KR100401007B1

KR100401007B1 - 담배의 인산수송자 유전자

Info

Publication number: KR100401007B1
Application number: KR10-2000-0046695A
Authority: KR
Inventors: 윤성중; 백소현
Original assignee: 윤성중
Priority date: 2000-08-11
Filing date: 2000-08-11
Publication date: 2003-10-08
Also published as: KR20020013207A

Abstract

본 발명은 작물의 인산 흡수 및 이용 효율 개량을 가능하게 하는 담배 (Nicotiana tabacumL)의 인산수송자 유전자의 염기서열 및 아미노산 특성에 관한 것으로, 담배 인산수송자 유전자 (phosphate transporter)를 분리하여 효모용 유전자 발현 운반체인 p520에 삽입시켜 발현 재조합체인 pYNtPT1-1을 구축하고, 이 재조합 벡터 pYNtPT1-1을 인산수송자 유전자가 결여된 효모 돌연변이체인 NS219 세포에 도입하여 형질전환시킴으로써, 담배 인산수송자 유전자 및 그로부터 연역되는 아미노산 서열을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

담배의 인산수송자 유전자 {Phosphate transporter cDNA from tobacco (Nicotiana tabacum L)}

본 발명은 담배 (Nicotiana tabacumL) 인산수송자 유전자에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 식물 세포 내로 인산을 흡수하는 능력을 보유하고 있는 단백질인 인산수송자를 암호화하는 유전자 (이하 인산수송자 유전자)를 담배 (Nicotiana tabacumL)로부터 분리한 후 그 유전자의 염기서열과 그로부터 연역되는 단백질 아미노산 서열 및 단백질 분자의 구조와 기능에 관한 것이다.

식물 조직의 각 세포는 식물체의 뿌리를 통하여 체내로 흡수되어 각 조직으로 운송된 무기 인산을 흡수 및 이용한다. 식물 세포의 무기인산 흡수는 능동적으로 이루어지며 흡수를 담당하는 인산수송자와 생물학적 에너지인 ATP를 필요로 한다. 인산수송자는 세포의 원형질막에 존재하며 무기인산에 대한 높은 친화도를 이용하여 인산을 세포 내로 흡수하는 통로 역할을 수행한다. 인산수송자는 무기인산을 대부분 1가 인산 (H₂PO₄ ^-) 형태로 흡수하며 1몰의 인산흡수에 약 1몰의 ATP가 소모된다 [Schachtman et al., Plant Physiol., 116:447-453 (1998)].

인산은 식물체 건물중의 약 0.2%를 차지하는 다량 요소이며, 핵산, 인지질, 저분자 고에너지 인산화합물 등 생명 활동에 필수적인 분자의 구성성분이다. 따라서 작물 재배시 무기인산을 화학비료의 형태로 시용하면 작물의 생육과 수량을 증대시킬 수 있다. 그러나, 사료 내에 존재하는 인의 이용률이 매우 낮아 사료에 인을 대량으로 첨가해 주고 있는 실정이다.

현재의 농업생산 기술은 대량 투입에 의한 대량 생산 체계를 근간으로 하고 있으며, 화학비료의 사용은 현재의 작물 재배 기술의 핵심 기술 중의 하나이다. 비료의 대량 투입 및 대량 생산 기술은 급격히 증가하는 인류의 생존에 필수적인 식량 확보에 공헌하여 왔다. 그러나, 비료의 대량 투입 및 대량 생산 기술은 환경오염과 생태계 파손의 부작용을 수반하여 인류의 생존 환경을 위협하고 있는 실정이다. 화학비료에 첨가되어 사용되는 인산질 비료 성분을 비롯한 각종 영양성분의 일부가 하천수 및 지하수에 유입되어 심각한 하천오염원으로 작용하고 있다.

또한, 화학비료의 생산에 필요한 원자재와 에너지 자원의 고갈도 대량 투입, 대량 생산 기술의 한계를 예고하고 있다. 인산질 비료 생산 주원료인 인광석의 세계 전체 매장량의 50%를 이미 사용하여 부족한 상태이므로 수년 내에 비료 생산 가격의 상승이 불가피할 것으로 예상되고 있다.

