CN105349663B - 大豆黄色相关基因分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大豆黄色相关基因分子标记及其应用。本发明提供了大豆基因组中Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸的单核苷酸多态性在鉴定大豆黄色突变体中的应用；所述单核苷酸多态性是指所述大豆基因组中Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸为G或A。本发明提供的功能标记可以准确用于本发明所示的大豆黄色突变体与野生型组配后代真伪性鉴定及其它相关研究工作。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种大豆黄色相关基因分子标记开发及其应用。
背景技术
叶色变异是比较常见的突变性状，一般在苗期表达，但少数突变体直到生育后期才发生叶色突变。由于突变基因往往是直接或间接影响叶绿素的合成和降解，改变叶绿素含量，所以叶色突变体也称为叶绿素突变体。叶色变异通常影响突变体光合效率，造成作物减产，严重时甚至导致植株死亡，因此过去常被认为是无意义的突变。近年来，叶色突变体的利用价值受到越来越多关注。在育种工作中，叶色变异可作为标记性状，简化良种繁育和杂交种生产；植株可为作物遗传育种提供优良种质资源。
在基础研究中，颜色改变是研究植物光合作用、光形态建成、激素生理以及抗病机制等一系列生理代谢过程的理想材料；同时颜色突变体可用于分析鉴定基因功能，了解基因互作。因而，研究大豆黄化突变体不仅有理论意义，同时还有重要的实际应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种大豆黄色相关基因分子标记的开发及其应用。
本发明所提供的应用具体为大豆基因组中Glyma13g30560基因(Glycine maxWm82.a1.v1，下同)第1727位核苷酸的单核苷酸多态性在鉴定大豆黄色突变体中的应用；所述单核苷酸多态性是指所述大豆基因组中Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸为G或A。
当然，用于鉴定大豆基因组中Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸为G还是A的物质在鉴定大豆黄色突变体的应用也属于本发明的保护范围。
在所述应用中，所述用于鉴定大豆基因组中Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸为G还是A的物质包括且不限于本发明的引物对；所述引物对中的上游引物根据所述大豆基因组中Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸的上游序列进行设计，所述引物对中的下游引物根据所述大豆基因组中Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸的下游序列进行设计。
所述用于鉴定大豆基因组中Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸为G还是A的物质除了包括且不限于本发明的引物对外，还包括与所述引物对相互配合使用的限制性内切酶以及其它检测方法。
在本发明中，所述用于鉴定大豆基因组中Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸为G还是A的物质为如下(a)或(b)或(c)：
(a)引物对A；
(b)所述引物对A和引物对B；
(c)所述引物对A、所述引物对B和限制性内切酶MboII；
所述引物对A为由序列表中序列4所示的单链DNA和序列5所示的单链DNA组成的引物对；所述引物对B为由序列表中序列6所示的单链DNA和序列7所示的单链DNA组成的引物对。
本发明还提供了用于鉴定大豆黄化突变体和/或鉴定待测大豆基因组中Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸为G还是A的引物对、成套引物以及试剂盒。
本发明所提供的用于鉴定大豆黄色突变体的引物对，具体为序列表中序列4和序列5所示单链DNA组成的引物对。
在实际应用中，所述引物对中的两条单链DNA在PCR反应体系中的摩尔比可为1：1。
