CN109536510A

CN109536510A - 一种旱柳锌铁转运基因SmZIP及采用荧光RT-PCR检测其表达的方法

Info

Publication number: CN109536510A
Application number: CN201811513910.4A
Authority: CN
Inventors: 邹金华; 尚晓硕; 薛文秀; 李崇豪; 王嘉玥; 刘祥君
Original assignee: Tianjin Normal University
Current assignee: Tianjin Normal University
Priority date: 2018-12-11
Filing date: 2018-12-11
Publication date: 2019-03-29
Anticipated expiration: 2038-12-11
Also published as: CN109536510B

Abstract

本发明公开了一种旱柳锌铁转运基因SmZIP及采用荧光RT‑PCR检测其表达的方法，本发明是在国内外首次公开旱柳锌铁转运蛋白SmZIP的cDNA全序列，该序列可为深入研究植物吸收转运Cd及缓解细胞内的Cd毒性提供一定的理论基础，通过实时荧光定量PCR方法，研究不同浓度Cd胁迫下旱柳不同器官SmZIP表达的变化，研究结果可为利用该基因改良植物以提高重金属Cd的吸收积累和转运率及Cd抗性，从而用于植物修复实践提供理论基础，具有潜在的应用价值和社会效益。

Description

一种旱柳锌铁转运基因SmZIP及采用荧光RT-PCR检测其表达的方法

本发明得到：天津市自然科学基金(17JCYBJC22500)；天津市高等学校科技发展计划项目(20110603)；天津师范大学博士基金及天津市动植物抗性重点实验开放基金的资助。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种旱柳锌铁转运基因SmZIP及采用荧光RT-PCR检测其表达的方法。

背景技术

重金属Cd污染严重威胁着生态环境和人类健康，植物修复技术以其不破坏土壤生态环境、安全廉价、不造成二次污染等特点，已成为国内外研究和开发的热点领域。多年生、高大的速生木本植物对重金属的富集能力方面虽然不如草本超富集积累植物，但是，生物量大、根系发达、不与食物链相连等特性使得其在治理重金属污染的土壤中具有更明显的优越性，具有成为植物修复候选植物的潜力。

锌-铁转运蛋白(ZIP)在植物、动物、真菌和细菌中均被检测到，主要吸收和运输Fe、Zn、Mn、Cd、Co和Ni等二价金属离子，ZIP属于跨膜蛋白，不仅位于细胞质膜上，还位于叶绿体膜及液泡膜上，ZIP家族氨基酸序列为309-476个，其氨基酸组成中含有多个疏水基团，有8个跨膜区，N-端和C-端均位于膜外侧，将二价金属离子从胞外运输至胞内。通过基因工程技术将锌-铁转运蛋白(ZIP)进行过表达或者转化，从而提高植物修复的效率。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种旱柳锌铁转运基因SmZIP及采用荧光RT-PCR检测其表达的方法。本发明通过转录组测序，报道了一个旱柳锌铁转运蛋白SmZIP的cDNA全长序列，该序列可为深入研究旱柳锌铁转运机制奠定基础。通过实时荧光定量PCR方法，研究不同浓度Cd胁迫下旱柳不同器官SmZIP表达的变化，研究结果可为利用该基因改良植物以提高重金属Cd的吸收积累和转运率及Cd抗性，从而用于植物修复实践提供理论基础。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种旱柳锌铁转运基因SmZIP，其cDNA序列全长为1140bp(GeneBank登录号：KU921227)，包含一个1053bp的开放阅读框，编码350个氨基酸，编码框位置是：71bp-1123bp，5’非编码区70bp，3’非编码区17bp。根据ExPASy在线软件分析结果显示该基因编码的蛋白化学分子式为C₁₆₇₈N₂₆₆₂H₄₂₄O₄₆₇S₁₇，分子量是36.79kDa，理论等电点值是6.82，序列的N-端是甲硫氨酸(Met)，C-端是丙氨酸(Ala)。

