CN114540347A - 鉴定耐咪唑啉酮类除草剂油菜的kasp标记引物、试剂盒及其应用 - Google Patents

鉴定耐咪唑啉酮类除草剂油菜的kasp标记引物、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了鉴定耐咪唑啉酮类除草剂油菜的KASP标记引物、试剂盒及其应用，涉及作物分子遗传育种技术领域。本发明的KASP标记引物组包括用于检测AHSH1基因的KASP标记引物组BN‑PM1.1和BN‑PM1.2，用于检测AHSH3基因的KASP标记引物组BN‑PM2.1和BN‑PM2.2。该组KASP标记引物组特异性高、质量好、灵敏度及分辨力高，能精准、快速、高效、特异地鉴定油菜AHAS1基因及AHAS3基因中PM1和PM2的变异位点。

Description

鉴定耐咪唑啉酮类除草剂油菜的KASP标记引物、试剂盒及其 应用
技术领域
本发明涉及作物分子遗传育种技术领域，特别涉及鉴定耐咪唑啉酮类除草剂油菜的KASP标记引物、试剂盒及其应用。
背景技术
油菜是一种主要的油料作物，杂草对油菜的生产危害十分大，在生产上常使用化学农药除草剂去除油菜田中的杂草。加拿大、澳大利亚等油菜生产国已经大面积推广和使用抗除草剂油菜，与不具抗除草剂能力的油菜相比，抗除草剂的油菜能够提高化学农药对油菜种植中的杂草防治效率，降低防治杂草的成本，减少对环境的危害，并使得油菜产量或经济回报更大。选育对特定除草剂具有抗性的油菜品种对我国油菜生产具有重要的意义。
乙酰羟基酸合酶(acetohydroxyacid synthase，AHAS)又称乙酰乳酸合酶(acetolactate syn-thase，ALS)，是支链氨基酸合成起始酶，对植物的生长发育起着重要的作用。AHAS抑制剂类除草剂是以AHAS为靶标开发的除草剂，主要作用机制是通过植物叶片、根茎等部位吸收，与AHAS形成复合物，使支链氨基酸合成受阻，进而影响蛋白质的合成，使植物逐渐黄化、死亡。AHAS抑制剂类除草剂包括磺酰脲类(Sulfonylureas)、咪唑啉酮类(Imidazolinones)、三唑嘧类(Triazolopyrimidines)、嘧啶硫代苯甲酸类(Pyrimidinylthiobenzoates)和磺酰胺羰基三唑啉酮类(Sulfonylaminocarbonyltriazolinones)等五类，其中磺酰脲类(Sulfonylureas)和咪唑啉酮类(Imidazolinones)使用最多。
相关技术中，AHAS1基因第653位密码子发生G/A突变，丝氨酸(Ser)突变为天冬氨酸(Asp)，该SNP位点命名为PM1；AHAS3基因第574位密码子发生G/T突变，色氨酸(Trp)突变为亮氨酸(Leu)，该SNP位点命名为PM2；当PM1和PM2突变堆叠且纯合时，对咪唑啉酮除草剂的耐受性最高。而由于AHAS基因的多拷贝特性，现在文章和专利中筛选相关抗性油菜的分子标记都基于上述SNP位点的SSCP或者CAPS标记，在一定程度上避免了多拷贝的干扰，但SSCP或者CAPS标记通量低，费用高，技术复杂，且耗时，因此一般育种很少用SSCP或者CAPS标记筛选，而直接用除草剂进行筛选。
因此，亟需开发一种检测通量高、特异性强、成本低的鉴定耐咪唑啉酮类除草剂油菜的方法。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一组KASP标记引物组，该组KASP标记引物组灵敏性高、特异性高，能够准确鉴定油菜AHAS1基因及AHAS3基因中PM1和PM2的SNP突变位点。
本发明还提出含上述KASP标记引物组的试剂盒。
本发明还提出含上述KASP标记引物组的基因芯片。
本发明还提出上述KASP标记引物组在鉴定或辅助鉴定耐除草剂油菜中的应用。
本发明还提出上述KASP标记引物组在油菜种质资源改良中的应用。
本发明还提出一种基于上述KASP标记引物组的耐除草剂油菜的鉴定方法。
本发明的第一个方面，提供包括用于检测AHSH1基因的KASP标记引物组BN-PM1.1和BN-PM1.2，用于检测AHSH3基因的KASP标记引物组BN-PM2.1和BN-PM2.2；所述BN-PM1.1的两条特异性引物Primer X1和Primer Y1的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述BN-PM1.2的两条特异性引物Primer X2和Primer Y2的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7所示；所述BN-PM2.1的两条特异性引物Primer X7和Primer Y7的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示；所述BN-PM2.2的两条特异性引物PrimerX8和Primer Y8的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示。
在本发明的一些实施方式中，所述BN-PM1.1和所述BN-PM1.2用于检测AHSH1基因第653位密码子非保守碱基的G/A突变。
在本发明的一些实施方式中，所述BN-PM2.1和所述BN-PM2.2用于检测AHSH3基因第574位密码子非保守碱基的G/T突变。
