L), MnCl₂ㆍ4H₂O (1.88mg/L), (NH₄)₆ㆍMO₇O₂₄ㆍ4H₂O(0.09mg/L), H₃BO₃(1.17mg/L), ZnSO₄ㆍ7H₂O(0.04mg/L), CuSO₄ㆍ5H₂O(0.04mg/L), FeCl₃ㆍ6H₂O(9.63mg/L), Citric acid (monohydrate, 14.9mg/L))으로 2주간 더 재배하였다. 인산흡수율을 조사하기 위해서 각 양액조건에 990Bq/ml Phosphorus³²(Anne L. Rea, Janine M. Jarmey, Stephen R. Mudge and Frank W. Smith., 2004, Functional Plant Biology. 31, 141-148)를 첨가하였고, 10분 후에 식물체를 채취하였다. 각 처리구에서 채취한 식물체를 증류수로 3회 세척하여 식물체 표면에 잔존한 Phosphorus³²을 제거한 후 식물체를 지상부와 지하부로 분리하여 70℃에서 3일간 건조하였다. 각 시료의 건물중을 측정한 뒤, H₂SO₄와 H₂O₂를 이용한 습식분해방법(Lee SH and Kim WS, 2001, J. Kor. Soc. Hort. Sci. 42(4):444-448)으로 시료를 완전히 소화시키고, 소화된 시료를 3차 증류수로 정용(25ml)하였다. 정용한 시료(1 ml)를 액체섬광계수기용 혼합시료용액(2 ml LSC-cocktai)과 혼합하여 액체섬광계수기(liquid scintillation counter, model 1409 DSA, Wallac, USA)를 이용하여 방사선량을 측정하였다. 인산흡수율은 방사선량에 의해 환산한 인산함량을 건물중과 처리시간을 고려하여 산출하였다.

도4 에서 보는 바와 같이 T2세대 형질전환계통 식물체에서만 전이유전자가 안정적으로 발현되고 있으며 인산흡수율도 비형질전환 대조 식물체에 비하여 증가하였다. 인산흡수율을 분석한 결과를 요약하면 표 1과 같다. 형질전환계통 1-7-4, 1-7-6, 1-7-8, 10-2-7 식물체의 인산흡수율이 인산충분조건에서 비형질전환 대조 식물체에 비하여 각각 43.08, 33.50, 26.32, 44.89% 증가하였으며, 인산결핍조건에서는 각각 32.29, 30.57, 24.90, 8.90% 증가하였다. 이와 같은 결과는 벼에 삽입된 NtPT 전이유전자의 발현에 의해 인산 흡수율을 대조대비 평균 24-37% 증가시킬 수 있음을 나타내는 것이라 할 수 있다.

실시예2의 결과는 전이유전자 동질형 T2세대 식물체내에 존재하는 NtPT 전이유전자의 발현에 의해 인산흡수율이 증가하였음을 나타낸다. 이러한 결과는 인산의 흡수와 이동은 세포막과 미소기관의 막에 존재하는 인산 수송자(phosphate transporter)를 통하여 능동적으로 이루어짐을 의미한다. 따라서 인산수송자를 통해 진행되는 모든 식물체의 경우에도 인산수송자 유전자의 형질전환에 의하여 인산흡수 효율을 증가시킬 수 있음을 의미한다.

이상의 본 발명은 인산수송자 유전자의 형질전환에 의해 인산흡수 효율이 증가한 식물체를 작성할 수 있는 방법을 제공한다.

표 1. T2세대 NtPT동질형 형질전환 계통 식물체와 비형질전환 대조(동진벼) 식물체의 인산 흡수율

	CPM/min/g FW		nmol P/min/g DW		대조 대비 증가율(%)
	정상양액	인산결핍양액	정상양액	인산결핍양액	정상양액	인산결핍양액
1-7-4	13,518.174	256,596.398	0.07	1.28	43.08	32.29
1-7-6	12,613.298	253,255.810	0.06	1.27	33.50	30.57
1-7-8	11,934.157	242,253.741	0.06	1.21	26.32	24.90
10-2-7	13,688.730	211,225.957	0.07	1.06	44.89	8.90
형질전환계통 평균	12,938.59	240,832.98	0.07	1.21	36.95	24.16
동진벼	94479.31	1939589.12	0.05	0.97	0.00	0.00

(제2단계) 재조합 유전자의 삽입이 확인된 재분화 벼 식물체 계통의 인산함량 조사

본 발명의 실시예 2의 1단계에서 인산흡수율의 증가가 확인된 T2세대 재분화 벼계통 1-7-4, 1-7-6, 1-7-8, 10-2-7의 전이유전자동질형 식물체와 비형질전환 동진벼 식물체 내의 인산함량을 ICP(inductively coupled plasma spectrometer)를 이용하여 측정하였다.

