CN1163118C - 产生大量存活的棉花植物的体外组织培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从特定棉花植物的组织产生大量可存活棉花植物的体外组织培养方法。发明提供了不依赖基因型、直接的、复枝繁殖的方法，并提供了微繁殖、突变体的选择以及用农业生物技术和基因工程的现代方法产生基因改良的棉花植物开创了新的可能性。本发明的方案提供了用组织培养技术使棉花成功改良的重要步骤。

Description

产生大量存活的棉花植物的体外组织培养方法

本发明涉及从特定的棉花植物中产生出大量存活的棉花植物的体外组织培养方法。本发明提供了基因型非依赖的、直接的、复枝的增生，并为微繁殖、突变体的选择和通过农业生物技术和基因工程的现代方法产生基因改良的棉花植物开创了新的可能性。该方案提供了用组织培养技术使棉花成功改良的重要步骤。

棉花是全球重要的作物，最初用作纤维。棉籽是家畜重要的食物来源，棉花影响着许多国家，直至全世界的经济发展。因此，全世界都对用现代农业生物技术方法改良棉花的计划有着深厚的兴趣。这增加了对棉花用基因工程的现代技术开发组织培养方法的重要性。

已公开了一些棉花的组织培养方法。它们涉及通过悬浮液和愈伤组织培养物的直接的枝条分化和体细胞的胚胎发生。下面列出这些文献供参考。

在多个植物种，如菜豆(Phaseolus sp.)中已显示了器官发生和再生，通过组织培养方法得到微繁殖。(Rubluo A & Kartha KK 1985”In vitro cultrue of shootapicalmeristems of various Phaseolus species and cultivars”J.of Plant physiol119：425-433)，Glycine max(Shetty K.，Asano Y和Oosawa K 1992“stimulation of invitro shoot organogenesis in Glycine max Merrill by allantoin and amides”PlantSci.81：245-252)，Cajanus cajan(Shiv Prakash N，Pental D & Bhalla-Sarin N 1994“Regeneration of pigeonpea from cotyledonary node via multiple shootformation”Plant Cell Rep.13：623-622)，Carnation(ClaireAnnev A.Yancheva S和DonsH 1995”Cells with in the nodal region of carnation shoots exhibit a high potential foradventitious shoot formation.”Plant Cell Tiss.Org.Cult.40：151-157)等。

已经完全建立了用组织培养技术进行植物再生。已成功地通过器官发生或形成体细胞胚胎发生在体外使各种植物种再生。器官发生形成了器官，即茎(或根)，它们可分别诱导根(或茎)的形成以产生整个植物，而体细胞胚胎发生导致形成体细胞的胚(无需受精即形成胚)，它开始可同时发芽和出根，并能长成整个植株。虽然植株各个部分和细胞能再生成整个植株(称为全能性)是公知的现象，但每个植物或每个植物部分需要特定的研究以得到允许这类再生的条件。现已测定了一些控制这类培养物生长和分化的广泛适用的因子。建立不同组植物激素和生长调节剂之间单独的相互作用或结合的相互作用是对存在于细胞、组织和器官中某些关系的反应。人们现已达成共识：成功地引发分化取决于外植体的种类、外植体的生理条件和在培养时外植体的物理和化学环境。由于这个因素，组织培养学科涉及到优化源植物的生理条件、外植体的种类、培养条件和用来激发组织培养的植物激素。这表明开发通过组织培养使植物增殖的新方法是非显而易见的。

本发明的一个主要方面逐个研究引发再生的植物生长调节剂的种类和用量。此外，培养基的化学组合物、生长温度和其它培养条件在引发器官发生和体细胞胚胎发生、以及茎和根的成熟和形成正常结实的植株中都起着重要的作用。对培养基、激素和生长条件的反应各个植物种类不尽相同。因此，对于给定的植物，其植物有效的再生、器官发生和体细胞胚胎发生需要开创性的特殊知识。

另一个主要领域是组织培养需要革新，它可识别足以对培养条件反应并得到繁殖的植物部分。不是所有给定植物部分都能有效地再生的。这是具有全能性的植物部分(称为外植体)、外植体的生理状况和生长条件，特别是决定组织培养中植物成功的生长调节剂的复杂的结合。来自给定植物不同外植体通常对增殖的生长条件有很不同的反应，没有通则可用以实现再生。在每种情况下，外植体和培养条件的确定是将植物部分再生成许多植物或体细胞胚的组织培养方法中的革新步骤。

对从培育的棉花变异体的任何组织外植体来形成复枝尚没有新的、详细的公开物。本发明首次揭示了从棉花秧苗的小部分(称为外植体)通过组织培养得到棉花植物多枝的器官发生方案。该方法在显微繁殖和基因转化的农业生物技术中极为有用，因为它显示对经发明者试验的所有培养物都适用，且枝可有效地成熟。该方法在用农业生物技术的现代方法改良棉花的计划中很有潜力。

一些文献涉及使体细胞胚(不经受精而得到正常植物的结构)生长的组织培养条件(Davidonis GH和Hamilton RH，1983从棉花愈伤组织中再生植物(Plantregeneration from callus tissue of Gossypium hirsutum L.)Plant Sci.Lett.32：89-93；Shoemarker RC，Couche LJ & Galbraith DW 1986；棉花(Gossypium hirsutum L)中体细胞胚胎发生和植物再生的特征(Characterization of somatic embryogenesisand plant regeneration in cotton)Plant Cell Rep.3：178-181；Trolinder NL和Goodin JR1987；棉花中体细胞胚胎发生和植物再生(Somatic embryogenesis and plantregeneration in cotton Gossypium hirsutum L.)Plant Cell Rep.6：231-234 Finer J.1988.来自棉花的体细胞胚胎发生悬浮液培养物的植物再生(Plant regeneration fromsomatic embryogenesis suspension cultures of cotton Gossypium hirsutum.)Plant CellRep.7：399-402)。体细胞胚的引发和成熟在数月内发生.该方法高度依赖于基因型(Trolinder NL和Xhixian C.1989棉花中体细胞胚发的反应的基因型特异性(Genotype specificity of the somatic embryogenesis response in cotton)Plant Cell Rep.8：133-136)，因此适用于限定的变种。体细胞胚的引发和成熟在数月内发生，据报道通过体细胞胚胎发生的再生植物在细胞学和形态学上是异常的(Stelly DM，Altman DW，Kohel Rz，Rangan TS & Commeskey E 1989，来自愈伤组织培养物的棉花体细胞克隆的细胞遗传学异常(Cytogenetic abnormalities of cotton somaclonesfrom callus cultures)Genome 32：762-770).也常报道通过体细胞胚胎发生发育的植物是不育的(Trolinder NL & Goodin JR 1987，棉花中的体细胞胚胎发生和植物再生(somatic embryogenesis and plant regeneration in cotton Gossypium hirsutum L.)PlantCell Rep.6：231-234).

