CN112322770A - 一种鉴定辣椒分枝类型的分子标记及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种鉴定辣椒分枝类型的分子标记，该分子标记的正向引物序列为：5′–GGTTGAAGTTAATGGTGGTG–3′，反向引物序列为：5′–CTGTCGTAAAAGGAATAGCC–3′。分子标记用于辣椒分枝类型辅助育种中的应用。该应用的具体方法包括以下步骤：步骤一，提取待测辣椒样品的DNA；步骤二，以步骤一提取的DNA为模板，根据分子标记进行PCR扩增；步骤三，采用质量分数为1％的琼脂糖凝胶电泳检测步骤二得到的PCR产物，获得条带的长度，根据条带的长度来判断辣椒分枝类型的结果。本发明利用该标记对F2群体中的单株以及不同辣椒品种进行基因型鉴定，符合率达到100％。同时，利用该标记对24份不同分枝类型辣椒品种或育种品系的分枝类型进行鉴定，符合率为100％。

Description

一种鉴定辣椒分枝类型的分子标记及应用
技术领域
本发明属于蔬菜育种技术领域，涉及辣椒，具体涉及一种鉴定辣椒分枝类型的分子标记及应用。
背景技术
辣椒(Capsicum annuum L.)属于茄科植物，是一种具有悠久历史的蔬菜作物。近年来我国辣椒年播种面积在150万-200万hm2，目前已经占全国蔬菜总播种面积的8％-10％，整个蔬菜生产中具有重要地位。辣椒在我们的日常生活中有很多的应用，它不仅用于制药、天然色素、化妆品、防御驱避剂，提供多种对人类健康所必需的维生素、矿物质和营养素，还用作观赏植物。植物株型是一个重要的农艺性状，每一种植物都有其独特的外观和结构特征，使我们能够识别、区分和分类它们。这些独特的外观是由生理和遗传因素共同决定的。农作物株型对其生长和产量有着至关重要的影响，如小麦和水稻的半水稻矮化株型，能够显著提高产量(Peng J,Richards DE,Hartley NM,Murphy GP,Devos KM,Flintham JE,Beales J,Fish LJ,Worland AJ,Pelica F(1999)‘Green revolution’genes encodemutant gibberellin response modulators.Nature 400:256–261)。近年来，选育优秀的农作物株型已成为许多作物育种的重要目标。
辣椒的株型主要由其分枝类型、分枝夹角、节间长度等决定，而分枝类型可以分为有限分枝和无限分枝(李锡香,张宝玺,沈镝,等.辣椒种质资源描述规范和数据标准[M].北京:中国农业出版社,2006.)：有限分枝表现为植株矮小，下部的叶芽，萌发分支，分枝的顶芽形成花簇而封顶，每个花簇的花数多，结果多而小；无限分枝表现为双叉或三叉分枝。一般在主茎长处7-18叶时，茎的顶端形成花芽，花芽下部的腋芽在萌生2-3个腋芽，腋芽的顶端又形成花芽。分枝的类型对于辣椒株型的构建发挥着主要作用，株型相关的辣椒育种成为了重要的育种方向之一。在实际辣椒育种或者种质资源鉴定中，在辣椒分枝期(发芽2个月以后)才能观察到辣椒的分枝性状，大大耗费人力和时间，而分子标记辅助育种技术作为当前育种工作的重要辅助手段，其关键就是开发出高效的分子标记。本发明的分子标记可以对辣椒种子或者早期辣椒幼苗进行分子标记鉴定，能够准确鉴别其分枝方式。因此，开发辣椒分枝类型的分子标记，能极大的提高育种中选择的准确性和效率，显著缩短育种周期，有效的减少人力和物力的消耗。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于，提供一种鉴定辣椒分枝类型的分子标记及应用，解决现有技术中的鉴定辣椒分枝类型的方法分辨率和稳定性不足的技术问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案予以实现：
一种鉴定辣椒分枝类型的分子标记，该分子标记的正向引物序列为：5′–GGTTGAAGTTAATGGTGGTG–3′，序列见SEQ ID NO.1；反向引物序列为：5′–CTGTCGTAAAAGGAATAGCC–3′，序列见SEQ ID NO.2。
本发明还具有如下技术特征：
如上所述的鉴定辣椒分枝类型的分子标记用于辣椒分枝类型辅助育种中的应用。
具体的，该应用的具体方法包括以下步骤：
步骤一，提取待测辣椒样品的DNA；
步骤二，以步骤一提取的DNA为模板，根据分子标记进行PCR扩增；
所述的PCR的反应程序中的退火温度为56℃～64℃；
步骤三，采用质量分数为1％的琼脂糖凝胶电泳检测步骤二得到的PCR产物，获得条带的长度，根据条带的长度来判断辣椒分枝类型的结果。
所述的PCR采用10μL反应体系：包括10-100ng模板DNA 1-2μL，浓度10μmol/L正、反向引物各0.5μL，2.5mM dNTPs 0.2μL，10×
Figure BDA0002795299480000031
Buffer 1μL,
Figure BDA0002795299480000032
DNAPolymerase 0.1μL及适量ddH2O。
所述的PCR的反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，根据引物的退火温度复性30s，72℃延伸2min，30次循环后72℃延伸10min；4℃存储。
优选的，所述的退火温度为56℃～64℃。
最优选的，退火温度为60℃。
若PCR产物存在1760bp条带，则待测辣椒样品为无限分枝；若PCR产物只存在2621bp条带，则待测辣椒样品为有限分枝。
存在1760bp条带的PCR产物的序列见SEQ ID NO.3，只存在2621bp条带的PCR产物的序列见SEQ ID NO.4。
本发明与现有技术相比，具有如下技术效果：
(Ⅰ)本发明利用辣椒无限分枝品种与有限分枝品种为试验材料构建F2代遗传群体。利用BSA群体定位方法获得与辣椒分枝方式基因紧密连锁的染色体，在此染色体内通过图位克隆的方法获得了控制辣椒分枝方式的候选基因。根据DNA片段的插入突变设计了1个分子标记，利用该标记对F2群体中的单株以及不同辣椒品种进行基因型鉴定，符合率达到100％。同时，利用该标记对24份不同分枝类型辣椒品种或育种品系的分枝类型进行鉴定，符合率为100％。本发明能够实现辣椒分支方式的快速检测，且本发明分子标记和方法通用性好、操作简单、稳定性好，为辣椒新品种的选育提供分子辅助选择手段，具有广泛的推广价值。