本发明所提供的用于鉴定大豆黄色突变体的成套引物对，具体由如下引物对A和引物对B组成：所述引物对A为由序列表中序列4所示的单链DNA和序列5所示的单链DNA组成的引物对；所述引物对B为由序列表中序列6所示的单链DNA和序列7所示的单链DNA组成的引物对。
本发明所提供的用于鉴定大豆黄色突变体的试剂盒，含有如下引物对A、引物对B和限制性内切酶MboII：所述引物对A为由序列表中序列4所示的单链DNA和序列5所示的单链DNA组成的引物对；所述引物对B为由序列表中序列6所示的单链DNA和序列7所示的单链DNA组成的引物对。
所述引物对或所述成套引物对或所述试剂盒在鉴定待测大豆基因组中Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸为G还是A中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定待测大豆是否为大豆黄色突变体的方法。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测大豆是否为大豆黄色突变体的方法，具体可包括如下步骤：检测待测大豆的基因组中Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸为A还是G还是A和G，根据检测结果按照如下确定所述待测大豆是否为大豆黄色突变体：若所述待测大豆的基因组中Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸为A，则所述待测大豆为或候选为大豆黄色突变体；若所述待测大豆的基因组中Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸为G或者为A和G，则所述待测大豆不为或候选不为大豆黄色突变体。
更加具体的，本发明所提供的方法可为如下(A)-(C)中任一种：
(A)包括：
(A1)以待测大豆的基因组DNA为模板，采用所述引物对A(序列4和序列5)进行PCR扩增，得到PCR产物；
(A2)对步骤(A1)所得的PCR产物进行测序，根据测序结果按照如下方法确定所述待测大豆的是否为大豆黄色突变体：若所述PCR产物的序列为序列表中序列2，第644位核苷酸为A，则所述待测大豆为或候选为大豆黄色突变体；若所述PCR产物的序列为序列表中序列2，第644位核苷酸为G或为G与A的叠加(所述G与A的叠加是由于所述待测大豆为杂合，测序图上该位点呈现G与A的叠加峰)，则所述待测大豆不为或候选不为大豆黄色突变体(即为或候选为野生型大豆)；
(B)包括：
(B1)以待测大豆的基因组DNA为模板，采用所述引物对A(序列4和序列5)进行PCR扩增，得到PCR产物1；再以所述PCR产物1为模板，采用所述引物对B(序列6和序列7)进行PCR扩增，得到PCR产物2；
(B2)对步骤(B1)所得的PCR产物2进行测序，根据测序结果按照如下方法确定所述待测大豆的是否为大豆黄色突变体：若所述PCR产物2的序列为序列表中序列3，第242位核苷酸为A，则所述待测大豆为或候选为大豆黄色突变体；若所述PCR产物2的序列为序列表中序列3，第242位核苷酸为G或为G与A的叠加(所述G与A的叠加是由于所述待测大豆为杂合，测序图上该位点呈现G与A的叠加峰)，则所述待测大豆不为或候选不为大豆黄色突变体(即为或候选为野生型大豆)；
(C)包括：
(C1)以待测大豆的基因组DNA为模板，采用所述引物对A(序列4和序列5)进行PCR扩增，得到PCR产物1；以所述PCR产物1为模板，采用所述引物对B(序列6和序列7)进行PCR扩增，得到PCR产物2；再采用所述限制性内切酶MboII对所述PCR产物2进行酶切，得到酶切产物；
(C2)根据步骤(C1)所得的酶切产物，按照如下方法确定所述待测大豆的是否为大豆黄色突变体：若所述酶切产物仅为320bp的DNA片段，则所述待测大豆为或候选为大豆黄色突变体；若所述酶切产物为254bp和66bp的两个DNA片段，或为254bp、66bp和320bp的三个DNA片段(由于所述待测大豆为杂合，因此所述PCR产物2既有不能被所述限制性内切酶MboII切开的DNA片段，也有可以被所述限制性内切酶MboII切开的DNA片段)，则所述待测大豆不为或候选不为大豆黄色突变体(即为或候选为野生型大豆)。
在所述(C2)中，所述320bp的DNA片段具体为序列表中序列3所示DNA片段，第242位核苷酸为A。所述254bp和66bp的两个DNA片段分别为序列表中序列3的第1-254位所示DNA片段以及序列表中序列3的第255-320位所示DNA片段，所述序列表中序列3的第1-254位所示DNA片段中对应序列3的第242位的核苷酸为G。
