CN111518828B - 一种玉米雄性不育系的建立方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种玉米雄性不育系的建立方法，所述方法包括将含有玉米花粉特异性启动子pPSP1以及与所述启动子可操作连接的EN1和EN2基因的反义片段的植物表达载体转化玉米，获得EN1和EN2基因在花粉中特异性沉默表达的玉米雄性不育系，其中所述的玉米花粉特异性启动子pPSP1具有SEQ ID NO.1所示的序列或是在严谨条件下能够与SEQ ID NO.1所示的序列发生杂交的且具有启动子活性的DNA序列。本发明使用玉米花粉特异性启动子pPSP1与花粉发育必需基因的反义基因连接，转化到植物中可使花粉发育必需的基因在花粉中沉默表达，产生花粉败育植株，且避免了目的基因在其他部位持续表达所带的不利影响，在植物的遗传改良和植物生物反应器研究方面将具有广阔的应用前景。

Description

一种玉米雄性不育系的建立方法
技术领域
本发明涉及一种玉米雄性不育系的建立方法。本发明属于农业生产技术领域。
背景技术
雄性不育是植物界存在的普遍现象，是指在有性繁殖过程中雄蕊不能正常生长和产生有效花粉，而雌蕊能正常发育和受精。在杂交育种中，以雄性不育系为材料控制授粉，可以获得高产杂交品种。迄今为止，育种工作者们已经在玉米、高粱、水稻、油菜、黑麦、小麦、珍珠粟等43科、162属、320种的617个植物品种或种间杂种中发现雄性不育现象，并以此开展杂交育种工作。在小麦中，利用雄性不育RMs2杂交系培育了42个品种，栽培面积达1230万hm2，增加小麦产量560万t。在水稻中，野生败育型胞质雄性不育系在我国广泛应用并取得巨大成功，增产幅度达20％～30％。因此，雄性不育已成为作物育种的主要方向和目标，并在作物育种和生产中发挥着重要作用。
雄性不育材料的获取方法有多种。一是从自然界基因突变资源中寻找雄性不育突变植株，如太谷核小麦是天然突变的雄性不育小麦，以其作为育种材料已广泛应用于小麦育种实践。但该方法费时费工，效率低下。二是利用种间或种内杂交、多代回交获得雄性不育材料。随着分子生物技术的发展，插入突变、外源基因导入、RNA干扰、病毒诱导基因沉默(VIGS)等广泛应用于雄性不育育种工作中，如构建启动子与核糖核酸酶的表达体，利用内切酶产生雄性不育基因突变体。因此，基因工程将是实现雄性不育的有效途径。
玉米是具有较强杂种优势的异化授粉作物。生产中应用的玉米杂交种多是通过母本人工去雄再与父本杂交的方式获得的，但人工去雄耗费大量人力、物力和财力，增加了育种成本，降低了制种收入。玉米杂交种制种需要应用特定的亲本进行杂交才能获得高产的玉米杂交品种，但生产中应用的雄性不育系较为有限，往往不能满足制种需要，因此利用生物技术手段，在花粉特异性启动子的驱动下干扰花粉发育必需基因的表达可以人为创制不同亲本的玉米雄性不育系，在生产中具有重要应用价值。
烯醇化酶(enolase)是糖酵解途径中催化甘油酸-2磷酸生产磷酸烯醇式丙酮酸的关键酶，该酶控制着丙酮酸的生成，而丙酮酸是细胞能量代谢的重要物质。当细胞能量代谢异常时，会引起发育的异常。玉米中具有两个烯醇化酶同工酶(烯醇化酶1(ENO1)以及烯醇化酶2(ENO2))，分别由ZmENO1(以下简称EN1基因)和ZmENO2基因(以下简称EN2基因)编码。因此，利用玉米花粉特异性启动子pPSP1驱动ZmENO1和ZmENO2基因反义片段在玉米中表达既可以干扰花粉中ZmENO1和ZmENO2基因的表达获得花粉败育材料，又可以避免使用组成型启动子对玉米其他组织的生长带来不利影响，具有重要的应用价值。
发明内容
本发明目的在于提供一种玉米雄性不育系的建立方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明利用PCR从玉米基因组DNA中克隆得到的核苷酸序列，命名为pPSP1，长度为2921bp，为双链核酸类型，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。生物信息学分析pPSP1序列位于bz基因座附近，具备真核启动子的基本元件。接着本发明构建了含有pPSP1启动子驱动外源基因的植物表达载体，其表达盒是由pPSP1启动子和GUS(β-葡糖醛酸酶基因)报告基因及来自胭脂碱合成酶(nos)基因的转录终止区域构成，选择标记基因为潮霉素抗性基因，所述的表达载体命名为pCambia1301-pPSP1-GUS。将含有所述pPSP1启动子序列驱动的表达载体转化玉米，对转基因玉米的花粉、幼根、老根、幼叶、老叶、幼胚、成熟胚、花丝、发育早期的雄花进行组织化学染色观察，叶片等绿色组织用95％乙醇脱色后观察。结果发现，与对照株相比，转基因玉米的幼根、老根、幼叶、老叶、幼胚、成熟胚、花丝、发育早期的雄花均未有蓝色出现，仅有转基因玉米的花粉有蓝色出现。由此可知，本发明所述的玉米花粉特异性启动子确实具有花粉特异性表达活性。将含有所述pPSP1启动子序列驱动EN1和EN2基因反义片段的表达载体转化玉米，获得了EN1和EN2基因在花粉中特异性沉默表达在转基因玉米，转基因玉米苗期和生育期植株生长正常，雄穗干瘪，花粉碘-碘化钾染色率降低，花粉干瘪，缺少内含物，体外萌发率显著下降，不能正常授粉。转基因玉米雌穗和花丝发育正常，可以接受野生型玉米花粉完成受精作用而正常结实，以上结果表明利用花粉特异pPSP1启动子同时驱动反义EN1和EN2片段所创造的转基因玉米材料具有雄性不育系的特征，该方法所创造的材料在育种中具有应用价值。
在上述研究的基础上，本发明提出了一种玉米雄性不育系的建立方法，所述方法包括将含有玉米花粉特异性启动子pPSP1以及与所述启动子可操作连接的ZmENO1(简称EN1基因)和ZmENO2基因(简称EN2基因)的反义片段的植物表达载体转化玉米细胞或组织，获得EN1和EN2基因在花粉中特异性沉默表达的玉米雄性不育系，其中所述的玉米花粉特异性启动子pPSP1具有SEQ ID NO.1所示的序列或是在严谨条件下能够与SEQ ID NO.1所示的序列发生杂交的且具有启动子活性的DNA序列。
