CN102210264A - 甜瓜属异源三倍体黄瓜的选育方法 - Google Patents

Abstract

本发明甜瓜属异源三倍体黄瓜的选育方法，属于生物技术育种领域，专用于黄瓜的染色体工程及倍性育种。将甜瓜属双二倍体新种与二倍体黄瓜进行正反杂交，杂交果实中收获的种子即为异源三倍体黄瓜种子。实生异源三倍体黄瓜生长势强，经济性状优良，可作为一种耐低温、弱光，抗南方根结线虫的加工型温室栽培黄瓜新品种进行推广应用。实生异源三倍体黄瓜还为研究黄瓜子叶遗传发育规律、果实发育、单性结实机理及杂种优势机理等科学问题提供了宝贵的材料，同时方便了异源三倍体黄瓜的利用，有利于野生优异基因的转导，培育黄瓜新品种。

Description

甜瓜属异源三倍体黄瓜的选育方法

一、技术领域

本发明涉及一种甜瓜属异源三倍体黄瓜的选育方法，属于生物技术育种领域，专用于黄瓜的染色体工程及倍性育种。

二、背景技术

在本课题组申请的专利《甜瓜属野生种用于新物种合成及黄瓜育种的方法》(申请号00112271.1)中，我们通过幼胚拯救，首次克服了甜瓜属野生种和栽培种之间的种间杂交障碍，并利用体细胞无性系变异成功地将双单倍体种间杂种进行了染色体加倍，随后经过育性恢复筛选，培育出了世界上第一个甜瓜属种间杂交双二倍体新种C. hytivus 。

异源三倍体是双二倍体新种与栽培黄瓜杂交得到的，具有一套野生种C. hytrix 的染色体组和两套栽培黄瓜的染色体组，并具有野生种C. hytrix 耐低温、弱光，抗根结线虫等优良性状。另外，由于异源三倍体黄瓜的染色体倍性的降低，其与二倍体黄瓜的可交配性得到了增强(Chen et al., 2001 )，有利于通过回交向普通栽培黄瓜转导新种携有的有用外源性状。利用异源三倍体黄瓜与黄瓜回交，可以获得耐弱光、抗根结线虫的异源易位系，将优良的异源易位系与栽培黄瓜进行杂交，可培育出耐弱光、抗根结线虫的黄瓜新品种。同时，异源三倍体黄瓜本身也表现出较好的经济性状，单性结实能力强，耐弱光，可望成为温室栽培中的加工黄瓜新类型（陈劲枫，2003）。

在本课题组申请的专利《甜瓜属异源三倍体黄瓜及其用于黄瓜育种的方法》(申请号02148497.X)中，我们利用甜瓜属双二倍体新种与普通二倍体黄瓜的杂交，通过胚胎拯救获得了异源三倍体，并利用异源三倍体黄瓜与二倍体黄瓜回交，获得耐弱光、抗根结线虫的异源易位系，将优良的异源易位系与雌性系黄瓜进行杂交，培育出耐弱光、抗根结线虫的黄瓜新品种，这对转导野生酸黄瓜的优异性状，培育黄瓜新品种具有重要意义，极大推进了黄瓜遗传育种的进程。

然而，上述研究未能得到有活力的异源三倍体黄瓜种子，只能通过胚胎拯救和离体扩繁的方式获得异源三倍体黄瓜植株，这在一定程度上限制了异源三倍体的推广应用。为了更充分地发掘异源三倍体黄瓜的利用价值，扩大其推广应用范围，我们在前期工作的基础上，通过提高双二倍体新种的育性，进行双二倍体新种与各种基因型二倍体黄瓜的杂交配组实验，筛选出了结籽率高的杂交组合，获得有活力的异源三倍体黄瓜种子。

三、发明内容

技术问题

本发明是针对甜瓜属双二倍体新种与二倍体黄瓜杂交创制异源三倍体的过程中，二者亲和力低不能得到有活力种子的问题，提出了新种与二倍体黄瓜杂交产生有活力种子的甜瓜属异源三倍体黄瓜的选育方法，进一步发掘了异源三倍体的利用价值，促进了异源三倍体黄瓜的推广应用。

