CN112176094B - 一种筛选不同千粒重、株高和/或叶绿素含量的小麦的方法及其使用的试剂盒 - Google Patents

一种筛选不同千粒重、株高和/或叶绿素含量的小麦的方法及其使用的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了筛选不同千粒重、株高和/或叶绿素含量的小麦的方法，包括如下步骤：检测待测小麦为单倍型I、单倍型II还是单倍型III；单倍型I的小麦基于SNP位点1为GG纯合型和/或基于SNP位点2为CC纯合型；单倍型II的小麦基于SNP位点1为CC纯合型和/或基于SNP位点2为CC纯合型；单倍型III的小麦基于SNP位点1为CC纯合型和/或基于SNP位点2为TT纯合型；SNP1位点为小麦基因组中SEQ ID NO：10自5’末端起的第16位核苷酸；SNP2位点为小麦基因组中SEQ ID NO：11自5’末端起的第133位核苷酸；单倍型II的小麦的株高低且千粒重和叶绿素含量高。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种筛选不同千粒重、株高和/或叶绿素含量的小麦的方法及 其使用的试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种筛选不同千粒重、株高和/或叶绿素含量的小麦的方法及其使用的试剂盒。
背景技术
小麦是我国三大主要粮食作物之一，在我国的粮食安全中占有举足轻重的地位。降低株高能够增加小麦耐肥和抗倒伏能力，并提高收获指数和最终产量，是育种过程中一个重要选择指标。千粒重是构成小麦产量的关键要素之一，一直以来是育种家重点选择的目标性状。小麦旗叶的叶绿素含量直接影响光合速率和光合产物形成，是影响产量潜力的重要因素。
SNP是位于染色体上的单个核苷酸变异位点，而单倍型则是指位于染色体上能够进行共同遗传的多个核苷酸变异位点的组合。目前，已经建立了多种检测这些核苷酸变异位点的方法，如直接测序、CAPS标记、KASP等。CAPS标记其原理是通过PCR扩增获得包含变异位点的DNA片段，该变异位点可以被特异的限制性内切酶识别，经酶切后，根据酶切产物的大小获得变异位点处的碱基信息。但是并不是所有的变异位点都可以设计CAPS标记，因此dCAPS标记应运而生。dCAPS标记是在设计引物时改变变异位点附近的1-3个碱基，使扩增片段在变异位点处产生新的酶切位点，然后通过酶切后产物的大小进行碱基的识别。
关联分析是一种基于连锁不平衡原理，鉴定群体单倍型与表型性状之间关系的分析方法。关联分析不需要构建遗传群体就可以进行分析，具有研究周期短、精度高等优点，是进行功能基因优异等位变异发掘的有效方法。小麦种质资源中蕴藏着丰富的等位变异，发掘优异等位基因并开发功能标记，对于利用分子标记选择抗逆稳产高产新品种具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的是如何筛选不同千粒重、株高和/或叶绿素含量的小麦。
本发明首先保护筛选不同千粒重、株高和/或叶绿素含量的小麦的方法。
本发明所保护的筛选不同千粒重、株高和/或叶绿素含量的小麦的方法，具体可为方法一，可包括如下步骤：检测待测小麦的单倍型为单倍型I、单倍型II还是单倍型III；
所述单倍型I的小麦为基于SNP位点1为GG纯合型和/或基于SNP位点2为CC纯合型的小麦；
所述单倍型II的小麦为基于SNP位点1为CC纯合型和/或基于SNP位点2为CC纯合型的小麦；
所述单倍型III的小麦为基于SNP位点1为CC纯合型和/或基于SNP位点2为TT纯合型的小麦；
所述SNP1位点为小麦基因组中SEQ ID NO：10自5’末端起的第16位核苷酸；
所述SNP2位点为小麦基因组中SEQ ID NO：11自5’末端起的第133位核苷酸；
单倍型III的小麦的千粒重<单倍型II的小麦的千粒重或单倍型I的小麦的千粒重；
单倍型II的小麦的株高<单倍型I的小麦的株高或单倍型III的小麦的株高；
单倍型III的小麦的叶绿素含量<单倍型II的小麦的叶绿素含量或单倍型I的小麦的叶绿素含量。
本发明所保护的筛选不同千粒重、株高和/或叶绿素含量的小麦的方法，具体可为方法二，依次可包括如下步骤：
(A1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用引物Primer-F和引物Primer-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物P1；
(A2)以所述PCR扩增产物P1为模板，采用引物TaqI-F和引物TaqI-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物P2；
(A3)将所述PCR扩增产物P2用限制性内切酶TaqI进行酶切，得到酶切产物；然后进行如下评判：如果所述酶切产物为两条DNA片段，则待测小麦的单倍型为单倍型I；如果所述酶切产物为一条DNA片段，则待测小麦的单倍型为单倍型II或单倍型III；
(A4)以步骤(A3)中判定的非单倍型I的待测小麦的PCR扩增产物P1为模板，采用引物SpeI-F和引物SpeI-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物P3；
(A5)将所述PCR扩增产物P3用限制性内切酶SpeI进行酶切，得到酶切产物；然后进行如下评判：如果所述酶切产物为两条DNA片段，则待测小麦的单倍型为单倍型II；如果所述酶切产物为一条DNA片段，则待测小麦的单倍型为单倍型III；
单倍型III的小麦的千粒重<单倍型II的小麦的千粒重或单倍型I的小麦的千粒重；
单倍型II的小麦的株高<单倍型I的小麦的株高或单倍型III的小麦的株高；
单倍型III的小麦的叶绿素含量<单倍型II的小麦的叶绿素含量或单倍型I的小麦的叶绿素含量；
引物Primer-F为SEQ ID NO：4所示的单链DNA分子；
引物Primer-R为SEQ ID NO：5所示的单链DNA分子；
引物TaqI-F为SEQ ID NO：6所示的单链DNA分子；