在本发明的一些实施方式中，所述KASP标记引物组还包括通用引物；所述BN-PM1.1的通用引物Primer C1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述BN-PM1.2的通用引物Primer C2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述BN-PM2.1的通用引物Primer C7的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；所述BN-PM2.2的通用引物Primer C8的核苷酸序列如SEQ IDNO.23所示。
AHAS1基因第653位密码子发生G/A突变，丝氨酸(Ser)突变为天冬氨酸(Asp)，该SNP位点命名为PM1；AHAS3基因第574位密码子发生G/T突变，色氨酸(Trp)突变为亮氨酸(Leu)，该SNP位点命名为PM2。当PM1和PM2均突变且纯合，或PM1和PM2均突变且杂合时，油菜耐受咪唑啉酮类除草剂；当PM1和PM2均突变且纯合时，油菜对咪唑啉酮类除草剂的耐受性最高。
在本发明的一些实施方式中，所述Primer X1和所述Primer Y1分别连接不同的荧光接头序列；所述Primer X2和所述Primer Y2分别连接不同的荧光接头序列；所述PrimerX7和所述Primer Y7分别连接不同的荧光接头序列；所述Primer X8和所述Primer Y8分别连接不同的荧光接头序列。
在本发明的一些实施方式中，所述Primer X1和所述Primer Y1的5’端分别连接不同的荧光接头序列；所述Primer X2和所述Primer Y2的5’端分别连接不同的荧光接头序列；所述Primer X7和所述Primer Y7的5’端分别连接不同的荧光接头序列；所述Primer X8和所述Primer Y8的5’端分别连接不同的荧光接头序列。
在本发明的一些实施方式中，所述荧光接头序列为FAM荧光接头序列或HEX荧光接头序列。
在本发明的一些实施方式中，所述FAM荧光接头序列的核苷酸序列为：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’。
在本发明的一些实施方式中，所述HEX荧光接头序列的核苷酸序列为：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。
在本发明的一些实施方式中，所述BN-PM1.1中的所述Primer X1的5’端连接有FAM荧光接头序列，所述Primer Y1的5’端连接有HEX荧光接头序列；所述BN-PM1.2中的所述Primer X2的5’端连接有FAM荧光接头序列，所述Primer Y2的5’端连接有HEX荧光接头序列；所述BN-PM2.1中的所述Primer X7的5’端连接有FAM荧光接头序列，所述Primer Y7的5’端连接有HEX荧光接头序列；所述BN-PM2.2中的所述Primer X8的5’端连接有FAM荧光接头序列，所述Primer Y8的5’端连接有HEX荧光接头序列。
本发明的第二个方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的KASP标记引物组。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶和dNTPs中的至少一种。
本发明的第三个方面，提供一种基因芯片，所述基因芯片包括本发明第一方面的KASP标记引物组。
本发明的第四个方面，提供本发明第一方面的KASP标记引物组在鉴定或辅助鉴定耐除草剂油菜中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述鉴定的方法为：采用本发明第一方面所述的KASP标记引物组对待测样品进行基因型检测。
在本发明的一些实施方式中，所述除草剂为咪唑啉酮类除草剂。
在本发明的一些实施方式中，所述耐除草剂油菜的基因型为：AHSH1基因第653位密码子非保守碱基仅为A且AHSH3基因第574位密码子非保守碱基仅为T，或AHSH1基因第653位密码子非保守碱基为A和G且AHSH3基因第574位密码子非保守碱基为T和G。
本发明的第五个方面，提供本发明第一方面的KASP标记引物组在油菜种质资源改良中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述种质资源改良的方法为：采用本发明第一方面所述的KASP标记引物组对待测样品进行基因型检测，选择耐除草剂油菜进行后续种质资源改良。
在本发明的一些实施方式中，所述种质资源改良的方法为：采用本发明第一方面所述的KASP标记引物组对待测样品进行基因型检测，选择含有AHSH1基因第653位密码子非保守碱基杂合型油菜和AHSH3基因第574位密码子非保守碱基杂合型油菜进行后续种质资源改良。
本发明的第六个方面，提供一种耐除草剂油菜的鉴定方法，包括以下步骤：
(1)以待测油菜样品基因组DNA为模板，利用本发明第一方面所述的KASP标记引物组进行PCR扩增，获得扩增产物；
(2)对所述扩增产物进行检测与分析，判断所述油菜样品是否为耐除草剂油菜；
