CN113080055A - 一种远缘杂交诱导胚发育直接创制甜瓜双单倍体的方法 - Google Patents

一种远缘杂交诱导胚发育直接创制甜瓜双单倍体的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113080055A
CN113080055A CN202110480062.7A CN202110480062A CN113080055A CN 113080055 A CN113080055 A CN 113080055A CN 202110480062 A CN202110480062 A CN 202110480062A CN 113080055 A CN113080055 A CN 113080055A
Authority
CN
China
Prior art keywords
melon
distant hybridization
directly creating
pollination
embryo development
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110480062.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113080055B (zh
Inventor
钱春桃
黄耀
刘麒
陈静
张春静
孙博文
孙亚亭
娄群峰
李季
陈劲枫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Agricultural Univ
Original Assignee
Nanjing Agricultural Univ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Agricultural Univ filed Critical Nanjing Agricultural Univ
Priority to CN202110480062.7A priority Critical patent/CN113080055B/zh
Publication of CN113080055A publication Critical patent/CN113080055A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113080055B publication Critical patent/CN113080055B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/02—Methods or apparatus for hybridisation; Artificial pollination ; Fertility

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明公开了一种远缘杂交诱导胚发育直接创制甜瓜双单倍体的方法，包括包括以下步骤：步骤1、取黄瓜雄花与甜瓜雌花进行授粉，授粉后对雌花进行套袋隔离，同时在果柄处喷施氯吡脲水溶液；步骤2、授粉后的4～5h，在子房基部喷施噻苯隆溶液；步骤3、收获种瓜后取相对饱满种子在培养基中进行胚拯救获得再生植株；步骤4、对再生植株进行炼苗、移栽，随后正常管理。本发明将氯吡脲和噻苯隆联合用于远缘杂交诱导，降低了基因型对单倍体诱导地限制，保证了稳定发育，解决了甜瓜利用雌核诱导单倍体效率低的问题，适用于国内的甜瓜品种。