这些再生方法已成功地用于在棉花中土壤杆菌(属)介导的基因转移(Umbeck P.Johnson G，Barton K.Swain W 1987.”基因转化的棉花(Genetically transformedcotton Gossypium hirsutum L.)”Plant Bio./Technology 5：263-266；FiroozabadyE.，DeBoer LD，Merlo JD，Halk LE.Amerson，NL，Rashka KE和Murrey EE 1987，通过根癌土壤杆菌的棉花的转化和转基因植物的再生(Transformation of cottonGossypium hirsutum L.by Agrobacterium tumefaciens and regeneration of transgenicplants.)Plant Mol.Biol.10：105116)和在粒子轰击方法中(Finer JJ和McMullen M1990，通过粒子轰击的棉花的转化(Transformation of cotton Gossypium hirsutum L.Via particle bombardment)(Plant Cel-I Rep.8：586-589)。某些细菌基因，如编码除草剂抗性的基因(Bayley C，Trolinder NL.Ray C，Morgan M，Quisenberry JE和OWDW 1992，将2，4-D抗性工程化入棉花(Engineering 2，4-D resistance into cotton)Theo.Appl.Genet.83：45-649)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)内毒性基因(Perlak FJ，Deaton RW，Armstrong TA，Fuchs RL.Sims SR.Greenplate JT & FischhoffDA 1990，昆虫抗性棉花植株(Insect resistant cotton plants Bio/Technology 8：939-943)已成功地在转基因棉花植物中表达。但这些进步目前仅限于棉花的柯克棉栽培，因为其它栽培对上述组织培养物，即体细胞胚胎发生方法没有反应。

现已有公开物揭示了在无菌组织培养条件下从生长中的棉花苗端组织体外长出单个嫩芽(Gould J，Banister S，Hassegawa)，Fahima M.Smith RH1991，Regeneration of Gossypium hirsutum and G.barbadense from shoot apex tissuefortransformation，Plant Cell Rep.10：12-16).棉花的顶端分生组织和苗端可用作培养物以得到愈伤组织、不定芽和复枝(Bajaj YPS和Manjeet Gill 1986；“Preservationof cotton Gossypium sps.through shoot tip and meristem cultrue”Indian J.of Exp.Biol.24：581-583)。在这些报道中，培养物的反应依赖于基因型，极少出根。由于该问题，这些方法的再现性不佳。

最近，(McCabe DE和Martinelli BJ 1993“Transformation of elite cotton cultivarsvia particle bombardment of meristems”Bio/Technology 11：596-598：Chlan CA，Lin J，Cary JW & Cleveland TE 1995，“A procedure for biolistic transformation andregeneration of transgenic cotton from meristematic tissue”Plant Mol.Bio.Rep.13：31137)通过生物列表转化方法用棉花胚斧引入基因，在这些报道中，单个顶端分生组织长成一个芽。再生的芽然后在合适的培养基中生根以得到成熟的棉花植物。在所有的报道中，转化和再生是不足的因为单个顶端分生组织只得到一个成熟植株，大多数转化体对于转化的基因，表达是嵌合的。这类方法可通过开发出如本发明揭示的，从单个外植体中产生多个植株的方法而得以大大的改善。

表1综述了涉及棉花植物的组织培养方法在现有技术(由专利或文献所揭示)中的状态。然后我们阐述本发明方法与已知技术的相比之处。

本文用于在培养基中使用的植物生长调节因子(激素)的缩写是：BAP(6-苄基氨基嘌呤或6-苄基腺嘌呤)，2iP(γ，γ-二甲基烷氨基嘌呤)，Kin(激动素)，IAA(吲哚乙酸)，NAA(萘乙酸)，IBA(吲哚丁酸)，TDZ(1-苯基-3，1，2，3-噻二唑-5-基脲)，DU(二苯基脲)，PU(U-1-苯基N-4-吡啶基脲)和2，4D(2，4-二苯氧基乙酸)。

                   表1.棉花组织培养再生的现有技术状态

报道	再生方式	植物激素	外植体	评述
					1.Davidinis GH和HamiltonRH(1983)PlantRegeneration from callustissue of G.HirsutumL.Plant Sci.Lett.32：89-93	体细胞胚胎发生	NAA和Kine	子叶	生长在含30g/升葡萄糖的LS培养基中，未使用NAA和Kin的2年龄G.hirsutum L.cv.柯克棉310的愈伤组织(calli).30％的培养物得到了体细胞胚胎发生。
2.Davidonis GH，MummaRO，Hamilton RH，1987”controlledregeneration of cotton plantsfrom tissue culture”美国专利号4672035	…进行…	…进行…	…进行…	…进行…
					3.Shoemaker RC，CoucheLS，和Galbraith DW 1986，“characterization of somaticembryogenesis and plantregeneration in cottonGossypium hirsutumL.”Plant Cell Rep.3：178-181	体细胞胚胎发生	NAA、Kine	下胚轴	评估17个棉花(G.Hirsutum L.)耕作物进行体细胞胚胎发生。一系列愈伤组织转移到含MS盐、NAA和Kin的培养基中。数周后观察到愈伤组织的体细包胚的存在。按胚

				胎发生来识别培养物柯克棉201和柯克棉315。分离胚，让它长成植物。
					4.Trolinder NL和GoodinJR 1987，”somaticembryogenesis and Plantregeneration in cottonGossyppium hirsutumL.”Plant Cell Rep 6：231-234	体细胞胚胎发生	2，4-D，Kin	下胚轴	在6周龄的愈伤组织培养物中观察到球状胚.在该阶段，将愈伤组织浸在没有生长调节剂基质的悬浮液中培养，3-4周后，悬浮液经筛子收集球状和心形胚.所收集的胚在固化的培养基中长到成熟，成熟的胚发芽成植物。用该方法种植的植物大多数是不育的。(只有15％可繁殖)。
5.Trolinder NL和Xhixian C1989“Genotype specificityof the somaticembryogenesis response incotton”Plant CellRep.8：133-136	体细胞胚胎发生	2，4-D，Kin	下胚轴	用种植柯克棉312的体细胞胚胎发生方法筛选38个棉花的耕作物、种系。筛选表明在胚胎发生存在时有基因型的变化。只有一些基因型可修饰成柯克棉312的种植模式。
					6.Stelly DM，AltmanDW，Kohel RZ，Rangan TS和Commeskey E				在通过体细胞胚胎发生再生的植物中染色体异常

1989，”cytogenetiabnormalities of cottoncultures”Genome 32：762-770				的频率很高，大多数该类植物是不育的。
					7.Finer J 1988，“PlantRegeneration from somaticembryogenesis suspensioncultures of cottonGossypium hirsutum“PlantCell Rep.7：399-402	体细胞胚胎发生	NAA，Kin，Picloram，2，4-D	子叶	开发出可保留的胚胎发生悬浮液培养物。胚通过将胚胎发生组织转移到没有生长素的培养基中得到发育。获得的植株不育。
8.Finer J，1990”An efficientmethod for regeneratingcotton from cultured cells”专利号ZA/A8808599	…进行…	…进行…	…进行…	…进行…
					9.RanganTS：1993”Regeneration ofcotton”专利号5244802	体细胞胚胎发生	NAA，Kin	下胚轴，子叶，未成熟胚	愈伤组织在含NAA和Kin的MS培养基中引发，每个第3周进行再次培养。4-6个月后形成体细胞胚。体外识别胚胎发生的种类为SJ2、SJ4、SJ5、SJ2C、GC510、B1644、B2710
10.Gawel NJ和RobackerCD 1990”somaticembryogenesis in twoGossypium hirsutumgenotypes on semisolid vslquid proliferationmedia”Plant Cell TissueOrgan Culture 23：201-204	体细胞胚胎发生	2，4D，Kin	来自成熟开花植物的柄	对于体细胞胚胎发生在液体和固体介质中进行对比研究，据发现液体培养基上的培养物对柯克棉312和T-25基因型都有体细胞胚

