CN104513859A - 水稻粒长基因gs3的功能标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于农业生物技术领域，提供了一种水稻粒长基因GS3的功能标记及其应用，通过设计合成了三条引物：gs3In、gs3F和gs3R，三条引物同时在PCR体系中对不同水稻DNA 进行扩增，然后对扩增产物通过电泳检测是否含有gs3等位基因。此过程中，扩增产物不需要进行酶切，直接通过电泳就能检测出是否含有gs等位基因，简化了步骤，不仅能快速、准确的鉴定水稻种质资源或育种群体是否含有gs等位基因，而且在育种应用中加速了选育进程，提高了效率。

Description

水稻粒长基因GS3的功能标记及其应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，涉及一种水稻粒长基因GS3的功能标记及其应用。
背景技术
水稻是重要的粮食作物，为全球一半的人口提供口粮。随着世界人口的增长，水稻作为主要粮食作物面临着提高产量的迫切需要。预计到2030年，水稻产量需要提高40％以上才能满足人类的需要。
水稻单株产量是由有效穗数、每穗粒数和粒重三个因素共同决定的，对于水稻的整体产量而言，这三个因素表面上是独立的但又相互关联，很多情况下会出现此消彼长的矛盾。在有效穗数和每穗粒数达到一个相对理想的较高水平时，提高籽粒的重量将是提高水稻产量的关键因素之一。研究表明，水稻粒重是由水稻粒长和粒宽决定的，最先鉴定的控制水稻粒长的主效QTL(quantitative trait locus，数量性状基因座)位点GS3是控制水稻粒重和粒长的主效QTL，同时也是控制水稻粒宽和籽粒充实度的微效QTL。GS3cDNA全长956bp，包含5个外显子，编码为一个由232个氨基酸组成的跨膜蛋白。经过序列分析表明，与小粒品种相比，大粒品种GS3第2外显子中编码第55位半胱氨酸的密码子TGC突变成终止密码子TGA，造成蛋白翻译提前终止(缺失了178个氨基酸)。
现有研究中，GS3开发有功能标记sf28，由正反两条引物构成，PCR扩增后需要限制性内切酶切消化过夜，再进行电泳检测，成本高，耗时长，不适应高通量的分子标记辅助选择。
发明内容
针对以上技术问题，本发明提供了一种水稻粒长基因GS3的功能标记及其应用。
水稻粒长基因GS3的功能标记，所述水稻粒长基因GS3的粒长等位基因的显性分子标记M-GS3由三条引物构成：
gs3F引物：ATTGGCTTGATTTCCTGTGC；
gs3In引物：GCAGGCTGGCTTACTTTCTT；
gs3R引物：TTGCTCTTACGGGAGGACAC；
其中，所述gs3In的序列与所述GS3等位基因匹配，并在3’末端引入一个错配。
作为本发明的进一步改进，扩增水稻基因组DNA时，如果同时含有720bp和308bp两条特征条带，则为含粒长gs3等位基因；如果仅含有720bp的特征条带，则为不含粒长gs3等位基因。
作为本发明的进一步改进，所述水稻粒长基因GS3的功能标记采用以下步骤进行分子标记：
步骤1)：水稻植株基因组DNA的提取；
步骤2)：PCR扩增：将所述的gs3F、gs3In和gs3R引物加入到PCR反应体系中，并对所述水稻植株基因组DNA进行扩增得到扩增产物；所述PCR反应程序为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s、55℃变性30s、72℃变性45s，循环35次；然后72℃延伸10min后得到扩增产物；
步骤3)：将扩增产物在质量比浓度为1.2％的琼脂糖凝胶中电泳，然后溴化乙锭染色，紫外灯下观察并拍照得到电泳图；
步骤4)：根据电泳图进行分析，如果同时含有720bp和308bp两条特征条带，则为含粒长gs3等位基因；如果仅含有720bp的特征条带，则为不含粒长gs3等位基因，为短粒品种。
作为本发明的进一步改进，上述步骤中，所述PCR反应体系为20μL的体系：2.0μL的10×Buffer、2.0μL的dNTPs、4mol/L的gs3F、4mol/L的gs3In和4mol/L的gs3R引物各1.0μL、0.2μL Taq DNA聚合酶，2.0μL模板DNA，12.8μL ddH2O。
本发明还提供了水稻粒长基因GS3的功能标记在水稻育种中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明针对技术问题，设计了一条能匹配长粒等位基因gs3的引物gs3In(3’端错配一个碱基)，并在其上游一条引物gs3F，下游设计一条gs3R。三条引物同时在PCR体系中进行扩增，长粒等位基因gs3的序列与gs3In只有一个碱基错配，故gs3F与gs3In之间的308bp能扩增出来；而短粒等位基因GS3与引物gs3In有两个碱基错配，则308bp的带就不能扩增出来。这样，扩增产物不需要进行酶切，直接电泳检测是否含有308bp的条带，就能检测出是否含有gs等位基因；简化了步骤，不仅能快速、准确的鉴定水稻种质资源或育种群体是否含有gs等位基因，而且在育种中加速了选育进程，提高了效率。
附图说明
图1是本发明粒长等位基因的扩增示意图；
图2是本发明检测24个水稻品种分子标记的电泳图。