(Ⅱ)本发明的能够直接对辣椒种子或者辣椒芽苗期幼苗提取的DNA进行PCR扩增，通过1％琼脂糖凝胶电泳直接鉴定样本的分枝类型，能够有效的减少人力和物力的消耗。该应用方法分辨率更好、稳定可靠、简单高效，它可以直接用于辣椒植物种质鉴定，为遗传育种提供有利的技术支持。
(Ⅲ)本发明操作过程实用性高：本发明设计的检测引物，对样本进行PCR扩增和常规的琼脂糖凝胶电泳后即可判断结果，其中琼脂糖凝胶电泳较聚丙烯酰胺凝胶电泳而言方法简单、快速、实用，并且无需对扩增的产物进行限制性内切酶酶切。
(Ⅳ)检测结果准确度高：本发明已对辣椒不同种质资源进行了检测，经过多次重复检测，检测结果高度的可靠性，准确率到达100％。
(Ⅴ)检测结果灵敏度高：对待测辣椒样品DNA浓度可PCR扩增范围较大，10-200ng均可准确鉴定其所属分枝类型。
(Ⅵ)PCR产物特异性高：主带清晰，几乎没有副带，非常容易辨别记录。
(Ⅶ)本发明分子标记和应用方法操作过程简单、结果准确灵敏、稳定性好，具有很好的应用前景，本发明的应用方法的推广应用将对辣椒产业的生产发展起到积极的推动作用。
附图说明
图1为辣椒的两种分枝类型，其中左图为无限分枝，右图为有限分枝。
图2为分子标记在亲本、F1代及F2代群体单株中的扩增结果。“茄门甜椒”为无限分枝亲本；“GS6”为有限分枝亲本；F1为“茄门甜椒”和“GS6”杂交后代单株；F2代群体单株为F1自交后代；M为DNA Marker，自下到上条带大小依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp、3000bp、5000bp、8000bp。
图3为分子标记在24份不同分枝类型辣椒品种或育种品系中的验证结果。从左至右依次为茄门甜椒、CM334、Zunla、AA3、R9、P70、A3、Y3、AA5、R24、R25、R30、B85、B86、Z1、EC、GS6、GS4、1702、1703、1920、G2、G1、2-2。其中辣椒茄门甜椒、CM334、Zunla为本申请之前业界熟知品种，其它辣椒样本为本申请的育种选系。
以下结合实施例对本发明的具体内容作进一步详细解释说明。
具体实施方式
需要说明的是，本发明中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
需要说明的是，本发明中的PCR是聚合酶链式反应的简称。
需要说明的是，本发明中的PCR的反应体系中的PCR成分均购于北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司，目录号：AP111。
需要说明的是，本发明中的待测辣椒样品为辣椒种子或辣椒幼苗。
需要说明的是，经申请人的多次试验证明，本发明适宜于现有的辣椒品种(系)和育种系。
进一步需要说明地是，下述实施例中涉及到的不同分枝类型辣椒品种或育种品系均为本申请之前业界熟知品种、已经公开的辣椒品系或已经公开的本发明的育种选系。
待测辣椒样品“茄门甜椒”是由上海市农业科学院园艺研究所从国外引进选出，审定(登记)编号：浙品认字第116号；审定(登记)年份：1987。
待测辣椒样品CM334参见Zhang H-X,Jin J-H,He Y-M,Lu B-Y,Li D-W,Chai W-G,Khan A and Gong Z-H,Genome-wide identification and analysis of the SBP-Boxfamily genes under phytophthora capsicistress in pepper(Capsicum annuum L.).Frontiers in Plant Science,2016,7:504。
待测辣椒样品Zunla参见Whole-genome sequencing of cultivated and wildpeppers provides insights into Capsicum domestication and specialization.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111,5135–5140.doi:10.1073/pnas.1400975111。
待测辣椒样品AA3参见Zhang H-X,Jin J-H,He Y-M,Lu B-Y,Li D-W,Chai W-G,Khan A and Gong Z-H,Genome-wide identification and analysis of the SBP-Boxfamily genes under phytophthora capsicistress in pepper(Capsicum annuum L.).Frontiers in Plant Science,2016,7:504。
待测辣椒样品R9参见Guo M,Liu J-H,Lu J-P,Zhai Y-F,Wang H,Gong Z-H,WangS-B and Lu M-H，Genome-wide analysis of the CaHsp20 gene family in pepper:comprehensive sequence and expression profile analysis under heatstress.Frontiers in Plant Science,2015,6:806。
待测辣椒样品P70参见Guo W-L,Wang S-B,Chen R-G,Chen B-H,Du X-H,Yin Y-X,Gong Z-H and Zhang Y-Y.Characterization and expression profile of CaNAC2pepper gene.Frontiers in Plant Science.2015,6:755。
待测辣椒样品A3、AA5参见陈儒钢,刘珂珂,巩振辉,张莹丽,李大伟.疫霉菌侵染后辣椒生理生化指标研究[J].北方园艺,2010(18):1-5。
待测辣椒样品Y3参见张淮霞.辣椒SBP-box基因家族分析及CaSBP11和CaSBP12基因功能的鉴定[D].西北农林科技大学,2016。
R24、R25和R30分别是从世界蔬菜发展中心引进的SZECHWAN 9、PASILLA和PBC932的选系。
待测辣椒样品B85、B86参见乔廼妮,巩振辉,樊红科,李大伟,黄炜,张菊平.辣椒果实数量性状的因子分析[J].西北农业学报,2006(05):177-181.