所述步骤(1)中，所述KASP标记引物组包括所述BN-PM1.1和所述BN-PM1.2中的至少一种，以及所述BN-PM2.1和所述BN-PM2.2中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述除草剂为咪唑啉酮类除草剂。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤(1)中，所述PCR扩增的扩增程序为：94℃15min；94℃20s，65℃-57℃60s，10个循环，每个循环降低0.8℃；94℃20s，57℃60s，30个循环。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤(1)中，所述待测油菜样品为该油菜植株或其细胞、组织、器官、种子或子代。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤(1)中，所述待测油菜样品为该油菜植株的叶片。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤(1)中，所述待测油菜样品基因组DNA通过试剂盒或CTAB提取法提取。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤(2)中，所述分析的方法为：1)针对所述BN-PM1.1或所述BN-PM1.2的检测结果，若仅检测到所述Primer X对应的荧光信号，则判断所述待测油菜样品AHSH1基因第653位密码子非保守碱基仅为G；若仅检测到所述Primer Y对应的荧光信号，则判断所述待测油菜样品AHSH1基因第653位密码子非保守碱基仅为A；若同时检测到Primer X和Primer Y对应的荧光信号，则判断所述待测油菜样品AHSH1基因第653位密码子非保守碱基为G和A；
2)针对所述BN-PM2.1或所述BN-PM2.2的检测结果，若仅检测到所述Primer X对应的荧光信号，则判断所述待测油菜样品AHSH3基因第574位密码子非保守碱基仅为G；若仅检测到所述Primer Y对应的荧光信号，则判断所述待测油菜样品AHSH3基因第574位密码子非保守碱基仅为T；若同时检测到Primer X和Primer Y对应的荧光信号，则判断待测油菜所述样品AHSH3基因第574位密码子非保守碱基为G和T；
3)结合1)和2)，若所述待测油菜样品AHSH1基因第653位密码子非保守碱基仅为A且AHSH3基因第574位密码子非保守碱基仅为T，或AHSH1基因第653位密码子非保守碱基为A和G且AHSH3基因第574位密码子非保守碱基为T和G，则判断所述待测油菜样品为耐除草剂油菜。
已知油菜中有5个不同的AHAS基因(AHAS1基因、AHAS2基因、AHAS3基因、AHAS4基因和AHAS5基因)，这五个基因具有高度同源性，油菜对咪唑啉酮类除草剂的耐受性来源于AHAS基因中的AHAS1基因(位于C1染色体)和AHAS3基因(位于A1染色体)，A HAS2基因(位于A5染色体)为花、蕾和角果特异表达基因，AHAS4和AHAS5基因为功能缺失基因，无活性。其中AHAS1基因和AHAS3基因两者高度同源，在其编码区内共享98％的核苷酸序列同源性；AHAS2基因与AHAS1基因和AHAS3基因的核苷酸同源性也很高，为85％，氨基酸同源性为75％。因此，得到能有效区别AHAS1基因、AHAS2基因、AHAS3基因，并能鉴定PM1突变和PM2突变的KASP引物组非常难。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一组KASP标记引物组，该组KASP标记引物组特异性高、质量好，能精准、快速、高效、特异地鉴定油菜AHAS1基因及AHAS3基因中PM1和PM2的变异位点。该组KASP标记引物组是基于油菜功能基因AHAS1和AHAS3的突变位点设计的功能性标记，能直接反映植株的抗性。通过组合使用该组KASP标记引物组，可最大限度检测油菜品种中的耐咪唑啉酮类除草剂材料。
本发明提供了一种基于上述KASP标记引物组的鉴定方法，该方法步骤简单、检测结果准确、稳定性好、检测快速，可适用于不同的检测仪器设备。该方法可以以处于不同时期的油菜样本(包括细胞、组织、器官和种子等)的基因组DNA为检测对象，能有效用于AHAS1基因及AHAS3基因PM1和PM2位点突变引起的油菜对咪唑啉酮类除草剂耐药的标记辅助育种，鉴定出耐咪唑啉酮类除草剂油菜以及对咪唑啉酮类除草剂敏感的油菜。相较于传统田间喷洒化学除草剂的鉴定方法，该方法不存在由于遗传交换而导致的错误鉴定，不仅能节约育种成本、减少咪唑啉酮类除草剂的土壤残留，还可大大加速抗咪唑啉油菜品种的选择进程。该方法结合Douglas Array Tape平台使用，具有步骤简单，检测结果准确、重复性和稳定性好，自动化程度高，检测通量高，检测反应体积少(仅0.8μL/反应)等优点。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例中的SNP分子标记开发流程图；
图2为本发明实施例中的BN-PM1.1对45株油菜的分型图；
图3为本发明实施例中的BN-PM1.2对45株油菜的分型图；
图4为本发明实施例中的BN-PM2.1对45株油菜的分型图；
图5为本发明实施例中的BN-PM2.2对45株油菜的分型图；
图6为本发明实施例中的BN-PM1.3对45株油菜的分型图；
