CN105010128A - 一种杂交水稻的制种方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种杂交水稻的制种方法，通过父本的分田栽插，花粉的组培增殖，然后再人工授粉，实现杂交水稻的制种，其优势有：1．基本消除了父本、母本花期差异对大面积杂交制种生产活动的影响，极大提高了杂交水稻制种的产量和安全性。2．大规模制种时母本大田间无需栽培父本，有利于机械化生产，提高制种产量，减少了田间除杂的工作量同时也提高了杂交种子的纯度。3．便于籼粳杂交时的大规模制种。4．有利于提高远缘杂交的成功率，可极大的提高杂种组合的杂种优势，从而大幅增产。5．可节省大规模制种时的生产成本，尤其是人工成本。6．节省了大量的栽插父本的田地面积，间接的增产。

Description

一种杂交水稻的制种方法

技术领域

本发明涉及一种杂交水稻的制种方法。

背景技术

杂交水稻指选用两个在遗传上有一定差异，同时它们的优良性状又能互补的水稻品种，进行杂交，生产具有杂种优势的第一代杂交种，用于生产，这就是杂交水稻。杂种优势是生物界普遍现象，利用杂种优势提高农作物产量和品质是现代农业科学的主要成就之一。

现有的杂交水稻的制种，是以雄性不育系作为母本，雄性不育恢复系作为父本，父本母本按照一定的行比相间种植，花期相遇，母本接受父本的花粉而受精结实，生产杂交种子，是一个异交结实的过程。

现有的制种方式具有若干缺陷，1．父本、母本平行种植，不利于机械化栽插及收割；2．现有母本授粉通过竹竿敲击或拉绳赶粉方式，操作繁琐，效率不高；3．生理花期，花时有差异，不能确保父本、母本同期、同时段开花，杂交水稻制种由于父本母本生育期的差异，一般大部分组合制种不能同时播种，两亲本播种时间的差异就是播差期，播差期是根据两个亲本的生育期和生育特性（感光性、感温性、营养生长性）和理想花期相遇的始穗期标准来确定，要确定一个组合的适宜播差期，必须对该组合的亲本进行多年的分期播种试验观察，了解亲本的生育期和生理特性的变化规律，在此基础上，采用时差法、叶差法、温差法来计算确定播差期；某些杂交组合的父母本，开花期间对天气因素（高、低温）的敏感程度不同，因此开花时间有错开，特别是籼粳交的组合粳型，亲本一般开花时间较迟，为11点30以后，而籼型亲本一般在10点30左右，对制种产量有一定影响，特别是籼粳交组合，甚至造成制种失败；4．受外界气候及开花期间天气因素影响较大，一般要求开花期日平均温度26-28度，日最高温度不超过35度，日最低温度不低于21度，昼夜温差大（10度以上），田间湿度在70%-90%，无干热风天气，授粉时最大风速在4m/s以下，光照充足，不会出现3天连续阴雨天气；5.为保证杂种的纯度，一般需在父母本盛花期和种子收割前进行除杂。

发明内容

为了克服现有技术的局限及不足，本发明提供一种杂交水稻的制种方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种杂交水稻的制种方法，包括以下步骤：a. 母本的播种栽插及田间管理；b. 安排父本的播插期，根据生产地的气候条件做好父本的播种栽插及田间管理，与母本分田栽插少量父本，采集足够离体培养需要的花粉，再进行父本花粉的组培增殖及粉碎、贮存、复活环节；c. 在母本盛花期进行人工授粉；d．授粉后母本的田间管理以及杂交种子的收割、干燥及贮藏。

进一步，在步骤a中，根据生产地域的气候条件，安排母本的最适播种期，如母本本身特性适合撒播，则可直接撒播而无需育秧，如母本本身特性需要育秧，可以采用抛秧或者插秧的方式进行栽插，并做好母本后续的田间管理。

进一步，在步骤b中，综合考虑父母本的花期差异，花粉组培增殖所需的时间以及花粉可贮存的时间，安排父本的播期及花粉的组培增殖及粉碎、贮存、复活环节的时间，保证在母本盛花期之前准备好花粉，当生产地域气候条件限制父本的播期时，可异地种植父本。

