CN105462964B - 水稻中胚轴延长特性相关的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业生物技术领域，涉及与水稻中胚轴延长特性相关的分子标记，该分子标记的SNP位点对应水稻基因组参考日本晴序列3号染色体上第315682836个核苷酸位点G>A突变，该位点的突变与水稻中胚轴延长特性有显著的相关性。本发明涉及到的230份水稻品种中含有该突变位点的中胚轴延长长度大于0.95cm，尤其是中胚轴延长长度最长的5个品种中都含有该位点，而延长长度小于0.95cm的203份品种都没有该突变位点，因此该位点可以作为水稻中胚轴遗传改良的分子标记。本发明的有益效果在于：运用全基因重测序的方法，能够快速地筛选与水稻中胚轴延长性状相关的分子标记，这个位点能够作为遗传标记用于水稻中胚轴延长特性的遗传改良。

Description

水稻中胚轴延长特性相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，涉及与水稻中胚轴延长特性相关的分子标记，具体涉及到水稻3号染色体上一个与水稻中胚轴延长特性相关的分子标记。

背景技术

随着旱直播水稻在雨育田和缺水地区的推广应用，具有抗旱能力的水稻品种可以采用机械化旱直播、免耕直播等环保、节约生产成本的新型栽培方式(Bhushan 2007)。由于直播用种量大，造成成本上升，尤其是杂交稻组合的种子价格较高，制约了机械化旱直播的进一步推广应用。旱直播水稻出苗是否快速整齐，是制约产量潜力和田间管理的因素之一，而机械化直播中覆土深度的控制有重要作用同时也有技术难度。水稻种子在黑暗条件下萌发时，除胚芽鞘伸长外，中胚轴的延长是影响深直播水稻种子顶土出苗能力的主要因素之一(张光恒2005)。中胚轴是指胚根着生点到胚芽鞘节之间的部分，中胚轴延长的品种，出苗速度快，出苗率高。研究表明水稻中胚轴延长特性有助于种子从较深土层下快速、整齐地出面。

水稻中胚轴延长受多个遗传因子和环境因子的影响。中胚轴延长能力在半矮秆水稻品种中能够稳定的遗传(Dilday et al.1990)。林建荣等(2006)发现水稻中胚轴伸长特性受2对隐性基因控制。随着以分子标记连锁图谱为基础的QTL分析技术的发展，该技术已成为研究复杂性状遗传机制的主要手段之一。Redona和Mackill(1996)利用Labelle和BlackGora籼粳交F₂群体构建的连锁图谱共检测到控制中胚轴长度的5个QTL，位于第1、3、5、7号染色体上，并认为该性状存在基因型与环境互作。Katsuta-Seki等(1996)利用Daorenqiao和Surjumkhi的F2:3家系，在第3、6、11号染色体上定位了3个控制中胚轴长度的QTL。曹立勇等(2002)利用籼稻IR64与粳稻Azucena杂交的F₁代花粉离体培养获得的DH群体定位了控制中胚轴长度的8个QTL，分别位于第1、3、6、7、8、12染色体上，也认为该性状存在基因型与环境互作。黄成等(2010)利用沈农265(长中胚轴)和丽江新团黑谷(短中胚轴)的RIL群体构建的连锁图谱，对水和赤霉素两种培养条件下的中胚轴长度进行QTL定位，共检测到控制中胚轴长度的5个QTL,分布在第1、2、3、6、11号染色体上；与其他研究比较发现，主效基因qML3可以在不同群体和不同环境下稳定表达。Lee等(2012)在两次独立的试验中利用Kasalath和日本晴的BIL群体构建的连锁图谱，定位了5个控制中胚轴长度的QTL，分别位于第1、3、7、9、12号染色体上，并精细定位了在这两次试验中都能检测到qMel-1和qMel-3。

近年来，随着新一代高通量测序技术的发展，利用重测序技术对种质资源的基因型进行鉴定更加方便、快捷、成本低，关联分析在水稻研究中也取得很大进步。特别是中国科学家(黄学辉等2010，2011，2012)已经完成上千份水稻种质资源的重测序工作，并且用这些种质资源组成的自然群体进行全基因组关联分析(GWAS)，获得许多重要性状的关联位点，同时也验证了关联分析方法可靠性。