该基因的全长序列如序列表SEQ NO.1所述：

CGGATTCCCTTCATCTTCAATCCCTTCTCCTCAACTTTGCAAACAAATTTTCTCTTGATATCATCTCACCATGCAGAGTTCTATCAAATTTTATTTAAAGTTCTTTTGCTTGCTTCTGCTACTCCCTACTCTTGCTTTAGGAGAATGCACATGTGATGCAGCAGGAGGAGAAGACACGAATAAATCTGAGGCCTTGAAATACAAAGCCGCAGCAATTGCTTCTATCCTTTTTGCGGGTGCAGTTGGAGTTTGTATTCCAGTTCTTGGAAAAAAGATCCCTGTTTTAAGCCCTGAAAGGAGTATTTTCTTCATCATCAAAGCTTTTGCGGCCGGTGTTATATTGTCGACAGCCTTTATTCATGTGCTTCCCGATGCTTTTGATAGCTTGACATCGCCATGCCTCGCTGAGAATCCTTGGGGTAAATTTCCCTTCACGGGTTTTGTGGCAATGATGTCGGCAATTGGGACTTTAATGGTGGATTGTCTTGCTAGTTCTTATTTTACACGGTTGCACCTCATCAAGGCTCAACCAGAGGAGAGCGGGGACGAGGAGAAGGCAGCAGGAGAGGCTCATGTTCATACTCATGCCCATTCTCATGGCATAGTTGCGGATAGTTCTGGTTCTGCTCCATCTCCTCAGCTTATTCGCCATCGGGTTATTACTCAGGTTCTCGAGTTGGGAATTGTGGTGCACTCTGTGATTATAGGAGTTTCTCTGGGAGCTTCTTCAAGTCCCAAGACAATAAGACCTCTAGTGGGTGCCCTAAGCTTTCACCAATTTTTTGAGGGTATAGGACTTGGTGGATGCATTACTCAGGCAAAATTCAAGACCAAAACTATGGTGACAATGGGACTCTTCTTCTCTCTAACAACCCCAGTTGGAATTGCAGTCGGGTTAGGCATATCAAATGTCTATAACGAGAGCAGTCCTAATGCTCTTATTGTTGAAGGAATTTTTAATGCCGCATCAGCTGGTATCCTAATCTACATGGCTCTTGTGGATCTTCTGGCAGCTGATTTTATGCATCCAAGAGTGCAAAGTAATGGAGCTCTTCAACTTGGGGTCAACGTTTCTCTTCTTCTAGGAGTTGGCTGTATGTCTCTCATCGCCAAATGGGCTTGAACCTGTAGGGATCCGCG

该基因编码一个长为350aa的氨基酸多肽，该多肽链的氨基酸序列如序列表SEQNO.2所述：

MQSSIKFYLKFFCLLLLLPTLALGECTCDAAGGEDTNKSEALKYKAAAIASILFAGAVGVCIPVLGKKIPVLSPERSIFFIIKAFAAGVILSTAFIHVLPDAFDSLTSPCLAENPWGKFPFTGFVAMMSAIGTLMVDCLASSYFTRLHLIKAQPEESGDEEKAAGEAHVHTHAHSHGIVADSSGSAPSPQLIRHRVITQVLELGIVVHSVIIGVSLGASSSPKTIRPLVGALSFHQFFEGIGLGGCITQAKFKTKTMVTMGLFFSLTTPVGIAVGLGISNVYNESSPNALIVEGIFNAASAGILIYMALVDLLAADFMHPRVQSNGALQLGVNVSLLLGVGCMSLIAKWA