图7为本发明实施例中的BN-PM1.4对45株油菜的分型图；
图8为本发明实施例中的BN-PM2.3对45株油菜的分型图；
图9为本发明实施例中的BN-PM2.4对45株油菜的分型图；
图10为本发明实施例中的BN-PM1.5对45株油菜的分型图；
图11为本发明实施例中的BN-PM1.6对45株油菜的分型图；
图12为本发明实施例中的BN-PM2.5对45株油菜的分型图；
图13为本发明实施例中的BN-PM2.6对45株油菜的分型图。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
下列实施例中采用的试剂、方法和设备均为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。
下列实施例中使用的Douglas Array Tape基因型分型平台配套的试剂和耗材均购于英国LGC(Laboratory of the Government Chemist)公司。
KASP引物的设计
该分子标记的设计过程，如图1所示，通过已克隆目标基因AHAS1和AHAS3确定物理位置，提取SNP位点和侧翼序列，设计和合成KASP标记引物，并对标记进行筛选与验证测试。
油菜中有5个不同的AHAS基因(分别为AHAS1基因、AHAS2基因、AHAS3基因、AHAS4基因和AHAS5基因)，其中AHAS2基因、AHAS3基因和AHAS4基因位于A基因组，AHAS1基因和AHAS5基因则位于C基因组，油菜对咪唑啉酮类除草剂的耐受性来源于AHAS基因中的AHAS1基因(位于C1染色体)和AHAS3基因(位于A1染色体)，AHAS2基因(位于A5染色体)为花、蕾和角果特异表达基因，AHAS4和AHAS5基因为功能缺失基因，无活性。其中AHAS1基因和AHAS3基因两者高度同源，在其编码区内共享98％的核苷酸序列同源性；AHAS2基因与AHAS1基因和AHAS3基因的核苷酸同源性也很高，为85％，氨基酸同源性为75％。
AHAS1基因第653位密码子位于油菜C1染色体，PM1的物理位置为20926211，该位点前后的核苷酸序列为5’-AAGAACTCCGAGAAGCTATTCAGACAATGCTGGATACACCAGGACCATACCTGTTGGATGTGATATGTCCGCACCAAGAACATGTGTTACCGATGATCCCAA[A/G]TGGTGGCACTTTCAAAGATGTAATAACAGAAGGGGATGGTCGCACTAAGTACTGAGAGATGAAGCTGGTGATCGATCATATGGTAAAAGACTTAGTTTCAGTTTCCAGTTTCTTTTGTGTGGTAATTTGGGTTTGTCAGTTGTTGTACTACTTTTGGTTGTTCCCAGACGTACTCGCTGTTGTTGTTTTGTTTCCTTTTTCTTTTATATATAAATAAACTGCTTGGGTTTTTTTTCATATGTTTGGGACTCAATGCAAGGAATGCTACTAGACTGCG-3’(SEQ ID NO.1)；AHAS3基因第574位密码子位于油菜A1染色体，PM2的物理位置为12243268，该位点前后的核苷酸序列为5’-TTTTACAAGTACAGGAAGCCGAGGCAGTGGCTGTCGTCCTCAGGACTCGGAGCTATGGGTTTCGGACTTCCTGCTGCGATTGGAGCGTCTGTGGCGAACCCTGATGCGATTGTTGTGGACATTGACGGTGATGGAAGCTTCATAATGAACGTTCAAGAGCTGGCCACAATCCGTGTAGAGAATCTTCCTGTGAAGATACTCTTGTTAAACAACCAGCATCTTGGGATGGTCATGCAAT[T/G]GGAAGATCGGTTCTACAAAGCTAACAGAGCTCACACTTATCTCGGGGACCCGGCAAGGGAGAACGAGATCTTCCCTAACATGCTGCAGTTTGCAGGAGCTTGCGGGATTCCAGCTGCGAGAGTGACGAAGAAAGAAGAACTCCGAGAAGCTATTCAGACAATGCTGGATACACCTGGACCGTACCTGTTGGATGTCATCTGTCCGCACCAAGAACA-3’(SEQ ID NO.2)。由于AHAS基因的多拷贝，使得开发针对上述两个SNP位点的KASP标记引物非常困难。
我们以油菜Darmor--bzh为参考基因组，利用BatchPrimer3软件(http://probes.pw.usda.g ov/batchprimer3/)针对上述两个SNP位点前后150bp的侧翼序列进行引物设计，并做筛选。现提供针对PM1的6组KASP标记引物组BN-PM1.1、BN-PM1.2、BN-PM1.3、BN-PM1.4、BN-PM1.5和BN-PM1.6，针对PM2的6组KASP标记引物组BN-PM2.1、BN-PM2.2、BN-PM2.3、BN-PM2.4、BN-PM2.5和BN-PM2.6，其中BN-PM1.1、BN-PM1.3、BN-PM1.4、BN-PM2.1、BN-PM2.3和BN-PM2.4是针对反义链设计得到，BN-PM1.2、BN-PM1.5、BN-PM1.6、BN-PM2.2、BN-PM2.5和BN-PM2.6是针对正义链设计得到，核苷酸序列具体如表1所示。每组引物由三条引物组成，包括两条特异性引物X(Primer X)和Y(Primer Y)以及一条通用引物C(Primer C)，其中Primer X和Primer Y的5’端分别连接英国LGC公司KASP反应试剂特定的FAM和HEX荧光接头序列。如果样品扩增产物只检测到Primer X对应的荧光信号，则该样品的基因型为纯合型，仅带有等位基因X(Allele X)；如果只检测到Prime r Y对应的荧光信号，则该样品的基因型为纯合型，仅带有等位基因Y(Allele Y)；如果同时检测到Primer X和Primer Y对应的荧光信号，则该样品的基因型为杂合基因型(同时带有Allele X和Allele Y)。