本发明选择的全基因组重测序群体材料由270份水稻微核心种质资源和旱稻种质资源合并组成。从中筛选出与水稻中胚轴延长特性相关的SNPs(single nucleotidepolymorphisms，单核苷酸多态性)位点作为遗传标记用于水稻遗传育种，以增加短中胚轴水稻品种的中胚轴延长长度，进而提高水稻旱直播的出苗率。

发明内容

本发明的目的是提供一个与水稻中胚轴延长特性相关的分子标记。

技术方案为，一种水稻中胚轴延长特性相关的分子标记，SNP位点以日本晴序列水稻基因组为基准，位于3号染色体上第15682836个核苷酸位点，等位基因为A和G，发生G>A突变，该位点的突变与水稻中胚轴延长特性有显著的相关性。

本发明选择的全基因组重测序群体材料由230份水稻微核心种质资源和旱稻种质资源合并组成。重测序数据参考日本晴基因组(Rice Genome Annotation ProjectRelease 6.1)进行比对，利用SAMTools软件进行SNPs位点的提取，共获得10198834个SNPs位点。群体材料在两种培养条件下测定水稻中胚轴延长长度，一种是在25度、水培黑暗条件下发芽10天；另外一种是沙培条件下种子上面覆盖5cm厚的沙子。黑暗水培发芽全基因组关联共获得13个显著性关联位点，3个位于1号染色体、3个位于3号染色体、1个位于4号染色体、2个位于5号染色体、2个位于6号染色体、2个位于9号染色体；沙培有4个显著性关联位点，分别位于3、6以及10号染色体。在这两种培养环境都检测到的关联位点有2个位于3号染色体、1个位于6号染色体。

但是在这三个显著性关联位点中，230份水稻品种检测结果显示，凡是在3号染色体上这个位点Chr3:15682836发生G>A突变的水稻品种的中胚轴延长长度均大于0.95cm，尤其是中胚轴延长长度最长的5个品种(扎西马、云陆8号、麻谷子、八月糯以及豪海)中都具有该位点，而延长长度小于0.95cm的203份品种中都没有该突变位点，因此该位点与水稻中胚轴延长特性有关，其等位基因为A和G，因此该位点可以作为短中胚轴水稻品种的中胚轴遗传改良的分子标记，中胚轴延长最长5个水稻品种可以作为水稻中胚轴遗传改良的亲本。

本发明的有益效果在于：运用全基因重测序的方法，能够快速地筛选与水稻中胚轴延长性状相关的分子标记，这个位点能够作为遗传标记用于水稻中胚轴延长特性的遗传改良。

本发明的有益效果在于：运用全基因组重测序方法，能够快速、批量地筛选与性状相关的分子标记或候选基因，基因版本参考日本晴序列Chr3：15682836这个位点能够作为遗传标记用于水稻中胚轴遗传改良，从而提高水稻旱直播出苗率。

附图说明

图1为实施例2水稻品种群体黑暗发芽中胚轴延长特性的全基因组关联定位分析结果

图2为实施例2水稻品种群体沙培中胚轴延长特性的全基因组关联定位分析结果

图3为实施例3水稻品种群体的第1、2主成分分析结果

具体实施方案

实施例1水稻中胚轴长度测定

本发明所选择的水稻中胚轴长度测定的230份品种是由水稻微核心种质资源和旱稻种质资源合并组合。群体材料在两种培养环境下测定中胚轴的延长长度。

一是挑选饱满一致的水稻种子20粒，先用3％的双氧水消毒30分钟，然后用自来水清洗3次，将种子均匀放置在垫有一层滤纸和一层海绵的塑料发芽盒里(长×宽×高＝12×12×2cm)。

发芽盒放在25度培养箱中黑暗培养10天，挑选长势正常、大小一致5株苗测定中胚轴延长长度，群体中胚轴延长长度变异丰富，从几乎不延长到最长延长5.05cm，26个水稻品种中胚轴延长长度大于1.0cm，29个品种中胚轴延长长度在0.5-1.0cm之间，其余水稻品种中胚轴延长长度小于0.5cm(如表1)。

