CN109207631A - 一种水稻抗白叶枯病基因xa5特异性分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻抗白叶枯病基因xa5特异性分子标记开发及应用，开发设计四条分子标记引物，等量加入到同一PCR反应体系对不同水稻基因组DNA进行扩增，如果有486bp和390bp的两条特征条带，则表示所述样品为xa5基因纯合；如果有486bp和143bp的两条特征条带，则表示所述样品不含有xa5基因；如果同时存在486bp、390bp和143bp的三条特征条带，则表示所述样品为为xa5基因杂合。该四引物PCR分子标记为共显性标记，可以有效区分水稻抗白叶枯病基因xa5三种不同基因型，提高对该基因的选择效率，加速水稻抗白叶枯病改良育种的进程。

Description

一种水稻抗白叶枯病基因xa5特异性分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及生物分子标记及其应用技术，具体是一种水稻抗白叶枯病基因xa5特异性分子标记及其应用。

背景技术

白叶枯病是水稻的主要病害之一，导致水稻大幅度减产和产量不稳定，同时也影响稻米品质。实践证明，培育和种植抗病品种是控制这一病害的最经济有效的方法之一，而培育抗病品种的关键在于挖掘并利用优良的抗病基因资源。目前从不同资源的水稻中鉴定出的抗白叶枯病基因已有 42 个。xa5是已克隆的抗白叶枯病隐性基因，xa5基因序列在抗病品种IRBB5和感病品种日本晴中有两个碱基的差异（A116T和G117C），导致IRBB5中的第39位的缬氨酸在日本晴中变成谷氨酸，该氨基酸位点的差异引起抗病性的差异在其他抗病和感病品种中也存在，说明xa5基因型与抗病表型的相关性是保守的，同时xa5基因对细菌性条斑病也具有抗性。

白叶枯病抗性是典型的数量性状，受多基因控制，且易受环境影响。常规抗病育种中，抗病性鉴定结果不准确导致育种效率偏低。分子标记辅助选择是一种利用与抗性基因紧密连锁标记或者基因内功能标记，在后代中结合基因型和表型鉴定对目标性状进行选择的现代育种技术，该方法不仅可大大缩短育种年限，提高育种效率，而且还节约了大量的人力、物力成本。xa5基因不仅对水稻白叶枯病有抗性，同时对细菌性条斑病也具有一定的抗性，在水稻抗细菌性病害育种方面有很大的应用价值，开发xa5基因的特异性分子标记对充分利用该基因，进一步改良水稻白叶枯病抗性有着重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水稻抗白叶枯病基因xa5特异性分子标记及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种水稻抗白叶枯病基因xa5特异性分子标记，其分子标记序列为：

正向外引物xa5-OUT F：5’- AGGTGACCATCCTCTTTCTTTCT -3’

反向外引物xa5-OUT R：5’- AGGCTTCCGTCATAGACTAATCA -3’

正向内引物xa5-IN F：5’- CTCGCCATTCAAGTTCTTCTC -3’

反向内引物xa5-IN R：5’- GGTAAAGTAGATACCTTATCAAACTCCT -3’。

作为本发明进一步的方案：一种水稻抗白叶枯病基因xa5特异性分子标记应用于水稻抗白叶枯病基因xa5种质资源鉴定和标记辅助选择育种。

作为本发明进一步的方案：一种水稻抗白叶枯病基因xa5的鉴定包括以下步骤：

i、提取供试水稻样品基因组DNA；

ii、利用所述水稻抗白叶枯病基因xa5特异性分子标记xa5-OUT F、xa5-OUT R、xa5-INF和xa5-IN R对步骤i中所提取基因组进行PCR扩增，获得扩增产物；

iii、通过2%的琼脂糖凝胶电泳检测所述扩增产物，如果有486bp和390bp的两条特征条带，则表示所述样品为xa5基因纯合；如果有486bp和143bp的两条特征条带，则表示所述样品不含有xa5基因；如果同时存在486bp、390bp和143bp的三条特征条带，则表示所述样品为xa5基因杂合。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