在本发明中，所述Glyma13g30560基因(大豆基因组中的Glyma13g30560基因)的核苷酸序列具体为序列表中序列1。
所述大豆黄色突变体为由于大豆基因组中所述Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸发生由G到A的纯合突变所造成的植株黄色突变体。
在本发明中，所述大豆黄色突变体具体为大豆品种中黄601(该材料的子/真叶、茎、未成熟荚等颜色均为黄色)。
在上述方法中，以所述引物对A或所述引物对B进行PCR扩增的退火温度均具体可为58℃。
在本发明的一个实施例中，所述待测大豆具体选自大豆品种中黄601×大豆品种中品661的杂交后代，如F2分离群体。在本发明的另一个实施例中，所述待测大豆具体选自大豆品种中黄601、Peking、冀豆12、中黄35、中黄39和大豆野生种ZYD3687。
实验证明，本发明提供的功能标记可以准确用于本发明所示的大豆黄色突变体与野生型组配后代真伪性鉴定及其它相关研究工作。
附图说明
图1为大豆(Glycine max(L.)Merr.)品种中品661(左)及其黄色突变体(即中黄601，该材料的子/真叶、茎、未成熟荚等颜色均为黄色)(右)的表型。
图2为SNP133-4等4对引物的PCR扩增产物。Marker：1K bp；1：5个样品(3个突变型、2个野生型)基因组DNA经引物SNP133-4的扩增产物；2：5个样品(3个突变型、2个野生型)基因组DNA经引物SNP133-3的扩增产物；3：5个样品(3个突变型、2个野生型)基因组DNA经引物SNP133-2的扩增产物；4：5个样品(3个突变型、2个野生型)基因组DNA经引物SNP133-1的扩增产物。
图3为F2代部分黄色突变体和部分显性纯合野生型的扩增产物在线比对结果。1-36、1-37为两个黄色突变体；1-38、1-39、1-40为三个显性纯合野生型。
图4为F2代引物SNP13g-3的PCR扩增产物。Marker：100bp；1：两个野生型基因组DNA经引物SNP13g-3的扩增产物；2：两个突变型基因组DNA经引物SNP13g-3的扩增产物。
图5为F2代以引物SNP13g-3的PCR扩增产物为底物的MboII酶切产物。Marker：100bp；1：野生型基因组DNA经引物SNP13g-3扩增后的MboII酶切产物；2：突变型基因组DNA经引物SNP13g-3的扩增后的MboII酶切产物。
图6为Peking等5个野生型品种和黄化突变体的SNP133-4引物的PCR扩增产物。M：100bp Marker；1：冀豆12；2：Peking；3：中黄35；4：中黄39；5：ZYD3687；6：黄化突变体中黄601。
图7为Peking等5个野生型品种和黄化突变体的以引物SNP13g-3的PCR扩增产物为底物的MboII酶切结果。M：100bp Marker；1：冀豆12；2：Peking；3：中黄35；4：中黄39；5：ZYD3687；6：黄色突变体中黄601。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
大豆(Glycine max(L.)Merr.)品种中品661：记载于“黄淮海大豆改良种质,张孟臣等主编,2014年新华书店发行”，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
大豆(Glycine max(L.)Merr.)品种中黄601：国家农作物种质库(网址：http://icgr.caas.net.cn)，统一编号为ZDD25362，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。中黄601为大豆(Glycine max(L.)Merr.)品种中品661的植株黄色突变体。
大豆(Glycine max(L.)Merr.)品种Peking和中黄39：均记载于“姜静涵.大豆苗期耐盐机理研究及耐盐基因定位.中国农业科学院,生物化学与分子生物学,2013,硕士论文”，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
大豆(Glycine max(L.)Merr.)品种冀豆12：记载于“陈强,闫龙,杨春燕等.冀豆12遗传背景下3个回交组合高低蛋白含量后代品系SSR标记分析.中国农业科学,2014年02期”，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