图中，M为Marker200，从上到下条带分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、200bp和100bp；1-II-32B；2-BX-16；3-岗46B；4-特B；5-良丰B；6-112B；7-西菲B；8-龙丰B；9-博IIB；10-158B；11-地谷B；12-福伊B；13-谷梅4号；14-02428；15-南粳46；16-BL122；17-博IIIB；18-协青早B；19-B5；20-IRBB7；21-L427；22-金23B；23-内香B；24-泰丰B。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例对本发明技术方案作进一步地详述。
实施例1
具体实施步骤如下：
(1)水稻基因组DNA提取
分别取种植于南宁的24份水稻叶片，通过CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵法)提取水稻基因组DNA；
(2)PCR扩增
PCR反应体系为20μL的体系：2.0μL 10×Buffer，2.0μL dNTPs，gs3F、gs3In和gs3R引物各1.0μL(4mol/L)，0.2μL Taq DNA聚合酶，2.0μL模板DNA，12.8μL ddH2O。PCR反应程序为94℃5min；然后94℃30s、55℃30s、72℃45s，循环35次；最后72℃延伸10min得到扩增产物；
(3)将扩增产物在1.2％琼脂糖凝胶中进行电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察拍照得到电泳图；
(4)结果与分析：
24个水稻品种的分子标记的电泳图详见图1，24个水稻品种的粒长表型和基因性详见表1。由图1和表1可见：基因型为“+”为图1中有720bp和308bp两条带的品种，其粒长较长；基因性为“-”为图1中仅有720bp条带的品种，其粒长均较短。
表1 24个水稻品种及其粒长表型和基因性
编号 品种 粒长mm 基因型 编号 品种 粒长mm 基因型
1 II-32B 7.6 - 13 谷梅4号 7.5 -
2 BX-16 13.1 + 14 02428 6.7 -
3 岗46B 7.8 - 15 南粳46 7.6 -
4 特B 8.2 - 16 BL122 8.1 -
5 良丰B 9.5 + 17 博IIIB 8.4 -
6 112B 8.5 - 18 协青早B 10.0 +
7 西菲B 7.4 - 19 B5 10.1 +
8 龙丰B 8.8 + 20 IRBB7 9.7 +
9 博IIB 7.9 - 21 L427 9.6 +
10 158B 8.7 + 22 金23B 10.0 +
11 地谷B 8.4 - 23 内香B 10.4 +
12 福伊B 8.4 - 24 泰丰B 11.9 +
备注：基因型为“+”为图1中有720bp和308bp两条带的品种，基因性为“-”为图1中仅有720bp条带的品种；
以下结合实施例2对水稻粒长基因GS3的功能标记在水稻育种中的应用进行说明。
实施例2：
实验目的：标记辅助改良保持系美B的粒长
实施方案：水稻三系保持系美B是在广西晚稻主载的亲本之一，其粒长为7.9mm，而宜香B的粒长为10.1mm。我们用美B与宜香B杂交，然后用美B为母本，后代用标记M-GS3选择含粒长等位基因GS3存在的单株为父本连续回交到BC2F1，然后自交，最后选择到农艺性状与美B一致，且粒长大于9.5mm的株系10个。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.水稻粒长基因GS3的功能标记，其特征在于，所述水稻粒长基因GS3的粒长等位基因的显性分子标记M-GS3由三条引物构成：
gs3F引物：ATTGGCTTGATTTCCTGTGC；
gs3In引物：GCAGGCTGGCTTACTTTCTT；
gs3R引物：TTGCTCTTACGGGAGGACAC。
2.根据权利要求1所述的功能标记，其特征在于：扩增水稻基因组DNA时，如果同时含有720bp和308bp两条特征条带，则为含粒长gs3等位基因；如果仅含有720bp的特征条带，则为不含粒长gs3等位基因。
3.根据权利要求1或2所述的功能标记，其特征在于，采用以下步骤进行分子标记：
步骤1）：水稻植株基因组DNA的提取；
步骤2）：PCR扩增：将所述的gs3F、gs3In和gs3R引物加入到PCR反应体系中，并对所述水稻植株基因组DNA进行扩增得到扩增产物；所述PCR 反应程序为：94 ℃预变性5 min ；然后94℃变性30s、55℃变性30s、72℃变性45s，循环35次；然后72℃延伸10 min 后得到扩增产物；
步骤3）：将扩增产物在质量比浓度为1.2% 的琼脂糖凝胶中电泳，然后溴化乙锭染色，紫外灯下观察并拍照得到电泳图；
步骤4）：根据电泳图进行分析，如果同时含有720bp和308bp两条特征条带，则为含粒长gs3等位基因；如果仅含有720bp的特征条带，则为不含粒长gs3等位基因，为短粒品种。
4.根据权利要求3所述的功能标记，其特征在于：所述PCR反应体系为20μL的体系：2.0μL的 10×Buffer、2.0μL的 dNTPs、4mol/L 的gs3F、4mol/L 的gs3In和4mol/L 的gs3R引物各1.0μL、0.2μL Taq DNA聚合酶，2.0μL模板DNA，12.8μL ddH2O。
5.权利要求1所述的水稻粒长基因GS3的功能标记在水稻育种中的应用。
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