引物TaqI-R为SEQ ID NO：7所示的单链DNA分子；
引物SpeI-F为SEQ ID NO：8所示的单链DNA分子；
引物SpeI-R为SEQ ID NO：9所示的单链DNA分子。
本发明所保护的筛选不同千粒重、株高和/或叶绿素含量的小麦的方法，具体可为方法三，依次可包括如下步骤：
(B1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用引物Primer-F和引物Primer-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物P1；
(B2)以所述PCR扩增产物P1为模板，采用引物TaqI-F和引物TaqI-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物P2；
(B3)将所述PCR扩增产物P2用限制性内切酶TaqI进行酶切，得到酶切产物；然后进行如下评判：如果酶切产物中具有273bp的DNA片段和193bp的DNA片段，则待测小麦的单倍型为单倍型I；如果酶切产物中只具有465bp的DNA片段，则待测小麦的单倍型为单倍型II或单倍型III；
(B4)以步骤(B3)中判定的非单倍型I的待测小麦的PCR扩增产物P1为模板，采用引物SpeI-F和引物SpeI-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物P3；
(B5)将所述PCR扩增产物P3用限制性内切酶SpeI进行酶切，得到酶切产物；然后进行如下评判：如果酶切产物中具有177bp的DNA片段和35bp的DNA片段，则待测小麦的单倍型为单倍型II；如果酶切产物中只具有212bp的DNA片段，则待测小麦的单倍型为单倍型III；
单倍型III的小麦的千粒重<单倍型II的小麦的千粒重或单倍型I的小麦的千粒重；
单倍型II的小麦的株高<单倍型I的小麦的株高或单倍型III的小麦的株高；
单倍型III的小麦的叶绿素含量<单倍型II的小麦的叶绿素含量或单倍型I的小麦的叶绿素含量；
引物Primer-F为SEQ ID NO：4所示的单链DNA分子；
引物Primer-R为SEQ ID NO：5所示的单链DNA分子；
引物TaqI-F为SEQ ID NO：6所示的单链DNA分子；
引物TaqI-R为SEQ ID NO：7所示的单链DNA分子；
引物SpeI-F为SEQ ID NO：8所示的单链DNA分子；
引物SpeI-R为SEQ ID NO：9所示的单链DNA分子。
本发明所保护的筛选不同千粒重、株高和/或叶绿素含量的小麦的方法，具体可为方法四，依次可包括如下步骤：
(1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用引物Primer-F和引物Primer-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物P1；
引物Primer-F为SEQ ID NO：4所示的单链DNA分子；
引物Primer-R为SEQ ID NO：5所示的单链DNA分子；
(2)将所述PCR扩增产物P1进行测序，然后进行如下评判：如果所述PCR扩增产物P1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，则待测小麦的单倍型为单倍型I；如果所述PCR扩增产物P1的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，则待测小麦的单倍型为单倍型II；如果所述PCR扩增产物P1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，则待测小麦的单倍型为单倍型III；
单倍型III的小麦的千粒重<单倍型II的小麦的千粒重或单倍型I的小麦的千粒重；
单倍型II的小麦的株高<单倍型I的小麦的株高或单倍型III的小麦的株高；
单倍型III的小麦的叶绿素含量<单倍型II的小麦的叶绿素含量或单倍型I的小麦的叶绿素含量。
本发明还保护一种鉴定小麦千粒重、株高和/或叶绿素含量的试剂盒，包括检测待测小麦的单倍型为单倍型I、单倍型II还是单倍型III的物质；
所述单倍型I的小麦为基于SNP位点1为GG纯合型和/或基于SNP位点2为CC纯合型的小麦；
所述单倍型II的小麦为基于SNP位点1为CC纯合型和/或基于SNP位点2为CC纯合型的小麦；
所述单倍型III的小麦为基于SNP位点1为CC纯合型和/或基于SNP位点2为TT纯合型的小麦；
所述SNP1位点为小麦基因组中SEQ ID NO：10自5’末端起的第16位核苷酸；
所述SNP2位点为小麦基因组中SEQ ID NO：11自5’末端起的第133位核苷酸。
上述试剂盒中，所述检测待测小麦的单倍型为单倍型I、单倍型II还是单倍型III的物质可为引物Primer-F、引物Primer-R、引物TaqI-F、引物TaqI-R、引物SpeI-F和/或引物SpeI-R；
所述引物Primer-F为SEQ ID NO：4所示的单链DNA分子；
所述引物Primer-R为SEQ ID NO：5所示的单链DNA分子；
所述引物TaqI-F为SEQ ID NO：6所示的单链DNA分子；
所述引物TaqI-R为SEQ ID NO：7所示的单链DNA分子；
所述引物SpeI-F为SEQ ID NO：8所示的单链DNA分子；
所述引物SpeI-R为SEQ ID NO：9所示的单链DNA分子。
所述试剂盒具体可由检测待测小麦的单倍型为单倍型I、单倍型II还是单倍型III的物质组成。
上述任一所述试剂盒还可包括限制性内切酶TaqI和/或限制性内切酶SpeI。
上述任一所述试剂盒具体可由检测待测小麦的单倍型为单倍型I、单倍型II还是单倍型III的物质和限制性内切酶组成。所述限制性内切酶可为限制性内切酶TaqI和/或限制性内切酶SpeI。
本发明还保护SEQ ID NO：10所示的分子标记甲或SEQ ID NO：11所示的分子标记乙。