表1
Figure BDA0003547270810000081
Figure BDA0003547270810000091
Figure BDA0003547270810000101
检测油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因AHAS1和AHAS3发生SNP突变的KASP分子标记体系的建立
利用上述实施例设计得到的KASP标记引物组在一个板中对收集到的45份甘蓝型油菜样本进行KASP反应检测。45份甘蓝型油菜样本中，30份为咪唑啉酮类除草剂耐药材料，15份为咪唑啉酮类除草剂感药材料。
1.DNA提取
采用简化CTAB法从油菜叶片中提取基因组DNA。具体包括以下步骤：
(1)取约30mg叶片至1.3mL 96孔板，并置于冻干机中，抽真空12h或以上；
(2)抽真空结束后，使用分珠器向每孔中加入两粒钢珠，并盖上硅胶膜，置于高通量研磨仪中研磨1min，研磨后置于深孔板离心机中瞬离，将磨碎组织离心到孔底；
(3)用移液工作站TECAN向每孔加CTAB提取液700μL，震荡混匀后置于65℃水浴锅中温浴约1-1.5h，每20min将1.3mL 96孔板取出于漩涡振荡器上振荡数次；
(4)温浴结束后取出1.3mL 96孔板，将其置于深孔板冷冻离心机中，4000rpm离心10min；
(5)用移液工作站TECAN将每孔380μL上清转移到新的1.3mL 96孔板中，并加入等体积氯仿，颠倒混匀后静置2min，置于深孔板冷冻离心机中，4000rpm，离心10min；
(6)离心后，用移液工作站TECAN抽取上清液250μL至预先加好250μL异丙醇的0.8mL 96孔板中，漩涡振荡混匀，将其置于-20℃冰箱沉淀1h或以上；
(7)取出0.8mL 96孔板置于深孔板冷冻离心机中，4000rpm，离心15min；
(8)弃掉上清，用移液工作站TECAN向每孔中加入250μL 70％乙醇，漩涡振荡器上振荡数次，5000rpm，离心15min；
(9)弃掉上清，并置于65℃烘箱中30min将其烘干；
(10)每孔加200μL灭菌超纯水，置于室温过夜溶解备用。
2.KASP反应测试
KASP反应测试在Douglas Array Tape平台上进行，Douglas Array Tape平台包括用于PCR扩增体系组装的NEXAR、用于PCR扩增的SOELLEX、用于荧光信号扫描的ARAYA以及用于数据分析的INTELLICS。具体检测步骤如下：
用NEXAR进行PCR扩增体系的自动组装。PCR体系的组分如表2所示。
表2
组分 终含量 体积
100μM Primer C 0.42μM 0.0033μL
100μM Primer X 0.17μM 0.0013μL
100μM Primer Y 0.17μM 0.0013μL
2×KASP Master Mix 1× 0.3945μL
超纯水 / 0.3995μL
DNA(干燥) 20ng-50ng /
总体积 / 0.8μL
在SOELLEX中完成PCR反应。扩增程序为：94℃15min；94℃20s，65℃-57℃60s，10个循环，每个循环降低0.8℃；94℃20s，57℃60s，30个循环。
反应完成后利用ARAYA对KASP反应产物进行荧光数据读取，然后用INTELLICS进行基因型分型和数据分析。样品基因型分为3簇(X簇、Y簇和杂合基因型簇)，若样品扩增产物只检测到Primer X对应的荧光信号，则该样品的基因型为纯合型，仅带有等位基因X，标记为红色，位于左上角，为X簇；如果只检测到Primer Y对应的荧光信号，则该样品的基因型为纯合型，仅带有等位基因Y，标记为蓝色，位于右下角，为Y簇；如果同时检测到Primer X和Primer Y对应的荧光信号，则该样品的基因型为杂合基因型(同时带有等位基因X和等位基因Y)，标记为紫色，为杂合基因簇。
若分析得到该样品AHSH1基因第653位密码子非保守碱基仅为A且AHSH3基因第574位密码子非保守碱基仅为T，或AHSH1基因第653位密码子非保守碱基为A和G且AHSH3基因第574位密码子非保守碱基为T和G，则判断该样品为咪唑啉酮类除草剂耐药材料。否则，该样品为咪唑啉酮类除草剂感药材料。
BN-PM1.1、BN-PM1.2、BN-PM2.1和BN-PM2.2可以将45株材料分为3簇，样本分型明显、紧凑。如图2-5所示。统计分型结果得到表3。
