CN103276071B

CN103276071B - 一种水稻直链淀粉含量控制基因Wx的基因型鉴定引物及鉴定方法

Info

Publication number: CN103276071B
Application number: CN201310187877.1A
Authority: CN
Inventors: 蔡海亚; 徐得泽; 吴建平; 游艾青; 周雷; 程建平; 赵锋
Original assignee: Hubei Academy Of Agricultural Sciences Institute Of Food Crops
Current assignee: Hubei Academy Of Agricultural Sciences Institute Of Food Crops
Priority date: 2013-05-20
Filing date: 2013-05-20
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2033-05-20
Also published as: CN103276071A

Abstract

本发明公开了一种水稻直链淀粉含量控制基因Wx的基因型鉴定引物及鉴定方法。Wx基因第一内含子+1位（In1）碱基类型决定了AC高低。本发明开发了一套鉴定Wx In1位点不同碱基类型的功能标记，方法如下：利用该标记及待检测水稻品种基因组DNA进行PCR扩增，In1位点为纯合G或T碱基基因型材料分别扩增出207bp或235bp的特有条带，GT杂合型则同时有这两条条带，并且三者还有一条387bp的共有条带可作为Wx基因存在的参照。因此，本发明的Wx基因型鉴定方法简便快速、费用低廉，可广泛应用于分子标记辅助选择培育具有不同AC品种应用于不同工业用途，或者辅助选择适中AC品种应用于水稻品质育种。

Description

一种水稻直链淀粉含量控制基因Wx的基因型鉴定引物及鉴定方法

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种水稻直链淀粉含量控制基因Wx的基因型鉴定引物，还涉及一种水稻直链淀粉含量基因Wx的基因型鉴定方法，该方法具有简单、准确、成本低并可以在水稻生长早期进行非破坏性检测等优点，适于在育种中对Wx基因型的大量筛选从而选育具有不同直链淀粉含量品种。

技术背景

世界上超过一半的人口以水稻为主食，提高水稻品质一直是育种学家的主要目标。稻米的主要成分是淀粉（约占精米的90%），包括直链淀粉和支链淀粉两种，其中直链淀粉含量（AC）是稻米品质的重要理化指标，AC的高低与米饭的粘性、柔软性、光泽和食味品质密切相关，对米质优劣起主要决定性作用，适中的AC是优质稻米的重要指标，一般将水稻直链淀粉含量分为4个等级：极低（<9%）、低（9～20%）、中（20～25%）和高（>25%），育种实践表明，要获得适中AC的杂交稻,其亲本选配原则是低AC值与中、高AC值配组或中AC值之间配组，因此，选育具有AC差异的不育系和恢复系配组杂交稻是获得适中AC的杂交稻的关键；在工业上不同AC稻米有不同用途，低AC稻米可用于制作婴儿食品，而高AC稻米适于制粉丝、味精、酿啤酒和生物降解材料，因此培育具有不同AC品种满足育种和工业各种需求具有重要的经济效益和社会效益。

多项研究表明，稻米直链淀粉的合成是由水稻Wx基因编码的颗粒结合淀粉合成酶(granule-boundstarchsynthase,GBSS)控制的，AC的高低与Wx基因第一内含子的剪接效率密切相关，若第一内含子+1位置（In1）碱基为G，则第一内含子被高效剪接AC增加；若In1碱基突变为T，则剪接效率降低AC降低，因此，通过鉴别Wx In1 SNP碱基类型即可实现对Wx不同基因型的选择，从而选育具有不同AC品种。目前有多种SNP鉴定方法，包括低通量的测序法、限制性内切酶酶切法；中等通量的SNaPshot、质谱法、高分辨溶解曲线分析法以及高通量的SNP芯片技术，但这些方法多技术繁琐、程序复杂、成本较高，不适于育种中对Wx基因的高通量检测。DNA分子标记技术是一种被广泛应用于育种学、遗传学和物种起源与进化等领域的新型生物技术，是DNA水平上遗传多态性的直接反映，具有众多优点：1）具有较高多态性；2）能够明确辨别等位基因；3）选择中性；4）检测手段简单、快速；5）开发成本和使用成本低廉。根据Wx In1位点序列蔡秀玲等（植物生理与分子生物学学报,2002,28(2):137-144）开发了PCR-AccⅠ分子标记，该标记为共显性标记，但缺点是PCR片段需要酶切，程序繁琐，成本高；毛兴学等（中国水稻科学,2005,19(3):285-287）开发了PCR一步法检测标记，该方法只需简单PCR电泳就可完成，但为显性标记，只能通过电泳条带的有无判断目标位点SNP类型，无法将纯合型单株与杂合型单株区分开，因此也限制了它在育种中的应用。