待测辣椒样品Z1参见Zhang R X,Cheng G X,Liu G T,et al.Assessing thefunctional role of color-related CaMYB gene under cold stress using virus-induced gene silencing in the fruit of pepper(Capsicum annuum L.)[J].ScientiaHorticulturae,2020:109504.
待测辣椒样品EC参见李永新,巩振辉,李大伟,陈儒钢.辣椒疫病抗性相关的共显性RGA-STS标记的开发及应用[J].西北农业学报,2011,20(06):123-127.
待测辣椒样品“GS6”参见许红娟,巩振辉,贾志银,黄炜,李大伟,逯明辉,陈儒钢.不同遮荫度对观赏辣椒苗期形态和生理生化指标的影响[J].北方园艺,2010(14):1-4.
待测辣椒样品GS4、1702、1703、1920、G2、G1、2-2参见许红娟,巩振辉,贾志银,黄炜,李大伟,逯明辉,陈儒钢.遮荫对观赏辣椒结果期生长发育的影响[J].-西北农业学报,2011,20(01):137-141.
本发明利用分子标记快速鉴定辣椒分枝类型的一种方法，特别是涉及在辣椒育种中的应用，以及未知分枝类型辣椒种质资源的分枝类型鉴定的方法。该方法可以利用辣椒种子对辣椒种质资源的分枝类型鉴定，或者在辣椒苗芽期对其分枝类型进行早期的鉴定和筛选，是一种操作简单、快速、有效鉴定大量辣椒种质资源(株系，或单株)分枝特性的方法，能够节省育种时间，极大的加快了辣椒育种进程。
分子标记已广泛应用于遗传图谱构建、品种指纹图谱绘制、品种纯度检测及目标性状分子标记筛选等领域，主要的分子标记技术包括SSR、Indel、AFLP、SNP标记等。很多应用与某一生物性状的标记主要为与目标性状紧密连锁的分子标记，而本发明的分子标记是以调控辣椒分枝类型基因开发的，根据其基因插入突变开发的高效、稳定的Indel分子标记。标记的质量主要由分子标记引物和PCR程序决定。围绕突变位点的分子标记开发，我们前期实验中设计了10多对引物，从中筛选出了结果准确度高、灵敏度高以及PCR产物特异性高的一对引物，即本发明的一对分子标记引物。
适宜的PCR退火温度是扩增的首要条件，过低的退火温度致使引物与模板不能结合，因此适宜的退火温度对于PCR扩增的效率至关重要。前期，我们试验表明，56℃～64℃均能够有比较理想的PCR产物，但是过低的退火温度(低于54℃)，致使PCR效率过低，出现PCR无产物或者产物特异性差、条带弥散等情况。其次，延伸时间也是PCR产物完整的重要条件。本发明扩增产物最长可达到2621bp，属于较长PCR产物，因此，必须有充分的延伸时间，保证目的条带在DNA聚合酶的作用下扩增延伸。试验发现，没有充分的延伸时间会导致目的条带扩增不完全，那么得到的PCR产物会出现弥散现象，严重影响试验结果的判定。
(一)辣椒分枝类型遗传规律调查：
本试验母本为GS6(有限分枝)，父本1为茄门甜椒(无限分枝)、父本2为GS5(无限分枝)，无限分枝和有限分枝类型详见附图1。GS6分别与茄门甜椒和GS5杂交获得F1代，然后各自F1代自交获得2个F2代分离群体GQ群体(GS6×茄门甜椒)和G56群体(GS6×GS5)。GQ群体656株F2代群体单株中无限分枝、有限分枝植株分别为495株和161株，G56群体253株F2代群体单株中无限分枝、有限分枝植株分别为191株和62株，经卡方检验，遗传分离符合孟德尔遗传分离比例，辣椒分枝类型性状为单基因隐性遗传(表1、表2)。
表1 GQ群体遗传规律调查
Figure BDA0002795299480000081
Figure BDA0002795299480000091
表2 G56群体遗传规律调查
Figure BDA0002795299480000092
(二)辣椒DNA的提取：
GQ群体的F2代遗传群体用于辣椒分枝类型分子标记的开发。采用改良的CTAB法提取植株总DNA。提取基因组DNA的方法如下：取冷冻叶片组织100～200mg，装入放有1粒钢珠的2ml离心管中，液氮迅速冷冻，用磨样机研磨至细粉状。每份待测辣椒样品中加800μLCTAB，剧烈振荡，混合均匀，65℃水浴30～60min；然后加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)抽提，充分震荡混匀，于12000r/min离心10min；小心吸取上清到新的离心管中，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)于12000r/min离心10min，弃上清液；转移上清到1.5mL离心管中，加入2倍体积无水乙醇和1/10体积5M NaCl，振荡混匀，4℃放置20min，使DNA沉淀悬浮；3000g/min离心3min，然后5000g/min在离心3min；取上清，加75％酒精1mL，洗涤两次，吸净残留液体，晾干DNA沉淀，加入100μL ddH2O充分溶解，然后利用微量分光光度计测定待测辣椒样品DNA浓度和纯度，再用1％浓度的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，然后DNA稀释到100ng/μL浓度，冷冻备用。
(三)辣椒分枝类型基因的定位：
调控辣椒青果基因定位所用的分子标记来源于开发的辣椒全基因组SSR及Indel标记。利用BSA群体定位方法获得与辣椒分枝方式基因紧密连锁的染色体，在此染色体内通过图位克隆的方法获得了控制辣椒分枝方式的候选基因，其定位在辣椒6号染色体(locus＝Chr06:9348505:9350985)。通过基因功能注释、文献查阅及表达分析，确定候选基因。