上述任一所述试剂盒、所述分子标记甲或所述分子标记乙在筛选不同千粒重、株高和/或叶绿素含量小麦中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述试剂盒、所述分子标记甲或所述分子标记乙在制备筛选不同千粒重、株高和/或叶绿素含量小麦的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述的应用中，当分子标记甲的SNP位点1为GG纯合型和/或分子标记乙的SNP位点2为CC纯合型，则判定为单倍型I的小麦；当分子标记甲的SNP位点1为CC纯合型和/或分子标记乙的SNP位点2为CC纯合型，则判定为单倍型II的小麦；当分子标记甲的SNP位点1为CC纯合型和/或分子标记乙的SNP位点2为TT纯合型，则判定为单倍型III的小麦；所述SNP1位点为小麦基因组中SEQ ID NO：10自5’末端起的第16位核苷酸；所述SNP2位点为小麦基因组中SEQ ID NO：11自5’末端起的第133位核苷酸。单倍型III的小麦的千粒重<单倍型II的小麦的千粒重或单倍型I的小麦的千粒重。单倍型II的小麦的株高<单倍型I的小麦的株高或单倍型III的小麦的株高。单倍型III的小麦的叶绿素含量<单倍型II的小麦的叶绿素含量或单倍型I的小麦的叶绿素含量；
上述任一所述试剂盒、所述分子标记甲或所述分子标记乙在小麦育种中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述“>”可为统计学上的“>”。
上述任一所述“<”可为在统计学上的“<”。
上述任一所述叶绿素含量可为小麦旗叶的叶绿素含量。
实验证明，通过检测待测小麦基于SNP位点1的基因型和/或SNP位点2的基因型可以筛选小麦千粒重、株高和/或叶绿素含量性状，在小麦分子标记辅助育种过程中具有重要的应用价值。
附图说明
图1为根据SNP1位点开发的CAPS标记的示意图和酶切产物琼脂糖凝胶电泳检测结果。
图2为根据SNP2位点开发的dCAPS标记的示意图和酶切产物琼脂糖凝胶电泳检测结果。
图3为不同种植条件下三种单倍型小麦平均株高的统计结果。
图4为不同种植条件下三种单倍型小麦平均千粒重的统计结果。
图5为不同种植条件下三种单倍型小麦平均叶绿素含量(灌浆期)的统计结果。
图6为不同种植条件下三种单倍型小麦平均叶绿素含量(拔节期)的统计结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中所用的小麦材料均来自国家作物种质库(网址为：http://icscaas.com.cn/jiguoku/zhongzhiku.htm)，材料信息见中国作物种质信息网(网址为：http://icgr.caas.net.cn)。由于小麦材料均为栽培种，因此通常被默认为是高度纯合的植物材料，单倍型均为纯合型。
实施例1、小麦核苷酸变异位点的发现及单倍型的分类
1、本发明的发明人经过大量实验，根据小麦基因组的核苷酸序列设计并合成引物Primer-F：5′-ACCAGGCTACCAACTGCTCC-3′(SEQ ID NO：4)和引物Primer-R：5′-CTCCGTCCACAATTTCAGCC-3′(SEQ ID NO：5)。
2、分别提取表1所示的30个小麦品种的基因组DNA并以其作为模板，采用引物Primer-F和引物Primer-R组成的引物对进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物P1。
反应体系为20μL，由11.7μLddH2O、4μL
Figure BDA0002762244470000052
FastPfu buffer、0.5μL引物Primer-F水溶液(浓度为10μM)、0.5μL引物Primer-R水溶液(浓度为10μM)、2μL dNTP(浓度为2.5mM)、0.3μL
Figure BDA0002762244470000053
FastPfu DNA Polymerase和1μL小麦基因组DNA(浓度为50ng/μL)组成。
Figure BDA0002762244470000054
FastPfu DNA Polymerase为北京全式金生物技术有限公司的产品。
Figure BDA0002762244470000055
FastPfu buffer为
Figure BDA0002762244470000056
FastPfu DNA Polymerase中的组件。
反应条件为：95℃ 5min；95℃ 40s，57℃ 45s，72℃ 2min，35个循环；72℃ 10min；4℃保存。
表1
Figure BDA0002762244470000051
Figure BDA0002762244470000061
3、将各个PCR扩增产物P1与
Figure BDA0002762244470000062
cloning vector(北京全式金生物技术有限公司的产品)连接，然后转化Trans1-T1 Phage Resistant化学感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司的产品)，涂布于含卡那霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，37℃倒置培养12h；挑取阳性单克隆于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养8h，提取质粒，测序。对测序结果进行序列比对分析。
结果表明，PCR扩增产物P1中含有35个SNP位点和4个InDel位点。30个小麦品种的PCR扩增产物P1的核苷酸序列有三种类型，分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
根据PCR扩增产物P1的不同，将小麦分为单倍型I、单倍型II和单倍型III三种单倍型。单倍型I小麦的PCR扩增产物P1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。单倍型II小麦的PCR扩增产物P1的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。单倍型III的小麦PCR扩增产物P1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