				胎发生。
					11.Bajaj YPS和Gill M，1986”Preservation of cottonGossypium sps throughshoot tip and meristemculture”Indian J.of Exp.Biol.24：581-583	愈伤组织培养、不定芽培养和复枝	NAA，IAA，Kin	枝顶端	培养物的反应依赖于基因型，只有一些培养物有复枝，同时也很少出根。
12.Gould J，Banister S，Hassegawa O，FahimaM.，Smith RH1991”Regeneration ofGossypium hirsutum and G，Barbedense from shoot apextissue fortransformation”Plant CellRep.10：12-16	从预存在的分生组织进行器官发生	没有	顶端枝分生组织	用该方法可再生正常和生育的G.barbedensePima S-6和G.hirsutum 19个耕作物的植物，但从一个外植体和根中只有一个枝，故不为最佳。
					13.Umback P，Johnson G，Barton K，Swain W，1987“Genetically transformedcotton“Plant.Bio/technology5：263-26614.Umback P，1991“Method of producingtransformed cotton cells bytissue culture”印度专利号INA168950	棉花的基因转化和植物的再生	2，4-D，Kin	下胚轴	揭示了棉花的基因转化方法。体外通过根癌土壤杆菌介导的基因转化方法来转化未成熟的棉花组织。所得的棉花组织进行药物筛选，然后诱发转化的培养物以得到体细胞胚。体细胞胚长成成熟的植物。用该方法转化了柯克棉310、312和5110。

15.Firoozabady E.DeBoerLD，Merlo JD，HalkLE，Amerson NL，RashkaKE和Murrey EE 1987“Transformation of cottonGossypium hirsutum L.byAgrobacterium tumefaciensand regeneration oftransgenic plants”Plant Mol.Bio.10：105-116	基因转化和转基因植物的再生	2ip，NAA	子叶	转化12天秧苗的子叶外植体，且再生植物。为了再生用根癌土壤杆菌处理过的外植体，将它转移到含抑菌剂和选择剂的培养基中使只有转化的细胞可生成愈伤组织。愈伤组织在没有激素的培养基中再次培养时得到转基因植物。用该方法转化了G.Hirsutum柯克棉201。
					16.Perlak FJ，Deaton RW，Armstrong TA，FuchsRL，Sims SR，Greenplate和Fischoff DA 1990”Insectresistant cotton“PlantsBio/Technology 8：939-943	转化和转基因植物的再生(通过体细胞胚胎发生)	2，4-D，Kin	下胚轴	苏云金芽孢杆菌Kurstaki变种HD-1[cry 1A(b)和HD73 Cry 1A(c)]昆虫控制昆虫基因的截形式通过根癌土壤杆菌转化到棉花下胚轴部分，从转化的细胞得到体细胞胚，最终得到抗虫棉花G.hirsutum cv.柯克棉312。
17.Baylay C，Trolinder NL，Ray C，Morgan M，Quisenberry JE和Ow DW1992”Engineering 2，4-Dresistance intocotton”Theo.Appl.Genet.83：	转化和再生(通过转基因植物的体细胞胚胎发生)	2，4-D，Kin	下胚轴	分离出来自真养产碱杆菌(Alcaligenuseutrophus)的2，4-D单氧化基因酶基因tfdA，修饰

645-649				并在烟草中表达用根癌土壤杆菌进行棉花植物的转化，得到2，4D抗性的柯克棉312系。
					18.Rangan T，Rajsekran，Hudspeth 和Yenofsky(1989)”Regeneration and transformation ofcotton”欧洲专利号344302	转化和再生(通过转基因植物的体细胞胚胎发生)	NAA，Kin	下胚轴，子叶，未成熟胚	从Beasley和Ting培养基上发芽的愈伤组织所得的体细胞胚的农用根癌土壤杆菌使棉花再生和转化(G.hirsutumvar.Acala SJ2、SJ4、SJ5、SJ2-1GC510、B1644、B2724、B1810、Siokra&stipper varFC2017的Picker种系)。
19.Finer JJ和McMullen(1990)”Transformation ofcotton Gossypium hirsutumL.via particlebombardment”Plant CellRep.8：586-589	转化和再生(通过转基因植物的体细胞胚胎发生)	NAA，Kin，2，4D，picloram	子叶的叶片	对棉花的胚胎发生悬浮液培养物进行粒子轰击，其中带有质粒DNA的高密度粒子向胚胎发生植物细胞积聚。然后在选择剂(潮霉素)存在下用该方法通过体细胞胚胎发生得到这些细胞。柯克棉310通过这种方法而转化。

20.McCabe DE和MartinelliBJ(1993)”Transformationof Elite cotton cultivars viaparticle bombardment ofmeristems”Bio/Technology11：596-598	来自预存在的分生组织的器官发生	BA(简单地处理15小时)	胚轴	该方法涉及切割发芽种子的胚轴轰击带有外源基因的粒子而进入胚轴。从处理过的胚轴中发现和筛选转化的植物。只有一种植物来自单轴。用该方法转化下列棉花：比马棉、海岛棉和陆地棉。
					21.McCabe DE和MartineliBJ(1992)”Particle mediatedtransformation of cotton”专利号PCT/US92/0172	…进行…	…进行…	…进行…	…进行…
22.Chlan CA，Lin J，CarryJW&Cleveland TE，1995”Aprocedure for biolistictransformation andregeneration of transgeniccotton from meristematictissue”Plant Mol.Bio.Rep.13：31-37	来自预存在分生组织的器官发生	BA，IAA	胚轴	非无菌除去胚轴，用涂覆1.6A°金粒子的DNA以90或110kg/cm2的捕获压轰击。轰击后，这些组织在卡那霉素选择剂的存在下长成整个植物，一个轴只长成一株植物。

相对于现有技术的本发明的新颖性：

本发明首次提供了一种有效的方法，得到了来自棉花秧苗顶端外植体的新的分生组织，并能得到大量抽芽。进一步的是，外植体形成了基部器官发生团块，它们可被划分成更小的部分以得到复枝重复再生循环。本发明的方法极为简单，可用于各棉花种类。该方法在微繁殖和基因转化中不依赖于基因型，可方便快速地使用。