Description

一种远缘杂交诱导胚发育直接创制甜瓜双单倍体的方法
技术领域
本发明涉及一种创制甜瓜双单倍体的方法，特别是一种远缘杂交诱导胚发育直接创制甜瓜双单倍体的方法。
背景技术
甜瓜是葫芦科甜瓜属一年生蔓性草本植物。传统育种手段经过几代自交获得的自交系，可能仍然不是100％纯合的。所以仅利用传统的育种手段难以满足现代遗传育种研究。双单倍体技术应用于育种不仅可以缩短育种年限，而且还在遗传理论研究上有独特的作用。
在葫芦科作物上，双单倍体通过未受精离体子房培养、离体胚珠培养、辐射花粉诱导结合胚拯救、花药培养获得单倍体，然后再通过染色体加倍获得。到目前为止，用辐射花粉授粉是甜瓜作物中最有效的单倍体诱导方法。通过远缘杂交创制单倍体在葫芦科作物中仅见几篇文献报导。Hayase从笋瓜(CucurbitamaximaL.)×中国南瓜(CucurbitamoschataL.)的种瓜中得到了单倍体植株。DumasdeVaulx用相同的方法(父本为Cucumis ficifolius A.Rich.)给甜瓜(CucumismeloL.)授粉得到了甜瓜的单倍体植株。Nikolova等用二倍体的黄瓜株系给1个黄瓜DH(双单倍体)株系授粉，从其后代中筛选出了5棵单倍体植株。Kurtar等曾用西瓜、甜瓜、黄瓜、南瓜、丝瓜、瓠瓜和黑籽南瓜分别给4种不同基因型的南瓜(CucurbitapepoL.)授粉试图诱导单倍体，结果在一个授粉组合中获得二倍体胚和植株。由此可见，现有技术利用此方法获得单倍体极大受到父、母本基因型的限制，形成单倍体不够稳定，且单倍体胚在发育阶段未能稳定地加倍形成DH(双单倍体)。
发明内容
针对上述现有技术缺陷，本发明的任务在于提供一种远缘杂交诱导胚发育直接创制甜瓜双单倍体的方法，解决甜瓜利用雌核诱导单倍体效率低的问题以及利用辐射花粉结合胚拯救诱导单倍体成本高、染色体加倍困难的问题。
本发明技术方案如下：一种远缘杂交诱导胚发育直接创制甜瓜双单倍体的方法，包括以下步骤：
步骤1、取黄瓜雄花与甜瓜雌花进行授粉，授粉后对雌花进行套袋隔离，同时在果柄处喷施氯吡脲水溶液；
步骤2、授粉后的4～5h，在子房基部喷施噻苯隆溶液；
步骤3、收获种瓜后取相对饱满种子在培养基中进行胚拯救获得再生植株；
步骤4、对再生植株进行炼苗、移栽，随后正常管理。
进一步地，所述氯吡脲水溶液浓度为20～25mg/L。
进一步地，所述噻苯隆溶液浓度为5～10mg/L。
进一步地，所述步骤1授粉时，所述黄瓜雄花为清晨开放的黄瓜雄花，所述甜瓜雌花为前一日去雄套袋隔离，当日开花的甜瓜雌花。
进一步地，所述步骤3进行胚拯救时培养基为MS基础培养基。
进一步地，所述步骤4为当再生植株长至三叶一心期时开始炼苗，置于常温下生长2～3d天后移栽至装有育苗基质的育苗钵。
进一步地，所述育苗基质为草炭与珍珠岩等体积混合。
进一步地，所述步骤4移栽至育苗钵，遮阴3d天转为正常管理。
进一步地，所述甜瓜品种为“满田红”。
本发明与现有技术相比的优点在于：
1、将氯吡脲和噻苯隆联合用于远缘杂交诱导，由远缘花粉和噻苯隆同时刺激卵细胞发育，极大地降低了基因型对单倍体诱导地限制，配合果柄处喷施氯吡脲水溶液，促进果实膨大，保证了坐果率，保证了双单倍体胚地稳定发育；
2、由于再生植株为二倍体，长势健壮，驯化过程简单，移栽植株成活率为100％；
3、利用远缘花粉进行授粉诱导胚直接发育成为双单倍体种子，父本材料来源广，且无需特别的核辐射装置，成本低，单倍体胚不需要再特定地进行染色体加倍形成二倍体，缩短了试验周期。培育的双单倍体植株经过田间筛选可直接用作育种材料，应用于甜瓜品种的选育，加快甜瓜育种进程，有利于大规模的推广。
附图说明
图1为实施例1种子培养在MS基础培养基上照片。
图2为实施例1获得的两株再生植株照片。
图3为实施例1得到的细胞流式仪鉴定图。
图4为实施例1得到的SSR标记电泳图。
图5为实施例2得到的细胞流式仪鉴定图。
图6为实施例2得到的SSR标记电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。
实施例1，
本实施例所涉及的一种远缘杂交诱导胚发育直接创制甜瓜双单倍体的方法，包括以下步骤：
步骤1、甜瓜品种为“满田红”，取当日清晨开放的黄瓜雄花5朵，对前一日去雄套袋隔离，当日开花的甜瓜雌花进行授粉，授粉后对雌花进行套袋隔离，同时在果柄处喷施25mg/L的氯吡脲水溶液；
步骤2、授粉后的4～5h，在子房基部喷施10mg/L噻苯隆溶液1次；
步骤3、授粉后4～5周时间收获种瓜，收获种瓜后取相对饱满种子2颗培养在MS基础培养基中，如图1所示，进行胚拯救获得再生植株，如图2所示；取幼苗叶片0.2～0.3cm2，制备单细胞悬浮液，浓度为1.0×105～1.0×107个/mL，用细胞流式仪进行检测，检测表明：两株幼苗均为二倍体植株，检测结果如图3所示。取二倍体幼苗叶片，CTAB法提取叶片的DNA，进行SSR标记鉴定，检测再生植株基因位点纯合性，结果如图4所示，检测表明：2株二倍体甜瓜植株基因位点纯合，即植株为双单倍体。
步骤4、植株长至三叶一心期，开始炼苗，逐渐将组培瓶盖打开，置于常温下生长3d后取出植株，洗净根部培养基，再将植株移栽到装有基质(草炭与珍珠岩等体积混合)的育苗钵，遮阴3d后，转为正常管理。
对上述获得的双单倍体进行全生育期观察，发现植株在株高、叶片、花等植物学性状上都表现出典型的双单倍体特征，详见下表
Figure BDA0003048255140000031
上表中不同小写字母代表在P>0.01水平上差异显著；不同大写字母代表P<0.05水平上差异显著。
实施例2
本实施例所涉及的一种远缘杂交诱导胚发育直接创制甜瓜双单倍体的方法，包括以下步骤：
步骤1、甜瓜品种为“联华金红”，取当日清晨开放的黄瓜雄花5朵，对前一日去雄套袋隔离，当日开花的甜瓜雌花进行授粉，授粉后对雌花进行套袋隔离，同时在果柄处喷施20mg/L的氯吡脲水溶液；
步骤2、授粉后的4～5h，在子房基部喷施5mg/L噻苯隆溶液1次；
步骤3、授粉后4～5周时间收获种瓜，收获种瓜后取相对饱满种子培养在MS基础培养基中，进行胚拯救获得再生植株；取幼苗叶片0.2～0.3cm2，制备单细胞悬浮液，浓度为1.0×105～1.0×107个/mL，用细胞流式仪进行检测，检测表明：两株幼苗均为二倍体植株，检测结果如图5所示。取二倍体幼苗叶片，CTAB法提取叶片的DNA，进行SSR标记鉴定，检测再生植株基因位点纯合性，结果如图6所示，检测表明：2株二倍体甜瓜植株基因位点纯合，即植株为双单倍体。
步骤4、植株长至三叶一心期，开始炼苗，逐渐将组培瓶盖打开，置于常温下生长3d后取出植株，洗净根部培养基，再将植株移栽到装有基质(草炭与珍珠岩等体积混合)的育苗钵，遮阴3d后，转为正常管理。
对照组
分别采用实施例1中步骤1的方法对甜瓜雌花进行授粉，不喷施氯吡脲水溶液及噻苯隆溶液的10朵甜瓜雌花为对照组1，仅喷施氯吡脲水溶液，不喷施噻苯隆溶液的10朵甜瓜雌花为对照组2，不喷施氯吡脲水溶液，仅喷施噻苯隆溶液的10朵甜瓜雌花为对照组3。结果对照组1和对照组3无法坐果，对照组2能够坐果8个，但均无法获得饱满种子。实施例1中处理10朵甜瓜雌花，坐果数为7个，获得2颗饱满种子，实施例2中处理10朵甜瓜雌花，坐果数为8个，获得2颗饱满种子。