大豆(Glycine max(L.)Merr.)品种中黄35：记载于“魏建军,罗赓彤,张力等.中黄35超高产大豆群体的生理参数.作物学报,2009年03期”，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
大豆(Glycine max(L.)Merr.)野生种ZYD3687：记载于“张涛.盐生和中生大豆属植物的结构比较研究.东北师范大学,植物学,2008,博士论文”，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
实施例1、大豆黄色突变体中黄化基因Glyma13g30560变异位点的鉴定
供试植株：大豆(Glycine max(L.)Merr.)品种中品661(野生型，叶色正常，为绿色)及植株黄色突变体(即中黄601)，表型见图1。
从大豆(Glycine max(L.)Merr.)品种中品661及其黄色突变体中黄601的幼苗叶片中分别提取基因组DNA，以此为模板，用SNP133-1、SNP133-2、SNP133-3及SNP133-4四对引物分别进行PCR扩增，各引物在大豆基因组中Glyma13g30560(Glycine max Wm82.a1.v1，下同)基因(序列1)上的PCR扩增区间及对应PCR产物的长度如表1所示。
表1用以PCR扩增的引物扩增区间
其中，引物SNP133-4(F1和R1)的PCR扩增区间跨越大豆Glyma13g30560基因整个第三外显子序列，其引物序列及在基因Glyma13g30560(序列1)上对应的碱基位置如下：
F1：5'-TGTGTGGTTGTGTGAGTGTT-3'(序列4，对应序列1的第1084-1103位)；
R1：5'-TCGACATCCCACCCAAGTTT-3'(序列5，位于大豆基因组中Glyma13g30560基因下游)。
SNP133-1 SNP133-2、SNP133-3等引物序列略，但PCR反应体系及检测方法均相同。
PCR反应扩增体系：DNA 4μl(20ng/μl)；rTaq酶0.3μl；2×GC Buffer I 15μl；2.5mM dNTPs 2.5μl；上下游引物(F/R)3.0μl(2μM)；ddH2O补足到30μl。
PCR反应程序：先94℃5min；然后94℃30S，58℃40S，72℃1min30S，扩增38个循环；最后72℃延伸10min，4℃保温。
反应结束后，将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
结果显示，所得PCR产物长度均如预期所示(图2)，并进一步对PCR扩增产物进行测序。4对引物中只有引物SNP133-4(序列4和序列5)的扩增序列在黄色突变体(中黄601)与野生型之间存在碱基序列的改变。即基因Glyma13g30560(序列1)的第1727位发生了碱基改变，由野生型碱基G变为突变型碱基A。采用引物SNP133-4(序列4和序列5)进行PCR扩增，黄色突变体(中黄601)的扩增产物的序列为序列表中序列2，第644位核苷酸为A(对应序列1的第1727位核苷酸)；大豆(Glycine max(L.)Merr.)品种中品661的扩增产物的序列为序列表中序列2，第644位核苷酸为G(对应序列1的第1727位核苷酸)。通过进一步对中品661及其黄色突变体(中黄601)进行测序，发现两者的基因组序列差异仅在于基因Glyma13g30560(序列1)的第1727位核苷酸。
实施例2、大豆黄色相关基因分子标记在基因型检测中的应用
一、大豆黄色相关基因分子标记在F2代个体基因型检测中的应用
为了进一步验证实施例1发现的SNP位点与表型之间的连锁关系，从F2(大豆黄化突变体中黄601×大豆中品661)分离群体中选取了169个单株(叶色为绿色的野生型个体85株，黄化个体84株)，分别提取基因组DNA，用以检测突变体与野生型两者基因型。
方法1：PCR产物测序法检测变异位点
1、引物SNP133-4的PCR扩增
以上述169份F2DNA溶液为模板，用引物SNP133-4(序列4和序列5)进行PCR扩增。
PCR反应扩增体系：DNA模板4μl(20ng/μl)；rTaq酶0.3μl；2×GCBuffer I 15μl；2.5mM dNTPs 2.5μl；上下游引物(F/R)3.0μl(2μM)；ddH2O补足至30μl。