이에 따라, 친환경 지속가능 농업 기술의 필요성이 제기되어 왔고 그에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 친환경 지속가능 농법은 비료 등 농업용 자재의 투입량을 감소시켜 농업에 의한 환경 부담을 줄이면서 인류에 필요한 식량을 지속적으로 생산하는 것을 목표로 하고 있다. 그러나, 현재의 작물 품종은 대량 투입, 대량 생산 체계에 적응하도록 개량되어 있어 비료의 저투입 환경에서 생육 및 생산이 우수한 품종의 개발이 절실히 요구되고 있다.

양분의 흡수는 대부분 해당 양분의 수송자에 의해 이루어지므로 양분 수송자의 개량을 통하여 양분 흡수 이용 효율을 개선할 수 있다. 인산의 경우, 인산에 대한 친화도가 높은 인산수송자 유전자를 뿌리 세포에 높게 발현시키면 저투입에 의해 낮아진 토양 중의 낮은 농도의 인산을 효과적으로 흡수하여 작물의 생육을 촉진시킬 수 있다. 또한, 인산수송자 유전자를 이용하여 인산 이용 효율이 개선된 작물품종은 세계적으로 광범위하게 분포하고 있는 인산이 부족한 척박한 토양에서도 생육, 생장 및 작물생산이 가능하게 되므로 인류의 식량난 해결에 도움이 될 수 있다.

식물 유전자원은 우량 품종 육종의 성패를 좌우하는 필수적인 소재이다. 현재까지 유전자원은 주로 수집과 인위적 돌연변이 유기를 이용하여 개체 단위로 확보되어 왔다. 그러나, 현재 보존하고 있는 식물 유전자원 중에서는 인산 흡수 및 이용 효율이 높은 유용 유전자원이 한정되어 있고 고전적인 방법에 의한 유용 돌연변이의 창출도 효율이 극히 저조한 실정이다. 따라서, 근래에는 인산수송자 유전자를 확보하여 이들 유전자를 이용한 식물 개량 연구가 시도되고 있다.

본 발명인 담배의 인산수송자 유전자는 우리나라에서 재배되고 있는 담배품종인 '버리 21'로부터 분리되었으며 기존의 분리된 감자, 토마토, 일일초의 인산수송자 유전자와 비교해 본 결과, 전체 염기서열에 있어서 각각 71.5%, 70.2%, 64.3% 가 유사함을 알 수 있었다.

상기의 사실들을 바탕으로, 본 발명은 인산 이용 고효율 품종의 개발에 필요한 유전자 소재인 담배의 인산 수송자 유전자의 염기서열 및 아미노산 특성을 제공하는데, 일반적으로 수송자 기능을 가진 DNA 서열은 조금 변경된 경우 즉, 그 염기서열 중의 1 또는 복수의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 삽입 혹은 부가된 경우라도 그 DNA의 기능이 유지되는 경우가 있는 것은 주지의 사실이다. 따라서, 상기한 본 발명의 서열에는 이와 같은 변형이 가하여진 것으로서 인산수송자 기능을 갖는 DNA 서열도 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명은 인산 이용 고효율 작물 및 인산 흡수 고효율 환경 정화용 식물의 개발에 사용될 수 있어 식량난의 해소에 도움을 줄 뿐만 아니라, 결과적으로 인산질 비료의 생산에 필수적인 부족한 인광석의 소비량 절감에도 기여할 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기의 사실들을 감안하여 식물 세포 내로 인산을 흡수하는 능력을 보유하고 있는 단백질인 인산수송자를 암호화하는 담배 인산수송자 유전자의 염기서열 및 그로부터 연역된 아미노산 서열을 제공하는데 있다.