实施例2、待测小麦的单倍型分型方法的建立
通过检测2个SNP位点(分别命名为SNP1位点和SNP2位点)的核苷酸序列来判定待测小麦的单倍型。SNP1位点为小麦基因组中SEQ ID NO：10自5’末端起的第16位核苷酸(即小麦基因组中SEQ ID NO：1自5’末端起的第1099位核苷酸、小麦基因组中SEQ ID NO：2自5’末端起的第1098位核苷酸或小麦基因组中SEQ ID NO：3自5’末端起的第1098位核苷酸)。SNP2位点为小麦基因组中SEQ ID NO：11自5’末端起的第133位核苷酸(即小麦基因组中SEQID NO：1自5’末端起的第723位核苷酸、小麦基因组中SEQ ID NO：2自5’末端起的第723位核苷酸或小麦基因组中SEQ ID NO：3自5’末端起的第723位核苷酸)。
1、特异引物对的制备
设计并合成用于扩增SNP1位点的靶序列的特异引物对1和用于扩增SNP2位点的靶序列的特异引物对2。特异引物对1由引物TaqI-F和引物TaqI-R组成。特异引物对2由引物SpeI-F和引物SpeI-R组成。
各个引物的核苷酸序列如下：
引物TaqI-F：5′-GTTTGGTATTGTAGATGTTGG-3′(SEQ ID NO：6)；
引物TaqI-R：5′-CAACCACATAATGAACAAGG-3′(SEQ ID NO：7)；
引物SpeI-F：5′-CCCATGAGGGCAATATGGC-3′(SEQ ID NO：8)；
引物SpeI-R：5′-ACTTTTTTTTGTAAGTTTGGTCCAAGTAGAACTA-3′(SEQ ID NO：9)。
根据SNP1位点开发的CAPS标记的示意图见图1。
根据SNP2位点开发的dCAPS标记的示意图见图2。
2、以待测小麦的基因组DNA为模板，采用引物Primer-F和引物Primer-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物P1。
反应体系同实施例1中步骤2的反应体系。
反应条件同实施例1中步骤2的反应条件。
3、以PCR扩增产物P1的稀释液(PCR扩增产物P1用水稀释至10倍获得)为模板，采用引物TaqI-F和引物TaqI-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物P2。
反应体系为20μL，由13.8μLddH2O、2μL10×Taq buffer、2μL dNTP(浓度为2.5mM)、0.5μL引物TaqI-F水溶液(浓度为10μM)、0.5μL引物TaqI-R水溶液(浓度为10μM)、0.2μL TaqDNA Polymerase(浓度为5U/μL)和1μLPCR扩增产物P1的稀释液组成。
Taq DNA Polymerase为Thermo Fisher Scientific公司的产品。10×Taq buffer为Taq DNA Polymerase中的组件。
反应条件为：95℃ 5min；95℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 30s；35个循环；72℃ 10min；4℃保存。
4、将步骤3得到的PCR扩增产物P2用限制性内切酶TaqI进行酶切消化，得到酶切产物；将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，然后进行如下判断：如果酶切产物为带型B(显示两条带，大小分别为273bp和193bp)，则待测小麦基于SNP1位点的核苷酸为G，即待测小麦为单倍型I；如果酶切产物为带型A(显示一条带，大小为465bp)，则待测小麦基于SNP1位点的核苷酸为C，即待测小麦为单倍型II或单倍型III。
5、以步骤4中判定的非单倍型I待测小麦的PCR扩增产物P1的稀释液(PCR扩增产物P1用水稀释至10倍获得)为模板，采用引物SpeI-F和引物SpeI-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物P3。
反应体系为20μL，由13.8μLddH2O、2μL10×Taq buffer、2μL dNTP(浓度为2.5mM)、0.5μL引物SpeI-F水溶液(浓度为10μM)、0.5μL引物SpeI-R水溶液(浓度为10μM)、0.2μL TaqDNA Polymerase(浓度为5U/μL)和1μLPCR扩增产物P1的稀释液组成。
反应条件为：95℃ 5min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s；35个循环；72℃ 10min；4℃保存。
6、将步骤5得到的PCR扩增产物P3用限制性内切酶SpeI进行酶切消化，得到酶切产物；将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，然后进行如下判断：如果酶切产物为带型D(显示两条带，大小分别为177bp和35bp)，则待测小麦基于SNP2位点的核苷酸为C，即待测小麦为单倍型II；如果酶切产物为带型C(显示一条带，大小为212bp)，则待测小麦基于SNP2位点的核苷酸为T，即待测小麦为单倍型III。
实施例3、小麦的单倍型与小麦株高、叶绿素及千粒重的关联分析
一、检测自然群体中各个小麦的单倍型
自然群体由主要来自中国北部晚熟冬麦区和黄淮冬麦区的323份小麦种质(均为六倍体小麦)组成。种质名称和地理来源详见表2。
表2
Figure BDA0002762244470000071
Figure BDA0002762244470000081
Figure BDA0002762244470000091
Figure BDA0002762244470000101
Figure BDA0002762244470000111
Figure BDA0002762244470000121
采用实施例2的方法对自然群体中的各个小麦种质进行单倍型分型。
各个小麦种质的单倍型分型结果见表2。