二是沙培试验，定做无底无盖的不锈钢盒子(长x宽x高＝90x30x30cm)，先在盒子底部铺上一层5cm厚的沙子，行行之间间距为5厘米，每份品种播种一行，播种在沙子表面，每行播种12粒，然后再在上面轻轻的覆盖5厘米厚的沙子，向沙子表面喷洒水至盒子底部有水渗透出来，培养10天后从沙子中取出水稻苗来测定中胚轴延长长度。不锈钢盒子放置在温室中，温室温度变化范围为20-38度，而沙子里的温度变化范围20-31度，沙培条件下中胚轴延长长度变异范围是0-2.05cm(如表1)。

两种培养条件下中胚轴延长长度有很高的相关性(r＝0.784)，结果如表1～表。230份水稻品种中中胚轴延长最长的5个品种分别是扎西马、云陆8号、麻谷子、八月糯以及豪海，这五个水稻品种可作为水稻中胚轴遗传改良的亲本。

实施例2全基因组重测序以及SNP检验

根据实施例1中胚轴延长特性，进行全基因组重测序以及SNP检验。

本发明所选择的研究群体的重测序是用Solexa Hiseq 2000系统，采用Burrows-Wheeler aligner(BWA version 0.7.5a；li&Durbin,2009)方法和默认设定，把原始测序数据比对到日本晴参比基因组(MSU6.0)。用SAMtools v0.1.19(http://sourceforge.net)把比对结果从SAM格式转换成排序、索引的BAM文件，利用samtools mpileup、bcftools view和vcfutils.pl varFilter等命令从BAM文件读取SNPs和InDels。然后利用华中农业大学谢为博博士提供的自定义脚本和相同的参数设定(-q 0 –m 20 –e 1 –E 0.1 –l 0.2 –t 8)，对SNPs进行过滤，共计获得1449945个位点的SNP数据。利用自编的脚本程序提取上述数据与水稻微核心种质SNP数据的交集，并进行5％以下稀有等位基因的筛除，最终获得合并群体的大约10198834个位点的SNP基因型数据。

为了验证所提取的SNP位点的可靠性，从研究群体中抽取24份品种提交中国种子集团生命科学技术中心进行高密度水稻SNP芯片检测。24份材料重测序提取的SNP和SNP微阵列两者都有的SNP位点有10851个。排除一些在重测序提取或者微阵列中缺失的SNP位点，24份材料有效的SNP位点数变化从8313到10746。以重测序提取的SNP和微阵列检测到一致的SNP位点数量占两者共同的SNP位点数量的百分比作为准确率，准确率从97.01％到99.53％，平均准确率为98.41％。因此，本发明所用的重测序提取的SNP数据是准确、可靠的。

实施例3全基因组关联分析(GWAS)

使用R软件包中混合线性模型来估算群体结构和全基因组关联作图。获得的1449945个高质量SNP位点来分析群体的遗传结构。对合并后群体进行群体结构分析，可观察到明显的两个亚群体，分别对应于籼稻(Indica)和粳稻(japonica)亚种，在籼稻亚群体内有分成两个亚亚群体的趋势(图3)。

水培黑暗发芽10天后测量的中胚轴长度数据进行全基因组关联分析，结果如图1，关联定位(MLM；GAPIT；Likpa et al.2012)检测到13个-log10(P)值高于8的关联SNP位点与中胚轴延长长度有显著的关联性，这些位点分别位于水稻6条染色体上，1号染色体上有3个位点、3号染色体有3个、4号染色体1个、5、6以及9号染色体各2个位点。跟水培黑暗发芽相比，沙培全基因组关联定位仅仅既拿到4个3个-log10(P)值高于8的关联SNP位点，两个位点位于3号、6号以及10号染色体上个有一个位点，结果如图2。两种培养条件下都检测到的位点是3号染色体上有2个，6号染色体上有1个。然而三个位点中只有3号染色体上Chr3:15682836这个位点在中胚轴延长长度大于0.95cm的品种中检测到，尤其是在中胚轴延长最长的5个品种(扎西马、云陆8号、麻谷子、八月糯以及豪海)中都有该位点，而在中胚轴延长长度小于0.94cm的所有材料种都没有检测到该SNP位点。因此该SNP位点可以作为水稻中胚轴遗传改良的分子标记。该位点的突变及中胚轴延长长度见表1。

表1各品种中胚轴延长长度及SNP位点

Claims (1)

1.一种通过检测分子标记的方法在水稻中胚轴延长特性遗传改良中的应用，其特征在于，以日本晴序列为基准，所述的分子标记位于Chr3：15682836，等位基因为A和G，所述分子标记为G>A突变。

Images