본 발명의 상기 목적은 감자 인산수송자 유전자의 RT-PCR법을 수행하기 위한 프라이머를 제작하여 감자의 mRNA를 PCR증폭하여 감자 cDNA를 제조하고 이 cDNA를 방사능 표지하여 담배 인산수송자 유전자 NtPT1-1를 분리한 후, 이 유전자를 유전자 운반체 pGEMT-Easy에 서브클로닝하여 상기 유전자 NtPT1-1의 염기서열과 아미노산 서열 특성 및 단백질 분자구조를 분석하고, NtPT1-1을 효모용 유전자 운반체 p520 에 삽입시켜 구축한 재조합 벡터 pYNtPT1-1을 인산수송자 유전자가 결핍된 NS219 형질돌연변이체에 도입하여 형질전환된 형질전환효모균주를 diazo-coupling 법으로 염색하고 저인산 배지 상에서의 생장율을 측정함으로써 달성되었다.

이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.

도 1은 담배 인산수송자 유전자 NtPT1-1의 염기서열과 염기서열부터 연역된 아미노산 서열을 나타낸다.

도 2는 담배 인산수송자 유전자 NtPT1-1의 염기서열에서 번역된 아미노산 서열의 hydropathy plot 결과를 나타낸다.

도 3은 효모 유전자 발현 운반체 p520로 형질전환된 효모 NS219 세포 (A)와 담배 인산수송자 유전자 재조합 벡터 pYNtPT1-1로 형질전환된 효모 NS219 세포 (B)의 diazo -coupling 반응 염색 결과를 나타낸다.

도 4는 담배 인산수송자 유전자 재조합 벡터 pYNtPT1-1로 형질전환된 NS219계통과 효모용 유전자 발현 운반체인 p520만으로 형질전환된 계통의 저인산 YNB 액체배지에서의 배양 시간별 생장율을 나타낸다.

본 발명은 담배 인산수송자 유전자를 분리해 내기 위한 탐침으로 이용할 감자 인산수송자 유전자의 RT-PCR법을 수행하기 위해 프라이머를 제작한 후 감자의 mRNA를 PCR 증폭하여 감자 cDNA를 준비하는 단계 ; 상기 감자의 cDNA를 방사능 표지하여 담배품종 '버리21' 의 인산수송자 유전자 cDNA인 Ntpt1-1를 분리하는 단계 ; 상기 분리한 Ntpt1-1를 유전자 운반체 pGEMT-Easy 벡터에 서브클로닝하는 단계 ; 상기 분리한 담배의 인산수송자 유전자 Ntpt1-1 의 염기서열과 그로부터 연역된 아미노산의 서열 특성을 분석하는 단계 ; 상기 담배 인산수송자 유전자 NtPT1-1를 효모용 유전자 발현 운반체인 p520에 삽입시켜 재조합 벡터 pYNtPT1-1을 구축하는 단계 ; 상기 재조합 벡터 pYNtPT1-1와 순수 p520을 인산수송자 유전자 결여 효모돌연변이계통인 NS219에 도입하여 형질전환시키는 단계 ; NS219 형질전환체가 생산하는 인산 수송 기능과 세포 생장율을 알아보기 위하여 재조합 벡터 pYNtPT1-1와 순수 p520을 인산수송자 유전자 결여 효모돌연변이계통인 NS219에 도입하여 형질전환시킨 두 균주를 Diazo-coupling 반응용액으로 염색하고, 흡광도를 측정하여 생장률을 측정하는 단계로 구성된다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리 범위는 이들에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 담배 인산수송자 유전자의 분리 및 분석

제1단계 : 감자 인산수송자 유전자의 RT-PCR 증폭을 위한 프라이머 (Primer)의 제작

유전자 염기서열 데이타베이스 (database)인 GenBank (NIH, USA)에 수록된일일초와 토마토의 인산수송자 유전자의 염기서열을 이용하여 정방향 프라이머 (AAGGAAGTTTAGTGATGGCG)와 역방향 프라이머 (CTTGTCTAAAACTTAAACAGGACTGTCC) 쌍을 합성하여 감자 인산수송자 유전자의 RT-PCR을 위한 프라이머 (primer)를 제작하였다.