进一步，在步骤b中，用超微粉碎机粉碎培养的花粉粒。

进一步，在步骤b中，贮存过程为，将花粉置于经过消毒杀菌的环境下，温度为-5摄氏度到10摄氏度，湿度在60%以下。

进一步，在步骤b中，在步骤c进行人工授粉之前，进行花粉的复活环节。

更进一步，在步骤b中，将贮存的花粉取出置于无菌洁净的常温下，回醒6-12小时，实现复活。

进一步，在步骤c中，在母本盛花期用喷粉器将粉碎、贮存、复活的花粉粒喷洒在母本上，进行人工授粉。

为保证授粉质量，在步骤c中，人工授粉时，在母本盛花期，每天喷花粉2-5次，每天12时前后必须喷2-3次。

本发明的有益效果是：1．基本上消除了父本、母本花期差异对大面积杂交制种生产活动的影响，极大提高了杂交水稻制种的产量和安全性。2．大规模制种时母本大田间无需栽培父本，有利于机械化生产，提高制种产量，减少了田间除杂的工作量，同时也提高了杂交种子的纯度。3．便于籼粳杂交时的大规模制种。4．有利于提高远缘杂交的成功率，可极大的提高杂种组合的杂种优势，从而大幅增产。5．可节省大规模制种时的生产成本，尤其是人工成本。6．节省了大量的栽插父本的田地面积，间接的增产。

具体实施方式

本实施例的一种杂交水稻的制种方法，包括以下步骤：

a. 根据生产地域的气候条件，安排母本的最适播种期，如母本本身特性适合撒播，则可直接撒播而无需育秧，如母本本身特性需要育秧，可以采用抛秧或者插秧的方式进行栽插，进行母本的播种栽插，并做好母本后续的田间管理。

b. 根据母本播插期估测母本开花期，综合考虑父母本的花期差异，花粉组培增殖所需的时间以及花粉可贮存的时间，安排父本的播插期，及花粉的组培增殖及粉碎、贮存、复活环节的时间，时间差期上可预留空间，保证在母本盛花期之前准备好花粉，根据生产地的气候条件做好父本的播种栽插及田间管理，与母本分田栽插少量父本，当生产地域气候条件限制父本的播期时，可异地种植父本，然后采集足够离体培养需要的花粉，再进行父本花粉的组培增殖及粉碎、贮存、复活环节，粉碎环节使用超微粉碎机对花粉进行不破壁粉碎，不破壁粉碎保护了花粉的结构，提高了花粉的活性，在需要进行步骤c的人工授粉时，再进行花粉的复活。

c. 在母本盛花期进行人工授粉，在本具体实施方式中，在母本盛花期用喷粉器将复活的花粉粒喷洒在母本上，进行人工授粉。喷粉步骤可以采用多种方式，1是将花粉加水及辅助剂，乳化稀释成花粉液，在母本盛花期，每天喷花粉液2-5次，每天12时前后必须喷2-3次。2是将花粉直接用喷气式喷粉。

d．授粉后母本的田间管理以及杂交种子的收割、干燥及贮藏。

在步骤b中，水稻花粉的采集：可以采用人工手动的方式，将袋子套在父本上，然后抖动父本，从而收集花粉。也可以使用花粉采集机，通过吸粉嘴将父本上落下的花粉吸入花粉杯中，从而达到采集目的。

水稻花粉的组培，即离体培养、增殖过程：包括灭菌、接种和培养。

其中，培养基较为关键，植物组织培养培养基的主要成分包括：

1.无机营养物：无机营养物主要由大量元素和微量元素两部分组成，大量元素主要包括氮、磷、钾、钙、镁和硫六种，氮源通常有硝态氮或铵态氮，但在培养基中用硝态氮的较多，也有将硝态氮和铵态氮混合使用的。磷和硫则常用磷酸盐和硫酸盐来提供。钾是培养基中主要的阳离子，在近代的培养基中，其数量有逐渐提高的趋势。而钙、钠、镁的需要则较少。培养基所需的钠和氯化物，由钙盐、磷酸盐或微量营养物提供。微量元素包括碘、锰、锌、钼、铜、钴和铁, 这些元素有的对生命活动的某个过程十分有用，有的对蛋白质或酶的生物活性十分重要，有的是参与某些生物过程的调节。培养基中的铁离子，大多以螯合铁的形式存在，即FeSO4与Na2—EDTA（螯合剂）的混合。