Claims (9)

1.一种远缘杂交诱导胚发育直接创制甜瓜双单倍体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、取黄瓜雄花与甜瓜雌花进行授粉，授粉后对雌花进行套袋隔离，同时在果柄处喷施氯吡脲水溶液；
步骤2、授粉后的4～5h，在子房基部喷施噻苯隆溶液；
步骤3、收获种瓜后取相对饱满种子在培养基中进行胚拯救获得再生植株；
步骤4、对再生植株进行炼苗、移栽，随后正常管理。
2.根据权利要求1所述的远缘杂交诱导胚发育直接创制甜瓜双单倍体的方法，其特征在于，所述氯吡脲水溶液浓度为20～25mg/L。
3.根据权利要求1所述的远缘杂交诱导胚发育直接创制甜瓜双单倍体的方法，其特征在于，所述噻苯隆溶液浓度为5～10mg/L。
4.根据权利要求1所述的远缘杂交诱导胚发育直接创制甜瓜双单倍体的方法，其特征在于，所述步骤1授粉时，所述黄瓜雄花为清晨开放的黄瓜雄花，所述甜瓜雌花为前一日去雄套袋隔离，当日开花的甜瓜雌花。
5.根据权利要求1所述的远缘杂交诱导胚发育直接创制甜瓜双单倍体的方法，其特征在于，所述步骤3进行胚拯救时培养基为MS基础培养基。
6.根据权利要求1所述的远缘杂交诱导胚发育直接创制甜瓜双单倍体的方法，其特征在于，所述步骤4为当再生植株长至三叶一心期时开始炼苗，置于常温下生长2～3d天后移栽至装有育苗基质的育苗钵。
7.根据权利要求6所述的远缘杂交诱导胚发育直接创制甜瓜双单倍体的方法，其特征在于，所述育苗基质为草炭与珍珠岩等体积混合。
8.根据权利要求6所述的远缘杂交诱导胚发育直接创制甜瓜双单倍体的方法，其特征在于，所述步骤4移栽至育苗钵，遮阴3d天转为正常管理。
9.根据权利要求1所述的远缘杂交诱导胚发育直接创制甜瓜双单倍体的方法，其特征在于，所述甜瓜品种为“满田红”。
CN202110480062.7A 2021-04-30 2021-04-30 一种远缘杂交诱导胚发育直接创制甜瓜双单倍体的方法 Active CN113080055B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110480062.7A CN113080055B (zh) 2021-04-30 2021-04-30 一种远缘杂交诱导胚发育直接创制甜瓜双单倍体的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110480062.7A CN113080055B (zh) 2021-04-30 2021-04-30 一种远缘杂交诱导胚发育直接创制甜瓜双单倍体的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113080055A true CN113080055A (zh) 2021-07-09
CN113080055B CN113080055B (zh) 2022-01-14