감자 인산수송자 유전자의 RT-PCR 증폭을 위한 프라이머

HPPN : 5'-AAGGAAGTTTAGTGATGGCG-3'H (20mer)

HPPC : 5'-CTTGTCTAAAACTTAAACAGGACTGTCC-3' (28mer)

제2단계 : 감자 인산수송자의 cDNA 제작을 위한 감자 mRNA 추출과 역전사-중합효소연쇄반응 (reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)

대한민국 감자품종인 '대지' 품종의 잎과 화기 조직을 채취하여 액체 질소로 급속동결시켜 마쇄하였다. mRNA 추출 kit (FastTrack 2.0,Invitrogen, USA)을 사용하여 마쇄한 조직으로부터 mRNA를 추출하였다.

RT-PCR kit (Titan RT-PCR System, Boehringer Mannheim, Germany)을 이용하여 잎과 화기에서 추출한 mRNA와 상기 제 1단계의 프라이머를 이용하여 감자의 인산수송자 유전자를 증폭하였다. 감자 mRNA로부터 증폭된 감자의 인산수송자 cDNA를 유전자 운반체인 pGEMT-Easy (pGEMT-Easy, Promega, USA)에 삽입하여 얻은 감자의 인산수송자 cDNA clone (StPT1-1)을 대장균 (XL1 Blue, Stratagene, USA)에 도입시켜 형질전환시킴으로써 감자의 인산수송자 유전자 분리에 이용하였다.

제3단계 : 담배 cDNA library 스크리닝 (screening)

Library 스크리닝은 기본적으로 Sambrook 등 [Molecular Cloning, Cold Spring Harbour, USA (1989)]의 방법에 따랐다. [alpha-³²P] dCTP와 Rediprime random primer labelling kit (Amersham, UK)을 이용하여 방사능으로 표지한 감자의 인산수송자 cDNA clone인 StPT1-1을 탐침으로 시용하여 담배품종 '버리21'의 cDNA library (2 x 10⁵pfu)를 검색하여 담배의 인산수송자 cDNA clone NtPT1-1을 분리하였다.

제4단계 : 담배의 인산수송자 유전자 NtPT1-1 염기서열 결정

상기 제 3단계의 인산수송자 NtPT1-1의 1107 bp와 1555 bp 위치에 존재하는 제한효소 NcoI과 벡터의 클로닝 자리에 존재하는 제한효소자리를 이용하여 1107bp, 447bp, 463bp의 단편으로 NtPT1-1을 유전자 운반체인 pGEMT-Easy 벡터에 서브클로닝하였다. 염기서열은 벡터에 존재하는 T7과 SP6 염기서열 결정 프라이머를 이용하여 양쪽 가닥의 염기서열을 염기서열 자동분석기 (모델 373A, Applied Biosystem사)로 결정하였다. 결정된 염기서열과 판독틀에 맞는 아미노산 서열을 도 1에 표시하였다 (도 1).

담배에서 분리한 인산수송자의 유전자 염기서열은 2059개의 뉴클레오티드로구성되어 있는데, 유전자의 상류와 하류에 각각 219개와 226개로 구성되어 있는 비번역 부위가 있고, 염기서열의 220번째 뉴클레오티드로부터 시작되는 1614개의 뉴클레티드로 구성된 판독틀 (open reading frame, ORF) 부분은 537개의 아미노산으로 구성된 인산수송자 단백질을 암호화하는 서열로서 구성되어 있다.

제5단계 : 상기 담배의 인산수송자 유전자로부터 연역된 아미노산 서열 특성 분석

상기 담배의 인산수송자 NtPT1-1의 판독틀 (open reading frame, ORF)에서 연역된 아미노산 서열의 친수도 지수 (hydropathy index)를 Kyte와 Doolittle [J. Mol. Biol., 157:105-132 (1982)]의 방법을 이용하여 분석하였다 (도 2). 도 1에 기재된 NtPT1-1의 판독틀에서 연역된 아미노산 서열은 중앙의 친수성 부위를 중심으로 15-20개의 아미노산으로 구성된 친수도 지수 (hydropathy index)가 1.3 이상인 소수성 구역이 양쪽으로 각각 6개씩, 총 12개가 존재하고 있어 전형적인 막 단백질 (membrane protein)의 특성을 나타내고 있다 .