其中，优选的，所述的EN1和EN2基因的反义片段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.3所示。
其中，优选的，所述的植物表达载体为pCambia1301。
其中，优选的，使用能够将所述的植物表达载体导入玉米细胞或组织的任何一种植物转化方法。
其中，优选的，所述的玉米细胞或组织来源于玉米萌动胚，所述的植物转化方法为农杆菌介导法。
其中，优选的，所述的植物表达载体通过以下方法构建得到：
(1)pCambia1301-pPSP1-GUS的构建
提取玉米幼苗的总DNA，设计用于启动子pPSP1克隆的引物：
F：AGTAGGCCAAAATTTCCAAACA；
R：CAGCTCCTGCTCCAAGATTGACG，
以提取的总DNA为模板，用以上引物进行PCR反应，回收目的条带，把回收片段亚克隆到测序载体pMD19-T中，测序正确的重组质粒命名为pMD19T-pPSP1；设计带有HindIII和NcoI酶切位点的用于pPSP1片段扩增的引物，引物序列为HindIII-F：CCAAGCTTAGTAGGCCAAAATTTCCAAACA，NcoI-R：CCCATGGCAGCTCCTGCTCCAAGATTGACG，以鉴定正确的pMD19T-pPSP1重组质粒为模板，扩增获得两端带有HindIII和NcoI酶切位点的pPSP1片段，再将获得的片段亚克隆到测序载体pMD19-T中，将测序正确的重组质粒命名为pMD19T-pPSP1-HN；
pMD19T-pPSP1-HN质粒经过HindIII和NcoI双酶切，得到带有HindIII和NcoI酶切位点的pPSP1启动子片段，与经过同样酶切的植物表达载体pCambia1301的大片段相连，经限制性内切酶和PCR扩增鉴定，鉴定正确的表达载体命名为pCambia1301-pPSP-GUS；
(2)提取玉米花粉的总RNA并反转录获得cDNA序列；
(3)设计扩增EN1和EN2反义片段的引物，引物的两端分别带有NcoI和BstEII位点，序列为EN1-5：cccatggaatcatcccgaggtgaccacggga；EN1-3：gggtacccggtacgtcctcaagtactaggag；EN2-5：cccatggaatcatcccgaggtgtccacgtg；EN2-3：gggtacccgatacgtcctcaaatactaggaa，以获得的cDNA序列进行PCR扩增，PCR产物的回收后与pMD19-T载体连接，分别构建得到pMD19-EN1质粒以及pMD19-EN2；
(4)将构建得到的pMD19-EN1质粒以及pMD19-EN2分别用NcoI和BstEII酶切后，回收含有的EN1和EN2反义片段的产物，与采用相同酶切后的pCambia1301-pPSP1-GUS载体连接，分别构建得到pPSP1-EN1质粒以及pPSP1-EN2；
(5)设计引物序列为：F：CCAAGCTTAGTAGGCCAAAATTTCCAAACA；R：CGGAATTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT，以构建好的pPSP1-EN2质粒为模板，扩增带有HindIII和EcoRI位点的含有pPSP1-EN2-Nos polyA的片段，回收含有pPSP1-EN2-Nos polyA的片段的PCR产物，与pMD19-T载体连接，构建得到的质粒命名为pMD19-pPSP1-EN2；
(6)pPSP1-EN1与pMD19-pPSP1-EN2质粒分别用HindIII和EcoRI进行双酶切，回收目的片段后，进行连接、转化以及鉴定，构建得到质粒pPSP1-EN1+2，即为所述的植物表达载体。
其中，优选的，步骤(3)中EN1和EN2的反义片段分别如SEQ ID NO.2以及SEQ IDNO.3所示。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明提出了一种玉米花粉特异性启动子并建立了一种玉米雄性不育系的建立方法，该玉米花粉特异性启动子在基因工程手段创制花粉败育材料时具有重要应用价值，将所述的启动子序列连接花粉发育必需基因的反义基因或构建成RNA干扰载体，转化到植物中可使花粉发育必需的基因在花粉中沉默表达，产生花粉败育植株，且避免了目的基因在其他部位持续表达所带的不利影响。本发明建立的一种玉米雄性不育系的方法，在植物的遗传改良和植物生物反应器研究方面将具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为PCR克隆pPSP1片段电泳图；
图中1为标准分子量标记物；2.为pPSP1的克隆结果；
图2为pPSP1驱动的植物表达载体构建过程；
图3为pPSP1驱动的植物表达载体鉴定结果；
图中a为带有HindIII和NcoI酶切位点pPSP1片段PCR扩增结果；1-3为不同扩增样品，M为标准分子量DNA；b为带有HindIII和NcoI酶切位点pPSP1片段连接pMD19T后转化大肠杆菌抗性菌液PCR检测；1为空白对照，2-3为不同克隆；c为pCambia1301-pPSP1-GUS酶切和PCR鉴定；1为pCambia1301-pPSP1-GUS HindIII+NcoI双酶切鉴定结果，2为质粒PCR扩增pPSP1片段结果，M为标准分子量DNA；
图4为由pPSP1驱动的植物表达载体向玉米的遗传转化；
图中a为受体材料种子的划胚处理；b为萌动胚纵面图以及切伤位点(黑线处)；c为农杆菌侵染后的玉米籽粒萌发情况；d为转化植株喷潮霉素筛选后的结果；e为T0代阳性植株所结种子；f为喷洒15mg/L潮霉素后的T1代抗性植株；
图5为转基因玉米的分子检测；
图中a为T1代植株GUS基因的PCR检测；b为T1代植株GUS基因的Southern blot杂交；c为T1代植株GUS基因的RT-PCR分析；图中M为标准分子量DNA；P为pCambia1301-pPSP1-GUS正对照；1-9为不同转化植株；Wt为野生型未转化负对照；
图6为GUS组织化学分析；