PCR反应程序：先94℃5min；然后94℃30S，58℃40S，72℃1min30S，扩增38个循环；最后72℃延伸10min，4℃保温。
将所得PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，140V电压，20min。
结果显示，所得PCR产物长度为1341bp，为目的扩增条带。
2、PCR产物测序
对所得PCR扩增产物(1341bp)分别进行双向测序。测序结果经在线比对显示，基因Glyma13g30560(序列1)的第1727位的碱基变化与F2个体表型间存在共分离。即所有F2黄化个体的测序结果第644位碱基为A(单峰)(隐性纯合)；而F2代野生型(叶色正常，为绿色)中有47株测序结果第644位碱基为G(单峰)(显性纯合)，另外38株的测序结果第644位碱基呈现G与A的叠加双峰(杂合)。即通过对PCR产物直接测序便可以准确鉴定F2个体基因型。部分黄化个体和部分显性纯合野生型的扩增产物在线比对结果如图3所示。
方法2：PCR产物限制性酶切法检测变异位点
1、引物SNP133-4的PCR扩增
同样以上述169份F2 DNA溶液为模板，用引物SNP133-4(序列4和序列5)进行PCR扩增。
PCR反应扩增体系：DNA模板4μl(20ng/μl)；rTaq酶0.3μl；2×GCBuffer I 15μl；2.5mM dNTPs 2.5μl；上下游引物(F/R)3.0μl(2μM)；ddH2O补足至30μl。
PCR反应程序：先94℃5min；然后94℃30S，58℃40S，72℃1min30S，扩增38个循环；最后72℃延伸10min，4℃保温。
将所得PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，140V电压，20min。
结果显示，所得PCR产物长度为1341bp，为目的扩增条带。
2、引物SNP13g-3二次扩增
以引物SNP133-4的扩增产物为模板，用引物SNP13g-3(F2和R2)进行第二轮PCR扩增。
F2：5'-TAGAGTGTGTGGAACGATTGAC-3'(序列6，对应于序列1的第1486-1507位)；
R2：5'-GCTCAGCATCCCTAACAGT-3'(序列7，对应于序列1的第1787-1805位的反向互补序列)。
PCR反应体系：DNA模板4μl；rTaq酶0.3μl；2×GCBuffer I 15μl；2.5mM dNTPs 2.5μl；上下游引物(F/R)3.0μl(2μM)；ddH2O补足至30μl。
PCR反应程序：先94℃5min；然后94℃30S，58℃40S，72℃35S，扩增38个循环；最后72℃延伸10min，4℃保温。
反应结束后，将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
结果显示，所得PCR产物为单一条带，长度为320bp(图4)。
3、限制性内切酶MboII单酶切
由于基因Glyma13g30560(序列1)的第1727位的碱基变化(SNP＝G/A)，使得：当为G(野生型)时形成限制性内切酶MboII的识别序列(GAAGA(N)8↓，下划线处为突变碱基，↓表示酶切位置)，可以被MboII切开；而当为A(突变型)时不能形成限制性内切酶MboII的识别序列，因而不能被MboII切开。
将经步骤2扩增得到的片段用限制性内切酶MboII单酶切。酶切体系：DNA 1μg；限制性内切酶MboII 1μl；10×NEBuffer 5μl；补ddH2O至总体积为50μl。与待酶切的DNA量相比，确保酶切体系中MboII酶的用量充足。酶切条件：37℃温浴0.5h；反应结束后，65℃温浴20min终止酶切反应。
将酶切产物再次进行2％琼脂糖凝胶电泳检测。
结果显示：F2代野生型(显性纯合)的PCR产物被MboII完全酶切，得到254bp与66bp两个片段；F2代野生型(杂合)的PCR产物被MboII部分酶切，得到254bp、66bp和320bp三条片段；而F2代黄化个体(隐性纯合)的PCR产物不能被MboII酶切，得到320bp的单一片段。部分黄化个体和部分显性纯合野生型的酶切产物电泳图如图5所示。
将上述320bp的DNA片段回收测序，发现其序列为序列表中序列3，第242位核苷酸为A。将上述254bp的DNA片段回收测序，发现其序列为序列表中序列3的第1-254位(序列3的第242位为G)；将上述66bp的DNA片段回收测序，发现其序列为序列表中序列3的第255-320位，与预期结果完全一致。