실시예 2 : 재조합 벡터 pYNtPT1-1가 도입된 형질전환체의 생산 및 그로부터 발현된 단백질의 인산 수송 기능의 확인

제1단계 : 재조합 벡터 pYNtPT1-1가 도입된 형질전환체의 생산

일본 나고야 대학으로부터 분양받은 인산수송자 유전자가 결여된 효모 돌연변이계통 NS219을 이용하여 담배 유전자인 NtPT1-1의 인산수송자 기능을 확인하였다. NS219는 고친화성 인산수송자 유전자가 결여되어 배지에 있는 인산을 흡수하는 능력이 현저히 저하되어 있으며 그로인해 체내 인산 농도가 매우 낮다. 따라서, 세포의 생장이 매우 느리며 체내 인산 부족시에 발현되는 acid phosphatase가 발현되고 있다. 그러나, NS219 계통도 체내 인산농도가 높아지면 생장률이 증가하고 acid phosphatase의 발현이 억제된다 [Bun-Ya et al., Mol. Cell Biol., 11:3229-3238 (1991)].

담배의 인산수송자 유전자인 NtPT1-1을 효모용 유전자 발현 운반체인 벡터 p520 [Anamnart et al., Gene, 184:299-306 (1997)]에 삽입시켜 구축한 담배 인산수송자 유전자 재조합 운반체 pYNtPT1-1와 대조군인 p520 운반체를 Gietz 등의 방법 [Gietz et al., Yeast, 11:355-360 (1995)]을 이용하여 인산수송자 유전자 결여 효모 돌연변이체인 상기 NS219 계통에 도입하여 형질전환시킨 후 효모 배양 배지인 그리세롤이 30/L 함유된 YNB 배지 (Difco)에 도말하여 완전한 집락이 형성될 때까지 배양하였다.

제2단계 : NS219 형질전환체가 생산하는 단백질의 인산 수송 기능 및 세포 생장율의 확인

재조합 벡터 pYNtPT1-1으로 형질전환된 효모세포를 diazo-coupling 반응 용액을 이용하여 염색하였다. 인산수송자 유전자가 결여되어 있는 세포는 배지에 있는 인산을 흡수하는 능력이 현저히 저하되어 있으며 그로인해 체내 인산 농도가 매우 낮다. 따라서, 세포의 생장은 매우 느리며 체내 인산 부족시에 발현되는 acidphosphatase가 발현된다. 그러나, 인산수송자 유전자 결여 세포도 체내 인산농도가 높아지면 생장률이 증가하고 acid phosphatase의 발현이 억제된다 [Bun-Ya et al., Mol. Cell Biol., 11:3229-3238 (1991)]. Acid phosphate 활성이 존재하는 경우는 diazo-coupling 반응용액에 의해 적색을 나타내며 acid phosphate 활성이 없으면 백색을 나타내게 된다. Diazo-coupling 반응은 0.1M acetate buffer (pH 4.0) 10ml에 α-naphthylphosphate 5mg과 fast blue aslt B 50mg을 녹인 후 아가로스 겔 (agarose gel) 0.5%을 첨가하고 암조건에서 50℃로 유지한 후 배양중인 효모 세포 위에 부은 후 30℃ 암상태에서 30분간 배양한 후 염색 상태를 확인하는 방법이다 [Toh-E and Oshima, J. Bacteiol. 120, 608-617 (1974)].

재조합 벡터 pYNtPT1-1으로 형질전환된 효모세포를 diazo-coupling 반응 용액을 이용하여 상기 방법으로 염색하여 본 결과, 모두 백색으로 염색되었으며 p520 운반체만으로 형질전환된 NS219계통은 모두 적색으로 염색되었다 (도 3). 이러한 결과는 담배 인산수송자 유전자인 NtPT1-1이 형질전환체 NS219 내에서 인산수송자를 발현시켰으며, 발현된 인산수송자에 의해 배지내의 인산이 돌연변이 NS219 세포내로 흡수되어 체내 인산 농도가 높아지고, 결과적으로 높은 농도의 인산에 의해 acid phosphatase의 발현이 억제되어 diazo-coupling 반응 용액에 백색으로 염색되어 나타났음을 알 수 있다. 따라서 실시예 1의 NtPT1-1은 세포 안으로 인산을 흡수시키는 역할을 수행하는 인산수송자 유전자의 cDNA clone임을 나타낸다.