图中A和a为幼胚；B和b为成熟胚；C和c为幼根；D和d为老根；E和e为幼叶；F和f为成熟叶片；G和g为早期花药；H和h为成熟花药；I和i为成熟花药放大观察；J和j为成熟花粉粒；K和k为萌发的花粉粒；L和l为花丝；WT为野生型样品，pCambia1301-pPSP1-GUS为转化该载体的转基因样品；
图7为pPSP1-EN1+2载体的构建流程；
图8为EN1和EN2反义基因片段的PCR扩增；
图中1为EN1反义片段；2为EN2反义片段；M为标准分子量DNA；
图9为pMD19-EN1和pMD19-EN2 PCR鉴定；
图中M为标准分子量DNA；1为pMD19-EN1的PCR鉴定结果；2为pMD19-EN2的PCR鉴定结果；
图10为pPSP1-EN1和pPSP1-EN2的酶切鉴定；
图中M为标准分子量DNA；1和2为pPSP1-EN1 NcoI+BstEII双酶切；3和4为pPSP1-EN2 NcoI+BstEII双酶切；
图11为pPSP1-EN1+2的酶切鉴定；
图中M为标准分子量DNA；1和2为pPSP1-EN1+2HindIII+EcoRI双酶切鉴定结果；
图12为pPSP1-EN1+2转基因玉米的分子检测；
图中a为T1代转基因玉米PCR检测；b为转pPSP1-EN1+2玉米植株Southern blot检测，1-5为转基因玉米样品，6为野生型样品；c为T1代转基因玉米花粉中ZmENO1和ZmENO2基因表达量检测；M为标准分子量DNA；1-6为不同转基因株系；
图13为转pPSP1-EN1+2玉米的表型鉴定；
图中a为转pPSP1-EN1+2基因玉米苗期表型；b为转pPSP1-EN1+2基因玉米生育期表型；c为野生型雄穗表型；d为野生型玉米结实情况；e为转pPSP1-EN1+2基因玉米雄穗表型；f为转pPSP1-EN1+2基因玉米结实情况；g为野生型玉米花粉碘-碘化钾染色情况；h为野生型花粉体外萌发情况；i和k为两个转pPSP1-EN1+2基因玉米花粉碘-碘化钾染色情况；j和l为两个转pPSP1-EN1+2基因玉米花粉体外萌发情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1.玉米花粉特异性启动子序列pPSP1的克隆
玉米栽培种McC种子表面消毒后，置于铺有湿润滤纸的培养皿中，24-28℃培养3-5天，使其长出幼嫩叶片后，收集2g鲜嫩幼苗，用CTAB改进方法提取总DNA，取2-3μL DNA样品，琼脂糖凝胶电泳检测器纯度和浓度。
设计克隆引物，F：AGTAGGCCAAAATTTCCAAACA；R：CAGCTCCTGCTCCAAGATTGACG，用以上引物进行PCR反应，反应成分如下:LA taq polymerase 0.2μL，GC buffer 5μL，dNTP 1.5μL，F引物0.2μL，R引物0.2μL，Template DNA 2μL，ddH2O 1.9μL。
PCR反应程序如下：94℃预变性5min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，扩增35个循环，72℃延伸5min，4℃保存。PCR产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳进行分离，100V恒压电泳30-40min后，用凝胶成像系统检测分析，结果如图1所示。大小正确的目标条带用DNA胶回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)回收，把回收片段亚克隆到测序载体pMD19-T(Takara公司产品)中，连接体系为：连接buffer 5μL，pMD19-T 1μL，回收的PCR片段4μL，16℃连接过夜，连接产物转化到用CaCl2法处理的大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素(终浓度100μg/ml)的LB固体培养基上培养过夜；挑取平板上生长的白色菌落，接入含氨苄青霉素(终浓度100μg/ml)的LB液体培养基培养过夜，离心收集菌体按碱裂解法[Sambroook，etal.，1989，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold SpringHarborLaboratory，New York，p19-21]提取质粒进行PCR扩增，鉴定阳性克隆送公司测序，测序正确的重组质粒命名为pMD19T-pPSP1，其中目的片段命名为pPSP1，其具有SEQ IDNO.1所示的序列。设计带有HindIII和NcoI酶切位点的用于pPSP1片段扩增的引物，引物序列为HindIII-F：CCAAGCTTAGTAGGCCAAAATTTCCAAACA，NcoI-R：CCCATGGCAGCTCCTGCTCCAAGATTGACG，以鉴定正确的pMD19T-pPSP1重组质粒为模板，扩增体系、反应条件和鉴定方法与上述获得pMD19T-pPSP1的方法相同，测序正确的重组质粒命名为pMD19T-pPSP1-HN。
实施例2.植物表达载体pCambia1301-pPSP1-GUS的构建
构建流程如图2所示，用碱裂解法提取pMD19T-pPSP1-HN质粒(实施例1构建)，经过HindIII和NcoI双酶切，得到带有HindIII和NcoI酶切位点的pPSP1启动子片段，与经过同样酶切的植物表达载体pCambia1301的大片段相连，然后将连接产物转化到用CaCl2法处理的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素(终浓度100μg/ml)的LB固体培养基上培养过夜；挑取平板上生长的白色菌落，接入含卡那霉素(终浓度100μg/ml)的LB液体培养基培养过夜，离心收集菌体按碱裂解法提取质粒，经限制性内切酶HindIII和NcoI双酶切和PCR扩增鉴定。酶切体系为：10x buffer 2μL，质粒4μL，HindIII和NcoI各0.5μL，ddH2O 13μL，37℃酶切4h，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，以确证pCambia1301-pPSP1-GUS含有pPSP1启动子片段。PCR鉴定的反应体系和反应程序与上述pPSP1片段的克隆相同。鉴定正确的表达载体命名为pCambia1301-pPSP1-GUS。植物表达载体鉴定结果如图3所示。