技术方案

本发明甜瓜属异源三倍体黄瓜的选育方法，其实施方案如下：

将甜瓜属双二倍体新种与二倍体黄瓜进行正交或反交，杂交果实中收获的种子即为异源三倍体黄瓜种子。具体包括：

1）双二倍体新种比二倍体黄瓜提早一个月进行催芽、种植，以使二者花期相遇；

2）以双二倍体新种为母本，二倍体黄瓜为父本杂交时，3朵雄花授一朵雌花；以二倍体黄瓜为母本，双二倍体新种为父本杂交时，5朵雄花授一朵雌花；

3）杂交授粉35-40天后，采收发育成熟果实中的种子。

4）杂交所得种子经鉴定为三倍体2n=26，即甜瓜属异源三倍体黄瓜。

甜瓜属异源三倍体黄瓜可在黄瓜育种中得到应用。

有益效果

本发明甜瓜属异源三倍体黄瓜的选育方法，与现有技术相比，具有如下优点和积极效果：

1、甜瓜属双二倍体新种与二倍体黄瓜杂交，其结籽率高，所得种子发芽率高。如甜瓜属双二倍体新种×P01、 甜瓜属双二倍体新种×CC1，直接作为耐低温、弱光，抗南方根结线虫的加工型温室栽培黄瓜新品种进行推广应用。比通过胚胎拯救和离体扩繁获得异源三倍体黄瓜（陈劲枫等，2003）省时省力，提高了工作效率，使异源三倍体黄瓜在生产上的大面积推广应用成为可能。该异源三倍体黄瓜新品种生长势强，多分枝，每株平均可结果30个左右，有时2个果结在同一节上，果重约100-150g，长约12-14cm，呈梭形，直径约3cm，果型指数约4.3，果型整齐，具有单性结实性，果实绿色或黄绿色，无籽，嫩果味似黄瓜，成熟时具有特殊的清香风味，不含任何苦味。另外，异源三倍体黄瓜结果期长，能连续结果2-3个月。并能耐夏季45℃以上的高温。若管理得当，植株可以越夏，实现一次播种两季收获，可以产生较大的经济效益。

2、异源三倍体黄瓜的子叶呈黄绿色，近圆形，明显区别于普通二倍体黄瓜绿色、椭圆形的子叶，异源三倍体黄瓜用于黄瓜子叶遗传发育及色素合成的研究，将开创此项研究的新局面。

3、实生异源三倍体黄瓜，在苗期比普通的实生二倍体黄瓜生长发育得慢，叶片黄，长势较弱；但在成株期与普通实生二倍体黄瓜相比，则表现出生长势强，结果力强，抗性强等优点，具有明显的杂种优势。由于异源三倍体黄瓜具有三个基因型黄瓜的染色体组，这为杂种优势的研究提供了新的材料。

4、异源三倍体黄瓜结果能力强，果实无籽，具有强单性结实能力，这为研究黄瓜的果实发育及单性结实机理提供了宝贵的材料。

四、具体实施方式

实施例1

将甜瓜属双二倍体新种与普通二倍体黄瓜P01、 P02、P03、CC1、CC4、EC1、Hazerd、627、长春密刺、平望小黄瓜、西双版纳黄瓜进行浸种、催芽、播种、定植及正常的植株管理，并且新种要提前1个月进行，以使新种与普通二倍体黄瓜的花期相遇。

甜瓜属双二倍体新种是由甜瓜属野生种和普通栽培黄瓜种间杂交并通过体细胞无性系变异得到(陈劲枫,庄飞云,钱春桃. 甜瓜属一新物种(双二倍体)合成及定性[J].武汉植物学研究, 2001,19(5):357-362)；P01是由津春5号黄瓜品种自交6代选育得到的(张晓青. 黄瓜同源四倍体的创制及不同倍性材料的相关研究[D]. 南京：南京农业大学，2007：16)；P02是由津春5号黄瓜品种经6代自交选育得到的(张晓青. 黄瓜同源四倍体的创制及不同倍性材料的相关研究[D]. 南京：南京农业大学，2007：16)；P03是由津春5号黄瓜品种经6代自交选育得到的(张淑霞. 甜瓜属双二倍体(Cucumis hytivus Chen and Kirkbride)育性的初步研究及全雌型黄瓜品系的创制[D]. 南京：南京农业大学，2010：19，2010年6月份毕业的硕士论文)；CC1是重庆地方品种白丝条(庄飞云.黄瓜属种间杂种（Cucumis hytivus Chen and Kirkbride）的细胞分子遗传及其系统亲缘关系研究[D].南京：南京农业大学，2003：47)；CC4是由津研4号黄瓜品种自交6代选育得到(张晓青. 黄瓜同源四倍体的创制及不同倍性材料的相关研究[D]. 南京：南京农业大学，2007：16)；EC1是Deltastar 黄瓜品种经6代自交选育得到的(娄群峰.黄瓜全雌性基因分子标记及ACC合酶基因的克隆与表达研究[D].南京：南京农业大学，2004：32)；Hazerd是由美国商品种自交多代选育得到(杨寅桂,李为观,娄群峰,等. 黄瓜耐热材料筛选[J].中国瓜菜, 2008,(1):1-3)；平望小黄瓜为地方农家品种(濮冶民. 平望小黄瓜[J]. 江苏农业科学,1985,(7):13)；627是黄瓜商品种Poinsett 97自交7代得到的稳定高代自交系（张晓青. 黄瓜同源四倍体的创制及不同倍性材料的相关研究[D]. 南京：南京农业大学，2007：16）；长春密刺是长春市地方品种（罗向东.栽培黄瓜（Cucumis sativus L.）与酸黄瓜（C. hystrix Chakr.）的种间杂种及异染色体系的创制与评价[D]. 南京：南京农业大学，2006：32）；西双版纳黄瓜是来自中国西双版纳地区的黄瓜近缘野生种(薄凯亮,陈龙正,钱春桃,等.短日处理诱导西双版纳黄瓜开花试验[J].中国瓜菜, 2010，23（4）：1-3)。

在开花期以甜瓜属双二倍体新种为母本，以二倍体黄瓜P01、 P02、P03、CC1、CC4、EC1、Hazerd、627、长春密刺、平望小黄瓜、西双版纳黄瓜为父本进行杂交，具体操作为：在授粉前一天下午，将第二天要开放的新种的雌花蕾和二倍体黄瓜的雄花蕾分别进行单花套袋隔离，在开花当天上午8点左右，将二倍体的雄花花粉分别授到新种雌花的柱头上，3朵雄花授一朵雌花，并继续对授粉后的雌花套袋隔离3天。

在授粉35-40天后，采收成熟的杂交果实，剖瓜取种，所得种子的大小、形状与母本双二倍体新种相似。

将杂交所得种子进行催芽、播种、定植及正常的植株管理，并取幼嫩的卷须进行植株染色体计数，鉴定杂种的倍性。具体方法为：于晴天上午8-9时摘取实生杂种植株1-3 cm的幼小卷须，在通气性良好的器皿中用冰水混合物暗处理12 h以上。然后于18℃下用8-羟基喹啉遮光处理3-4 h。用改良Carony’s II固定液固定24 h，经1 mol/LHCl于严格的60℃下解离10-20 min后，切取卷须顶部1.5-3 mm的分生区，用Schiff试剂于阴凉处遮光染色1 h，再用1%醋酸洋红滴染、微烤、敲片、压片和镜检。鉴定结果为：甜瓜属双二倍体新种与二倍体黄瓜杂交F1为异源三倍体2n=26。

所得植株生长势强，多分枝（见表1），每株平均可结果30个左右，有时2个果结在同一节上，果重约100-150g，长约12-14cm，直径约3cm，果型指数约4.3，呈梭形，果型整齐，果实绿色或黄绿色，果实无籽，具有单性结实性，嫩果味似黄瓜，成熟时具有特殊的清香风味，不含任何苦味。植株结果期长，能连续结果2-3个月。并能耐夏季45℃以上的高温，若管理得当，植株可以越夏，实现一次播种两季收获。植株长势强，耐低温、弱光，并且抗南方根结线虫。