二、大豆黄色相关基因分子标记在大豆品种基因型鉴定中的应用
本发明同时选取了部分大豆品种，用于检验本发明提供的变异基因型是否存在一定的普遍性，同时检验本发明提供的功能标记在基因型检测中的可行性。
选取的大豆品种包括4个野生型栽培品种、1个野生种及1个黄化突变体。栽培品种包括Peking、冀豆12、中黄35、中黄39，叶色均正常，为绿色。野生种为ZYD3687，叶色正常，为绿色。黄化突变体即为中黄601。
将上述大豆品种各取5粒籽粒，种在光照培养箱，待约15日后出现第一个三出复叶时，分别取少许叶片组织提取基因组DNA，稀释到20ng/μl备用。
方法1：PCR产物测序法检测变异位点
1、引物SNP133-4的PCR扩增
以上述基因组DNA为模板，用引物SNP133-4(序列4和序列5)进行PCR扩增。
PCR扩增体系及反应程序如下：
PCR反应扩增体系：DNA 4μl(20ng/μl)；rTaq酶0.3μl；2×GCBuffer I 15μl；2.5mMdNTPs 2.5μl；上下游引物(F/R)3.0μl(2μM)；ddH2O 6.2μl；总体积为30μl。
PCR反应程序：先94℃5min；然后94℃30S，58℃40S，72℃1min30S，扩增38个循环；最后72℃延伸10min，4℃保温。
经1％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR扩增产物均在1400bp左右(图6)。
2、PCR产物测序
对所有PCR产物进行双向测序。测序结果经Seqman软件处理及Multalin在线比对，发现前述6个品种的PCR扩增产物序列存在碱基差异，即4个野生型栽培种和1个野生种在基因Glyma13g30560(序列1)的第1727位的碱基为G，而黄色突变体(中黄601)对应为突变型碱基A。即黄色突变体(中黄601)的扩增产物序列为序列表中序列2(第644位核苷酸为A)，4个野生型栽培种和1个野生种的扩增产物的序列为序列表中序列2(第644位核苷酸为G)。
方法2：PCR产物限制性酶切法检测变异位点
1、引物SNP133-4的PCR扩增
以上述基因组DNA为模板，用引物SNP133-4(序列4和序列5)进行PCR扩增。
PCR扩增体系及反应程序如下：
PCR反应扩增体系：DNA 4μl(20ng/μl)；rTaq酶0.3μl；2×GCBuffer I 15μl；2.5mMdNTPs 2.5μl；上下游引物(F/R)3.0μl(2μM)；ddH2O 6.2μl；总体积为30μl。
PCR反应程序：先94℃5min；然后94℃30S，58℃40S，72℃1min30S，扩增38个循环；最后72℃延伸10min，4℃保温。
经1％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR扩增产物均在1400bp左右(图6)。
2、引物SNP13g-3的二次扩增
以SNP133-4引物的PCR产物为扩增模板，用标记SNP13g-3进行第二轮PCR扩增。
PCR反应程序：先94℃5min；然后94℃30S，58℃40S，72℃35S，扩增38个循环；最后72℃延伸10min，4℃保温。
反应结束后，将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
结果显示，上述6个样品PCR产物为均为单一条带，长度为320bp。
3、限制性内切酶MboII单酶切
将扩增产物用MboII单酶切，并将酶切产物再次进行2％琼脂糖凝胶电泳检测。酶切体系：DNA 1μg；限制性内切酶MboII 1μl；10×NEBuffer 5μl；补ddH2O至总体积为50μl。与待酶切的DNA量相比，确保酶切体系中MboII酶的用量充足。酶切条件：37℃温浴0.5h；反应结束后，65℃温浴20min终止酶切反应。
从电泳结果可知，4个野生型栽培种和1个野生种的PCR产物均被酶切为254bp与66bp两个片段，黄化突变体的酶切产物则是长度为320bp的单一片段(图7)。由此可知，4个野生型栽培种和1个野生种因含有可被MboII识别的酶切位点碱基(GAAGA(N)8↓)发生了酶切反应，而黄化突变体因酶切位点识别碱基发生了改变(AAAGA(N)8↓)，则不能为MboII酶切。