利用BN-PM1.1和BN-PM1.2对45株材料进行KASP检测，BN-PM1.1和BN-PM1.2分析结果相同，共检测到AHAS1基因含有纯合Y等位基因(A:A)的材料27份，AHAS1基因含有纯合X等位基因型(G:G)的材料15份，AHAS1基因含有X和Y杂合等位基因(G:A)的材料3份；利用BN-PM2.1和BN-PM2.2对45株材料进行KASP检测，BN-PM2.1和BN-PM2.2分析结果相同，共检测到AHAS3基因含有纯合Y等位基因(T:T)的材料有27份，A HAS3基因含有纯合X等位基因型(G:G)的材料15份，AHAS3基因含有X和Y杂合等位基因型(G:T)的材料3份。结合BN-PM1.1、BN-PM1.2、BN-PM2.1和BN-PM2.2的分析结果，分析得到30份咪唑啉酮类除草剂耐药材料(包括27份PM1和PM2均突变且纯合的材料和3份PM1和PM2均突变且杂合的材料)和15份咪唑啉酮类除草剂感药材料(15份PM1和PM2均未突变的材料)，且上述分析结果与45份材料对唑啉酮类除草剂的耐药或感药特性完全对应。如表3所示。
因此，利用BN-PM1.1、BN-PM1.2、BN-PM2.1和BN-PM2.2可以有效区分咪唑啉酮类除草剂耐药材料和咪唑啉酮类除草剂感药材料，并区分出PM1和PM2均突变且纯合的咪唑啉酮类除草剂耐药材料，以及PM1和PM2均突变且杂合的咪唑啉酮类除草剂耐药材料。
BN-PM1.3、BN-PM1.4、BN-PM1.5、BN-PM1.6、BN-PM2.3、BN-PM2.4、BN-PM2.5和BN-PM2.6分型散乱，无法将45株材料分为3簇，即无法有效区分咪唑啉酮类除草剂耐药材料和咪唑啉酮类除草剂感药材料。如图6-13所示。
表3
Figure BDA0003547270810000121
Figure BDA0003547270810000131
上述实施例表明，结合BN-PM1.1、BN-PM1.2、BN-PM2.1和BN-PM2.2的分析结果能准确鉴别咪唑啉酮类除草剂耐药/感药材料，且能避免多拷贝的影响，准确鉴定PM1和PM2的基因型，具有很好的特异性。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
序列表
<110> 华智生物技术有限公司
<120> 鉴定耐咪唑啉酮类除草剂油菜的KASP标记引物、试剂盒及其应用
<160> 31
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 380
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aagaactccg agaagctatt cagacaatgc tggatacacc aggaccatac ctgttggatg 60
tgatatgtcc gcaccaagaa catgtgttac cgatgatccc aaatggtggc actttcaaag 120
atgtaataac agaaggggat ggtcgcacta agtactgaga gatgaagctg gtgatcgatc 180
atatggtaaa agacttagtt tcagtttcca gtttcttttg tgtggtaatt tgggtttgtc 240
agttgttgta ctacttttgg ttgttcccag acgtactcgc tgttgttgtt ttgtttcctt 300
tttcttttat atataaataa actgcttggg ttttttttca tatgtttggg actcaatgca 360
aggaatgcta ctagactgcg 380
<210> 2
<211> 455
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttttacaagt acaggaagcc gaggcagtgg ctgtcgtcct caggactcgg agctatgggt 60
ttcggacttc ctgctgcgat tggagcgtct gtggcgaacc ctgatgcgat tgttgtggac 120
attgacggtg atggaagctt cataatgaac gttcaagagc tggccacaat ccgtgtagag 180
aatcttcctg tgaagatact cttgttaaac aaccagcatc ttgggatggt catgcaattg 240
gaagatcggt tctacaaagc taacagagct cacacttatc tcggggaccc ggcaagggag 300
aacgagatct tccctaacat gctgcagttt gcaggagctt gcgggattcc agctgcgaga 360
gtgacgaaga aagaagaact ccgagaagct attcagacaa tgctggatac acctggaccg 420
tacctgttgg atgtcatctg tccgcaccaa gaaca 455
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gttattacat ctttgaaagt gccaccat 28
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
attacatctt tgaaagtgcc accac 25