本发明的方法使用不同于早期报道中所用的起始物质(外植体)，得到了原始的植物，因为它基于直接的器官发生，需要较短的时间，较为简单，得到大量可育且正常的植物。表1中的报告和专利极为依赖于变种(基因型)。本申请人所述的方法可用于大量各种种系的植物。表1栏目20和22和21的专利中用胚轴作为外植体，这些方法得到单枝而不是如本发明所述的多枝。表1的栏目4和6得到不育的植物，而本发明的方法得到可育的正常植物。

本发明方法的成功取决于秧苗的苗龄和用本发明方法从秧苗中取出的作为培养物的外植体的方法。本发明中，从2-20天龄的秧苗中取出子叶结(也称为子叶腋或秧苗的顶端分生组织)。根据种系，从这类秧苗中取出的外植体经培养后得到各种枝条。不带子叶或带一片或部分子叶和0.5厘米下胚轴的顶端分生组织得到复枝。该方法从没有子叶的顶端分生组织中一步得到大量枝条。对生长调节剂的需求视外植体的不同而不同。当取出的外植体没有子叶时，复枝繁殖需要BAP和激动素。另一方面，当包括一片或一部分子叶时，复枝的繁殖只需要BAP。我们所用的激素结合物和外植体不同于表1中所述的任何报道。本发明复枝再生的方法在限制的激素水平内是成功的。例如，在一片或一片中一部分子叶的存在下，浓度为10-100μM BAP可有效地从腋下得到枝条。在4-20μM BAP和2-20μM激动素存在下只有腋下的子叶可生长。如表1所述，早期没有将这些生长调节剂，即BAP与激动素的结合用于棉花复枝再生的方法。在表1的栏目11和12中，该方法得到不良的根，本发明的方法在该方面很优秀。

引发复枝发育的方法涉及除原始分生组织外的细胞，而原始的分生组织可自然长成单个植株。识别外植体(子叶结，也称为秧苗腋)，它在有合适浓度常用的生长调节剂的培养基上培养时从新分生组织得到复枝。该技术可用于任何种类、耕作的、种系的棉花，故该方法是新颖的，没有基因型的限制，也减少了再生所需的时间，这些都是现有技术中存在的严重问题。

本发明首次提供了来自棉花秧苗顶端外植体的新分生组织的生长并得到多枝条的方法。进一步的是，外植体在基部发生了器官形成团块，它可被划分成更小的部分以得到复枝重复和再生循环。

棉花相关领域的早期专利是美国专利4672035和美国专利5244802，其中发明者揭示了从柯克棉310的愈伤组织中通过体细胞胚胎发生再生植物的方法；US-A86937384和CA A1，1335799的发明者揭示了涉及基于再生方法的体细胞胚胎发生的棉花的再生和转化的方法，专利WO A1 9215675的发明者揭示了轰击介导的棉花胚转化的方法，其中得到了转基因植物。

本发明方法不是针对体细胞胚胎发生。该方法很简单，适合商用，能用于各种棉花。该方法在微繁殖和基因转化中不依赖于基因型，可方便快速地使用。不象现有技术，该方法不会得到形态学和细胞遗传学上异常的植物。

本发明的方法使用不同于早期报道中所用的起始物质(外植体)，得到了原始的植物，因为它基于直接的器官发生，需要较短的时间，较为简单，得到大量可育且正常的植物。

本发明的主要目的是提供棉花培养物中有效的器官发生的改进方法，其目的是从特定的植物组织中得到大量植物的再生。

本发明的另一个目的是通过棉花植物枝条以能长成出根早、能有效地形成成熟、可生育棉花植物的方式再生的改进方法。

本发明的另一个目的提供了棉花植物的器官发生组织培养的改进方法，所述的棉花可用土壤杆菌或覆盖有DNA的微粒进行基因转化以将DNA送递入植物细胞。

本发明的另一个目的是提供无病棉花的生长方法以改变和保留无病种质。

为了满足上述目的，申请人现提供了通过组织培养技术从带有一片或部分棉花秧苗子叶的子叶结(也称为子叶轴或腋)开始再生大量存活的、可育的棉花植物。所述的方法包括：

(i)用常规的方法处理棉花植物的种子以除去细菌/真菌(污染物)，

(ii)在pH5.4-6.2范围里，在由下列物质构成的第一培养基中培养步骤(i)所得的处理过的种子：

a.任何常规培养基的盐，

b.任何常规培养基的维生素，

c.碳源，和

d.凝胶剂

培养基通过压热器消毒，培养在光存在下(至少40微摩尔/米²秒)于20-40℃温度下进行16小时，持续3天到数周。

(iii)切下从步骤(ii)所得的带有或不带有部分或完整子叶的子叶结(外植体)，

(iv)在pH5.4-6.2的范围下，在由下列物质构成的第二培养基中培养从步骤(iii)所得的外植体，以达到枝条繁殖：

a.任何常规培养基的盐，

b.任何常规培养基的维生素，

c.碳源，

d.植物激素(植物生长调节剂)，浓度范围为0.1-100μM的诸如6-苄基氨基嘌呤、6-苄基腺嘌呤、γ，γ-二甲基烯丙基氨基嘌呤、激动素、1-苯基-3-(1，2，3-噻二唑-5-基)脲的细胞激动素的单独或结合使用，

e.凝胶剂

培养基通过压热器消毒，培养在光存在下(至少40微摩尔/米²秒)于20-40℃温度下进行16小时；

(v)继续培养，最少达4周直至形成许多枝条；

(vi)收获形成的枝条；

(vii)在pH5.4-6.2范围下，将收获的枝条转移到包括下列物质的生根培养基(第三培养基)中：

a.任何常规培养基的盐，

b.任何常规培养基的维生素，

c.碳源，

d.植物激素(植物生长调节剂)，包括选自吲哚乙酸、吲哚丁酸和萘乙酸植物的生长素，

e.凝胶剂

培养基通过压热器消毒，和

(viii)培养在温度20-40℃和光(至少40微摩尔/米²秒)存在下培养16小时直至形成根。

本发明较好的特征是使用第一、第二和第三培养基，它们包括MS培养基的盐、B5培养基的维生素、碳源和凝胶剂。但是，第二和第三培养基另外还包括植物激素(植物生长调节剂)和凝胶剂。用于第一、第二和第三培养基中最佳的盐包括：

            组份                         浓度(mg/L)

            a.MS培养基的盐：

            NHNO₃                        1650

            KNO₃                         1900

            MgSO₄7H₂O                   370

            MnSO₄H₂O                    169

            ZnSO₄7H₂O                   8.6

            CuSO₄5H₂O                   0.025

            CaCl₂H₂O                    440

            KI                             83

            CoCl₂2H₂O                   0.025

            KH₂PO₄                      170

            H₃BO₃                       6.2

            Na₂MoO₄2H₂O                0.25

            FeSO₄7H₂O                   27.85

            Na₂EDTA                      37.3

            肌醇                          100

第一、第二和第三培养基较佳的维生素选自：

            组份                          浓度(mg/L)