二、株高、叶绿素含量以及千粒重的农艺性状检测
将各个小麦种质分别种植于2015年北京顺义水地(以下简称E1)、2015年北京顺义旱地(以下简称E2)、2015年北京顺义水地并进行热处理(以下简称E3)、2015年北京顺义旱地并进行热处理(以下简称E4)、2016年北京昌平水地(以下简称E5)、2016年北京昌平旱地(以下简称E6)、2016年北京顺义水地(以下简称E7)、2016年北京顺义旱地(以下简称E8)、2016年北京顺义水地并进行热处理(以下简称E9)、2016年北京顺义旱地并进行热处理(以下简称E10)，拔节期和灌浆期分别统计不同种植条件下三种单倍型的小麦旗叶的叶绿素含量；收获后分别统计不同种植条件下三种单倍型的小麦的平均株高和千粒重。需要指明的是，北京昌平旱地、北京昌平水地、北京顺义旱地和北京顺义水地均为中国农业科学院作物科学研究所的实验基地。所述旱地指的是小麦的整个生长期仅有自然的雨水灌溉，人为不灌溉任何水分。所述水地指的是小麦的整个生长期不仅有自然的雨水灌溉，还有人为灌溉水分(人为灌溉的具体操作为：分别在越冬期之前、抽穗期、开花期和灌浆期灌溉，每次灌溉的水量为750m3/公顷水地)。所述热处理为当待测小麦处于开花期，开始覆盖塑料大棚，直至小麦品种成熟。在旱地进行热处理，塑料大棚外温度平均为33℃，塑料大棚内温度为43℃。在水地进行热处理，塑料大棚外温度平均为33℃，塑料大棚内温度为41℃。
不同种植条件下自然群体中三种单倍型小麦平均株高、平均千粒重、平均叶绿素含量(灌浆期)和平均叶绿素含量(拔节期)的统计结果分别见图3、图4、图5和图6。
三、关联分析
利用Tassel2.1软件GLM模型将自然群体中小麦的单倍型与株高、叶绿素含量以及千粒重进行关联分析，结果见表3。
表3
Figure BDA0002762244470000122
Figure BDA0002762244470000131
注：P value为关联分析的显著性水平，“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01，“***”表示P<0.005。
结果表明，自然群体中，“单倍型II的小麦”的株高<“单倍型I的小麦”的株高和“单倍型III的小麦”的株高；“单倍型I的小麦”的叶绿素含量和“单倍型II的小麦”的叶绿素含量>“单倍型III的小麦”的叶绿素含量；“单倍型I的小麦”的千粒重和“单倍型II的小麦”的千粒重>“单倍型III的小麦”的千粒重；所述“<”为在统计学上的<；“>”为在统计学上的>。
上述结果表明，通过检测待测小麦的单倍型可以筛选小麦株高、叶绿素含量和千粒重性状，在小麦分子标记辅助育种过程中具有重要的应用价值。
<110> 山西农业大学
<120> 一种筛选不同千粒重、株高和/或叶绿素含量的小麦的方法及其使用的试剂盒
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3343
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
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taccaaaata aaaccgaagt accaggctat caactgctcc attaggagta gagatatggt 180
tgtgtgcatc gctcagtgca tagggttgtc cttcctttca aaaaacaatt tgcttatagg 240
agtatccaag agattctctc aagtggcaaa tgatgttttc agacggacac atggttggaa 300
tcctgctgtt caaagacttt cttgacactg cgtgggatat gtgggatgtc cttattgctt 360
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tgtaggtagt gttctggtat cctttacaca tggctatgtg tccagggatg taggtttcct 480
tagttggggg ctatgcctag gtgttgtagt tatgctgcgt ggtgtatatg aatgatgcga 540
cgtatcccat gagggcaata tggccccttt tatccaagaa aaagttttgg tattcacacg 600
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taaatattag ttactccctc tgcccttttt tagtatgtat acaagttttg tctgaagtta 720
aactatctct acttggacca aacttacaaa aaaaagtatg aacattcata atgccaaatc 780
aatattatta gattcattat gaaatgtagt ttcataatat atatgtttgg tattgtagat 840
gttggtattt tttaatgtaa atttggttaa actttgaaaa gtttaacttg acataaatct 900
aatacgcgaa gtaaaaagga tcggagggag tatatgttaa aatccatatc attgattata 960
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aaacatctaa ctttcatcga aaatttgatg gaaatgacca catacccaca attgtagagt 1140
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tcctcctcgg ccaaccgtcg tcgggcttcc aacatgagct taatgacaac atctttagca 1260
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tttcaattat ataatttttt tcttccgtca cagttggtct cgttggttaa atttatggtc 1740