각 실험계통의 T1세대 종자를 25℃ 암조건에서 3일간 발아시킨 후, 발아된 종자를 2주간 요시다 수경액(oshida S, Forno DA, Cock JH, Gomez KA, 1976, The international rice research institute, Philippines. pp. 61-66)으로 재배하였다. 인산충분조건(정상 양액)에서 2주간 자란 식물체를 각각 정상 양액(인산충분조건)과 인산 부족 양액(정상 양액의 인산의 1/10, 인산부족조건)으로 2주간 더 재배하였다. 인산흡수율을 조사하기 위해서 각 양액조건에 990Bq/ml Phosphorus³²(Anne L. Rea, Janine M. Jarmey, Stephen R. Mudge and Frank W. Smith., 2004, Functional Plant Biology. 31, 141-148)를 첨가하였고, 10분 후에 식물체를 채취하였다. 각 처리구에서 채취한 식물체를 증류수로 3회 세척하여 식물체 표면에 잔존한 Phosphorus³²을 제거한 후 식물체를 지상부와 지하부로 분리하여 70℃에서 3일간 건조하였다. 각 시료의 건물중을 측정한 뒤, H₂SO₄와 H₂O₂를 이용한 습식분해방법(Lee SH and Kim WS, 2001, J. Kor. Soc. Hort. Sci. 42(4):444-448)으로 시료를 완전히 소화시키고, 소화된 시료를 3차 증류수로 정용(25ml)하였다. 정용한 시료를 여과지로 여과하여 Sequential Plasma Spectrometer(ICPS-7500, Shimadzu Corporation, Japan)를 이용하여 인산을 분석하였다.

도5 에서 보는 바와 같이 각 전이유전자동질형 형질전환계통의 인산함량이 대조에 비하여 증가하였다. 인산함량을 분석한 결과를 요약하면 표 2와 같다. 비형질전환 대조 식물체에 비하여 형질전환계통(1-7-4, 1-7-6, 1-7-8, 10-2-7) 식물체의 인산함량이 정상인산조건에서 각각 54.25, 63.57, 52.99, 48.09% 증가하였으며, 인산결핍조건에서는 각각 41.91, 31.49, 45.99, 44.34% 증가하였다. 이와 같은 결과는 벼에 삽입된 NtPT 전이유전자의 발현에 의해 식물체내 인산함량이 대조대비 평균 41-55% 증가하였음을 나타내는 것이라 할 수 있다.

본 발명의 결과는 NtPT 유전자의 벼로의 형질전환과 형질전환된 전이유전자의 발현이 벼의 인산흡수율과 식물체내 인산함량을 증가시키는데 효과적임을 나타낸다. 즉, 본 실시 예에서 형질전환 식물체 내에서 인산함량이 증가한 결과도 흡수와 이동이 세포막과 미소기관의 막에 존재하는 인산 수송자(phosphate transporter)를 통하여 능동적으로 이루어진다는 일반적 사실에 부합하는 것이다. 따라서, 인산수송자를 이용하여 능동적으로 인산을 흡수하는 모든 식물체에도 인산수송자 유전자 발현의 촉진조절에 의한 인산 흡수효율의 개선이 가능함을 의미한다.

이상의 본 발명은 인산수송자 유전자의 형질전환에 의해 인산흡수 효율이 증가하고 체내에 물질대사에 이용 가능한 인산의 함량이 증가한 식물체를 작성할 수 있는 방법을 제공한다.

표 2. T2세대 NtPT동질형 형질전환 계통 식물체와 비형질전환 대조(동진벼) 식물체의 인산 함량

식물체-인함량	ug/g FW		대조 대비 증가율(%)
식물체-인함량	정상양액	인산결핍양액	정상양액	인산결핍양액
1-7-4	25.38	11.50	54.25	41.91
1-7-6	26.92	10.66	63.57	31.49
1-7-8	25.17	11.84	52.99	45.99
10-2-7	24.37	11.70	48.09	44.34
형질전환계통 평균	25.46	11.43	54.73	40.93
동진벼	16.46	8.11	0.00	0.00

이상의 실시 예를 통하여 명백하게 나타난 바와 같이, 본 발명은 NtPT유전자를 이용하여 식물체의 인산 흡수효율을 증가시키는 방법을 제공하는 효과가 있다. 또한, 인산흡수율 증가가 인산함량을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 결과적으로 본 발명은 인산흡수효율을 증가시켜 식물체내에 생체대사에 이용 가능한 인산함량을 증가시켜 인산질 비료 저투입 고효율의 환경학적으로 우수한 벼 식물체를 제공하여 화학비료에 의한 환경 오염을 최소화시키는 뛰어난 실질적 효과가 있으며, 동 발명을 이용하여 벼 이외의 식물체에서도 인산흡수효율이 증가한 품종을 개발할 수 있는 방법을 제공함으로서 식물종자산업의 발전에도 유용할 수 있게 된다.

Claims

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담배(Nicotiana tabacum) 유래의 인산 수송자 NtPT 유전자가 클로닝된 벡터 pGA16118로 형질전환시켜 인산 흡수율이 24~37%가 증대되어 생체대사에 이용 가능한 인산함량이 증가된 것을 특징으로 하는 조직배양에 의해 무성번식되는 형질전환 벼 식물체.
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