            烟酸                          1.0

            吡哆素HCl                     1.0

            硫胺素HCl                     10.0

用于第一、第二和第三培养基的较佳的碳源选自蔗糖或葡萄糖，这类碳源的用量范围为1-6％(重量/体积)。

用于第二培养基的植物激素选自细胞激动素和细胞激动素活性脲或它们的结合物。较佳的是，用于第二培养基的植物激素选自细胞激动素，如6-苄基氨基嘌呤、6-苄基腺嘌呤、玉米素(γ，γ-二甲基烯丙基氨基嘌呤)、激动素；和细胞激动素活性脲，如1-苯基-3-(1，2，3-噻二唑-5-基)脲和二苯基脲、4-1-苯基N(吡啶基)脲。用于第三培养基的生长调节剂是植物生长素，如吲哚乙酸、萘乙酸和吲哚丁酸。

从2天到数周龄的发芽秧苗中分离出子叶结(外植体)，所用的外植体来自大田中生长的棉花植物或组织培养物。基本再生组织(在第一循环中枝条收获后仍保留)通过步骤(iv)到(viii)重复培养以保留植物的再生。所用的MS培养基盐的浓度可为前面指出的全量或以重量/体积为基础，为半量水平。所用的凝胶剂选自琼脂凝胶(植物凝胶)或任何凝胶剂，其浓度变化为0.2-1.2％(重量/体积)。

另外，本组织培养方法培养的枝条可用来微繁殖棉花。此外，本方法制得的子叶结或基本再生组织可用作基于土壤杆菌或通过轰击DNA涂覆粒子来转化基因。

此外，由所述组织培养方法再生的枝条可用来生产无病棉花植物，或这类枝条可用来改变和保留无病棉花的种质。

本发明最优选的方法包括：

(i)用常规的方法处理棉花植物的种子以除去诸如细菌/真菌的污染物；

(ii)在pH5.4-6.2范围里，在如表2所述的培养基中使处理过的种子培养发芽：

                       表2

组份                                  浓度(mg/L)

a.MS培养基的盐：

NH₄NO₃                              1650

KNO₃                                 1900

MgSO₄7H₂O                           370

MnSO₄H₂O                            169

ZnSO₄7H₂O                           8.6

CuSO₄5H₂O                           0.025

CaCl₂H₂O                            440

KI                                     83

CoCl₂2H₂O                           0.025

KH₂PO₄                              170

H₃BO₃                               6.2

Na₂MoO₄2H₂O                        0.25

FeSO₄7H₂O                           27.85

Na₂EDTA                              37.3

肌醇                                  100

B.B5培养基的维生素：

组份                                  浓度(mg/L)

烟酸                                1.0

吡哆素HCl                           1.0

硫胺素HCl                           10.0

C.碳源

蔗糖/葡萄糖                         30000.0

D.凝胶剂                            0.2-1.2％(w/v)

培养基通过压热器消毒，

(iii)切下从步骤(ii)所得的带有子叶腋的子叶结(外植体)，

(iv)在pH5.4-6.2的范围下，在如表3所示的培养基中培养从步骤(iii)所得的外植体，

                    表3

组份                               浓度(mg/L)

A.MS培养基的盐：

NH₄NO₃                           1650

KNO₃                              1900

MgSO₄·7H₂O                      370

MnSO₄·H₂O                       169

ZnSO₄·7H₂O                      8.6

CuSO₄·5H₂O                      0.025

CaCl₂·H₂O                       440

KI                                  83

CoCl₂·2H₂O                      0.025

KH₂PO₄                           17O

H₃BO₃                            6.2

Na₂MoO₄·2H₂O                   0.25

FeSO₄·7H₂O                      27.85

Na₂EDTA                           37.3

肌醇                               100

B.B5培养基的维生素：

烟酸                               1.0

吡哆素HCl                          1.0

硫胺素HCl                          10.0

C.碳源

蔗糖/葡萄糖                        30000.0

D.激素(植物生长调节剂)

细胞激动素                         0.1-100μM

E.凝胶剂                            0.2-1.2％(w/v)

培养基通过压热器消毒，

(v)在20-40℃温度和光(至少40微摩尔/米²秒)存在下继续进行16小时，光照达4-6周或直至形成许多枝条；

(vi)收获形成的枝条；

(vii)在pH5.4-6.2范围下，将收获的枝条转移到如表4所示的生根培养基中：

                 表4

组份                             浓度(mg/L)

A.MS培养基的盐：

NH₄NO₃                         1650

KNO₃                            1900

MgSO₄·7H₂O                    37O

MnSO₄·H₂O                     169

ZnSO₄·7H₂O                    8.6

CuSO₄·5H₂O                    0.025

CaCl₂·H₂O                     440

KI                                83

CoCl₂·2H₂O                    0.025

KH₂PO₄                         170

H₃BO₃                          6.2

Na₂MoO₄·2H₂O                 0.25

FeSO₄·7H₂O                    27.85

Na₂EDTA                         37.3

肌醇                             100

B.B5培养基的维生素：

烟酸                             1.00

吡哆素HCl                        1.0

硫胺素HCl                        10.00

C.碳源

蔗糖/葡萄糖                      30000.0

D.激素(植物生长调节剂)

生长素                           直至50μM

E.凝胶剂                         0.2-1.2

培养基通过压热器消毒，

(viii)在20-40℃温度下培养枝条直至形成根。

这样形成的小植物可移植到土壤用来生长棉花植物。

根据本发明的技术方案，该方法的成功依赖于秧苗的苗龄和从秧苗上取出用于本发明方法培养的外植体的方法。为于得到最佳结果，从2-20天龄秧苗中取出带有子叶腋的子叶结。但是，根据所用的植物种系和所用的植物激素，可从特定苗龄的秧苗中取出的外植体得到最多的枝条。

根据本发明的再一个技术方案，在收获了步骤(vi)所述的枝条后通过使用所留下的基本团块可重复本发明的方法。基本团块被割成2-6片，如上所述，按步骤(iv)培养，并重复剩余的步骤直至步骤(viii)以得到枝条繁殖的第二循环。

下面给出本发明方法的细节：

为了制得没有细菌/真菌污染物的种子，在使用前进行表面消毒。对于表面消毒有各种已知的消毒技术。这类消毒方法涉及将种子浸在含至少一种消毒剂的溶液中。这类消毒剂可为任何次氯酸钠、次氯酸钙、氯化汞、醇类、硫酸等。种子的表面消毒可这样进行：将种子浸在0.05-0.5％-w/v氯化汞水溶液达1-15分钟，同时持续振摇，然后种子用去离子水彻底洗涤(3-10次)，然后将种子浸在乙醇或精馏酒精达30秒到10分钟，并点燃。

表面消毒过的种子可放于在发芽瓶中含如0.6-1.2％琼脂的凝胶剂水上发芽，发芽瓶在潮湿的毛巾上或在含Murashige和Skoog盐的培养基或其它任何常规的培养基、B5培养基的维生素或其它维生素混合物以及任何的碳源(如1-6％w/v葡萄糖或蔗糖)和凝胶剂，如0.6-1.2％w/v琼脂或0.2-0.5％w/v凝胶体(植物凝胶)的培养基上，将培养基的pH调节到5.6-6.2，然后在121℃，15磅/厘米下压热消毒达20分钟。