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gtttaaaaaa aagtataaac taggcataac tgggccgtga taataaaaaa aaggcataac 1860
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ggttcctggg tacatatata tgtaccctat atgagaattt tttttagcaa ttcaacaaaa 1980
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caaaatagca tgaatagtga cctataatag catgtaaatt ttatcttttt cgctgtgaag 2160
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acggcgaagc ccgcccgaag ctataataaa agtataaaag taccgcgtcg gcccgccgtg 2640
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gagagagagc gcgcggcttg gggaaaagca ggagcgaagc gaggggatcg gaaaccggcg 2760
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gcgccgagca ccgcacgtac gttgagcacg gctgcccgcg cgccgccgac cagggccgca 2940
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<211> 3343
<212> DNA
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atgtaggtag tgttctggta tcctttacac atggctatgt gtccagggat gtaggtttcc 480
ttagttgggg ctatgcctgg gtgttgtagt tatgctgcgt ggtgtatatg aatgatgcga 540
cgtatcccat gagggcaata tggccccttt tatccaagaa aaagttttgc tattcacacg 600
attcgtgtct atgaggcact aacatatatt agaaaacttt tgatcatgaa tttgatcaat 660
taaatattag ttactccctc tgcccttttt tagtatgtat acaagttttg tctgaagtta 720
aactatctct acttggacca aacttacaaa aaaaagtatg aacattcata atgccaaatc 780
aatattatta gattcattat gaaatgtagt ttcataatat atatgtttgg tattgtagat 840
gttggtattt tttaatgtaa atttggttaa actttgaaaa gtttaacttg acataaatct 900
aatacacgaa gtaaaaagga tcggagggag tatatgttaa aatccatatc attgattata 960
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<213> Artificial sequence
<400> 9
actttttttt gtaagtttgg tccaagtaga acta 34
<210> 10
<211> 476
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<220>
<221> misc_feature
<222> （16）
<223> m is g or c
<400> 10
catctaactt tcatcmaaaa tttgatggaa atgaccacat acccacaatt gtagagttgc 60
agtttttctt gatgacccat cgcaaacaca acttgttttt cacattccac ccttgaatcc 120
tcctcggcca accgtcgtcg ggcttccaac atgagcttaa tgacaacatc tttagcatca 180
attgcgacct tgttcattat gtggttgttc gagcaagctt gtttaaacaa taagctcaat 240
cttgaaggca agcaaactgg cggccaatga tactattttt ttatgacatg cattaatatt 300
ttattaatta catccatgac caaaatttgg cacagaaaat taagaagacc aataaaccag 360
gaggaggtag taaacaattt gggtgcaatc gtgctcaaaa ttcatgagtg gcgaccacaa 420
aaaaggatga aaaaaatctt tcaaagactc atgacgtctc caaaaaagta ctccct 476
<210> 11
<211> 315
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<220>
<221> misc_feature
<222> （133）
<223> n is t or c
<400> 11
tattcacacg attcgtgtct atgaggcact aacatatatt agaaaacttt tgatcatgaa 60
tttgatcaat taaatattag ttactccctc tgcccttttt tagtatgtat acaagttttg 120