一种采用荧光RT-PCR检测旱柳锌铁转运基因SmZIP表达的方法，按如下步骤进行：

(1)使用下述引物进行SmZIP基因的检测：

符合荧光PCR反应特点的该序列特异上下游引物：

SmZIP-q-F：5’-TTTTGCGGCCGGTGTTATAT-3’，如序列表SEQ NO.3所述；

SmZIP-q-R：5’-AAAGTCCCAATTGCCGACATC-3’，如序列表SEQ NO.4所述；

以及作为内参基因的β-actin特异上下游引物：

β-actin-F：5’-CCCCTCAACGCTAAGGCTAACAG-3’，如序列表SEQ NO.5所述；

β-actin-R：5’-CAGAATCTTCATCAAAGCATCGGTG-3’，如序列表SEQ NO.6所述；

(2)总RNA提取与纯化：采用通用的RNA提取方法和纯化方法，从旱柳的组织中中提取得到纯化的总RNA；

(3)cDNA第一链合成：以旱柳的总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系为20μL；

(4)实时荧光PCR：以上述步骤(3)中合成的cDNA第一链为模板，上述步骤(1)中SmZIP-q-F和SmZIP-q-R、β-actin-F和β-actin-R为特异性引物，进行实时荧光PCR扩增反映，每个样品设3个平行管，扩增后所得3个平行管的Ct值取平均数。

(5)旱柳组织中SmZIP基因的相对表达量计算：实时荧光PCR完成后，根据测得的Ct值计算△Ct、2-(ΔΔCt)值，以2-(ΔΔCt)数值表示旱柳组织中SmZIP基因的相对表达量。

本发明的有益效果在于：

1、本发明是在国内外首次公开旱柳锌铁转运蛋白SmZIP的cDNA全序列，该序列可为深入研究植物吸收转运Cd及缓解细胞内的Cd毒性提供一定的理论基础。

2、本发明采用的实时荧光RT-PCR技术与常规PCR相比，实时荧光PCR技术由自动化仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，可进一步提高灵敏度；实时荧光PCR技术全封闭反应，无须PCR后处理，避免污染，保证了结果的可靠性和重复性。实时荧光RT-PCR技术也免除了常规PCR中的电泳、定量扫描等后续繁琐步骤，大大缩短了实验时间。

3、通过实时荧光定量PCR方法，研究不同浓度Cd胁迫下旱柳不同器官SmZIP表达的变化，研究结果可为利用该基因改良植物以提高重金属Cd的吸收积累和转运率及Cd抗性，从而用于植物修复实践提供理论基础，具有潜在的应用价值和社会效益。

附图说明

图1为旱柳经50μmol/L Cd胁迫0、1、3、6、12和24h后根茎叶中SmZIP的表达量示意图。

图2为旱柳经10、50和100μmol/L Cd胁迫7天后根茎叶中SmZIP的表达量示意图。

对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

本发明中所述的提取旱柳总RNA的提取、cDNA的合成、实时荧光定量RT-qPCR等方法都是本领域成熟的技术，其中所用试剂均有市售，试剂盒 Green qPCR SuperMix等都可以从生产商家购买。

实施例1

旱柳锌铁转运蛋白SmZIP基因序列的获得

实验材料取自天津师范大学生命科学学院培养的旱柳(Salix matsudanaKoidz.)插条，生根培养7天后，取幼根液氮速冻，用EASY spin植物micro RNA快速提取试剂盒(艾德莱，北京)提取根部总RNA，-80℃低温保存，送至北京百迈克生物科技有限公司进行转录组测序。应用高通量测序平台IlluminaHiSeq 2500对旱柳根样本进行转录组测序，采用Trinity软件对每个读取序列片段进行聚类后拼接成unigene，再结合生物信息学软件进行靶标序列cDNA全长的判定，进行Blast同源序列检索予以确认，得到SmZIP基因序列和编码氨基酸的序列。

基因序列如序列表SEQ NO.1所述：

氨基酸序列如序列表SEQ NO.2所述：

实施例2：

Cd金属胁迫下的旱柳各组织培养

1、将旱柳根、茎、叶组织在50μmol/L的CdCl₂的胁迫环境下进行培养，并分别在0h、1h、3h、6h、12h和24h进行取样。

2、将旱柳根、茎、叶组织分别在10、50和100μmol/L的CdCl₂的胁迫环境下进行培养，并在培养7天后进行取样。

实施例3：

总RNA的提取

使用EASY spin植物micro RNA快速提取试剂盒(艾德莱,北京)，按照其说明书上的步骤提取上述实施例中得到的旱柳组织，待乙醇挥发完全晾干后加入10μL的RNase-freeddH₂O，取1μL旱柳总RNA使用微量紫外分光光度计测定RNA浓度，并取2μL总RNA经1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，其余的总RNA放置-80℃冰箱保存以备后续的RT-PCR实验。