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccaggaccat acctgttgga tgtg 24
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaacatgtgt taccgatgat cccaaa 26
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aacatgtgtt accgatgatc ccaag 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtacttagtg cgaccatccc cttct 25
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tattacatct ttgaaagtgc caccat 26
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gctggataca ccaggaccat acctg 25
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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attacatctt tgaaagtgcc accat 25
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aggaccatac ctgttggatg tgatatg 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aacatgtgtt accgatgatc ccaaa 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gtgcgaccat ccccttctgt tatta 25
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acatgtgtta ccgatgatcc caaa 24
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acatgtgtta ccgatgatcc caag 24
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cacacaaaag aaactggaaa ctgaaac 27
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gttagctttg tagaaccgat cttcca 26
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
agctttgtag aaccgatctt ccc 23
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aaccctgatg cgattgttgt ggac 24
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
agcatcttgg gatggtcatg caatt 25
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
catcttggga tggtcatgca atg 23
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
atgacatcca acaggtacgg tcca 24
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tagctttgta gaaccgatct tcca 24
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
attgttgtgg acattgacgg tga 23
<210> 26
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gttagctttg tagaaccgat cttccc 26
<210> 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttttacaagt acaggaagcc gagg 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agcatcttgg gatggtcatg caatg 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caacaggtac ggtccaggtg tatcc 25
<210> 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gcatcttggg atggtcatgc aatt 24