Family

ID=76680942

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110480062.7A Active CN113080055B (zh) 2021-04-30 2021-04-30 一种远缘杂交诱导胚发育直接创制甜瓜双单倍体的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113080055B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114208676A (zh) * 2021-12-28 2022-03-22 南京农业大学 一种甜瓜属野生种与栽培种部分种间杂种的创制方法
CN114946563A (zh) * 2022-05-27 2022-08-30 时创农业(上海)股份有限公司 一种提高网纹甜瓜设施栽培产量和品质的整枝方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1279009A (zh) * 2000-05-12 2001-01-10 南京农业大学 甜瓜属野生种用于新物种合成及黄瓜育种的方法
CN102210264A (zh) * 2011-04-28 2011-10-12 南京农业大学 甜瓜属异源三倍体黄瓜的选育方法
CN107517850A (zh) * 2017-09-08 2017-12-29 湖北省农业科学院经济作物研究所 一种甜瓜单倍体的创制方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1279009A (zh) * 2000-05-12 2001-01-10 南京农业大学 甜瓜属野生种用于新物种合成及黄瓜育种的方法
CN102210264A (zh) * 2011-04-28 2011-10-12 南京农业大学 甜瓜属异源三倍体黄瓜的选育方法
CN107517850A (zh) * 2017-09-08 2017-12-29 湖北省农业科学院经济作物研究所 一种甜瓜单倍体的创制方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
周霞等: "瓜类作物离体雌核诱导单倍体研究进展", 《园艺学报》 *
陈劲枫等: "甜瓜属植物种间杂交研究进展", 《植物学通报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114208676A (zh) * 2021-12-28 2022-03-22 南京农业大学 一种甜瓜属野生种与栽培种部分种间杂种的创制方法
CN114946563A (zh) * 2022-05-27 2022-08-30 时创农业(上海)股份有限公司 一种提高网纹甜瓜设施栽培产量和品质的整枝方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113080055B (zh) 2022-01-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chang et al. A tissue culture protocol for propagation of a rare plant, Lilium speciosum Thunb. var. gloriosoides Baker
US5445961A (en) Isolated microscope and anther culture of maize
CN113080055B (zh) 一种远缘杂交诱导胚发育直接创制甜瓜双单倍体的方法
US5322789A (en) Isolated microspore and anther culture of corn
Moqbeli et al. In vitro cucumber haploid line generation in several new cultivars
CN101243776A (zh) 一种甘蓝型油菜游离小孢子植株的培育方法
Skene et al. In vitro culture of abscissed immature avocado embryos
CN102499086B (zh) 一种刺槐的繁殖方法
CN103461132B (zh) 利用大孢子培养技术培育黄瓜育种材料的方法
CN110122316B (zh) 棉花光敏核雄性不育突变体及其应用
Zou et al. Efficient induction of gynogenesis through unfertilized ovary culture with winter squash (Cucurbita maxima Duch.) and pumpkin (Cucurbita moschata Duch.)
CN107278891B (zh) 一种杏梅组织培养快速繁殖方法
Barnabás Protocol for producing doubled haploid plants from anther culture of wheat (Triticum aestivum L.)
CN101810144B (zh) 瓜叶菊的快速繁殖方法
CN108353790A (zh) 一种花生高油品种的培育方法
CN103299896A (zh) 一种广适性耐抽苔春白菜游离小孢子的培养方法
CN103109736B (zh) 一种非洲菊纯合体植株的选育方法
Hung et al. Cytokinin concentrations for optimal micropropagation of Corymbia torelliana× C. citriodora
CN102326513B (zh) 一种建立通用玉米再生体系的方法
AU609717B2 (en) Plant generation method
Inoue et al. Genomic factors controlling the lethality exhibited in the hybrid between Nicotiana suaveolens Lehm. and N. tabacum L.
Arisumi In Vitro Culture of Embryos and Ovules of Certain Incompatible Selfs and Crosses among Impatiens Species1
CN116491415A (zh) 优化温度提高cenh3介导的母本单倍体诱导效率的方法
Sagi et al. Production of doubled haploid breeding lines in case of paprika, spice paprika, eggplant, cucumber, zucchini and onion
CN111937741B (zh) 芙蓉菊与阔叶毛华菊的属间远缘杂种创制方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant