CN111713400A

CN111713400A - 一种黄瓜-酸黄瓜二体附加系的创制、鉴定方法

Info

Publication number: CN111713400A
Application number: CN202010635664.0A
Authority: CN
Inventors: 娄群峰; 李梦雪; 刘昱希; 陈劲枫
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2020-07-03
Filing date: 2020-07-03
Publication date: 2020-09-29

Abstract

本发明公开了一种黄瓜‑酸黄瓜二体附加系的创制、鉴定方法，属于植物生物技术育种领域。该方法首先利用黄瓜‑酸黄瓜种间杂交异源四倍体与二倍体栽培黄瓜回交两次得到黄瓜‑酸黄瓜单体异附加系，再通过黄瓜‑酸黄瓜单体异附加系自交，经分子标记方法和基因组原位杂交方法筛选出黄瓜‑酸黄瓜二体附加系。本方法操作过程简单方便，成本低廉，并首次创制出携带酸黄瓜10号染色体的黄瓜‑酸黄瓜二体附加系材料，对于挖掘酸黄瓜优异基因，进一步实现栽培黄瓜的遗传改良奠定了基础。

Description

一种黄瓜-酸黄瓜二体附加系的创制、鉴定方法

技术领域

本发明属于植物生物技术育种领域，具体涉及一种黄瓜-酸黄瓜二体附加系的创制、鉴定方法，可用于转移野生酸黄瓜优异基因及栽培黄瓜品种的遗传改良。

背景技术

黄瓜(Cucumis sativus L.,2n＝2x＝14)起源于印度，是十分重要的蔬菜作物。目前为止，由于长期以来追求黄瓜的高产以及定向选择，导致黄瓜品种单一，遗传基础越来越狭窄(Staub et al.,1999)，同时黄瓜的病虫害对黄瓜的生产造成了严重的威胁，例如，霜霉病、白粉病等病害的传播，造成了黄瓜大面积的减产(熊艳等，2016；沈虹等，2017)。因此增加黄瓜的遗传多样性、选育抗性强的品种以预防病害威胁是一种安全高效的方式，同时也是黄瓜育种发展的必然趋势。

酸黄瓜(Cucumis hystrix Chakr.,2n＝2x＝24)是起源亚洲的甜瓜属野生种，其携带多种抗性基因，包括抗根结线虫、白粉病、霜霉病等，具有潜在的利用价值(Perez-Garcia et al.,2009；刘雪娇等，2014)。在黄瓜中，随着种质资源的不断利用，遗传资源不断减少，亟需通过野生资源进行品种改良，利用种间杂交能够引入野生种的优异抗性基因以拓宽栽培种的遗传基础，对黄瓜的改良至关重要(Chen et al.,2003a)。

种间杂交通过转移野生种的抗性基因和增加遗传变异为作物的遗传改良提供了重要的途经(Kroon et al.,1979；Jena et al.,2016)。但由于物种间存在种间不亲和现象，目前为止，在甜瓜属中，仅在黄瓜与酸黄瓜之间成功实现了种间杂交并经过进一步染色体加倍后形成异源四倍体新种Cucumis×hytivus Chen&Kirkbride(HHCC,2n＝4x＝38)(Chen et al.,1997b；Chen and Kirkbride,2000b)，基于该种间异源四倍体物种，通过连续回交的方式，获得了多份异染色体材料(Chen et al.,2003b；Chen et al.,2004；曹清河，2006；张旭等，2019)。

异附加系是指受体物种基因组中添加了一条或几条外来染色体所形成的品系，通常通过回交产生，单体异附加系是指在受体基因组背景中仅添加了一条外源染色体(Gu etal.,2015)；二体附加系是指携带了一对外来物种同源染色体的个体。二体附加系除了作为重要的材料用于研究物种基因组之间的起源与进化以及优异基因的染色体定位外(An etal.,2015；Li et al.,2016；Kong et al.,2018)，相比于单体异附加系而言，二体异附加系遗传更加稳定，二体附加系有利于维持减数分裂过程中的稳定性，是用于黄瓜遗传改良以及加速育种进程的理想桥梁材料(王峰等，2012)。因此选育二体附加系对于转移野生优异基因，加速黄瓜的育种进程至关重要。但是，目前为止，甜瓜属中关于二体附加系的选育还尚未有过报道。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题是提供一种黄瓜-酸黄瓜二体附加系的创制、鉴定方法，本发明所要解决的另一技术问题是提供上述方法在黄瓜育种中的应用

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种黄瓜-酸黄瓜二体附加系的创制方法，首先利用黄瓜-酸黄瓜种间杂交异源四倍体与二倍体栽培黄瓜回交两次得到黄瓜-酸黄瓜单体异附加系，再通过黄瓜-酸黄瓜单体异附加系自交，经分子标记方法和基因组原位杂交方法筛选出黄瓜-酸黄瓜二体附加系。

一种黄瓜-酸黄瓜二体附加系的创制方法，具体包括以下步骤：

S1、用黄瓜与同属野生种--酸黄瓜种间杂交后代异源四倍体材料(C.hytivus)与二倍体栽培黄瓜(C.sativus)回交，创制出异源三倍体材料；

S2、利用异源三倍体与二倍体栽培黄瓜进行回交，授粉后40-60天内，采收发育成熟果实的种子；

S3、将回交后所获得的植株，先利用基因组原位杂交方法筛选单体异附加系，后利用分子标记手段识别单体异附加中的外源染色体；

S4、将筛选出的单体异附加系进行自交，自交后代首先通过分子标记方法继续筛选异附加系植株；

S5、通过分子标记方法确定的扩增出特异条带的自交后代进行基因组原位杂交以筛选二体附加系，携带两条酸黄瓜外源染色体的自交后代植株为二体附加系。

进一步的，黄瓜-酸黄瓜种间杂交异源四倍体基因组为HHCC，H代表酸黄瓜基因组，C代表黄瓜基因组，染色体数为2n＝4x＝38。

上述黄瓜-酸黄瓜二体附加系的鉴定方法，黄瓜-酸黄瓜单体异附加系进行自交，自交后代首先通过分子标记方法筛选异附加系植株；然后通过基因组原位杂交方法筛选出携带两条酸黄瓜外源染色体的异附加系植株即为黄瓜-酸黄瓜二体附加系；具体包括以下步骤：

1)提取黄瓜-酸黄瓜单体异附加系自交后代植株的基因组DNA，利用鉴定酸黄瓜外源染色体的特异分子标记的引物对对基因组DNA进行PCR扩增，根据电泳分离的结果判定目的片段的大小；

酸黄瓜外源染色体为酸黄瓜10号染色体，用于鉴定酸黄瓜10号染色体的特异分子标记为SSH10，特异分子标记引物对的核苷酸序列如下：

正向引物：5′-CCCTACAACTTCCCCTAT-3′；

方向引物：5′-TTCCTCTTCTTGGCTAAT-3′。

2)对产生酸黄瓜染色体特异性条带的植株材料取有丝分裂旺盛部分根尖进行有丝分裂染色体的制备，选择染色体清晰、背景干净的片子待测；

将待测的片子滴加100μL 70％的去离子甲酰胺，盖上玻片放于80℃的杂交仪上变性90s，变性完成后，立即甩掉盖玻片，将片子在-20℃条件下用70％、90％和100％的乙醇溶液依次脱水5min后晾干；总共20μL的杂交混合液放入90℃的金属浴中变性6min，变性后放入冰上10min；将变性后的杂交混合液滴至经变性晾干后的载玻片上，盖上盖玻片后放置37℃杂交仪中杂交过夜；洗片后室温风干，加入20μL 0.02mg/ml DAPI复染后封片，盖玻片封片后在避光的条件下，荧光显微镜观察杂交信号。

进一步的，步骤1)中，PCR反应体系为20μL，包括10×PCR Buffer 2.0μL，25mmol/LMgCl₂ 1.2μL，150μmol/L dNTPs 2.0μL，0.67μmol/L标记引物各1.0μL，40ng/μL样品DNA1μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，去离子水补足至20μL；

PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，29个循环；72℃延伸10min。

进一步的，步骤2)中，杂交混合液包括50％的去离子甲酰胺、2×SSC、10％硫酸葡聚糖及已标记的探针。

进一步的，探针为hy-gDNA探针，即酸黄瓜基因组探针，用于识别酸黄瓜外源染色体数目。

所述创制方法在黄瓜育种中的应用。

所述鉴定方法在筛选黄瓜-酸黄瓜二体附加系进行黄瓜育种中的应用。

有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：

1)本发明首次在甜瓜属物种中创制出二体附加系材料，具体为携带酸黄瓜10号染色体的黄瓜-酸黄瓜二体附加系，对于挖掘酸黄瓜优异基因，进一步实现栽培黄瓜的遗传改良奠定了基础。

2)本发明通过分子标记及基因组原位杂交手段筛选黄瓜-酸黄瓜二体异附加系，操作过程简单方便，成本低廉。

附图说明

图1是黄瓜-酸黄瓜二体附加系的创制路线图；

图2是利用酸黄瓜染色体特异序列标记SSH10识别出携带酸黄瓜10号染色体的黄瓜-酸黄瓜单体异附加系图；图中CC代表栽培黄瓜C.sativus，HH代表酸黄瓜C.hystrix，HCC代表异源三倍体，CC-H10代表携带酸黄瓜10号染色体的黄瓜-酸黄瓜单体附加系；

图3是酸黄瓜10号染色体特异序列标记对携带酸黄瓜10号染色体的单体异附加系自交后代的扩增结果图：出现特异条带的自交后代表明携带酸黄瓜10号染色体；图中，CC表示栽培黄瓜C.sativus；HH表示酸黄瓜C.hystrix；HCC表示异源三倍体；1-19表示19个存活的自交后代植株；

图4是携带酸黄瓜10号染色体的黄瓜-酸黄瓜二体附加系(CC-2H10)的基因组原位杂交分析图；图中hy-gDNA作为探针用于识别酸黄瓜外源染色体数目；

图5是携带酸黄瓜10号染色体的二体附加系的叶型图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

实施例1

本发明携带酸黄瓜10号染色体的黄瓜-酸黄瓜二体附加系材料的创制和鉴定方法，包括以下步骤：

(1)异源三倍体的创制：利用先前陈劲枫所获得的黄瓜与同属野生种--酸黄瓜种间杂交后代异源四倍体材料(C.hytivus)(Chen J F,Luo X D,Staub J E,et al.Anallotriploid derived from a amphidiploid×diploid mating in Cucumis-I:Production,micropropagation and verification[J].Euphytica,2003,131(2):235-241.)与二倍体栽培黄瓜(C.sativus)回交，创制出异源三倍体材料。

(2)黄瓜-酸黄瓜单体异附加系的创制：将异源三倍体与二倍体栽培种回交获得候选异附加系材料，候选异附加系通过基因组原位杂交筛选出单体异附加系，利用酸黄瓜染色体特异序列标记识别出单体异附加系中外源染色体的身份，如图2所示，最终筛选出携带酸黄瓜10号染色体的单体异附加系(CC-H10)。

(3)黄瓜-酸黄瓜二体附加系的创制：将筛选出的携带酸黄瓜10号染色体的二体附加系进行自交，自交后获得了26粒种子，全部种植后19株材料最终成活。为确定这19株成活的自交后代植株染色体的组成，首先用酸黄瓜染色体特异标记SSH10对自交后代植株进行PCR扩增。所用的酸黄瓜染色体特异标记引物为下列引物对，

SSH10：正向引物：5′-CCCTACAACTTCCCCTAT-3′；

反向引物：5′-TTCCTCTTCTTGGCTAAT-3′。

PCR扩增方法如下：

(1)PCR反应体系为20μL，含10×PCR Buffer 2.0μL，25mmol/L MgCl21.2μL，150μmol/L dNTPs 2.0μL，0.67μmol/L标记引物各1.0μL，40ng/μL基因组DNA1μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，去离子水补足至20μL；

(2)扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，29个循环；72℃延伸10min，4℃保存；

(3)PCR产物经2％琼脂糖凝胶或8％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。

结果发现，如图3所示，19株自交后代植株中，有8株产生了酸黄瓜染色体特异性条带。为确定该8株材料中酸黄瓜染色体的数目，对产生特异性条带的8株材料进行基因组原位杂交鉴定。

基因组原位杂交过程如下：

(1)取有丝分裂旺盛部分根尖进行有丝分裂染色体的制备，制备完成后在相差显微镜下选择染色体清晰、背景干净的片子保存备用；

(2)荧光原位杂交及信号检测：将待用的片子滴加100μL 70％的去离子甲酰胺，盖上玻片放于80℃的杂交仪上变性90s，变性完成后，立即甩掉盖玻片，将片子在-20℃条件下用70％、90％和100％的乙醇溶液依次脱水5min后晾干。总共20μL的杂交混合液(含50％的去离子甲酰胺、2×SSC、10％硫酸葡聚糖及已标记的探针)放入90℃的金属浴中变性6min，变性后放入冰上10min。将变性后的杂交混合液滴至经变性晾干后的载玻片上，盖上盖玻片后放置37℃杂交仪中杂交过夜。洗片后室温风干，加入20μL DAPI(0.02mg/ml)复染后封片，盖玻片封片后在避光的条件下，用Olympus BX51荧光显微镜观察杂交信号。

最终，经基因组原位杂交分析后，如图4所示，两条染色体上显示荧光信号，携带了两条酸黄瓜染色体，为黄瓜-酸黄瓜二体附加系(CC-2H10)。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种黄瓜-酸黄瓜二体附加系的创制、鉴定方法

<130> 1

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> SSH10正向引物(Artificial Sequence)

<400> 1

ccctacaact tcccctat 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> SSH10反向引物(Artificial Sequence)

<400> 2

ttcctcttct tggctaat 18

Claims

1.一种黄瓜-酸黄瓜二体附加系的创制方法，其特征在于，首先利用黄瓜-酸黄瓜种间杂交异源四倍体与二倍体栽培黄瓜回交两次得到黄瓜-酸黄瓜单体异附加系，再通过黄瓜-酸黄瓜单体异附加系自交，经分子标记方法和基因组原位杂交方法筛选出黄瓜-酸黄瓜二体附加系。

2.根据权利要求1所述的黄瓜-酸黄瓜二体附加系的创制方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

S1、黄瓜-酸黄瓜种间杂交异源四倍体与二倍体栽培黄瓜回交得到异源三倍体；

S2、异源三倍体与二倍体栽培黄瓜回交获得候选异附加系，候选异附加系通过基因组原位杂交筛选出单体异附加系；

S3、将筛选出的单体异附加系进行自交，自交后代首先通过分子标记方法继续筛选异附加系植株；然后通过基因组原位杂交方法筛选出携带两条酸黄瓜外源染色体的异附加系植株即为黄瓜-酸黄瓜二体附加系。

3.根据权利要求1或2所述的黄瓜-酸黄瓜二体附加系的创制方法，其特征在于，所述黄瓜-酸黄瓜种间杂交异源四倍体基因组为HHCC，H代表酸黄瓜基因组，C代表黄瓜基因组，染色体数为2n＝4x＝38。

4.如权利要求1所述方法创制的黄瓜-酸黄瓜二体附加系的鉴定方法，其特征在于，黄瓜-酸黄瓜单体异附加系进行自交，自交后代首先通过分子标记方法筛选异附加系植株；然后通过基因组原位杂交方法筛选出携带两条酸黄瓜外源染色体的异附加系植株即为黄瓜-酸黄瓜二体附加系；具体包括以下步骤：

所述酸黄瓜外源染色体为酸黄瓜10号染色体，用于鉴定酸黄瓜10号染色体的特异分子标记为SSH10，特异分子标记引物对的核苷酸序列如下：

正向引物：5′-CCCTACAACTTCCCCTAT-3′；

反向引物：5′-TTCCTCTTCTTGGCTAAT-3′。

5.根据权利要求4所述的黄瓜-酸黄瓜二体附加系的鉴定方法，其特征在于，步骤1)中，所述PCR反应体系为20μL，包括10×PCR Buffer 2.0μL，25mmol/L MgCl₂ 1.2μL，150μmol/LdNTPs 2.0μL，0.67μmol/L标记引物各1.0μL，40ng/μL样品DNA 1μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，去离子水补足至20μL；

所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，29个循环；72℃延伸10min。

6.根据权利要求4所述的黄瓜-酸黄瓜二体附加系的鉴定方法，其特征在于，步骤2)中，所述杂交混合液包括50％的去离子甲酰胺、2×SSC、10％硫酸葡聚糖及已标记的探针。

7.根据权利要求6所述的黄瓜-酸黄瓜二体附加系的鉴定方法，其特征在于，所述探针为hy-gDNA探针。

8.权利要求1所述创制方法在黄瓜育种中的应用。

9.权利要求4所述鉴定方法在筛选黄瓜-酸黄瓜二体附加系进行黄瓜育种中的应用。