将上述320bp DNA片段回收测序，发现其序列为序列表中序列3，第242位核苷酸为A。将上述254bp的DNA片段回收测序，发现其序列为序列表中序列3的第1-254位(序列3的第242位为G)；将上述66bp的DNA片段回收测序，发现其序列为序列表中序列3的第255-320位，与预期结果一致。
Claims (15)
1.用于鉴定大豆基因组中Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸为G还是A的物质在鉴定大豆黄色突变体中的应用；
所述大豆黄色突变体为由于大豆基因组中所述Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸发生由G到A的纯合突变所造成的黄色突变体。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述用于鉴定大豆基因组中Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸为G还是A的物质包括引物对；所述引物对中的上游引物根据所述大豆基因组中Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸的上游序列进行设计，所述引物对中的下游引物根据所述大豆基因组中Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸的下游序列进行设计。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述用于鉴定大豆基因组中Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸为G还是A的物质为如下(a)或(b)或(c)：
(a)引物对A；
(b)所述引物对A和引物对B；
(c)所述引物对A、所述引物对B和限制性内切酶Mbo II；
所述引物对A为由序列表中序列4所示的单链DNA和序列5所示的单链DNA组成的引物对；所述引物对B为由序列表中序列6所示的单链DNA和序列7所示的单链DNA组成的引物对。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述Glyma13g30560基因的核苷酸序列为序列表中序列1。
5.引物对，为由序列表中序列4所示的单链DNA和序列5所示的单链DNA组成的引物对；
所述引物对具有如下功能中的至少一种：
(1)鉴定大豆黄色突变体；所述大豆黄色突变体为由于大豆基因组中所述Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸发生由G到A的纯合突变所造成的黄色突变体；
(2)鉴定待测大豆基因组中Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸为G还是A。
6.根据权利要求5所述的引物对，其特征在于：所述Glyma13g30560基因的核苷酸序列为序列表中序列1。
7.成套引物对，由引物对A和引物对B组成：
所述引物对A为由序列表中序列4所示的单链DNA和序列5所示的单链DNA组成的引物对；所述引物对B为由序列表中序列6所示的单链DNA和序列7所示的单链DNA组成的引物对；
所述成套引物对具有如下功能中的至少一种：
(1)鉴定大豆黄色突变体；所述大豆黄色突变体为由于大豆基因组中所述Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸发生由G到A的纯合突变所造成的黄色突变体；
(2)鉴定待测大豆基因组中Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸为G还是A。
8.根据权利要求7所述的成套引物对，其特征在于：所述Glyma13g30560基因的核苷酸序列为序列表中序列1。
9.试剂盒，含有引物对A、引物对B和限制性内切酶Mbo II；
所述引物对A为由序列表中序列4所示的单链DNA和序列5所示的单链DNA组成的引物对；所述引物对B为由序列表中序列6所示的单链DNA和序列7所示的单链DNA组成的引物对；
所述试剂盒具有如下功能中的至少一种：
(1)鉴定大豆黄色突变体；所述大豆黄色突变体为由于大豆基因组中所述Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸发生由G到A的纯合突变所造成的黄色突变体；