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tgcggacaga tgacatccaa cagg 24

Claims (10)

1.一组KASP标记引物组，其特征在于，包括用于检测AHSH1基因的KASP标记引物组BN-PM1.1和BN-PM1.2，用于检测AHSH3基因的KASP标记引物组BN-PM2.1和BN-PM2.2；
所述BN-PM1.1的两条特异性引物Primer X1和Primer Y1的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示；
所述BN-PM1.2的两条特异性引物Primer X2和Primer Y2的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7所示；
所述BN-PM2.1的两条特异性引物Primer X7和Primer Y7的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.18和SEQ ID NO.19所示；
所述BN-PM2.2的两条特异性引物Primer X8和Primer Y8的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.21和SEQ ID NO.22所示。
2.根据权利要求1所述的KASP标记引物组，其特征在于，所述KASP标记引物组还包括通用引物；
所述BN-PM1.1的通用引物Primer C1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述BN-PM1.2的通用引物Primer C2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述BN-PM2.1的通用引物Primer C7的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；
所述BN-PM2.2的通用引物Primer C8的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示。
3.根据权利要求1所述的KASP标记引物组，其特征在于，所述Primer X1和所述PrimerY1分别连接不同的荧光接头序列；
所述Primer X2和所述Primer Y2分别连接不同的荧光接头序列；
所述Primer X7和所述Primer Y7分别连接不同的荧光接头序列；
所述Primer X8和所述Primer Y8分别连接不同的荧光接头序列。
4.根据权利要求3所述的KASP标记引物组，其特征在于，所述荧光接头序列为FAM荧光接头序列或HEX荧光接头序列。
5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-4任一项所述的KASP标记引物组。
6.一种基因芯片，其特征在于，所述基因芯片包括权利要求1-4任一项所述的KASP标记引物组。
7.权利要求1-4任一项所述的KASP标记引物组在鉴定或辅助鉴定耐除草剂油菜中的应用。
8.权利要求1-4任一项所述的KASP标记引物组在油菜种质资源改良中的应用。
9.一种耐除草剂油菜的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以待测油菜样品基因组DNA为模板，利用权利要求1-4任一项所述的KASP标记引物组进行PCR扩增，获得扩增产物；
(2)对所述扩增产物进行检测与分析，判断所述油菜样品是否为耐除草剂油菜；
所述步骤(1)中，所述KASP标记引物组包括所述BN-PM1.1和所述BN-PM1.2中的至少一种，以及所述BN-PM2.1和所述BN-PM2.2中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述分析的方法为：
1)针对所述BN-PM1.1或所述BN-PM1.2的检测结果，若仅检测到所述Primer X对应的荧光信号，则判断所述待测油菜样品AHSH1基因第653位密码子非保守碱基仅为G；若仅检测到所述Primer Y对应的荧光信号，则判断所述待测油菜样品AHSH1基因第653位密码子非保守碱基仅为A；若同时检测到Primer X和Primer Y对应的荧光信号，则判断所述待测油菜样品AHSH1基因第653位密码子非保守碱基为G和A；
2)针对所述BN-PM2.1或所述BN-PM2.2的检测结果，若仅检测到所述Primer X对应的荧光信号，则判断所述待测油菜样品AHSH3基因第574位密码子非保守碱基仅为G；若仅检测到所述Primer Y对应的荧光信号，则判断所述待测油菜样品AHSH3基因第574位密码子非保守碱基仅为T；若同时检测到Primer X和Primer Y对应的荧光信号，则判断待测油菜所述样品AHSH3基因第574位密码子非保守碱基为G和T；
3)结合1)和2)，若所述待测油菜样品AHSH1基因第653位密码子非保守碱基仅为A且AHSH3基因第574位密码子非保守碱基仅为T，或AHSH1基因第653位密码子非保守碱基为A和G且AHSH3基因第574位密码子非保守碱基为T和G，则判断所述待测油菜样品为耐除草剂油菜。
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