(四)分子标记的开发：
通过候选基因序列克隆，发现了858bp的片段插入突变，依据此插入片段设计了一对检测此突变的Indel引物，即本发明鉴定辣椒分枝类型的分子标记，正向引物序列为：5′–GGTTGAAGTTAATGGTGGTG–3′，反向引物序列为：5′–CTGTCGTAAAAGGAATAGCC–3′。
(五)分子标记的准确性和稳定性检测：
(A)提取两个亲本、F1代和F2代重组自交系群体叶片基因组DNA。
用CTAB法提取亲本及F2代分离群体叶片的基因组DNA，微量分光光度计测定待测辣椒样品DNA浓度和纯度，再用1％浓度的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，然后DNA稀释到100ng/μL浓度，冷冻备用。
(B)利用开发的分子标记对步骤PCR(1)获得的DNA进行扩增。
引物序列为：5′–GGTTGAAGTTAATGGTGGTG–3′，反向引物序列为：5′–CTGTCGTAAAAGGAATAGCC–3′，合成于生工生物工程(上海)股份有限公司，引物纯化方法为PAGE。
优化反应体系为(10μL)：模板DNA样品1μL，浓度10μmol/L正、反向引物各0.5μL，2.5mM dNTPs 0.2μL，10×
Figure BDA0002795299480000101
Buffer 1μL,
Figure BDA0002795299480000102
DNA Polymerase 0.1μL及ddH2O 6.7μL。
PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，30次循环后72℃延伸10min，4℃存储，其PCR反应体系中所述PCR成分均购于北京全式金生物技术有限公司，目录号：AP111。
(C)PCR扩增产物的检测：
扩增PCR产物中加入1.5μL 6×Loading Buffer，混合均匀，取2μL混合样品，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，以120V电压电泳15min左右，最后显影、拍照。
(D)结果分析：
如图2所示，“茄门甜椒”为无限分枝亲本；“GS6”为有限分枝亲本；F1为“茄门甜椒”和“GS6”杂交后代单株；F2代群体单株为F1自交后代；M为DNA Marker，自下到上条带大小依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp、3000bp、5000bp、8000bp。
如图3所示，为分子标记在24份不同分枝类型辣椒品种或育种品系中的验证结果。从左至右依次为茄门甜椒、CM334、Zunla、AA3、R9、P70、A3、Y3、AA5、R24、R25、R30、B85、B86、Z1、5219、GS6、GS4、1702、1703、1920、G2、G1、2-2。其中辣椒茄门甜椒、CM334、Zunla为本申请之前业界熟知品种，其它辣椒样本为本申请的育种选系。
若PCR产物只存在1760bp条带，其序列见SEQ ID NO.3，则待测辣椒属于无限分枝类型；
若PCR产物只存在2621bp条带，其序列见SEQ ID NO.4，则待测辣椒属于有限分枝类型；
若PCR产物同时存在1760bp和2621bp条带，则待测辣椒属于无限分枝类型。
特异性条带统计结果与辣椒品种实际的分枝类型结果完全一致，正确率为100％，表明，该分子标记准确、稳定，由此，可在育种过程中及早剔除不合育种目标的植株，避免不必要的人工和资金成本的浪费。
遵从上述技术方案，以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。
实施例1：
遵从上述技术方案，本实施例给出一种鉴定辣椒分枝类型的分子标记用于辣椒分枝类型辅助育种中的应用。
该分子标记的正向引物序列为：5′–GGTTGAAGTTAATGGTGGTG–3′，序列见SEQ IDNO.1；反向引物序列为：5′–CTGTCGTAAAAGGAATAGCC–3′，序列见SEQ ID NO.2。
该应用的具体方法包括以下步骤：
步骤一，提取待测辣椒样品的DNA；
待测辣椒样品为品系CM334、AA3、R9、P70、Z1和GS6辣椒种子。
提取待测辣椒样品的DNA的具体过程为：
将待测辣椒样品分别放入适当容器中，缓缓倒入50℃～55℃水，边倒边搅拌，使种子受热均匀，15-20min后，水温降至常温，继续浸种4h后在液氮中磨成粉末，转移至Eppendorf管中。利用CTAB法提取种子基因组DNA，随后利用微量分光光度计测定样品DNA浓度和纯度，用1％质量浓度的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量；将模板DNA浓度稀释至100ng/μL，保存于-20℃冰箱中备用；
步骤二，以步骤一提取的DNA为模板，根据分子标记进行PCR扩增；
PCR采用10μL反应体系：包括10-100ng模板DNA 1-2μL，浓度10μmol/L正、反向引物各0.5μL，2.5mM dNTPs 0.2μL，10×
Figure BDA0002795299480000131
Buffer 1μL,
Figure BDA0002795299480000132
DNA Polymerase0.1μL及适量ddH2O。