所得异源三倍体植株还可用作黄瓜子叶遗传发育、果实发育、单性结实机理及杂种优势机理等科学问题的研究。

实施例2

将普通二倍体黄瓜长春密刺、平望小黄瓜、新泰密刺、优加全雌09、7011A、HH1-8-57、 HH1-8-1-2、CC1、EC1、P03与甜瓜属双二倍体新种进行浸种、催芽、播种、定植及正常的植株管理，并且新种要提前1个月进行，以使二者的花期相遇。

长春密刺是长春市地方品种（罗向东.栽培黄瓜（Cucumis sativus L.）与酸黄瓜（C. hystrix Chakr.）的种间杂种及异染色体系的创制与评价[D]. 南京：南京农业大学，2006：32），平望小黄瓜为地方农家品种(濮冶民. 平望小黄瓜[J]. 江苏农业科学,1985,(7):13)；新泰密刺是地方优良品种(曹清河,陈劲枫,李英,等.黄瓜-酸黄瓜渐渗系霜霉病抗性及感病前后几种酶活性的变化[J].植物病理学报,2007,37(4): 433-437)；全雌黄瓜新品种优加全雌09见专利“全雌加工型黄瓜优加全雌09的培育及应用”,专利公开号： CN101861827A）；7011A是从美国威斯康星大学引进的优良加工型材料，并经自交纯化的自交系(陈龙正,陈劲枫,Jack Staub,等.通过种间杂交选育加工黄瓜新品种宁佳1号[J].中国蔬菜,2005,(3):4-6)；HH1-8-57是在获得远缘杂交双二倍体新种的基础上，再与普通黄瓜回交，并经5代自交筛选而成的自交系(杨寅桂,李为观,娄群峰,等. 黄瓜耐热材料筛选[J].中国瓜菜, 2008,(1):1-3)；HH1-8-1-2是甜瓜属种间杂交双二倍体新种Cucumis hytivus Chen ＆Kirkbride和普通栽培黄瓜杂交并多代自交得到的高代自交系(钱春桃.黄瓜异源易位系的细胞遗传学形成机制及其对枯萎病的抗性遗传特点[D].南京:南京农业大学, 2006:71)；CC1是重庆地方品种白丝条(庄飞云.黄瓜属种间杂种（Cucumis hytivus Chen and Kirkbride）的细胞分子遗传及其系统亲缘关系研究[D].南京：南京农业大学，  2003：47)；EC1是Deltastar 黄瓜品种经6代自交选育得到的(娄群峰.黄瓜全雌性基因分子标记及ACC合酶基因的克隆与表达研究[D].南京：南京农业大学，2004：32)；P03是由津春5号黄瓜品种经6代自交选育得到的(张淑霞. 甜瓜属双二倍体(Cucumis hytivus Chen and Kirkbride)育性的初步研究及全雌型黄瓜品系的创制[D]. 南京：南京农业大学，2010：19)；甜瓜属双二倍体新种是由甜瓜属野生种和普通栽培黄瓜种间杂交并通过体细胞无性系变异得到(陈劲枫,庄飞云,钱春桃. 甜瓜属一新物种(双二倍体)合成及定性[J].武汉植物学研究, 2001,19(5):357-362）。

在开花期，以二倍体黄瓜长春密刺、平望小黄瓜、新泰密刺、优加全雌09、7011A、HH1-8-57、 HH1-8-1-2、CC1、EC1、P03为母本，以甜瓜属双二倍体新种为父本进行杂交。具体操作为：在授粉前一天下午，将第二天要开放的二倍体黄瓜的雌花蕾和新种的雄花蕾分别进行单花套花隔离，在开花当天上午8点左右，将新种的雄花花粉分别授到栽培黄瓜雌花的柱头上，5朵雄花授一朵雌花，并继续对授粉后的雌花套袋隔离3天。