实施例3.pCambia1301-pPSP-GUS表达载体转化玉米萌动胚
利用冻融发将实施例2构建的重组植物表达载体pCambia1301-pPSP1-GUS转入根癌农杆菌EHA105，转化方法参照Hofen等[Hofen R，Willmitzer L，(1988)Storage ofcompetent cells for Agrobacterium transformation.Nucleic Acids Research，16，9877]。
利用玉米萌动胚转化外源基因的方法，按照Wang等人(2007)的试验步骤进行操作，如下：
(1)农杆菌菌液制备：挑取鉴定的阳性农杆菌菌落(pCambia1301-pPSP1-GUS)，接种到50mL含有Kanamycin和Rifampicin抗生素的YEB液体培养基中，28℃恒温，200rpm摇培8-12hr，测定OD600值为0.8，直接用于侵染；
(2)玉米受体材料制备：精选饱满子粒且无虫害损伤的种子(野生型McC)，每100粒为一份装于灭菌的广口瓶中，加入70％乙醇溶液进行表面消毒30s，再用0.1％氯化汞消毒浸泡10min，无菌水冲洗5-7次除去残留氯化汞，最后加入150mL无菌水，置于摇床90rpm振荡，浸泡12hr；在超净工作台内，用手术刀刀尖将膨胀种子的胚生长点划伤(置于灭菌的滤纸上)，参见图4a、b所示，放入新的装有135mL无菌水的广口瓶中，备用。
(3)转化与筛选：处理过的玉米外植体浸泡于15mL菌液中，再加入AS溶液，90rpm振荡共培养48hr后，播种于含有蛭石的营养土中，待种子萌发后，统计出苗率，图4c所示；3叶1心期时，喷洒15mg/L潮霉素溶液进行筛选，具有抗性的植株移至大盆，精细盆栽管理至结实，收获种子，参见图4d、e、f所示。
(4)再生植株的分子检测：将T0代种子播种于大盆中，提取基因组DNA进行GUS基因的PCR检测。基因组DNA的提取方法与pPSP1克隆中使用的方法相同，引物序列为GUS-F：5’-GCAACTGGACAAGGCACT-3’；GUS-R：5’-GAGCGTCGCAGAACATTACA-3’，反应体系为：LA taqpolymerase 0.2μL，GC buffer 5μL，dNTP 1.5μL，GUS-F引物0.2μL，GUS-R引物0.2μL，Template DNA2μL，ddH2O 1.9μL；PCR反应程序如下：94℃预变性5min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，扩增35个循环，72℃延伸5min，4℃保存。PCR产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳进行分离，100V恒压电泳30-40min后，用凝胶成像系统检测分析。结果如图5a所示。
PCR阳性植株进一步进行Southern blot杂交。为了验证PCR检测的阳性转基因植株，待T1代长至3叶1心期时采用CTAB法提取叶片基因组DNA(Stacey and Isaac,1994)，然后进行Southern杂交检测。结果如图5b所示。
以pCAMBIA1301-GUS为模板，GUS-F和GUS-R为引物，在Ex Taq DNA Polymerase的作用下，经PCR扩增获得DNA探针。PCR反应程序为：1.94℃预变性4min，2.94℃变性1min，3.58℃退火1min，4.72℃延伸2min，5.30个循环，6.72℃延伸5min。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测并胶回收。再以探针DNA片段(2μg)为模板，标记探针DNA；将T1代阳性植株的基因组DNA(40μg)进行Hind III酶切后电泳；转膜、杂交及检测等上述步骤均按照DIG HighPrime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ试剂盒(Roche)说明书操作；显色的膜用数码相机拍照记录。
T1代植株散粉后采用Trizol试剂(Thermo Scientific)提取玉米花粉总RNA。取5-10μL提取得到的RNA用于1％琼脂糖凝胶的电泳检测，采用凝胶成像系统检测RNA的完整性。反转录的操作步骤按照cDNA第一链合成M-MuLV Reverse Transcriptase(RNase H Minus)试剂盒(Thermo Fisher Scientific)说明书进行。反转录的cDNA以GUS-F：5’-GCAACTGGACAAGGCACT-3’和GUS-R：5’-GAGCGTCGCAGAACATTACA-3’引物进行RT-PCR分析，检测GUS基因的转录水平，证明GUS基因在花粉中的表达情况，反应条件与反应体系与GUS基因分子检测相同。结果如图5c所示。
实施例4.转基因玉米GUS活性组织化学染色分析
GUS基因活性的组织化学染色分析方法依据Bradford等人[Bradford H M.Arapid and sensitive method for the quantification ofmicrogram quantities ofprotein utilizing the principle of protein-dyebinding[J].Anal Biochem.，1976，72248-254.]。将收集的实施例3获得的转基因玉米的不同组织材料与含底物X-Gluc(X-Gluc染液组成1.0mg/μlX-Gluc；50mmol/L磷酸缓冲液，pH 7.0；10mmol/L EDTA，pH8.0；0.05mmol/L铁氰化钾；0.05mmol/L亚铁氰化钾；甲醇，终浓度20％；0.1％Triton X-100)的染色反应液于37℃保温过夜，进行组织化学染色观察，叶片等绿色组织用95％乙醇脱色后观察。结果发现，与对照株相比，转基因玉米的幼根、老根、幼叶、老叶、幼胚、成熟胚、花丝、发育早期的雄花均未有蓝色出现，仅有转基因玉米的花粉有蓝色出现，如图6。