两对交叉引物PCR（PCR with confronting two-pair primers,PCR-CTPP）是一种操作简便、分型快速、费用低廉的SNP分型方法，该方法通过一次PCR反应和常规电泳技术即可区分3种不同基因型，其基本原理为：引物3′末端错配时延伸效率降低，扩增受阻；在SNP位点上下游设计2条外引物，以SNP突变位点为3′终末端在其两侧设计2条特异性内引物，根据4条引物组合扩增片段的大小和数量鉴定SNP类型，因此，该方法适于一般育种单位的中小型试验室对较大群体的批量检测。

本发明在PCR-CTPP方法的基础上加以改进（图1），通过在内引物倒数第三位引入错配碱基，开发出一套利用PCR电泳便可区分Wx基因In1位点3种不同基因型的功能标记，通过设计4条引物及待测品种基因组DNA进行PCR扩增，根据扩增条带类型判断Wx基因型，In1位点为纯合G型的材料扩增出207bp与387bp条带；纯合T型材料扩增出235bp与387bp条带；GT杂合型材料扩增出207bp、235bp与387bp条带，并且387bp的共有条带可作为Wx基因存在的参照（图2、3），因此利用一次PCR扩增就可将3种不同基因类型材料完美区分，该方法简单可靠、成本低廉，适于田间的大群体筛选检测，提高育种效率。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种水稻直链淀粉含量控制基因Wx的基因型鉴定引物，分别为：WxGF：TACAAATAGCCACCCACA；WxGR：GGGAAACAAAGAATTATAAACATATATGTACAC；WxTF：CATCAGGAAGAACATCTGCAAGT；WxTR：GATCAGCCTAACCAAACA。引物特异性好，扩增效率高，可用于水稻直链淀粉含量控制基因Wx的基因型的鉴定。

本发明的另一个目的是提供了一种水稻直链淀粉含量控制基因Wx的基因型鉴定方法，该方法可以有效的对水稻直链淀粉含量基因Wx进行基因型选择，既可以用于水稻资源的筛选鉴定，又可以用于水稻直链淀粉含量控制基因Wx的分子育种。

为了实现上述目的，本发明采取以下技术措施：

本发明技术方案采取以下思路：

Wx基因位于第6染色体的短臂，由14个外显子和13个内含子组成，编码由609个氨基酸组成的蛋白。在非糯品种中，Wx基因分化为Wx^a和Wx^b两种等位基因，其中，籼稻以Wx^a为主，直链淀粉含量较高；粳稻基本为Wx^b，直链淀粉含量较低。与Wx^a相比，Wx^b的第1内含子+1位置（In1）的碱基发生由G→T的突变导致第1内含子剪接效率降低及剪接不正常，粳型品种中成熟Wx转录本含量降低，GBSS活性下降，从而引起直链淀粉含量下降。本发明的鉴定方法就是通过设计特异性引物对该位点SNP的特异性扩增进行不同等位基因的区分。

引物设计原理如下（图1）：根据PCR-CTPP方法原理，首先为扩增G型等位基因在In1上游设计一个Tm较低的正向引物WxGF（表1），以Wx In1碱基G作为反向引物WxGR的3′端，理论上该位点和G型等位基因正常结合扩增而和T型等位基因形成GT错配无法扩增，而我们实验结果表明仅有GT错配的引物在两种基因型的材料中扩增出相同条带无法区分两种基因型，据报道碱基错配不稳定性强度依次为：GA/CT/TT>CC>AA/GG>CA/GT，因此GT错配不稳定性太弱，不足以区分两种不同基因型，因此我们在WxGR的倒数第三位引入了一个错配碱基C与T型等位基因形成CT强不稳定性错配从而增强其特异性，结果表明该引物和正向引物WxGF组合对两种不同等位基因类型扩增时只有G类型有一条207bp的目标条带，T类型没有条带扩增，除在反向引物引入错配碱基外，该引物Tm值一定要高于正向无错配引物10℃以上也是正反向引物正常扩增的关键之一，因为错配碱基的引入会导致引物Tm值降低；同理为扩增T型等位基因，以Wx In1碱基T作为正向引物WxTF的3′端同In1下游设计的一个Tm较低的反向引物WxTR向下游扩增T型基因型，WxTF3′端与T型等位基因正常结合而与G型等位基因形成强不稳定性错配TC，因此没有再引入错配，结果表明WxTF与WxTR对两种不同等位基因类型扩增时只有T类型有一条235bp的目标条带，G类型没有条带扩增。利用4条引物等量混合扩增时不同基因型材料中同样扩增出识别不同基因型的特有条带（207bp或235bp），不过两种基因型均会扩增出一条387bp的共有条带，但对目的条带没任何影响；4条引物名称、序列、Tm值及扩增片段长度见表1所示。