tctgaagtta aantatctct acttggacca aacttacaaa aaaaagtatg aacattcata 180
atgccaaatc aatattatta gattcattat gaaatgtagt ttcataatat atatgtttgg 240
tattgtagat gttggtattt tttaatgtaa atttggttaa actttgaaaa gtttaacttg 300
acataaatct aatac 315

Claims (9)

1.一种筛选不同千粒重、株高和/或叶绿素含量的小麦的方法，包括如下步骤：检测待测小麦的单倍型为单倍型I、单倍型II还是单倍型III；
所述单倍型I的小麦为基于SNP位点1为GG纯合型且基于SNP位点2为CC纯合型的小麦；
所述单倍型II的小麦为基于SNP位点1为CC纯合型且基于SNP位点2为CC纯合型的小麦；
所述单倍型III的小麦为基于SNP位点1为CC纯合型且基于SNP位点2为TT纯合型的小麦；
所述SNP位点1为小麦基因组中SEQ ID NO：10自5’末端起的第16位核苷酸；
所述SNP位点2为小麦基因组中SEQ ID NO：11自5’末端起的第133位核苷酸；
单倍型III的小麦的千粒重<单倍型II的小麦的千粒重或单倍型I的小麦的千粒重；
单倍型II的小麦的株高<单倍型I的小麦的株高或单倍型III的小麦的株高；
单倍型II的小麦的叶绿素含量>单倍型I的小麦的叶绿素含量或单倍型III的小麦的叶绿素含量；
所述叶绿素含量为灌浆期的叶绿素含量。
2.一种筛选不同千粒重、株高和/或叶绿素含量的小麦的方法，依次包括如下步骤：
（A1）以待测小麦的基因组DNA为模板，采用引物Primer-F和引物Primer-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物P1；
（A2）以所述PCR扩增产物P1为模板，采用引物TaqI-F和引物TaqI-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物P2；
（A3）将所述PCR扩增产物P2用限制性内切酶TaqI进行酶切，得到酶切产物；然后进行如下评判：如果所述酶切产物为两条DNA片段，则待测小麦的单倍型为单倍型I；如果所述酶切产物为一条DNA片段，则待测小麦的单倍型为单倍型II或单倍型III；
（A4）以步骤（A3）中判定的非单倍型I的待测小麦的PCR扩增产物P1为模板，采用引物SpeI-F和引物SpeI-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物P3；
（A5）将所述PCR扩增产物P3用限制性内切酶SpeI进行酶切，得到酶切产物；然后进行如下评判：如果所述酶切产物为两条DNA片段，则待测小麦的单倍型为单倍型II；如果所述酶切产物为一条DNA片段，则待测小麦的单倍型为单倍型III；
单倍型III的小麦的千粒重<单倍型II的小麦的千粒重或单倍型I的小麦的千粒重；
单倍型II的小麦的株高<单倍型I的小麦的株高或单倍型III的小麦的株高；
单倍型II的小麦的叶绿素含量>单倍型I的小麦的叶绿素含量或单倍型III的小麦的叶绿素含量；所述叶绿素含量为灌浆期的叶绿素含量；
引物Primer-F为SEQ ID NO：4所示的单链DNA分子；
引物Primer-R为SEQ ID NO：5所示的单链DNA分子；
引物TaqI-F为SEQ ID NO：6所示的单链DNA分子；
引物TaqI-R为SEQ ID NO：7所示的单链DNA分子；
引物SpeI-F为SEQ ID NO：8所示的单链DNA分子；
引物SpeI-R为SEQ ID NO：9所示的单链DNA分子。
3.一种筛选不同千粒重、株高和/或叶绿素含量的小麦的方法，依次包括如下步骤：
（B1）以待测小麦的基因组DNA为模板，采用引物Primer-F和引物Primer-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物P1；
（B2）以所述PCR扩增产物P1为模板，采用引物TaqI-F和引物TaqI-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物P2；
（B3）将所述PCR扩增产物P2用限制性内切酶TaqI进行酶切，得到酶切产物；然后进行如下评判：如果酶切产物中具有273bp的DNA片段和193bp的DNA片段，则待测小麦的单倍型为单倍型I；如果酶切产物中只具有465bp的DNA片段，则待测小麦的单倍型为单倍型II或单倍型III；
（B4）以步骤（B3）中判定的非单倍型I的待测小麦的PCR扩增产物P1为模板，采用引物SpeI-F和引物SpeI-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物P3；
（B5）将所述PCR扩增产物P3用限制性内切酶SpeI进行酶切，得到酶切产物；然后进行如下评判：如果酶切产物中具有177bp的DNA片段和35bp的DNA片段，则待测小麦的单倍型为单倍型II；如果酶切产物中只具有212bp的DNA片段，则待测小麦的单倍型为单倍型III；
单倍型III的小麦的千粒重<单倍型II的小麦的千粒重或单倍型I的小麦的千粒重；
单倍型II的小麦的株高<单倍型I的小麦的株高或单倍型III的小麦的株高；
单倍型II的小麦的叶绿素含量>单倍型I的小麦的叶绿素含量或单倍型III的小麦的叶绿素含量；所述叶绿素含量为灌浆期的叶绿素含量；
引物Primer-F为SEQ ID NO：4所示的单链DNA分子；
引物Primer-R为SEQ ID NO：5所示的单链DNA分子；
引物TaqI-F为SEQ ID NO：6所示的单链DNA分子；
引物TaqI-R为SEQ ID NO：7所示的单链DNA分子；
引物SpeI-F为SEQ ID NO：8所示的单链DNA分子；
引物SpeI-R为SEQ ID NO：9所示的单链DNA分子。
4.一种筛选不同千粒重、株高和/或叶绿素含量的小麦的方法，依次包括如下步骤：