由此可知，本发明所述的玉米花粉特异性启动子确实具有花粉特异性表达活性。
实施例5.一种玉米雄性不育系的建立方法
1、玉米EN1和EN2反义片段的获得及pPSP1-EN1+2表达载体的构建
pPSP1-EN1+2载体的构建流程如图7所示。玉米花粉总RNA的提取和反转录如实施例3，设计EN1和EN2反义片段引物，引物的两端分别带有NcoI和BstEII位点，序列为EN1-5：cccatggaatcatcccgaggtgaccacggga；EN1-3：gggtacccggtacgtcctcaagtactaggag；EN2-5：cccatggaatcatcccgaggtgtccacgtg；EN2-3：gggtacccgatacgtcctcaaatactaggaa进行PCR扩增，反应体系为：taq polymerase 0.2μL，GC buffer 5μL，dNTP 1.5μL，EN1-5/EN2-5引物0.2μL，EN1-3/EN2-3引物0.2μL，Template DNA2μL，ddH2O 0.9μL；PCR反应程序如下：94℃预变性5min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，扩增35个循环，72℃延伸5min，4℃保存。PCR产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳进行分离，100V恒压电泳30-40min后，用凝胶成像系统检测分析，结果如图8所示。PCR产物的回收、与pMD19-T载体连接、转化和鉴定过程参照实施例1中的方法进行，分别构建得到pMD19-EN1质粒以及pMD19-EN2，其中EN1和EN2的反义片段分别如SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.3所示。pMD19-EN1和pMD19-EN2 PCR鉴定结果如图9所示。
将构建得到的pMD19-EN1质粒以及pMD19-EN2分别用NcoI和BstEII酶切后，回收含有的EN1和EN2反义片段的产物，与采用相同酶切后的pCambia1301-pPSP1-GUS载体连接，分别构建得到pPSP1-EN1质粒以及pPSP1-EN2。pPSP1-EN1和pPSP1-EN2的酶切鉴定结果如图10所示。
扩增带有HindIII和EcoRI位点的含有pPSP1-EN2-Nos polyA的片段引物序列为：F：CCAAGCTTAGTAGGCCAAAATTTCCAAACA；R：CGGAATTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT，扩增体系同上，模板为构建好的pPSP1-EN2质粒，扩增条件为94℃预变性5min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸4min，扩增35个循环，72℃延伸5min，4℃保存。PCR产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳进行分离，100V恒压电泳30-40min后，用凝胶成像系统检测分析。回收含有pPSP1-EN2-Nos polyA的片段的PCR产物，与pMD19-T载体连接、转化和鉴定过程参照实施例1中的方法进行，构建得到的质粒命名为pMD19-pPSP1-EN2。
pPSP1-EN1与pMD19-pPSP1-EN2质粒分别用HindIII和EcoRI进行双酶切，回收目的片段后，进行连接、转化以及鉴定，构建得到质粒pPSP1-EN1+2。pPSP1-EN1+2的酶切鉴定结果如图11所示。
2、pPSP1-EN1+2对玉米的遗传转化及转基因玉米的分子检测
玉米的遗传转化、PCR检测、Southern blot杂交的过程同实施例3。EN1和EN2基因片段干扰效果的RT-PCR检测中RNA的提取、反转录过程与实施例3相同，检测EN1基因片段的干扰效果所用引物序列为EN1-5：aatcatcccgaggtgaccacggga；EN1-3：cggtacgtcctcaagtactaggag；EN2-5：aatcatcccgaggtgtccacgtg；EN2-3：cgatacgtcctcaaatactaggaa，反应体系和条件同实施例7，内参基因为玉米tubulin基因，引物序列为Tub1-F:5’-CCTTCAACACCCCTGCTATG-3’和Tub1-R:5’-CAATGCCAGGGAACATAGTG-3’，反应体系为：模板1μL，引物各0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，buffer 2μL，dNTP 1μL，水补齐至20μL，反应条件：94℃5min，94℃30sec，60℃30sec，72℃20sec，35个循环，72℃10min。pPSP1-EN1+2转基因玉米的分子检测结果如图12所示。
3、转基因玉米的表型观察及育性鉴定
转基因玉米花粉的碘-碘化钾染色：取适量花粉于载玻片上，加一滴染色液，配制方法为：称取1.95g碘化钾和0.45g碘，溶于150mL蒸馏水中，染色5min后显微镜下观察着色情况，形态饱满的被染为深褐色的为可育花粉，干瘪，着色浅的为败育花粉。花粉体外萌发实验时选择晴天上午刚刚散粉的花粉，散在萌发培养基上，培养基成分为：15％蔗糖，0.005％H3BO3，10mM CaCl2，0.05mM KH2PO4，12％PEG 4000和0.7％琼脂，高压灭菌后使用，将萌发样品放入带有一层湿润滤纸的培养皿中，置于25℃恒温光照条件下培养2hr后，在显微镜下观察萌发情况。
转pPSP1-EN1+2玉米的表型鉴定结果如图13所示，从该结果可以看出，转基因玉米苗期和生育期植株生长正常，未见明显缺陷，通过自交授粉检测花粉育性，结果表明通过本方法获得的转基因玉米花粉不能受精，雌穗不能结实，达到败育的目的。以野生型玉米花粉授给本方法获得的转基因玉米雌穗可以使雌穗正常结实，表明本方法获得的玉米材料具有不育系的特征，可以在实际育种中应用。