PCR的反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，根据引物的退火温度复性30s，72℃延伸2min，30次循环后72℃延伸10min；4℃存储。
退火温度为56℃～64℃，优选的退火温度为60℃。
步骤三，采用质量分数为1％的琼脂糖凝胶电泳检测步骤二得到的PCR产物，获得条带的长度，根据条带的长度来判断辣椒分枝类型的结果。
若PCR产物存在1760bp条带，序列见SEQ ID NO.3，则待测辣椒样品为无限分枝；若PCR产物只存在2621bp条带，序列见SEQ ID NO.4，则待测辣椒样品为有限分枝。
根据本实施例提供的方法，PCR的检测结果如下：
待测辣椒样品CM334的PCR产物条带的长度为1760bp，序列见SEQ ID NO.3，为无限分枝类型。
待测辣椒样品AA3的PCR产物条带的长度为1760bp，序列见SEQ ID NO.3，为无限分枝类型。
待测辣椒样品R9的PCR产物条带的长度为1760bp，序列见SEQ ID NO.3，为无限分枝类型。
待测辣椒样品P70的PCR产物条带的长度为1760bp，序列见SEQ ID NO.3，为无限分枝类型。
待测辣椒样品Z1的PCR产物条带的长度为2621bp，序列见SEQ ID NO.4，为有限分枝类型。
待测辣椒样品GS6的PCR产物条带的长度为2621bp，序列见SEQ ID NO.4，为有限分枝类型。
这一结果与多年田间鉴定观察(CM334、AA3、R9、P70的分枝类型为无限分枝；Z1、GS6的分枝类型为有限分枝)一致，说明本发明的辣椒分枝类型分子标记检测方法能真实反映辣椒的分枝性，适用于辣椒分枝类型的种子期鉴定。
实施例2：
遵从上述技术方案，本实施例给出一种鉴定辣椒分枝类型的分子标记用于辣椒分枝类型辅助育种中的应用。
该分子标记与实施例1的分子标记相同。
该应用的具体方法包括以下步骤：
步骤一，提取待测辣椒样品的DNA；
待测辣椒样品为品系CM334、AA3、R9、P70、Z1和GS6的2片真叶期植株叶片。
提取待测辣椒样品的DNA的具体过程为：
摘取2叶真叶期辣椒叶片，置于液氮中冷冻，直接利用CTAB法提取叶片基因组DNA，随后利用微量分光光度计测定样品DNA浓度和纯度，用1％浓度的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量；将模板DNA浓度稀释至100ng/μL，保存于-20℃冰箱中备用。
步骤二，以步骤一提取的DNA为模板，根据分子标记进行PCR扩增；
PCR的反应体系与实施例1的PCR的反应体系相同。
PCR的反应程序与实施例1的PCR的反应程序相同。
步骤三，采用质量分数为1％的琼脂糖凝胶电泳检测步骤二得到的PCR产物，获得条带的长度，根据条带的长度来判断辣椒分枝类型的结果。
若PCR产物存在1760bp条带，则待测辣椒样品为无限分枝；若PCR产物只存在2621bp条带，则待测辣椒样品为有限分枝。
根据本实施例提供的方法，检测结果如下：
CM334的PCR产物条带的长度为1760bp，序列见SEQ ID NO.3，为无限分枝类型。
AA3的PCR产物条带的长度为1760bp，序列见SEQ ID NO.3，为无限分枝类型。
R9的PCR产物条带的长度为1760bp，序列见SEQ ID NO.3，为无限分枝类型。
P70的PCR产物条带的长度为1760bp，序列见SEQ ID NO.3，为无限分枝类型。
Z1的PCR产物条带的长度为2621bp，序列见SEQ ID NO.4，为有限分枝类型。
GS6的PCR产物条带的长度为2621bp，序列见SEQ ID NO.4，为有限分枝类型。
这一结果与实施列1和多年田间鉴定观察(CM334、AA3、R9、P70的分枝类型为无限分枝；Z1、GS6的分枝类型为有限分枝)一致，说明本发明的辣椒分枝类型分子标记检测方法能真实反映辣椒的分枝性，适用于辣椒分枝类型的芽苗期鉴定。
对比例1：
本实施例给出一种鉴定辣椒分枝类型的分子标记用于辣椒分枝类型辅助育种中的应用，该应用方法的具体步骤与实施例2基本相同，区别仅仅在于：
步骤二中，用于DNA提取的为2片真叶期辣椒品种茄门甜椒和GS6叶片。
步骤二中，PCR的退火温度设定为50℃。
本对比例的测试结果为：步骤三中琼脂糖凝胶电泳检测无条带，表明无PCR产物产生，无法判定辣椒的分枝类型。
对比例2：
本实施例给出一种鉴定辣椒分枝类型的分子标记用于辣椒分枝类型辅助育种中的应用，该应用方法的具体步骤与实施例2基本相同，区别仅仅在于：
步骤二中，用于DNA提取的为2片真叶期辣椒品种茄门甜椒和GS6叶片。
步骤二中，PCR的退火温度设定为51℃。
本对比例的测试结果为：步骤三中琼脂糖凝胶电泳检测无条带，表明无PCR产物产生，无法判定辣椒的分枝类型。
对比例3：
本实施例给出一种鉴定辣椒分枝类型的分子标记用于辣椒分枝类型辅助育种中的应用，该应用方法的具体步骤与实施例2基本相同，区别仅仅在于：
步骤二中，用于DNA提取的为2片真叶期辣椒品种茄门甜椒和GS6叶片。
步骤二中，PCR的退火温度设定为52℃。
本对比例的测试结果为：步骤三中琼脂糖凝胶电泳检测无条带，表明无PCR产物产生，无法判定辣椒的分枝类型。
对比例4：
本实施例给出一种鉴定辣椒分枝类型的分子标记用于辣椒分枝类型辅助育种中的应用，该应用方法的具体步骤与实施例2基本相同，区别仅仅在于：
步骤二中，用于DNA提取的为2片真叶期辣椒品种茄门甜椒和GS6叶片。
步骤二中，PCR的退火温度设定为53℃。
本对比例的测试结果为：步骤三中琼脂糖凝胶电泳检测无条带，表明无PCR产物产生，无法判定辣椒的分枝类型。