在含10-15毫升用来发芽的培养基的50毫升玻璃培养管中放入1-2粒种子，或将1-10粒种子放在含50毫升培养基的稍大(250毫升)塑料或玻璃罐中。为了发芽，种子需在温度20-40℃，在光(至少40微摩尔/m²秒)下孵育达光照持续16小时。继续孵育直到种子发芽得到根生的和具有多个完全伸展的的胚芽，

通过用尖利消毒过的刀并在环境没有污染物，即现有技术已知的层流环境下通过切割从发芽后的2-20天苗龄的秧苗得到子叶结(外植体)。带有子叶腋的子叶结以不伤着结的方式切割。

将子叶结(外植体)放在培养基中，该培养基含表2所示浓度的Murashige和Skoog盐，或其浓度以重量/体积为基础，为表2中的一半，B5的维生素或任何其它维生素组合物，碳源可为1-6％w/v任何蔗糖或葡萄糖，通常使用的生长调节剂，如细胞激动素-BAP(6-苄基氨基嘌呤)、6-苄基腺嘌呤、激动素、玉米素和2iP(γ，γ-二甲基烯丙基氨基嘌呤)等，包括0.6-1.2％琼脂或0.2-0.5％w/v植物凝胶的凝胶剂。将培养基的pH调节到5.6-6.2，然后在121℃，15磅/厘米下压热消毒达20分钟。用于枝条繁殖的培养基组合物如表3所示。

将培养物放在温度20-40℃下，于白色荧光(40-100微摩尔m^-2秒^-1)下孵育，光照达16小时，直到形成复枝。这在外植体的基部会膨胀，在该阶段，收获枝条，并转移到含Murashige和Skoog盐的培养基中，盐的用量可为如表3所述的全量或基于重量/体积，为该水平的一半，该培养基还含有B5维生素或任何该技术领域已知的其它维生素组合物，1-6％w/v葡萄糖或果糖或蔗糖作为碳源，用来出根的植物生长素类型的生长调节剂，如吲哚乙酸、萘乙酸、吲哚丁酸(直至50μM)，凝胶剂琼脂0.6-1.2％w/v或0.2-0.5％w/v植物凝胶，将培养基的pH调节到5.6-6.2，然后在121℃，15磅/厘米下压热消毒达20分钟。引发出根的培养基组合物如表4所示。继续培养直到出根，枝条生长有2-4轮叶子。

(收获枝条后)剩余的基部组织可分成小部分，可在如表3所示的培养基再培养得到枝条繁殖的第二轮循环。

继续培养直到形成复枝。在该阶段，可再收获枝条，并转移到如表4所述的出根培养基中。剩余的基部团块可进入下一轮生枝循环，用该方法，人们可在以单个外植体起始的3个培养循环中得到30个枝条。

这类能出根的枝条可从培养物上取走，用消毒的蒸馏水洗涤以除去残留在根表面的痕量营养物，然后将小植物放在一些营养溶液中，如用于自养生长的Hoagland溶液(无糖)。当自养生长开始时，它们可被转移到蛭石，最后转移到土壤中以得到成熟的带种子的植物，

本发明的方法可高效地出枝，这样可长成整个植物。从子叶结得到复枝的基础涉及细胞而不是天然生长的并可长成单个植物的原始的分生组织。我们已经从秧苗中识别外植体，在具有合适浓度的合适生长调节剂的培养基上培养时，秧苗可给出新的分生组织，分生组织可得到复枝。该技术可用于任何种系的棉花。该方法是新颖的，没有基因型的限制，也减少了枝条再生所需的时间，这些都是该技术领域早先存在的严重问题。本发明的方法涉及从细胞而不是预存在的发芽种子的分生组织中得到枝条的分化。所以，人们认为在合适浓度生长调节剂存在下外植体的培养物能导致细胞程序的修正产生复枝。预存在的分生组织长成单枝。本发明方法产生的新的分生组织得到多枝。

由于是新的，从棉花任何培养物的任何组织外植体形成复枝的具体方法尚未公知。涉及微繁殖的组织培养方法的报道限于通过体细胞胚胎发生来再生植物。只有一些作物，即柯克棉系对早先使用的体细胞胚胎发生方法成功地反应。通过体细胞胚胎发生再生植物的步骤需要数个月。此外，体细胞胚胎发生所得的植物在形态学和细胞遗传学上异常，且为不育。本发明首次揭示了在棉花中外植体器官发生得到复枝的具体方案。用本发明的方法，在具有合适浓度生长调节剂的培养基中可重复再培养外植体，得到3-30个枝条的复枝的产生。该结果在早先的公开物中从未述及，对于从单个外植体产生多个小植物极为重要。

下列实施例作为阐述本发明用，并非用来限定本发明的范围。

实施例1

外植体的来源和基因类型

通过用0.1％氯化汞对棉花植物(G.hirsutum c.v.Khandwa-2)的种子处理7分钟来表面消毒种子。然后种子用消毒的蒸馏水洗涤5次，浸于乙醇(90％v/v)达30秒，并点然。消毒过的种子放在含Murashige和Skoog盐、B5维生素、3％w/v蔗糖和0.8％w/v作为凝胶剂的琼脂的培养基上，在压热消毒前将培养基的pH调节到5.8。两个种子放在每个含15毫升培养基的50毫升玻璃管中。在没有微生物环境(即层流环境)下借助于无菌的镊子放入种子。培养基上的种子在25±2℃、白色荧光(60微摩尔/米²秒)下孵育光照达16小时直至种子发芽得到根生的和具有多个完全伸展的子叶的胚芽。

使用6天龄的秧苗以切下外植体(秧苗的小片部分，它们用作再生实验的起始物质)。切下不同种类的外植体，如下胚轴部分、来自子叶的叶片、从种子分离的成熟的胚、从未成熟种子分离的未成熟胚、带或不带一片或部分子叶且有0.5厘米下胚轴的子叶结(腋)。

这些不同的外植体被放在由Murashige和Skoog盐、B5维生素、3％葡萄糖、22.19μM6-苄基腺嘌呤和0.6％w/v琼脂凝胶剂构成的培养基上，在压热消毒前将培养基的pH调节到5.8，继续培养以得到复枝的再生。据观察与子叶一起取下的顶端分生组织没有复枝。下胚轴部分、子叶叶片和成熟及未成熟的胚没有复枝，带有0.5厘米下胚轴和一片或部分子叶叶片的子叶结在上述培养基上有复枝。没有任何子叶叶片的子叶结在含8.87μM 6-苄基腺嘌呤和9.29μM激动素的培养基上也有大量枝条。