由此可知，本发明所述的玉米花粉特异性启动子确实具有花粉特异性表达活性，而且应用该启动子驱动EN1和EN2反义片段干扰玉米花粉发育中内源基因的表达可以获得玉米雄性不育系。
序列表
<110> 沈阳农业大学
<120> 一种玉米雄性不育系的建立方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2921
<212> DNA
<213> maize
<400> 1
agtaggccaa aatttccaaa caatgcaggc taatcgtaga cttatcacga ttaatcggat 60
caatctgaaa acattgcata aaaccttata ataaatgcta ttttgtcaat ctggagaggc 120
aactgctaga agacagaagg ttcttgatgc tttcagacaa ctggtgacag gaatacagat 180
ccaaagccaa gatacaggag gctgttactg ctgctgcaac tcatgtatca actacaaatt 240
atgttcttct gttggtaaaa cctctgaaca gcaagacgac ctttcacgcg cgacagacta 300
tctcgacgaa cctgtcgaag ttcttcctgc actcaccgcc tggcccgaac gcctcggcca 360
ccaaggcctg cagctccttg gcccttgccc tcatccgcgc cccttcctcc ccgcgcagca 420
gctcctccac ggccgcggcc actccggcgc tcgtcatggc gccctcgaac gcggcgccga 480
acccccacac gtgcgccacg gaccgcgcgt tcatccgctg gtcgccgaag aaggggcggc 540
acgccatggg caccccgctg gacacgccct ccagcaccga cgcccacccg gcgtgcgtca 600
cgaacgcgcc cacggaaggg tggcgcagca cggccacctg cggcgcccag ggcaccacga 660
gcccggaccc ggtgcccgcg gcgcggtcaa ggaaacccgg cgggaggagc gtccacgagt 720
cctcgcgcag cgaccacagg aacggcgcgg ccgaggcctc cagcccggcc gccagctcgc 780
ggagctcgtc aggccgcggg cacgccaccg tgccgaagct gacgtacgcg acgccgcgcg 840
cgggttggcg gcccagccag gcgaggcagc cgtgcgggtc ggctggtgcg gcggtgtcgg 900
cgtcgtcctc ggcgaggagg aggtggtagg ggccgaacgg gacgcagttg ggcaggatct 960
ccgcgagcgc cgcggtgacg tcgggcgggt ccaggcctgg gaacgtgttg agtgccacgg 1020
cggcggcaga gcgcgggagg cactgcccca tgcggtggac gaggaggttg atgacgtagt 1080
tgaagtcgcc ggagacgacg ccgtctggga ggtcacggac gcggtagctg gcgaggcccg 1140
ggtgggagat cagtggctcg tccaccctgt ttgcggctgc gaacgatgga aatgcaacag 1200
ccattcgctc atcaaacccg cgcgcaatga agggacaagg aagggagaga agtagtactg 1260
tagtagtaga atccaacgca ccctggtcgc cgacgtcctc ccggagcgcg tcggtgcgga 1320
cgtgcgccag gagcgcgcac gacgcggccg tccacaccgg cacccacggc gcccccgcgg 1380
aggcggccgc gtccgccgca ggccacacga acgcgtcgcc caccacgcag gtcaccctgg 1440
cgccgcccgc cgcggcgcgg gccgcctcca gccaggcctt cacccctccg gcctccgcgg 1500
cctccatgaa cagctgcatc tgccgcggca ccggcacggt ctcctcggcc gcgggcgcgc 1560
cgtccggtac ctcgacgaag cgcaggttcc ccgggagccc gtgcccggcg gaggcgctgc 1620
tggccttgcg gagctgcgcg agggaggacg cggtggagag gaacgagagc gtggccccgg 1680
acggcgccgc ggcggcagcc agggcgcgcg cgatggagag cagcaccgcc gcgtgggagc 1740
tgaacgggaa ggcgaccacg gccacgtgcg gcggcgggga ggactcgccg tcggcgggcg 1800
ccatcttcgc gcgctcaggc tgttcggcta ggctagccgc tagcgtcgga tgcgacctgc 1860
gatgcgatgc gaatgcgatg cgtgcgggct tcgctggggg cgcaacgtgt ccgctttatt 1920
ccgcgcgacc acgcgtgcgc acctgccagt cgcagttaga cgtgccgaaa tttttaggtg 1980
agccggcggt tggatcgccg cgcacgcagc gcatcgggct tagctgttgg tgctgtggag 2040