对比例5：
本实施例给出一种鉴定辣椒分枝类型的分子标记用于辣椒分枝类型辅助育种中的应用，该应用方法的具体步骤与实施例2基本相同，区别仅仅在于：
步骤二中，用于DNA提取的为2片真叶期辣椒品种茄门甜椒和GS6叶片。
步骤二中，PCR的退火温度设定为54℃。
本对比例的测试结果为：步骤三中琼脂糖凝胶电泳检测条带弥散，表明PCR产物特异性差，无法准确判定辣椒的分枝类型。
对比例6：
本实施例给出一种鉴定辣椒分枝类型的分子标记用于辣椒分枝类型辅助育种中的应用，该应用方法的具体步骤与实施例2基本相同，区别仅仅在于：
步骤二中，用于DNA提取的为2片真叶期辣椒品种茄门甜椒和GS6叶片。
步骤二中，PCR的退火温度设定为55℃。
本对比例的测试结果为：步骤三中琼脂糖凝胶电泳检测，茄门甜椒条带清晰，PCR产物长度为1760bp，序列见SEQ ID NO.3，为无限分枝类型；GS6条带弥散，PCR产物特异性差，无法准确判定辣椒GS6的分枝类型。
对比例7：
本实施例给出一种鉴定辣椒分枝类型的分子标记用于辣椒分枝类型辅助育种中的应用，该应用方法的具体步骤与实施例2基本相同，区别仅仅在于：
步骤二中，用于DNA提取的为2片真叶期辣椒品种茄门甜椒和GS6叶片。
步骤三中，PCR的延伸的时间均设定为30s。
本对比例的测试结果为：步骤四中琼脂糖凝胶电泳检测无条带，表明无PCR产物产生，无法判定辣椒的分枝类型。
对比例8：
本实施例给出一种快速鉴定辣椒类型的分子标记及应用，该方法的具体步骤与实施例2基本相同，区别仅仅在于：
步骤二中，用于DNA提取的为2片真叶期辣椒品种茄门甜椒和GS6叶片。
步骤二中，PCR的延伸的时间均设定为1min。
本对比例的测试结果为：步骤三中琼脂糖凝胶电泳检测，茄门甜椒条带清晰，PCR产物长度为1760bp，序列见SEQ ID NO.3，为无限分枝类型；GS6条带弥散，PCR产物特异性差，无法准确判定辣椒GS6的分枝类型。
根据上述全部对比例和实施例1和2之间的对比可以看出：利用快速鉴定辣椒分枝类型的分子标记的技术要点是使用本发明引物在标准的PCR程序下，以辣椒种子或者叶片所提取的DNA作为待测样品模板，然后对PCR产物，采用优化的1％琼脂糖凝胶电泳检测，再根据电泳后条带的大小确定待测辣椒样品的分枝类型。除上述环境与技术环节外，改变为PCR的退火温度和延伸时间，其结果均不能实现对辣椒分枝性的鉴定。
Figure BDA0002795299480000191
Figure BDA0002795299480000201
Figure BDA0002795299480000211
Figure BDA0002795299480000221
Figure BDA0002795299480000231
核苷酸序列表电子文件
<110> 西北农林科技大学
<120> 一种鉴定辣椒分枝类型的分子标记
<160>
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 发明专利正向序列
<400> 1
GGTTGAAGTTAATGGTGGTG
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 发明专利反向序列
<400> 2
CTGTCGTAAAAGGAATAGCC
<210> 3
<211> 1760
<212> DNA
<213> 无限分枝扩增序列
<400> 3
GGTTGAAGTTAATGGTGGTGATCTCAGATCCTTCTTCACACTGGTATATATTTATTATACTCCCTTATAATGAGGAGCCTTGGCGTAACTGTTTAAGTTGTTGTCATGTAATCAACACGTCACGAGAAACACCCCTGGAAACAACCTCTTGCAGAAATGCAGGGTAAGGTTGCGTACAATAGATCTTTGTGCTATATGCGAGGTCCAGCTCTTCCCCATACTTCGCATGTAGCAAAAGTTTTAATGCACCGGGCTGCCTCTAATTTTATATTACTCCCTTATAGTTTTTTTAACATCTTTTACTTCATCCGTCCTAATATACGTGACACTTTTTTCTATTTTAGCGCATCCGTCCTAATATATGTGACACTTTTTTCTATTTTAGCGCGACCACTTAGTTATAAATTCTTATTTCATCATTATAAATGGAGTTGATTTATAGTCTAGAAATTTCTAATATTTATTTTAGACCACAACTTCTAAATTTTTTTAATCTTTATTAAACTTCATAGCTTTTCAAGTATTGCCCCACATAAACTTAGACAAATGCAAGTGATACATTTATCTTCTAATTATTATTTATATAAGTATGAATATTTGATACCTCATAAATGGGGACAGAAAGAGTGGTACGTTTCTCTTCTATGATTTATATGAATATGAATATTTGACCTCTTTTGTTGTTTTCAATATTCAGATCATGATAGATCCAGATGTACCTGGTCCTAGTGATCCATATCTCAGGGAACATCTACACTGGTACAGACATACGCCTTTAAACTAACTCTTTCAATTTTATTTTCCATCTTTTTCAATTGTTTACATTTGTAGGAAAATGAAATGGTTATCCTATGATGTAACTGATCTTTCTTTCTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAATGTTTATTATGACATGATTTCATCAGCAAGTACTCATAGAGGTGGCTAATATATTACATATAGAAGTAGTACCACAATAAAGATTAAAAGTATGTACTACTACTATATATTGCACTAAAATGATGAGTAATAGTATTATTTAACTTAGAATAAATGTAATCAATATATAATAATAACTCAATTCACAATAAGCTAAGATATTTAGCGAATTTGTTAATATATATGTATGAAATTAATGAGAAAAAGTTATTAGGTTCACGTGAACTCACAAGTGTTTGCACCTTCGAATATATTTGCTAGCAATTTATTGGCAGTTATCCCCTTTCTAGAACATCAAAAAAAAAATCCCAGAAAACGCACTCTCTGGCAAATTTTAAAAATATGTTCCTAATTTAATTACTTGTTGACAAGAGAGTACCAAAAAAGAAGACTGCAAAATGGTGATATTACATGGTAACGGAAAAAACGTACTCGATTTATGATAGAATAAAAGTGACATATATTTTGTGCAATAATATTAATAGTTGACAAATAACTGAAAAGAGGATTTGACCATCTTTACAGGATTGTCACGGACATTCCAGGCACTACAGATTGCTCATTTGGTATGTATCCTTAGCCATATACTTCCAAATAACATTTTTCTAAAAATTACATTTTATTTGTCATAGATATATACATATATATGGTACTACTACATATTTTCTTTGTTAGTATGCAAATATACATTAGAATTCGCGTGTTAGTGATGGGATTAGGTATTGATTCTTAATTTATTTATACTAATAAACAACAAGAAGAAATAAAGTGTTTACTCCTAATTTCCTACATGAAAAAATATACCTGGCTATTCCTTTTACGACAG
<210> 4
<211> 2621
<212> DNA
<213> 有限分枝扩增序列
<400> 4
GGTTGAAGTTAATGGTGGTGATCTCAGATCCTTCTTCACACTGGTATATATTTATTATACTCCCTTATAATGAGGAGCCTTGGCGTAACTGTTTAAGTTGTTGTCATGTAATCAACACGTCACGAGAAACACCCCTGGAAACAACCTCTTGCAGAAATGCAGGGTAAGGTTGCGTACAATAGATCTTTGTGCTATATGCGAGGTCCAGCTCTTCCCCATACTTCGCATGTAGCAAAAGTTTTAATGCACCGGGCTGCCTCTAATTTTATATTACTCCCTTATAGTTTTTTTAACATCTTTTACTTCATCCGTCCTAATATACGTGACACTTTTTTCTATTTTAGCGCATCCGTCCTAATATATGTGACACTTTTTTCTATTTTAGCGCGACCACTTAGTTATAAATTCTTATTTCATCATTATAAATGGAGTTGATTTATAGTCTAGAAATTTCTAATATTTATTTTAGACCACAACTTCTAAATTTTTTTAATCTTTATTAAACTTCATAGCTTTTCAAGTATTGCCCCACATAAACTTAGACAAATGCAAGTGATACATTTATCTTCTAATTATTATTTATATAAGTATGAATATTTGATACCTCATAAATGGGGACAGAAAGAGTGGTACGTTTCTCTTCTATGATTTATATGAATATGAATATTTGACCTCTTTTGTTGTTTTCAATATTCAGATCATGATAGATCCAGATGTACCTGGTCCTAGTGATCCATATCTCAGGGAACATCTACACTGGTACAGACATACGCCTTTAAACTAACTCTTTCAATTTTATTTTCCATCTTTTTCAATTGTTTACATTTGTAGGAAAATGAAATGGTTATCCTATGATGTAACTGATCTTTCTTTCTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAATGTTTATTATGACATGATTTCATCAGCAAGTACTCATAGAGGTGGCTAATATATTACATATAGAAGTAGTACCACAATAAAGATTAAAAGTATGTACTACTACTATATATTGCACTAAAATGATGAGTAATAGTATTATTTAACTTAGAATAAATGTAATCAATATATAATAATAACTCAATTCACAATAAGCTAAGATATTTAGCGAATTTGTTAATATATATGTATGAAATTAATGAGAAAAAGTTATTAGGTTCACGTGAACTCACAAGTGTTTGCACCTTCGAATATATTTGCTAGCAATTTATTGGCAGTTATCCCCTTTCTAGAACATCAAAAAAAAAATCCCAGAAAACGCACTCTCTGGCAAATTCTTATTTCATCATTATAAATGGAGTTGATTTATAGTCTAGAAATTTCTAATATTTATTTTAGACCACAACTTCTAAATTTTTTTAATCTTTATTAAACTTCATAGCTTTTCAAGTATTGCCCCACATAAACTTAGACAAATGCAAGTGATACATTTATCTTCTAATTATTATTTATATAAGTATGAATATTTGATACCTCATAAATGGGGACAGAAAGAGTGGTACGTTTCTCTTCTATGATTTATATGAATATGAATATTTGACCTCTTTTGTTGTTTTCAATATTCAGATCATGATAGATCCAGATGTACCTGGTCCTAGTGATCCATATCTCAGGGAACATCTACACTGGTACAGACATACGCCTTTAAACTAACTCTTTCAATTTTATTTTCCATCTTTTTCAATTGTTTACATTTGTAGGAAAATGAAATGGTTATCCTATGATGTAACTGATCTTTCTTTCTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAATGTTTATTATGACATGATTTCATCAGCAAGTACTCATAGAGGTGGCTAATATATTACATATAGAAGTAGTACCACAATAAAGATTAAAAGTATGTACTACTACTATATATTGCACTAAAATGATGAGTAATAGTATTATTTAACTTAGAATAAATGTAATCAATATATAATAATAACTCAATTCACAATAAGCTAAGATATTTAGCGAATTTGTTAATATATATGTATGAAATTAATGAGAAAAAGTTATTAGGTTCACGTGAACTCACAAGTGTTTGCACCTTCGAATATATTTGCTAGCAATTTATTGGCAGTTATCCCCTTTCTAGAACATCAAAAAAAAAATCCCAGAAAACGCACTCTCTGGCAAATTTTAAAAATATGTTCCTAATTTAATTACTTGTTGACAAGAGAGTACCAAAAAAGAAGACTGCAAAATGGTGATATTACATGGTAACGGAAAAAACGTACTCGATTTATGATAGAATAAAAGTGACATATATTTTGTGCAATAATATTAATAGTTGACAAATAACTGAAAAGAGGATTTGACCATCTTTACAGGATTGTCACGGACATTCCAGGCACTACAGATTGCTCATTTGGTATGTATCCTTAGCCATATACTTCCAAATAACATTTTTCTAAAAATTACATTTTATTTGTCATAGATATATACATATATATGGTACTACTACATATTTTCTTTGTTAGTATGCAAATATACATTAGAATTCGCGTGTTAGTGATGGGATTAGGTATTGATTCTTAATTTATTTATACTAATAAACAACAAGAAGAAATAAAGTGTTTACTCCTAATTTCCTACATGAAAAAATATACCTGGCTATTCCTTTTACGACAG

Claims (8)

1.一种鉴定辣椒分枝类型的分子标记，其特征在于，该分子标记的正向引物序列为：5′–GGTTGAAGTTAATGGTGGTG–3′，反向引物序列为：5′–CTGTCGTAAAAGGAATAGCC–3′。
2.如权利要求1所的鉴定辣椒分枝类型的分子标记用于辣椒分枝类型辅助育种中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，该应用的具体方法包括以下步骤：
步骤一，提取待测辣椒样品的DNA；
步骤二，以步骤一提取的DNA为模板，根据分子标记进行PCR扩增；
所述的PCR的反应程序中的退火温度为56℃～64℃；
步骤三，采用质量分数为1％的琼脂糖凝胶电泳检测步骤二得到的PCR产物，获得条带的长度，根据条带的长度来判断辣椒分枝类型的结果。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的PCR采用10μL反应体系：包括10-100ng模板DNA 1-2μL，浓度10μmol/L正、反向引物各0.5μL，2.5mM dNTPs 0.2μL，
Figure FDA0002795299470000011
Buffer 1μL,
Figure FDA0002795299470000012
DNA Polymerase 0.1μL及适量ddH2O。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的PCR的反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，根据引物的退火温度复性30s，72℃延伸2min，30次循环后72℃延伸10min；4℃存储。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的退火温度为60℃。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，若PCR产物存在1760bp条带，则待测辣椒样品为无限分枝；若PCR产物只存在2621bp条带，则待测辣椒样品为有限分枝。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，存在1760bp条带的PCR产物的序列见SEQ IDNO.3，只存在2621bp条带的PCR产物的序列见SEQ ID NO.4。
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