实施例4

SmZIP基因的实时荧光RT-PCR检测

(1)引物设计：

根据所得SmZIP基因的全长序列，使用Primers软件设计适用于实时荧光PCR检测的特异性引物。设计出SmZIP的引物为(SmZIP-q-F:5’-TTTTGCGGCCGGTGTTATAT-3’；SmZIP-q-R:5’-AAAGTCCCAATTGCCGACATC-3’)，内参基因(Actin gene)的引物为(β-actin-F：5’-CCCCTCAACGCTAAGGCTAACAG-3’；β-actin-R：5’-CAGAATCTTCATCAAAGCATCGGTG-3’)，通过普通PCR验证所设计的引物是否匹配，再使用 Select Master Mix试剂盒结合光学96孔反应板进行实时荧光定量PCR。

检验引物的PCR反应体系(15μL)如下：

PCR条件为94℃4min；94℃30s，60℃30s，72℃1min(35cycles)；72℃10min；4℃∞。PCR产物经电泳检测。

(2)旱柳组织cDNA的合成：

使用Trans Script First-Strand cDNA Synthesis试剂盒(20μL体系)，以旱柳总RNA为模板合成cDNA的第一链，反转录体系如下：

使反应物充分混匀，PCR条件是25℃10min；42℃30min；85℃5min。产物立即使用或保存于-20℃冷冻保存。

(3)实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR反应体系(20μL)如下：

实时荧光定量PCR反应条件如下：

在实时荧光定量PCR仪器上分别测出3个平行样品的2-(ΔΔCt)值，取其平均数使用SigmaPlot软件绘制成直方图，分析出旱柳不同器官中SmZIP基因的表达量。其中2-(ΔΔCt)数值代表了SmZIP基因的表达倍数。β-actin基因是看家基因，在所有类型的细胞中都进行表达，看家基因的表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节，受环境因素影响很小，表达水平较为恒定。因此，看家基因常被用做测定目标基因表达量时的参照基因。本实验中的2-(ΔΔCt)数值越大，表明SmZIP基因的表达量越高。

实验结果与分析：

图1为实时荧光定量PCR研究旱柳经50μmol/L Cd胁迫1、3、6、12和24小时后旱柳根、茎、叶中SmZIP基因的表达量变化结果，从图中可以看出在50μmol/L CdCl₂溶液处理短时间后，根中该基因表达量增长最快并在处理3h后达到最大值；随着处理时间的增长茎中该基因表达量会降低；而叶中在CdCl₂溶液处理6h之前，基因的表达量都是逐渐降低，但在6h之后其表达量大幅度增加直至处理12h时达到最大值，之后又呈现下降趋势。因此，可以证明旱柳根部对于Cd十分敏感，在短时间内就能加快表达出SmZIP基因，缓解Cd对植物的毒害。

图2为通过实时荧光定量PCR研究不同浓度Cd胁迫7天后旱柳根、茎、叶中SmZIP基因的表达量变化结果，结果显示三种不同浓度(10、50和100μmol/L)CdCl₂溶液处理长时间后，旱柳根、茎、叶中SmZIP基因呈现相似的表达趋势。在相同浓度处理下，旱柳各个器官中该基因表达量排名为根>茎>叶；在相同处理时间下，根和叶中该基因的表达量都是持续增加的，但在根中的表达量增长率要高于叶中的，在高浓度CdCl₂溶液处理下，茎中的表达量却逐渐减少，所以可以推断出相同时间下随着处理浓度的增加，旱柳富集Cd能力为根>叶>茎。

有研究表明ZIP家族能够吸收或转运多种二价金属离子，如Zn、Fe、Cd、Mn、Co和Ni等(Varanavasiappan et al.,2013)。上述实施例中所述的采用荧光RT-PCR检测旱柳锌铁转运基因SmZIP表达的方法除了适用于Cd胁迫下SmZIP基因的表达外，对其他的二价金属离子同样适用。以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津师范大学