（1）、本发明通过基因的突变位点设计的功能分子标记，不存在遗传交换，准确性高，能直接反映表型，缩短育种周期，提高选择效率；

（2）、本发明提供的四引物一步PCR扩增方法能有效区分xa5的纯和和杂合基因型，不需要酶切反应，操作便捷，节约成本。

附图说明

图1为水稻抗白叶枯病基因xa5特异性分子标记的设计策略原理图。

图2为抗白叶枯病基因xa5特异性分子标记对亲本的电泳检测图，

其中：M：D2000 Marker；1：IRBB5（xa5基因供体），2：沪旱1B，3：沪旱7B，4：旱恢3号，5：旱恢37，6：旱恢49，7：华占，8：黄华占。

图3为抗白叶枯病基因xa5特异性分子标记对旱恢3号/IRBB5 BC1F2群体xa5基因型的电泳检测图，

其中：M：D2000 Marker；1-28：部分旱恢3号/IRBB5 BC1F2单株，其中1，2，4，9，18，19，21，26，27和28孔道的样品表示为xa5基因纯合。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：水稻抗白叶枯病基因xa5特异性分子标记的开发

（1）、供试材料：

xa5基因供体亲本：IRRBB5；

受体亲本：沪旱1B，沪旱7B，旱恢3号，旱恢37，旱恢49，华占，黄华占；

（2）、提取水稻基因组DNA（水稻基因组DNA方法可参考（楼巧君, 陈亮, 罗利军. 三种水稻基因组 DNA 快速提取方法的比较[J]. 分子植物育种, 2006, 3(5): 749-752））；

（3）、xa5基因特异性分子标记的开发：

如图1，利用四引物扩增受阻突变体系PCR方法检测水稻抗白叶枯病基因xa5：四引物ARMS-PCR是一种在普通PCR技术基础上发展起来的专用于鉴定DNA中单核苷酸多态性的方法，其基本原理是利用了Taq DNA聚合酶缺少3'→5'外切酶活性，在DNA从5'端开始向3'端合成时不能对读取错误的碱基进行校正，当错配达到一定程度时，3'末端的碱基就不再继续向前延伸，导致反应终止，不能获得特异扩增谱带，表明所用的 DNA模板不存在有与引物3'端相同的变异。

根据上述原理，引物设计时，在SNP位点上下游设计2条外引物，以SNP突变位点为3’末端在其两侧设计2条特异性内引物，此外，在引物设计时，为增强引物灵敏度与特异性，往往在3'末端的第3位碱基处引入一个人为错配碱基，以阻止非完全匹配的延伸，根据4条引物组合扩增片段的的大小鉴定基因型。

通过序列分析，xa5基因序列在抗病品种IRBB5和感病品种日本晴中有两个碱基的差异（A116T和G117C），导致IRBB5中的第39位的缬氨酸在日本晴中变成谷氨酸引起水稻品种对白叶枯病的抗感差异。

（4）、根据AG/TC的双碱基差异设计四条特异性PCR分子标记，其正反引物序列为：

正向外引物xa5-OUT F：5’- AGGTGACCATCCTCTTTCTTTCT -3’

反向外引物xa5-OUT R：5’- AGGCTTCCGTCATAGACTAATCA -3’

正向内引物xa5-IN F：5’- CTCGCCATTCAAGTTCTTCTC -3’

反向内引物xa5-IN R：5’- GGTAAAGTAGATACCTTATCAAACTCCT -3’。

理论上反向内引物xa5-IN R的3’末端的CT碱基与抗病等位基因AG碱基配对正常扩增而与感病等位基因错配无法扩增，为了增强该引物的特异性我们在反向内引物xa5-INR的倒数第3位引物了一个错配碱基C增强其特异性，因此正向外引物xa5-OUT F和反向内引物xa5-IN R只有与抗病等位基因样品DNA扩增时有一条390bp的条带，与感病等位基因样品材料没有条带扩增；同理，按照上述思路设计出扩增感病等位基因样品DNA的正向内引物xa5-IN F与反向外引物xa5-OUT R，感病等位基因特异条带为143bp。