(2)鉴定待测大豆基因组中Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸为G还是A。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述Glyma13g30560基因的核苷酸序列为序列表中序列1。
11.权利要求5所述的引物对或权利要求7所述的成套引物对或权利要求9所述的试剂盒在鉴定待测大豆基因组中Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸为G还是A中的应用。
12.一种鉴定或辅助鉴定待测大豆是否为大豆黄色突变体的方法，包括如下步骤：检测待测大豆的基因组中Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸为A还是G还是A和G，根据检测结果按照如下确定所述待测大豆是否为大豆黄色突变体：若所述待测大豆的基因组中Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸为A，则所述待测大豆为或候选为大豆黄色突变体；若所述待测大豆的基因组中Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸为G或者为A和G，则所述待测大豆不为或候选不为大豆黄色突变体；
所述大豆黄色突变体为由于大豆基因组中所述Glyma13g30560基因的第1727位核苷酸发生由G到A的纯合突变所造成的黄色突变体。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述方法为如下(A)-(C)中任一种：
(A)包括：
(A1)以待测大豆的基因组DNA为模板，采用权利要求5所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；
(A2)对步骤(A1)所得的PCR产物进行测序，根据测序结果按照如下方法确定所述待测大豆是否为所述大豆黄色突变体：若所述PCR产物的序列为序列表中序列2，第644位核苷酸为A，则所述待测大豆为或候选为所述大豆黄色突变体；若所述PCR产物的序列为序列表中序列2，第644位核苷酸为G或为G与A的叠加，则所述待测大豆不为或候选不为所述大豆黄色突变体；
(B)包括：
(B1)以待测大豆的基因组DNA为模板，采用权利要求7所述成套引物对中的所述引物对A进行PCR扩增，得到PCR产物1；再以所述PCR产物1为模板，采用权利要求7所述成套引物对中的所述引物对B进行PCR扩增，得到PCR产物2；
(B2)对步骤(B1)所得的PCR产物2进行测序，根据测序结果按照如下方法确定所述待测大豆是否为所述大豆黄色突变体：若所述PCR产物2的序列为序列表中序列3，第242位核苷酸为A，则所述待测大豆为或候选为所述大豆黄色突变体；若所述PCR产物2的序列为序列表中序列3，第242位核苷酸为G或为G与A的叠加，则所述待测大豆不为或候选不为所述大豆黄色突变体；
(C)包括：
(C1)以待测大豆的基因组DNA为模板，采用权利要求9所述试剂盒中的所述引物对A进行PCR扩增，得到PCR产物1；以所述PCR产物1为模板，采用权利要求9所述试剂盒中的所述引物对B进行PCR扩增，得到PCR产物2；再采用权利要求9所述试剂盒中的所述限制性内切酶Mbo II对所述PCR产物2进行酶切，得到酶切产物；
(C2)根据步骤(C1)所得的酶切产物，按照如下方法确定所述待测大豆是否为所述大豆黄色突变体：若所述酶切产物仅为320bp的DNA片段，则所述待测大豆为或候选为所述大豆黄色突变体；若所述酶切产物为254bp和66bp的两个DNA片段，或为254bp、66bp和320bp的三个DNA片段，则所述待测大豆不为或候选不为所述大豆黄色突变体。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述(C2)中，所述320bp的DNA片段为序列表中序列3所示DNA片段，第242位核苷酸为A；
所述254bp和66bp的两个DNA片段分别为序列表中序列3的第1-254位所示DNA片段以及序列表中序列3的第255-320位所示DNA片段，所述序列表中序列3的第1-254位所示DNA片段的第242位核苷酸为G。
15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述Glyma13g30560基因的核苷酸序列为序列表中序列1。
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