<120> 一种旱柳锌铁转运基因SmZIP及采用荧光RT-PCR检测其表达的方法

<130> 1

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1140

<212> DNA

<213> 旱柳

<400> 1

cggattccct tcatcttcaa tcccttctcc tcaactttgc aaacaaattt tctcttgata 60

tcatctcacc atgcagagtt ctatcaaatt ttatttaaag ttcttttgct tgcttctgct 120

actccctact cttgctttag gagaatgcac atgtgatgca gcaggaggag aagacacgaa 180

taaatctgag gccttgaaat acaaagccgc agcaattgct tctatccttt ttgcgggtgc 240

agttggagtt tgtattccag ttcttggaaa aaagatccct gttttaagcc ctgaaaggag 300

tattttcttc atcatcaaag cttttgcggc cggtgttata ttgtcgacag cctttattca 360

tgtgcttccc gatgcttttg atagcttgac atcgccatgc ctcgctgaga atccttgggg 420

taaatttccc ttcacgggtt ttgtggcaat gatgtcggca attgggactt taatggtgga 480

ttgtcttgct agttcttatt ttacacggtt gcacctcatc aaggctcaac cagaggagag 540

cggggacgag gagaaggcag caggagaggc tcatgttcat actcatgccc attctcatgg 600

catagttgcg gatagttctg gttctgctcc atctcctcag cttattcgcc atcgggttat 660

tactcaggtt ctcgagttgg gaattgtggt gcactctgtg attataggag tttctctggg 720

agcttcttca agtcccaaga caataagacc tctagtgggt gccctaagct ttcaccaatt 780

ttttgagggt ataggacttg gtggatgcat tactcaggca aaattcaaga ccaaaactat 840

ggtgacaatg ggactcttct tctctctaac aaccccagtt ggaattgcag tcgggttagg 900

catatcaaat gtctataacg agagcagtcc taatgctctt attgttgaag gaatttttaa 960

tgccgcatca gctggtatcc taatctacat ggctcttgtg gatcttctgg cagctgattt 1020

tatgcatcca agagtgcaaa gtaatggagc tcttcaactt ggggtcaacg tttctcttct 1080

tctaggagtt ggctgtatgt ctctcatcgc caaatgggct tgaacctgta gggatccgcg 1140

<210> 2

<211> 350

<212> PRT

<213> 旱柳

<400> 2

Met Gln Ser Ser Ile Lys Phe Tyr Leu Lys Phe Phe Cys Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Pro Thr Leu Ala Leu Gly Glu Cys Thr Cys Asp Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Glu Asp Thr Asn Lys Ser Glu Ala Leu Lys Tyr Lys Ala Ala Ala