tttggggacc ggagtttgtt gggatcaacg gtgagtggat cgctcgccag cgtgcagcgc 2100
gctccagtag gtacattctg gacacacccc cgtgcacgat atggcaaggc cgggccagag 2160
ctgtgaaggc tgtggaccag gggatggggc actggattgt gccggattgt cacgggatct 2220
ggtctaaact gtcgtgttca tgtcagtcca ttgtgcggag gtcgtggtcc aaagatgtga 2280
ctaaacctgt gccgtatgac attatataaa tcgtgtccgt gtcgtgtcaa agcatcgcgg 2340
gtcgtactgt gcttagtgcc tacccattta ggccctgttt gggaacaaag tttttgaaaa 2400
ccacagtttt tgaaatacta cagtatactt tagttatgac aatactgcag tttacaatac 2460
cacaattttg aaaactgagg tccagaccta agtttagaat aacttaaaac aactatagta 2520
tttgcaatac ttcagtttta aaaacagaga ttttagccaa cttgccaaac acaattctgt 2580
atataatacc gtagtatttt attcttccaa aactgtgaaa aaacttcact ctcaaacacc 2640
ccttagcgaa taagtatata ggttacaatc gtgtgcgctc gtgagccatg gtagttttgt 2700
gatggtgttt gactgtttgt ttccaaagtg taaataaaaa gtcgagtaac caaacgtgtt 2760
ccacaggaac atgaatccgt tgtccagtgg ccacccgttg aacgaggttg aagcccccga 2820
taaacagctc tatttttggc cggcgcgtac ggcccaaacg gccaccacat ccctaaaatg 2880
gcgtgcttta ataagagacg tcaatcttgg agcaggagct g 2921
<210> 2
<211> 834
<212> DNA
<213> maize
<400> 2
ttagtagggc tccactggtg ccctgaactt tgctccggcg tagaccgcgg catcaccgag 60
ctcttcctcg atcctgagca gctggttgta tttggccagg cgctcagacc ggcaaggagc 120
tcccgtcttg atttggcccg tagacaggcc aactgagagg tcagcaatga aggtgtcctc 180
tgtctcgcca ctcctgtggc ttgccatcac tccccatccg gcgcgcttgg acatcctgac 240
agcttcgata ctctcggtca cagacccgat ttggttcacc ttcaagagga gagcattgca 300
ggtcttctca ttgatggcct tggcgaccct ggtggggttg gtaacgagaa gatcatctcc 360
tacaatctgc actttctgtc caatctcatc agtgagtttg gcataagtgc tccagtcatc 420
ctgatcaaat ggatcttcga tcgactcgat agggtactca gaaacaaagg acttgtacag 480
gtctttcagg ctgtcgcctg aaattttgtt tgagccatcg ttgttctcct ccttgaaatt 540
aagatcataa gtcttgtctt tctcaccgaa gaactcagaa gcagcaacat ccattccaat 600
gaccaccttt ccagtgtagc cagccttttc tatggctgcc ttcaatagtt caaggccttc 660
tttgttttcc tgaatgttag gtgcaaaacc accttcatcc ccaacatttg tcgcatcctg 720
accgtacttc ttcttgatta tgctcttcag gttgtggtac acctcaactc ccatcttcat 780
ggcctccttg aacgaggagg caccagttgg gaggatcatg aactcctgca tggc 834
<210> 3
<211> 834
<212> DNA
<213> maize
<400> 3
ttagtagggc tccacaggtg cacggaattt ggcacctgcg tagacagcaa tagcgccaag 60
ctcttcttca atcctaagaa gctggttgta tttggcaaga cgctctgatc tgcagggtgc 120
tccagtctta atctgacccg tggacaaacc aactgccaga tcagcaatga aagtgtcctc 180
agtctcacca ctcctatgac tagtcatcac accccagccc gcacgctttg acatcttcac 240
agcctcaata ctctcagtca cagatccgat ttggttaacc ttgagcagaa gggcattgca 300
tgatttctcc ttgatagcct tagcaaccct agtggggttg gtgacgagaa ggtcatcacc 360
aacaatctgc acttgctctc caatttcttc agtcatctta gcatagtgaa cccagtcatc 420