子叶结外植体类型的识别和对生长调节剂结合物的反应是本发明重要方面。

实施例2

外植体对培养基的依赖反应

用0.1％氯化汞对棉花植物(G.hirsutum L.Khandwa-2)的种子处理7分钟，然后种子用无菌蒸馏水洗涤6次，再浸于乙醇(90％v/v)达30秒，并点然。消毒过的种子放在含Murashige和Skoog盐、B5维生素、3％w/v蔗糖和0.8％w/v琼脂的培养基上，(在压热消毒前已将培养基的pH调节到5.8)。为了发芽，将两个种子放在每个含15毫升培养基的玻璃管中。培养基上的种子在25±2℃、白色荧光(60微摩尔/米²秒)下孵育光照达16小时。在没有微生物环境(即层流环境)下借助于无菌的镊子放入种子。继续培养直至种子发芽得到根生的和具有多个完全伸展的子叶的胚芽。

使用6天龄的秧苗以切下带有子叶结的种子腋(外植体)。外植体借助于尖利的刀切割。外植体被放在由Murashige和Skoog盐、B5维生素、3％葡萄糖和/或蔗糖、22.19μM6-苄基腺嘌呤和0.6％w/v琼脂凝胶剂构成的培养基上，(在压热消毒前将培养基的pH调节到5.8)。

继续培养以得到复枝的再生。在30克/升蔗糖或葡萄糖存在下观察到复枝。但是，基于葡萄糖、蔗糖和葡萄糖加蔗糖用于复枝分化的对比研究显示，葡萄糖可选作培养基中较好的碳源。只含蔗糖或含蔗糖与葡萄糖的结合物的培养基上会有大量酚类物质(phenolics)逸出。只用葡萄糖作为碳源时酚类物质的逸出量最少。培养基中酚类物质含量高会减少枝条的生长，增大外植体的死亡。对棉花使用葡萄糖(优于使用蔗糖)是本发明一个重要方面。它防止了酚类物质的逸出。该方案也不要求生长中外植体频繁的再培养。这曾经是已有的组织培养棉花报道中的一个重要问题。

培养子叶结(外植体)也在含Murashige和Skoog盐、B5维生素、3％葡萄糖、各种浓度的生长调节剂，如2.22μM-44.38μM BAP(6-苄基腺嘌呤)、2.32μM-4447μMKIN(激动素)和2.46μM-49.21μM2iP(γ，γ-二甲基烷氨基嘌呤)和0.6％w/v琼脂凝胶剂的培养基上进行，(在压热消毒前将培养基的pH调节到5.8)。

培养在25±2℃、白色荧光(60微摩尔/米²秒)下孵育光照达16小时。直至形成复枝。所得的结果如表5和6所示。

                              表5

再生的第一循环中细胞激动素对来自”Khandwa-2”作物的外植体(带有一片子

                     叶的子叶结)的枝形成的作用

细胞激动素       外植体形成        每个外植体形       评述

(浓度μM)        的枝(％)          成的枝条的平

                                   均数，±SE

                                   (第一循环)^*

BAP(2.22)        66                0.8±0.17(a)

BAP(4.44)        73                1.23±0.27(a)

BAP(8.87)        70                2.90±0.57(b)

BAP(13.31)       66                3.28±0.60(b)

BAP(22.19)       80                4.46±0.68(b)

BAP(33.09)       66                3.07±0.65(b)    枝条生长不良

BAP(44.38)       60                3.33±0.49(b)    枝条生长不良

KIN(2.32)        26                0.8±0.2(a)

KIN(4.65)        33                0.8±0.2(a)

KIN(9.29)        26                2.00±0.54(b)

KIN(13.94)       53                2.20±0.41(b)

KIN(23.23)       60                3.10±0.43(b)    形成根

KIN(34.85)          60          2.00±0.31(b)       形成根

KIN(46.47)          60          2.80±0.48(b)       形成根

2iP(2.46)           20          0.6±0.24(a)

2iP(4.92)           26          0.4±0.16(a)

2iP(9.84)           40          0.46±0.16(a)

2iP(14.76)          53          0.73±0.52(a)

2iP(24.61)          60          1.261±0.53(a)      形成愈伤组织

2iP(36.91)          30          1.25±0.41(a)       形成愈伤组织

2iP(49.21)          30          1.09±0.42(a)       形成愈伤组织

注：显示的数据是从三个独立实验结果计算得到的平均值±SE(标准误差)。分类为a和b的处理在处理物之间有显著的差异，但在处理内部没有不同，因Student的t-试验对BAP(6-苄基腺嘌呤)，Kin(激动素)和2iP(γ，γ-二甲基烷氨基嘌呤)显示p＞0.05。

                        表6

第一循环中细胞激动素对在改良培养基上、来自”Khandwa-2”作物的外植体(带有一片子叶的子叶结)的枝形成的合并

各种激动素的浓度(μM)           外植体的成每个外植体

                                枝率(％)    形成枝芽的

                                            平均数±SD^*

BAP           KIN                2iP

4.44          4.65      --       50         0.75±0.21(a)

8.87          9.29      --       33         1.00±0.36(a)

13.31         13.94     --       66         2.13±0.19(b)

22.19         23.23     --       86         3.86±0.48(c)

4.44          4.65      2.46     60         0.73±0.18(a)

4.44          9.29      4.92     40         1.19±0.34(a)

4.44          13.94     9.84     50         1.28±0.38(a)

4.44          23.23     24.61    66         2.20±0.45(b)

4.44          46.47     49.21    66         2.16±0.27(b)

注：显示的数据是从三个独立实验结果计算得到的平均值±SE(标准误差)。分类为a，b和c的处理在处理物之间有显著的差异，但在处理内部没有不同，因Student的t-试验对BAP(6-苄基腺嘌呤)，Kin(激动素)和2iP(γ，γ-二甲基烷氨基嘌呤)显示p＞0.05。

从结果可知，生长调节剂浓度的变化对复枝的形成有不同的作用。这可用来找到不同种系再生的最佳条件。

实施例3

依赖于作物/种的反应

用0.1％氯化汞对13种不同棉花植物(G.hirsutum L和C)的种子处理7分钟，然后用无菌的蒸馏水洗涤6次，浸于乙醇(90％v/v)达30秒，并点然。

消毒过的种子放在含Murashige和Skoog盐、B5维生素、30％w/v蔗糖和0.8％w/v作为凝胶剂的琼脂的培养基上，(在压热消毒前将培养基的pH调节到5.8)。两个种子放在每个含15毫升培养基的玻璃管中在25±2℃、白色荧光(60微摩尔/米²秒)下孵育光照达16小时。在没有微生物环境(即层流环境)下借助于无菌的镊子放入种子，继续培养直至种子发芽得到根生的和具有多个完全伸展的子叶的胚芽。

使用6天龄的秧苗以切下子叶结(外植体)。用尖利的手术刀切下外植体。将外植体放在含Murashige和Skoog盐、B5维生素、3％葡萄糖、22.19μM 6-苄基腺嘌呤和0.6％w/v琼脂凝胶剂的培养基上，(在121℃，15磅/厘米²压热消毒前将培养基的pH调节到5.8)。在25±2℃、白色荧光(60微摩尔/米²秒)下孵育光照达16小时。继续培养以得到复枝。

在该阶段，收获枝条并转移到含Murashige和Skoog盐、B5维生素、3％蔗糖、2.69μM生长调节剂(萘乙酸)NAA和0.8％w/v琼脂凝胶剂的培养基上，(在压热消毒前将培养基的pH调节到5.8)。结果如表7所示。