实施例2，水稻抗白叶枯病基因xa5特异性分子标记的亲本多态性检测：

（1）、供试材料：

xa5基因供体亲本：IRRBB5；

受体亲本：沪旱1B，沪旱7B，旱恢3号，旱恢37，旱恢49，华占，黄华占；

（2）、利用四条特异性分子标记xa5-OUT F、xa5-OUT R、xa5-IN F和xa5-IN R对水稻供受体亲本材料进行PCR扩增，PCR扩增体系为：20ng水稻基因组DNA模板，10 uL Taq PCRMastermix（天根生化科技(北京)有限公司），10 uM的四引物各0.5 uL，补充dd H2O至20uL；PCR反应程序为： 95℃预变性5 min，然后按95℃ 30 s，55℃下 30 s，72℃下 1 min进行30个循环，最后72℃下延伸 5 min；

（3）、取PCR产物8 uL上样于2%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，被外引物xa5-OUT F和xa5-OUT R扩增的486bp的条带在每个DNA样品中均出现，供体IRBB5还能扩增出一条390bp的条带，是由正向外引物xa5-OUT F和反向内引物xa5-IN R扩增产生，特异扩增的是xa5基因第116和117突变的AG抗病等位基因型；其余受体亲本均扩增出143bp的感病等位基因型的特征条带。

实施例3：水稻抗白叶枯病基因xa5特异性分子标记的验证与应用

为验证该标记鉴定的突变位点在分离群体中为单基因分离，利用上述的特异性分子标记对旱恢3号和IRBB5构建的BC1F2 群体的96个单株DNA进行扩增，其结果如图3所示，其电泳产物呈现三种类型的条带，即xa5基因纯合的有486bp和390bp的特征条带；xa5基因杂合的486bp、390bp和143bp的特征条带；不含有xa5基因的486bp和143bp的特征条带。

统计发现3 种基因型的分离比为 23：54：19，经卡方检验符合 1:2:1 的孟德尔单基因分离比（χ2=1.17<χ² _0.05 =5.99），通过人工接种白叶枯菌鉴定，验证了xa5纯和基因型对应的单株表现出抗病水平。因此该特异性分子标记为共显性标记，可以有效将两种不同的纯合子以及杂合子区分开，能利用该特异性分子标记进行水稻抗白叶枯病基因xa5的辅助选择中，加速水稻抗病育种的进程。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (3)

1.一种水稻抗白叶枯病基因xa5特异性分子标记，其特征在于：其分子标记序列为：

正向外引物xa5-OUT F：5’- AGGTGACCATCCTCTTTCTTTCT -3’

反向外引物xa5-OUT R：5’- AGGCTTCCGTCATAGACTAATCA -3’

正向内引物xa5-IN F：5’- CTCGCCATTCAAGTTCTTCTC -3’

反向内引物xa5-IN R：5’- GGTAAAGTAGATACCTTATCAAACTCCT -3’。

2.根据权利要求1所述的一种水稻抗白叶枯病基因xa5特异性分子标记，其特征在于：应用于水稻抗白叶枯病基因xa5种质资源鉴定和标记辅助选择育种。

3.根据权利要求1所述的一种水稻抗白叶枯病基因xa5特异性分子标记，其特征在于：用于水稻抗白叶枯病基因xa5的鉴定包括以下步骤：

i、提取供试水稻样品基因组DNA；

ii、利用所述水稻抗白叶枯病基因xa5特异性分子标记xa5-OUT F、xa5-OUT R、xa5-INF和xa5-IN R对步骤i中所提取基因组进行PCR扩增，获得扩增产物；

iii、通过2%的琼脂糖凝胶电泳检测所述扩增产物，如果有486bp和390bp的两条特征条带，则表示所述样品为xa5基因纯合；如果有486bp和143bp的两条特征条带，则表示所述样品不含有xa5基因；如果同时存在486bp、390bp和143bp的三条特征条带，则表示所述样品为xa5基因杂合。