ctggtcaaaa ggatcttcaa tcgaaacaat ggggtattcg ctcacaaaag atttgtatac 480
attctttaag ctatcgccag atatcttctg tgaaccatca ttattctcct ccttaaagtt 540
gaggtcatag gtttggtcct tgtcactgta aaactccgaa gcagcaacat ccattccgat 600
gacaaccttg ccagtgtatc cagccttctc aattgcagtt ttcaagagct caagtccttc 660
cttgttctcc tggatgttcg gagcaaaacc accttcgtca ccaacattcg tggcatcttg 720
cccatacttc tttttgataa cggacttcag gtggtgataa acttcaacac ccatcttcat 780
agcctcctta aatgaggcag ctccagtagg aaggatcata aactcctgca tagc 834

Claims (7)

1.一种玉米雄性不育系的建立方法，其特征在于，所述方法包括将含有玉米花粉特异性启动子pPSP1以及与所述启动子可操作连接的ZmENO1和ZmENO2基因反义片段的植物表达载体转化玉米细胞或组织，获得ZmENO1和ZmENO2基因在花粉中特异性沉默表达的玉米雄性不育系，其中所述的玉米花粉特异性启动子pPSP1的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的ZmENO1和ZmENO2基因的反义片段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.3所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物表达载体为pCambia1301。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使用能够将所述的植物表达载体导入玉米细胞或组织的任何一种植物转化方法。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的玉米细胞或组织来源于玉米萌动胚，所述的植物转化方法为农杆菌介导法。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物表达载体通过以下方法构建得到：
(1)pCambia1301-pPSP1-GUS的构建
提取玉米幼苗的总DNA，设计用于启动子pPSP1克隆的引物：
F：AGTAGGCCAAAATTTCCAAACA；
R：CAGCTCCTGCTCCAAGATTGACG，
以提取的总DNA为模板，用以上引物进行PCR反应，回收目的条带，把回收片段亚克隆到测序载体pMD19-T中，测序正确的重组质粒命名为pMD19T-pPSP1；设计带有HindIII和NcoI酶切位点的用于pPSP1片段扩增的引物，引物序列为HindIII-F：
CCAAGCTTAGTAGGCCAAAATTTCCAAACA，NcoI-R：
CCCATGGCAGCTCCTGCTCCAAGATTGACG，以鉴定正确的pMD19T-pPSP1重组质粒为模板，扩增获得两端带有HindIII和NcoI酶切位点的pPSP1片段，再将获得的片段亚克隆到测序载体pMD19-T中，将测序正确的重组质粒命名为pMD19T-pPSP1-HN；
pMD19T-pPSP1-HN质粒经过HindIII和NcoI双酶切，得到带有HindIII和NcoI酶切位点的pPSP1启动子片段，与经过同样酶切的植物表达载体pCambia1301的大片段相连，经限制性内切酶和PCR扩增鉴定，鉴定正确的表达载体命名为pCambia1301-pPSP-GUS；
(2)提取玉米花粉的总RNA并反转录获得cDNA序列；
(3)设计扩增ZmENO1和ZmENO2反义片段的引物，引物的两端分别带有NcoI和BstEII位点，序列为EN1-5：cccatggaatcatcccgaggtgaccacggga；EN1-3：gggtacccggtacgtcctcaagtactaggag；EN2-5：cccatggaatcatcccgaggtgtccacgtg；EN2-3：gggtacccgatacgtcctcaaatactaggaa，以获得的cDNA序列进行PCR扩增，PCR产物的回收后与pMD19-T载体连接，分别构建得到pMD19-EN1质粒以及pMD19-EN2；
(4)将构建得到的pMD19-EN1质粒以及pMD19-EN2分别用NcoI和BstEII酶切后，回收含有的ZmENO1和ZmENO2反义片段的产物，与采用相同酶切后的pCambia1301-pPSP1-GUS载体连接，分别构建得到pPSP1-EN1质粒以及pPSP1-EN2；
(5)设计引物序列为：F：
CCAAGCTTAGTAGGCCAAAATTTCCAAACA；R：
CGGAATTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT，以构建好的pPSP1-EN2质粒为模板，扩增带有HindIII和EcoRI位点的含有pPSP1-EN2-Nos polyA的片段，回收含有pPSP1-EN2-Nos polyA的片段的PCR产物，与pMD19-T载体连接，构建得到的质粒命名为pMD19-pPSP1-EN2；
(6)pPSP1-EN1与pMD19-pPSP1-EN2质粒分别用HindIII和EcoRI进行双酶切，回收目的片段后，进行连接、转化以及鉴定，构建得到质粒pPSP1-EN1+2，即为所述的植物表达载体。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中ZmENO1和ZmENO2的反义片段分别如SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.3所示。
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