35 40 45

Ile Ala Ser Ile Leu Phe Ala Gly Ala Val Gly Val Cys Ile Pro Val

50 55 60

Leu Gly Lys Lys Ile Pro Val Leu Ser Pro Glu Arg Ser Ile Phe Phe

65 70 75 80

Ile Ile Lys Ala Phe Ala Ala Gly Val Ile Leu Ser Thr Ala Phe Ile

85 90 95

His Val Leu Pro Asp Ala Phe Asp Ser Leu Thr Ser Pro Cys Leu Ala

100 105 110

Glu Asn Pro Trp Gly Lys Phe Pro Phe Thr Gly Phe Val Ala Met Met

115 120 125

Ser Ala Ile Gly Thr Leu Met Val Asp Cys Leu Ala Ser Ser Tyr Phe

130 135 140

Thr Arg Leu His Leu Ile Lys Ala Gln Pro Glu Glu Ser Gly Asp Glu

145 150 155 160

Glu Lys Ala Ala Gly Glu Ala His Val His Thr His Ala His Ser His

165 170 175

Gly Ile Val Ala Asp Ser Ser Gly Ser Ala Pro Ser Pro Gln Leu Ile

180 185 190

Arg His Arg Val Ile Thr Gln Val Leu Glu Leu Gly Ile Val Val His

195 200 205

Ser Val Ile Ile Gly Val Ser Leu Gly Ala Ser Ser Ser Pro Lys Thr

210 215 220

Ile Arg Pro Leu Val Gly Ala Leu Ser Phe His Gln Phe Phe Glu Gly

225 230 235 240

Ile Gly Leu Gly Gly Cys Ile Thr Gln Ala Lys Phe Lys Thr Lys Thr

245 250 255

Met Val Thr Met Gly Leu Phe Phe Ser Leu Thr Thr Pro Val Gly Ile

260 265 270

Ala Val Gly Leu Gly Ile Ser Asn Val Tyr Asn Glu Ser Ser Pro Asn

275 280 285

Ala Leu Ile Val Glu Gly Ile Phe Asn Ala Ala Ser Ala Gly Ile Leu

290 295 300

Ile Tyr Met Ala Leu Val Asp Leu Leu Ala Ala Asp Phe Met His Pro

305 310 315 320

Arg Val Gln Ser Asn Gly Ala Leu Gln Leu Gly Val Asn Val Ser Leu

325 330 335

Leu Leu Gly Val Gly Cys Met Ser Leu Ile Ala Lys Trp Ala

340 345 350

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ttttgcggcc ggtgttatat 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

aaagtcccaa ttgccgacat c 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

cccctcaacg ctaaggctaa cag 23

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

cagaatcttc atcaaagcat cggtg 25

Claims

1.一种旱柳锌铁转运基因SmZIP，其特征在于：该基因全长1140bp，编码框位置是：71bp-1123bp，该基因的全长序列如序列表SEQ NO.1所述，该基因编码一个长350aa的多肽，该多肽链的氨基酸序列如序列表SEQ NO.2所述。

2.一种采用荧光RT-PCR技术检测旱柳锌铁转运基因SmZIP表达的特异性引物，其特征在于：由序列表SEQ NO.3、SEQ NO.4、SEQ NO.5和SEQ NO.6组成，其中

序列表SEQ NO.3和SEQ NO.4为锌铁转运基因SmZIP的特异上下游引物，

序列表SEQ NO.5和SEQ NO.6为内参基因的SmZIP-actin特异上下游引物。

3.如权利要求3所述的一种特异性引物在采用荧光RT-PCR技术检测旱柳锌铁转运基因SmZIP表达中的应用。

4.一种采用荧光RT-PCR检测旱柳锌铁转运基因SmZIP表达的方法，其特征在于按如下步骤：

(1)将旱柳在二价金属环境下进行培养；

(2)采用通用的RNA提取方法和纯化方法，从上述经过二价金属斜坡的旱柳组织中提取得到纯化的总RNA；并以总RNA为模板合成cDNA第一链；

(3)以上述步骤(2)中合成的cDNA第一链为模板，以如序列表中SEQ NO.3、SEQ NO.4、SEQ NO.5和SEQ NO.6中所述的SmZIP-q-F和SmZIP-q-R、β-actin-F和β-actin-R特异性引物，进行实时荧光PCR扩增反应；

(4)实时荧光PCR完成后，根据测得的Ct值计算△Ct、2-(ΔΔCt)值，以2-(ΔΔCt)数值表示旱柳组织中SmZIP基因的相对表达量。

5.如权利要求5所述的一种采用荧光RT-PCR检测旱柳锌铁转运基因SmZIP表达的方法，其特征在于：所述二价金属为Zn、Fe、Cd、Mn、Co或Ni中的一种。

6.如权利要求5所述的一种采用荧光RT-PCR检测旱柳锌铁转运基因SmZIP表达的方法，其特征在于：在所述步骤(2)中，反应体系为20μL。

7.如权利要求5所述的一种采用荧光RT-PCR检测旱柳锌铁转运基因SmZIP表达的方法，其特征在于：在所述步骤(4)中，每个样品设3个平行管，扩增后所得3个平行管的Ct值取平均数。