（1）以待测小麦的基因组DNA为模板，采用引物Primer-F和引物Primer-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物P1；
引物Primer-F为SEQ ID NO：4所示的单链DNA分子；
引物Primer-R为SEQ ID NO：5所示的单链DNA分子；
（2）将所述PCR扩增产物P1进行测序，然后进行如下评判：如果所述PCR扩增产物P1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，则待测小麦的单倍型为单倍型I；如果所述PCR扩增产物P1的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，则待测小麦的单倍型为单倍型II；如果所述PCR扩增产物P1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，则待测小麦的单倍型为单倍型III；
单倍型III的小麦的千粒重<单倍型II的小麦的千粒重或单倍型I的小麦的千粒重；
单倍型II的小麦的株高<单倍型I的小麦的株高或单倍型III的小麦的株高；
单倍型II的小麦的叶绿素含量>单倍型I的小麦的叶绿素含量或单倍型III的小麦的叶绿素含量；
所述叶绿素含量为灌浆期的叶绿素含量。
5.一种鉴定小麦千粒重、株高和/或叶绿素含量的试剂盒，包括引物Primer-F、引物Primer-R、引物TaqI-F、引物TaqI-R、引物SpeI-F和引物SpeI-R；
所述引物Primer-F为SEQ ID NO：4所示的单链DNA分子；
所述引物Primer-R为SEQ ID NO：5所示的单链DNA分子；
所述引物TaqI-F为SEQ ID NO：6所示的单链DNA分子；
所述引物TaqI-R为SEQ ID NO：7所示的单链DNA分子；
所述引物SpeI-F为SEQ ID NO：8所示的单链DNA分子；
所述引物SpeI-R为SEQ ID NO：9所示的单链DNA分子。
6.权利要求5所述试剂盒在筛选不同千粒重、株高和/或叶绿素含量小麦中的应用；
所述叶绿素含量为灌浆期的叶绿素含量；
单倍型III的小麦的千粒重<单倍型II的小麦的千粒重或单倍型I的小麦的千粒重；
单倍型II的小麦的株高<单倍型I的小麦的株高或单倍型III的小麦的株高；
单倍型II的小麦的叶绿素含量>单倍型I的小麦的叶绿素含量或单倍型III的小麦的叶绿素含量；
所述单倍型I的小麦为基于SNP位点1为GG纯合型且基于SNP位点2为CC纯合型的小麦；
所述单倍型II的小麦为基于SNP位点1为CC纯合型且基于SNP位点2为CC纯合型的小麦；
所述单倍型III的小麦为基于SNP位点1为CC纯合型且基于SNP位点2为TT纯合型的小麦；
所述SNP位点1为小麦基因组中SEQ ID NO：10自5’末端起的第16位核苷酸；
所述SNP位点2为小麦基因组中SEQ ID NO：11自5’末端起的第133位核苷酸。
7.SEQ ID NO：10所示的分子标记甲和SEQ ID NO：11所示的分子标记乙在筛选不同千粒重、株高和/或叶绿素含量小麦中的应用；所述叶绿素含量为灌浆期的叶绿素含量；
单倍型III的小麦的千粒重<单倍型II的小麦的千粒重或单倍型I的小麦的千粒重；
单倍型II的小麦的株高<单倍型I的小麦的株高或单倍型III的小麦的株高；
单倍型II的小麦的叶绿素含量>单倍型I的小麦的叶绿素含量或单倍型III的小麦的叶绿素含量；
所述单倍型I的小麦为基于SNP位点1为GG纯合型且基于SNP位点2为CC纯合型的小麦；
所述单倍型II的小麦为基于SNP位点1为CC纯合型且基于SNP位点2为CC纯合型的小麦；
所述单倍型III的小麦为基于SNP位点1为CC纯合型且基于SNP位点2为TT纯合型的小麦；
所述SNP位点1为小麦基因组中SEQ ID NO：10自5’末端起的第16位核苷酸；
所述SNP位点2为小麦基因组中SEQ ID NO：11自5’末端起的第133位核苷酸。
8.权利要求5所述试剂盒在制备筛选不同千粒重、株高和/或叶绿素含量小麦的产品中的应用；
所述叶绿素含量为灌浆期的叶绿素含量；
单倍型III的小麦的千粒重<单倍型II的小麦的千粒重或单倍型I的小麦的千粒重；
单倍型II的小麦的株高<单倍型I的小麦的株高或单倍型III的小麦的株高；
单倍型II的小麦的叶绿素含量>单倍型I的小麦的叶绿素含量或单倍型III的小麦的叶绿素含量；
所述单倍型I的小麦为基于SNP位点1为GG纯合型且基于SNP位点2为CC纯合型的小麦；
所述单倍型II的小麦为基于SNP位点1为CC纯合型且基于SNP位点2为CC纯合型的小麦；
所述单倍型III的小麦为基于SNP位点1为CC纯合型且基于SNP位点2为TT纯合型的小麦；
所述SNP位点1为小麦基因组中SEQ ID NO：10自5’末端起的第16位核苷酸；
所述SNP位点2为小麦基因组中SEQ ID NO：11自5’末端起的第133位核苷酸。
9.SEQ ID NO：10所示的分子标记甲和SEQ ID NO：11所示的分子标记乙在制备筛选不同千粒重、株高和/或叶绿素含量小麦的产品中的应用；
所述叶绿素含量为灌浆期的叶绿素含量；
单倍型III的小麦的千粒重<单倍型II的小麦的千粒重或单倍型I的小麦的千粒重；
单倍型II的小麦的株高<单倍型I的小麦的株高或单倍型III的小麦的株高；
单倍型II的小麦的叶绿素含量>单倍型I的小麦的叶绿素含量或单倍型III的小麦的叶绿素含量；
所述单倍型I的小麦为基于SNP位点1为GG纯合型且基于SNP位点2为CC纯合型的小麦；
所述单倍型II的小麦为基于SNP位点1为CC纯合型且基于SNP位点2为CC纯合型的小麦；
所述单倍型III的小麦为基于SNP位点1为CC纯合型且基于SNP位点2为TT纯合型的小麦；
所述SNP位点1为小麦基因组中SEQ ID NO：10自5’末端起的第16位核苷酸；
所述SNP位点2为小麦基因组中SEQ ID NO：11自5’末端起的第133位核苷酸。
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