재조합 벡터 pYNtPT1-1으로 형질전환된 NS219 계통과 효모용 유전자 발현 운반체인 p520만으로 형질전환된 NS219 계통을 저인산 (110μM) YNB 액체배지에서 21시간 배양시킨 후 OD_600mm으로 흡광도를 조사하여 생장율을 비교하였다. pYNtPT1-1으로 형질전환된 NS219 세포는 효모용 유전자 발현 운반체인 p520만으로 형질전환된 NS219 세포보다 본 발명의 DNA 단편에서 발현된 인산수송자 단백질에 의해 배양 5, 13, 16, 21 시간 후의 생장율이 약 2.5배 이상 높게 나타났다 (도 4).

이러한 형질전환체의 생장률 증가 효과와 diazo-coupling 반응 염색 결과는 상기 실시예 1의 NtPT1-1이 세포내로 인산을 흡수하는 역할을 수행하는 단백질인 인산수송자를 발현시키는 유전자임을 나타내는 증거이다.

이상의 실시예를 통하여 명백한 바와 같이, 본 발명은 담배 (Nicotiana tabacumL)의 인산수송자 유전자 NtPT1-1의 염기서열, 그로부터 연역한 아미노산 특성 및 인산수송자 단백질의 분자구조를 제공하는 효과가 있다. 또한, NtPT1-1를 삽입시킨 재조합 벡터 pYNtPT1-1을 도입하여 형질전환시킨 재조합 형질전환 효모균주는 식물의 인산 이용 효율 및 인산 흡수 효율을 개량한 환경 정화용 식물의 개발에 응용될 수 있고, 인산질 비료의 생산에 필요한 인광석의 소비량을 절감시킬 수 있으므로, 결과적으로 상기 개발된 식물은 친환경 농업과 척박지의 활용을 통한 인류의 식량난 해결 및 자원의 절감과 환경 보전 등을 통하여 인간의 삶의 질을 향상시킬 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로, 식물종자산업, 환경보전산업 및 비료산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

담배 (Nicotiana tabacumL)로부터 분리한 인산수송자를 코딩하는 하기의 유전자 염기서열.
담배 (Nicotiana tabacumL)로부터 분리한 인산수송자를 구성하는 하기의 아미노산 서열.

M A K D Q L Q V L N A L D V A K T Q L Y H F T A I V I A G M

G F F T D A Y D L F C I S L V T K L L G R I Y Y H H D G A P

K P G T L P P N V S A A V N G V A F C G T L A G Q L F F G W

L G D K M G R K R V Y G M T L M M M V I C S I A S G L S F G

H T P K S V M T T L C F F R F W L G F G I G G D Y P L S A T

I M S E Y A N K K T R G A F I A A V F A M Q G F G I L A G G

M V A I I V S A A F K G A F P A Q T Y Q T D P L G S T V S Q

A D F V W R I I L M F G A I P A A M T Y Y W R M K M P E T A

R Y T A L V A K N L K Q A A N D M S K V L Q V D I E E E Q E

K V E N V S Q N T R N E F G L F S K E F L R R H G L H L L G

T A S T W F L L D I A F Y S Q N L F Q K D I F S A I G W I P

P A Q T M N A L E E V Y K I A R A Q T L I A L C S T V P G Y

W F T V F F I D K I G R F A I Q L M G F F F M T V F M F A L

A I P Y H H W T L K D N R I G F V I M Y S L T F F F A N F G

P N A T T F V V P A E I F P A R L R S T C H G I S A A A G K

A G A M I G A F G F L Y A A Q P T D R K K A D A G Y P A G I

G V R N S L I V L G C V N F L G M V F T F L V P E S K G K S

L E E M S R E N E G E E E S G T E M K N S G R T V P V