一种水稻直链淀粉含量控制基因Wx的基因型鉴定方法：其步骤如下：

1.水稻DNA的提取

CTAB方法提取水稻DNA。

2.引物设计

引物设计参照珍汕97B和明恢63的Wx基因序列（Genbank登陆号分别为：GQ151066,GQ151064），其In1碱基分别为G和T，利用Primer Premier5.0进行引物设计，Oligo6.0进行引物评价，引物序列由上海赛百盛基因技术有限公司合成，引物序列信息见表1。

表1引物序列

3.PCR扩增

PCR反应体系为20μL，含2.0μL10×Buffer，1.0μL dNTPs（10mmol/L）,4条10μmol/L引物各0.5μL，0.2μL Taq酶（5U/μL）,2.0μL模板DNA，12.8μL ddH2O；PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min，扩增产物在2%（w/v）琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像仪扫描记录结果。

4.结果判断

4条引物等量混合扩增，根据扩增条带类型判断基因型，In1为G碱基的G型等位基因材料扩增出207bp和387bp2条条带，T型等位基因材料扩增出235bp和387bp2条条带，GT杂合型则扩增出207bp、235bp和387bp的3条条带。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明在PCR-CTPP方法的基础上加以改进，利用目标SNP位点开发出仅利用PCR电泳技术即可鉴定亲本及F₂子代不同Wx基因型的共显性分子标记。

2.在利用Wx基因对水稻AC性状改良时，分子标记辅助选择（MAS）在回交过程中成为一种最直接、有效的筛选工具，利用本发明的方法可准确实现子代基因型检测，筛选携带目的基因的个体连续回交后自交纯合从而完成品种改良；在选育具有不同AC品种过程中也可利用该标记筛选Wx基因型，从而选取综合性状优良并携带目的Wx基因型的品种应用于生产。因此，该方法具有简单、准确、成本低并可以在水稻生长早期进行非破坏性检测等一系列优点，适于在育种中对Wx基因型的大量筛选。

附图说明

图1为一种两对交叉引物PCR扩增(PCR-CTPP)方法对水稻Wx In1SNP分型示意图。

图2为一种利用Wx In1SNP分型标记鉴定部分已知基因型的亲本材料电泳示意图。

M:DL500DNA marker;1-11为11份已报道的G型材料，分别是：特青，金23B，鄂金B，中9B，扬稻4号，粤泰B，R287，HR141，HR820，金科1B，R8006；12-23为12份已报道的T型材料，分别为：9311，绵恢725，辐恢838，HD9802S，鄂早18，明恢63，黄华占，岳4A，Y58S，广占63S，早优143，粤泰A。各材料直链淀粉含量标注于对应泳道下方。

图3为一种利用Wx In1分型标记鉴定In1位点分离的F₂群体电泳图。

M:DL500DNA marker;P1，P2为In1分别为G和T碱基的亲本珍汕97与明恢63，1-21为利用两亲本构建的部分F₂单株，各材料所属基因型标注于对应泳道下方。

图4为利用Wx In1分型标记鉴定的53份G型常规水稻品种和97份T型常规水稻品种直链淀粉含量频率分布图。

箭头指向两种不同基因型常规水稻品种直链淀粉含量的平均值。

具体实施方式

本实施例中未特别说明的实验方法即为分子生物学常规方法。本研究所用Taq酶及dNTP产自上海博彩生物科技有限公司，其余均为常规生化试剂

实施例1：一种水稻直链淀粉含量控制基因Wx的基因型鉴定方法其步骤如下：

1）生物材料

G型材料，分别是：特青，金23B，鄂金B，中9B，扬稻4号，粤泰B，R287，HR141，HR820，金科1B，R8006；

T型材料，分别为：9311，绵恢725，辐恢838，HD9802S，鄂早18，明恢63，黄华占，岳4A，Y58S，广占63S，早优143，粤泰A。

2）水稻DNA提取

CTAB方法提取上述材料的DNA。

3）PCR

PCR反应体系为20μL，含2.0μL10×Buffer，1.0μLdNTPs（10mmol/L）,4条10μmol/L引物各0.5μL（引物序列见表1），0.2μL Taq酶（5U/μL）,2.0μL模板DNA，12.8μL ddH₂O；PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min，扩增产物在2%(w/v)琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像仪扫描记录结果。

4）结果分析

1-11泳道为G型材料，利用本发明标记扩增结果均有一条207bp的特异性条带和一条387bp的共有条带，12-23泳道为T型材料，扩增结果均有一条235bp的特异性条带和一条387bp的共有条带，因此该标记通过207bp条带和235bp条带将两种不同Wx等位基因类型的纯合型材料区分开，通过检测各品种直链淀粉含量表明G型材料处于20.6-27.1%之间，T型材料处于8.2-17.5%之间。

实施例2：Wx In1SNP位点在F₂群体中为单基因分离的鉴定。

1）生物材料

利用亲本珍汕97与明恢63构建F₂群体，选取F₂群体100株单株。

2）CTAB方法提取上述材料的DNA。

3）PCR

过程参见实施例1。

4）结果分析

利用本发明标记对部分F₂群体单株Wx基因型鉴定电泳图谱见图3，其中P1为G型亲本珍汕97，P2为T型亲本明恢63，泳道1-21为21株由两亲本构建的F₂，纯合G型单株具有与G型亲本珍汕97相同的207bp条带，纯合T型具有与T型亲本明恢63相同的235bp条带单株，GT杂合型单株同时有207bp与235bp条带，三种基因型还都有387bp共有条带，单株基因型标注于对应泳道下方，因此该标记为共显性，可区分3种不同基因型；通过对100个单株基因型检测表明，3种不同基因型的分离比为29GG：48GT：23TT经卡方检验符合1:2:1的孟德尔单基因分离比（X²=0.88<X² _0.05=5.99），因此该标记鉴定的目标位点为单基因分离（图3）。

实施例3：不同品种In1SNP位点碱基类型与直链淀粉含量的相关性分析

利用该标记对150份常规水稻品种进行Wx In1碱基鉴定结果表明，T型品种97份，G型品种53份；对两种不同基因型材料个体直链淀粉含量测定表明，T型品种稻米直链淀粉含量平均值13.7%，G型品种稻米直链淀粉含量平均值22.5%（图4），t-检验表明两者存在极显著性差异（P<0.01），单因素方差分析表明Wx In1SNP位点解释直链淀粉含量表型变异的77.8%，因此Wx是控制直链淀粉含量的主效基因，In1G/T替换造成了两种不同基因型材料直链淀粉含量的差异，利用本研究开发的标记可以判定不同水稻品种的Wx基因类型预测品种直链淀粉含量的高低，从而通过对Wx基因遗传选择辅助选育具有不同直链淀粉含量品种，为育种提供帮助。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北省农业科学院粮食作物研究所

<120> 一种水稻直链淀粉含量控制基因Wx的基因型鉴定引物及鉴定方法

<130> 一种水稻直链淀粉含量控制基因Wx的基因型鉴定引物及鉴定方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tacaaatagc cacccaca 18

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gggaaacaaa gaattataaa catatatgta cac 33

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catcaggaag aacatctgca agt 23

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gatcagccta accaaaca 18

Claims

1.一种水稻直链淀粉含量控制基因Wx的基因型鉴定引物，分别为：

WxGF：TACAAATAGCCACCCACA；

WxGR：GGGAAACAAAGAATTATAAACATATATGTACAC；

WxTF：CATCAGGAAGAACATCTGCAAGT；

WxTR：GATCAGCCTAACCAAACA。

2.一种水稻直链淀粉含量控制基因Wx的基因型鉴定方法：其步骤如下：

1)水稻DNA的提取：CTAB方法提取水稻DNA；

2)PCR扩增：

PCR反应体系为20μL，含2.0μL 10×Buffer，10mmol/L dNTPs 1.0μL，4条10μmol/L引物各0.5μL，5U/μL Taq酶0.2μL，2.0μL模板DNA，12.8μL ddH2O；

PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min，扩增产物在2％w/v琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像仪扫描记录结果；

所述的4条引物为：

WxGF：TACAAATAGCCACCCACA；

WxGR：GGGAAACAAAGAATTATAAACATATATGTACAC；

WxTF：CATCAGGAAGAACATCTGCAAGT；

WxTR：GATCAGCCTAACCAAACA；

3)结果判断：

4条引物等量混合扩增待检测品种基因组DNA，根据扩增条带类型判断基因型，In1为G碱基的G型等位基因材料扩增出207bp和387bp 2条条带，T型等位基因材料扩增出235bp和387bp 2条条带，GT杂合型则扩增出207bp、235bp和387bp的3条条带。