                         表7

在含22.19μM6-苄基腺嘌呤修饰培养基上的棉花作物的器官形成作用。

作物            外植体的成芽率    (第一循环中)每     (第二循环中)每

                    (％)          个外植体的最初     个外植体的次级

                                  枝条数±SE         枝条数±SE

Gossypium            80           4.46±0.70(a)      5.80±0.91(a)

hirsrtum

cv.Khandwa-2

G.hirsrtum           66           2.10±0.56(b)      7.08±0.13(a)

cv.PKV081

G.hirsrtum           73           1.90±0.44(b)      4.66±0.86(a)

cv.RS810

G.hirsrtum           90           2.70±0.42(b)      4.30±0.73(a)

cv.Pusa37

G.hirsrtum           80           1.60±0.45(b)      3.10±0.70(b)

cv.pusa

G.hirsrtum             70         1.40±0.40(b)        2.80±0.57(b)

cv.Stoneville

G.hirsrtum             70         2.40±0.63(b)        3.50±0.87(a)

G.hirsrtum             60         2.10±0.56(b)        2.50±0.63(b)

cv.CA-1193

G.hirsrtum             70         1.50±0.44(b)        ND³

cv.Jurhat

G.hirsrtum             90         1.90±0.44(b)        ND

cv.Sima

G.hirsrtum             87         2.37±0.37(b)        ND

cv.LH1343

G.arboreum             50         1.00±0.39(b)        2.20±1.00(b)

cv.Shyamly

G.arboreum            40          0.50±0.16(c)        0.90±0.34(c)

cv.Lohit

1.数据代表从每次实验取10到15份样本的三个独立实验结果计算得到的平均值±SE(标准误差)。

2.分类为a，b和c的处理在处理物之间有显著的差异，但在处理内部没有不同，因Student的t-试验对BAP(6-苄基腺嘌呤)，Kin(激动素)和2iP(γ，γ-二甲基烷氨基嘌呤)显示p＞0.05。

3.未进行。

从表中的数据可知本发明的方法对所有13个棉花作物都有效果。但是，对于不同种的器官发生，在含22.19μM的6-苄基腺嘌呤的培养上培养的G.hirsutum的种系更易于反应，而G.arboreum的种系反应差。

进一步的是，在再生的第一循环中，从根上除去枝条，剩余的外植体基部再在培养基上培养以进入下个再生循环。再收获再生物并转移到含合适浓度生长调节剂的培养基上出根，剩余的基部团块再在培养基上进行再生的下一个循环，用该方法，我们可在以单个外植体开始的培养的3个循环中收获直至30个枝条。

根据本发明的各个方面，它提供了使再生物高效直接分化以及从数种棉花作物植物繁殖的简便、有效和繁殖的方法。本发明的方法使枝条直接分化，提供了如前所述的许多优点。用该方法常规地得到培养物快速、高效的直接枝形态生成可通过根癌土壤杆菌和/或生物列表转化技术对棉花作物进行基因转化来实施。

Claims (13)

1.一种通过器官发生的组织培养技术从子叶结的外植体再生存活的和可育的棉花植物的方法，所述的方法包括：

(i)用常规的方法处理棉花植物的种子以除去污染物：细菌/真菌，

(ii)在pH5.4-6.2范围里，在由下列物质构成的第一培养基中培养步骤(i)所得的处理过的种子进行发芽：

a.MS培养基的盐，

b.B5培养基的维生素，

c.碳源，和

d.凝胶剂

培养在40-100微摩尔/m²秒的光存在下，于20-40℃温度下进行16小时，持续3天到数周，

(iii)切下从步骤(ii)所得的带有或不带有部分或完整子叶的子叶结作为外植体，

(iv)在pH5.4-6.2的范围里，在由下列物质构成的第二培养基中培养从步骤(iii)所得的外植体，以达到枝条繁殖：

a.MS培养基的盐，

b.B5培养基的维生素，

c.碳源，

d.植物激素(植物生长调节剂)，浓度范围为0.1-100μM的细胞激动素或细胞激动素活性脲单独使用或结合使用，所述的细胞激动素选自6-苄基氨基嘌呤、6-苄基腺嘌呤、玉米素、γ，γ-二甲基烯丙基氨基嘌呤、激动素，所述的细胞激动素活性脲衍生物选自1-苯基-3-(1，2，3噻二唑-5基)脲、二苯基脲、4-1-苯基N(4-吡啶基)脲；

e.凝胶剂

培养基通过压热器消毒，培养在40-100微摩尔/m²秒的光存在下，于20-40℃温度下进行16小时；

(v)继续培养，最少达4周直至形成许多枝条；

(vi)收获形成的枝条；

(vii)在pH5.4-6.2范围里，将收获的枝条转移到包括下列物质的生根培养基(第三培养基)中：

a.MS培养基的盐，

b.B5培养基的维生素，

c.碳源，

d.植物激素(植物生长调节剂)，包括选自吲哚乙酸、吲哚丁酸和萘乙酸的浓度为直至50μM的植物生长素，

e.凝胶剂

培养基通过压热器消毒，

(viii)在温度20-40℃和40-100微摩尔/m²秒的光存在下培养16小时，直至形成根。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(ii)，(iv)和(vii)中所述的MS培养基包括：

        组份                     浓度(mg/L)

        NH₄NO₃                  1650

        KNO₃                     1900

        MgSO₄·7H₂O            370

        MnSO₄·H₂O             169

        ZnSO₄.7H₂O             8.6

        CuSO₄·5H₂O            0.025

        CaCl₂·H₂O             440

        KI                        83

        CoCl₂·2H₂O            0.025

        KH₂PO₄                  170

        H₃BO₃                   6.2

        Na₂MoO₄·2H₂O         0.25

        FeSO₄·7H₂O            27.85

         Na₂EDTA                  37.3

         肌醇                      100

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述B5培养基的维生素包括烟酸和盐酸吡哆素为1mg/L，盐酸硫胺素为10mg/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述的碳源选自蔗糖或葡萄糖。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其中碳源的用量范围为1-6％w/v。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述的子叶结从2天龄到数周龄的发芽秧苗中分离出来。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所用的外植体取自大田中生长的棉花植物的秧苗或组织培养物。

8.根据权利要求1所述的方法，它还包括，在所述步骤(vi)收获枝条后，对其剩余的组织按照所述的步骤(iv)-(viii)重复培养以延续再生小植物。

9.根据权利要求1所述的方法，其中凝胶剂选自琼脂、植物凝胶，浓度为0.2-1.2％w/v。

10.根据权利要求1所述的方法，其中通过所述组织培养方法再生的枝条可用于棉花植物的微繁殖。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述的子叶结或所述基本再生组织可用于基于土壤杆菌的基因转化或通过轰击DNA涂覆粒子转化基因。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述组织培养方法再生的枝条可用来产生无病棉花植物。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述组织培养方法再生的枝条可用于改变和保存无病棉花的种质。