2.碳源：培养的植物组织或细胞，它们的光合作用较弱。因此，需要在培养基中附加一些碳水化合物以供需要。培养基中的碳水化合物通常是蔗糖或D-葡萄糖，用量通常为2%-4%，高者可达5%，亦可用市售的白糖所代替，但一般应增加用量，而且最好用比较固定的厂家生产的产品，以保证实验的稳定性。

3.有机营养成分：包括人工合成或天然的有机附加物（包括维生素，氨基酸及其它有机物质等）。最常用的有酪朊水解物(水解乳蛋白、水解酪蛋白CH)、酵母提取物、玉米胚乳、麦芽浸出物、西红柿汁、椰子汁(CM)及各种氨基酸如甘氨酸（氨基乙酸）等。维生素：在培养基中加入维生素，常有利于外植体的发育。培养基中的维生素属于B族维生素，其中效果最佳的有硫氨素（维生素B1）、盐酸吡哆醇（维生素B6）和维生素H（生物素）、泛酸钙等、肌醇（环己六醇）、烟酸。在部分培养基中还添加维生素BX（氨酰苯甲酸）、维生素C（抗坏血酸）、维生素E（生育酚）、、维生素B12（氰钴胺酸）、维生素BC（叶酸）、维生素B2（核黄素）和氯化胆碱等维生素。这些可能对某些植物或植物的某些代谢过程有重要作用，如肌醇主要以磷酸肌醇和磷脂酰肌醇的形式参与由Ca介导的信号转导。

4.生长调节物质（常称为激素），常用的生长调节物质大致包括以下三类：

(1)植物生长素类。主要作用是：诱导愈伤组织的产生，促进细胞脱分化；促进细胞的伸长；促进生根。如吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、IBA（吲哚丁酸）、NOA（萘氧乙酸），P-CPA（对氯苯氧乙酸）、2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸），2，4，5-T（2，4，5-三氯苯氧乙酸）和ABT生根粉等。生长素的使用浓度通常为0.1～10mg/L。这类在本专利中不要添加。

(2)细胞分裂素。如玉米素、6-苄基嘌呤（6-BA或BAP）和激动素（Kt，6-呋喃氨基嘌呤）、2IP（异戊烯氨基嘌呤）和TDZ（thidiazuron,噻二唑苯基脲）等。作用主要是：第一，促进细胞分裂和扩大(与生长素促进细胞伸长的作用不同)，可使茎增粗，而抑制茎伸长；第二，诱导芽的分化，促进侧芽萌发生长；第三，抑制衰老，减少叶绿素的分解。延缓离体组织或器官的衰老过程，有保鲜的效果。但是，细胞分裂素对根的生长一般起抑制作用。在组培中，细胞分裂素的使用浓度通常为0.1～10mg／L。细胞分裂素常常与生长素相互配合，用以调节细胞分裂，细胞伸长，细胞分化和器官形成。在本专利中，酌量添加可促进细胞分裂的该类单一或组合成分。

(3)赤霉素。组织培养中使用的赤霉素只有一种，即赤霉酸（GA3）。虽然已经用于顶端分生组织的培养和维管分化的研究，但在培养基中很少添加，因为它的作用往往是负面的，在本专利中，优选不添加。

5.琼脂或其他支持物，除液体悬浮培养外，就目前情况而言，琼脂是一种极为理想的支持物。一般浓度0.4%-1%，质量越差的琼脂用量越大。琼脂作为培养基的支持物，使培养基呈固体状态，以利于各种外植体的培养。

6.其他添加剂（含天然提取物、抗生素等），活性炭、渗透调节剂、抗生素、抗氧化剂等。活性炭加入培养基中的目的主要是利用其吸附能力，减少一些有害物质的影响，例如防止酚类物质污染而引起组织褐化死亡。这在兰花组织培养中效果更明显。另外，活性炭使培养基变黑，有利于某些植物生根。但活性炭对物质吸附无选择性，既吸附有害物质，也吸附有利物质，因此使用时应慎重考虑，不能过量，一般用量为1%—5％。活性炭对形态发生和器官形成有良好的效应。在失去胚状体发生能力的胡萝卜悬浮培养细胞中加入1％一4%活性炭可使胚状体的发生能力得以恢复。