在授粉35-40天后，采收成熟的杂交果实，剖瓜取种，所得种子的大小、形状与母本二倍体黄瓜相似。

将杂交所得种子进行催芽、播种、定植及正常的植株管理，并取幼嫩的卷须进行植株染色体计数，鉴定杂种的倍性。具体方法为：于晴天上午8-9时摘取实生杂种植株1-3 cm的幼小卷须，在通气性良好的器皿中用冰水混合物暗处理12 h以上。然后于18℃下用8-羟基喹啉遮光处理3-4 h。用改良Carony’s II固定液固定24 h，经1 mol/LHCl于严格的60℃下解离10-20 min后，切取卷须顶部1.5-3 mm的分生区，用Schiff试剂于阴凉处遮光染色1 h，再用1%醋酸洋红滴染、微烤、敲片、压片和镜检。鉴定结果为：二倍体黄瓜与甜瓜属双二倍体新种杂交F1为异源三倍体2n=26。

所得植株生长势强，多分枝（见表2），每株平均可结果30个左右，有时2-3个果结在同一节上，果重约100-150g，长约12-14cm，呈梭形，直径约3cm，果型指数约4.3，果型整齐，果实绿色或黄绿色，果实无籽，具有单性结实性，嫩果味似黄瓜，成熟时具有特殊的清香风味，不含任何苦味。植株结果期长，能连续结果2-3个月。并能耐夏季45℃以上的高温，若管理得当，植株可以越夏，实现一次播种两季收获。植株生长势强，耐低温、弱光，并且抗南方根结线虫。

所得异源三倍体植株还可用作黄瓜子叶遗传发育、果实发育、单性结实机理及杂种优势机理等科学问题的研究。异源三倍体黄瓜的子叶呈黄绿色，近圆形，明显区别于普通二倍体黄瓜绿色、椭圆形的子叶，异源三倍体黄瓜用于黄瓜子叶遗传发育及色素合成的研究，在苗期比普通的实生二倍体黄瓜生长发育得慢，叶片黄，长势较弱；但在成株期与普通实生二倍体黄瓜相比，则表现出生长势强，结果力强，抗性强等优点，具有明显的杂种优势。结果能力强，果实无籽，具有强单性结实能力，这为研究黄瓜的果实发育及单性结实机理提供了宝贵的材料。

Claims (5)

1.甜瓜属异源三倍体黄瓜的选育方法，包括：

将甜瓜属双二倍体新种与二倍体黄瓜进行正交或反交，杂交果实中收获的种子即为异源三倍体黄瓜种子。

2.根据权利要求1所述的甜瓜属异源三倍体黄瓜的选育方法，其特征在于：

甜瓜属双二倍体新种比二倍体黄瓜提早一个月进行催芽、种植，以使  二者花期相遇；

以甜瓜属双二倍体新种为母本，二倍体黄瓜为父本杂交时，3朵雄花授一朵雌花；以二倍体黄瓜为母本，甜瓜属双二倍体新种为父本杂交时，5朵雄花授一朵雌花；

杂交授粉35-40天后，采收发育成熟果实中的种子；

杂交所得种子经鉴定为三倍体2n=26的材料，即杂交得到的为甜瓜属异源三倍体黄瓜。

3.根据权利要求1和2所述的甜瓜属异源三倍体黄瓜的选育方法，其特征在于：是以甜瓜属双二倍体新种为母本，以二倍体黄瓜P01、 P02、P03、CC1、CC4、EC1、Hazerd、627、长春密刺、平望小黄瓜或西双版纳黄瓜为父本的杂交组合方法。

4.根据权利要求1和2所述的甜瓜属异源三倍体黄瓜的选育方法，其特征在于：是以二倍体黄瓜长春密刺、平望小黄瓜、新泰密刺、优加全雌09、7011A、HH1-8-57、 HH1-8-1-2、CC1、EC1或P03为母本，以双二倍体新种为父本的杂交组合方法。

5.权利要求1-4之一所述方法育成的甜瓜属异源三倍体黄瓜在黄瓜育种中的应用。