7.水，水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止储藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。

8.pH，培养基的pH因培养材料不同而异，大多数植物都要求在pH5.6—5.8的条件下进行组织培养。常用0.1mol/L的Na0H和0.1mol/L的HCl来调节培养基的PH。但需注意两点：第一，经高温高压灭菌后，培养基的PH会下降0.2—0.8，故调整后的PH应高于目标pH0.5个单位；第二，pH的大小会影响琼脂的凝固能力，一般当pH大于6.0时，培养基将会变硬，低于5.0时，琼脂就不能很好地凝固。

培养基种类：根据培养基态相不同分为固体培养基与液体培养基。固体培养基是指加凝固剂(多为琼脂)的培养基，其优点是外植体只是部分接触培养基，因此会使培养基中的效应物质产生一定的浓度梯度，从而有利于外植体的分化、生长。液体培养基是指不加凝固剂的培养基。外植体在液体培养基中能够与效应物质更好地接触，因此，生长速度比在固体培养基中更快。根据培养物的培养过程，培养基分为初代培养基与继代培养基。初代培养基是指用来第一次接种外植体的培养基。继代培养基是指用来接种继初代培养之后的培养物的培养基。根据其作用不同，培养基分为诱导培养基、增殖培养基和生根培养基。根据其营养水平不同，培养基分为基本培养基和完全培养基。基本培养基(就是通常称呼的培养基)主要有MS、White、B5、N6、改良MS、Heller、Nitsh、Miller、SH等。完全培养基就是在基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，附加一些物质，如植物生长调节物质和其他复杂有机附加物等。

在本实施例中，培养基选择N6培养基，不加激素，即不加生长调节物质、植物激素诱导。优选的，N6培养基配方如下：

1.无机物:硝酸钾 2800 mg/L，硫酸铵463 mg/L，磷酸二氢钾400 mg/L，硫酸镁(MgSO4·7H2O)185 mg/L，氯化钙(CaCl2·2H2O)165 mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3 mg/L，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)27.8 mg/L，硫酸锰(MnSO4·H2O)4.4 mg/L，硫酸锌(ZnSO4·7H2O)1.5 mg/L，硼酸1.6 mg/L，碘化钾0.8 mg/L。            

2.有机物：维生素B1(盐酸硫胺素)1.0 mg/L，维生素B6(盐酸吡哆醇)0.5 mg/L，烟酸0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，蔗糖20000 mg/L。

其中pH值为5.8，温度为25℃。在上述配方中，烟酸0.5 mg/L和氨酸2.0 mg/L也可替换为叶酸1.0mg/L。

组织培养培养基配制：选择合适的培养基是植物组织培养成功的基础，一般将大量元素分别配制成10倍的母液，使用时再分别稀释10倍。选择合适的培养基主要从以下两个方面考虑：一是基本培养基；二是各种激素的浓度及相对比例。N6培养基适合与许多单子叶植物，特别是N6培养基对禾本科植物小麦、水稻等很有效。

①根据配方要求，用量筒或移液管从每种母液中分别取出所需的用量，放入同一烧杯中，并用粗天平称取蔗糖、琼脂放在一边备用。

②将①中称好的琼脂加蒸馏水300～400毫升，加热并不断搅拌，直至煮沸溶解呈透明状，再停止加热。

③将①中所取的各种物质（包括蔗糖），加入煮好的琼脂中，再加水至1000毫升，搅拌均匀，配成培养基。

④用酸碱性物质，滴入③中的培养基里，每次只滴几滴，滴后搅拌均匀，并用pH试纸测其pH值，直到将培养基的pH值调到5.8。

⑤将配好的培养基，用漏斗分装到三角瓶（或试管）中，并用棉塞塞紧瓶口，瓶壁写上号码。瓶中培养基的量约为容量的1/4或1/5。

注意事项：(1)称量要精确；(2) 配制母液时要注意药品溶解的先后顺序，以免发生化学反应，使的产生沉淀。

培养基的成分比较复杂，为避免配制时忙乱而将一些成分漏掉，可以准备一份配制培养基的成分单，将培养基的全部成分和用量填写清楚。配制时，按表列内容顺序，按项按量称取，就不会出现差错。

组织培养培养基的灭菌与保存：培养基配制完毕后，应立即灭菌。培养基通常应在高压蒸汽灭菌锅内，在汽相120℃条件下，灭菌20分钟。如果没有高压蒸汽灭菌锅，也可采用间歇灭菌法进行灭菌，即将培养基煮沸10分钟，24小时后再煮沸20分钟，如此连续灭菌三次，即可达到完全灭菌的目的。

经过灭菌的培养基应置于10℃下保存，在4～5℃低温下保存要更好些。最好在配制后的一周内使用完，在多数情况下，应在消毒后两周内用完。

水稻花粉及其外植体粒的粉碎：现超微粉碎技术可做到破壁粉碎，本发明无需破壁，具体实施时可根据实际机型进行相关调节调整。

水稻花粉及其外植体粒的贮存：在现今技术条件下，将花粉在-5摄氏度到10摄氏度的范围内贮存在经过消毒杀菌的环境下，湿度控制在60%以下，可以贮存时长达30天以上，花粉活力以及离体培养萌发率在40%以上。优选的，贮存温度为-2摄氏度，湿度为45%。

水稻花粉及其外植体粒的复活：将贮存花粉取出置于无菌洁净的常温下，回醒6-12小时，实现复活，也可以用药物处理，提高受精活力。

步骤b中，可以异地种植父本，只需要小面积种植就行，在其盛花时根据生产需求采集足够离体培养需要的花粉并离体培养、增殖，异地种植父本的所采集的花粉可低温保活运输至生产地。从而充分利用不同地区的气候条件及时间差，提高大面积杂交制种的安全性和生产活动安排的灵活性。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，但本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (9)

1.一种杂交水稻的制种方法，其特征在于，包括以下步骤：

a. 母本的播种栽插及田间管理；

b. 安排父本的播插期，根据生产地的气候条件做好父本的播种栽插及田间管理，与母本分田栽插少量父本，采集足够离体培养需要的花粉，再进行父本花粉的组培增殖及粉碎、贮存、复活环节；

c. 在母本盛花期进行人工授粉；

d．授粉后母本的田间管理以及杂交种子的收割、干燥及贮藏。

2.根据权利要求1所述的一种杂交水稻的制种方法，其特征在于，在步骤a中，根据生产地域的气候条件，安排母本的最适播种期，如母本本身特性适合撒播，则可直接撒播而无需育秧，如母本本身特性需要育秧，可以采用抛秧或者插秧的方式进行栽插，并做好母本后续的田间管理。

3.根据权利要求1所述的一种杂交水稻的制种方法，其特征在于，在步骤b中，综合考虑父母本的花期差异，花粉组培增殖所需的时间以及花粉可贮存的时间，安排父本的播期及花粉的组培增殖及粉碎、贮存、复活环节的时间，保证在母本盛花期之前准备好花粉，当生产地域气候条件限制父本的播期时，可异地种植父本。

4.根据权利要求1所述的一种杂交水稻的制种方法，其特征在于，在步骤b中，用超微粉碎机粉碎培养的花粉粒。

5.根据权利要求1所述的一种杂交水稻的制种方法，其特征在于，在步骤b中，贮存过程为，将花粉置于经过消毒杀菌的环境下，温度为-5摄氏度到10摄氏度，湿度在60%以下。

6.根据权利要求1所述的一种杂交水稻的制种方法，其特征在于，在步骤b中，在步骤c进行人工授粉之前，进行花粉的复活环节。

7.根据权利要求6所述的一种杂交水稻的制种方法，其特征在于，在步骤b中，将贮存的花粉取出置于无菌洁净的常温下，回醒6-12小时，实现复活。

8.根据权利要求1所述的一种杂交水稻的制种方法，其特征在于，在步骤c中，在母本盛花期用喷粉器将粉碎、贮存、复活的花粉粒喷洒在母本上，进行人工授粉。

9.根据权利要求1所述的一种杂交水稻的制种方法，其特征在于，在步骤c中，人工授粉时，在母本盛花期，每天喷花粉2-5次，每天12时前后必须喷2-3次。