CN116406616A

CN116406616A - 一种提高丝瓜辐射诱变胚状体诱导率的方法

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Publication number: CN116406616A
Application number: CN202310208723.XA
Authority: CN
Inventors: 冯翠; 刘慧颖; 吉茹; 钱春桃; 钱巍; 衣政伟; 倪维晨; 雍明丽; 冯英娜; 苏小俊
Original assignee: Taizhou Agricultural Science Institute Jiangsu Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Taizhou Agricultural Science Institute Jiangsu Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2023-03-07
Filing date: 2023-03-07
Publication date: 2023-07-11
Anticipated expiration: 2043-03-07
Also published as: CN116406616B

Abstract

本发明公开了一种提高丝瓜辐射诱变胚状体诱导率的方法。属于作物组培和育种技术领域。本发明方法包括花粉辐射处理、辐射花粉授粉、消毒处理和培养处理。本发明为丝瓜单倍体育种提供了技术支撑，进一步提高了育种效率。

Description

一种提高丝瓜辐射诱变胚状体诱导率的方法

技术领域

本发明涉及作物组培和育种技术领域，更具体的说是涉及一种提高丝瓜辐射诱变胚状体诱导率的方法。

背景技术

丝瓜为葫芦科丝瓜属，分为普通丝瓜和有棱丝瓜。其适应性强，在世界温带、热带地区广泛栽培，在我国南、北各地也普遍栽培，是我国重要的瓜类蔬菜之一。丝瓜营养价值丰富，其果肉细腻柔滑，味道鲜美，除富含丰富的蛋白质、脂肪、粗纤维、糖类、维生素B、维生素C、木糖胶以及钙、磷、铁等多种矿物质外，还含有甾醇三萜、皂甙类、黄酮体和酚类等几大类化合物和多种化学单体等药用成分，是一种药膳兼用型蔬菜，深受人们的喜爱，生产应用前景广泛，近几年栽培面积不断扩大。

丝瓜是异花授粉作物，传统的育种方法主要是通过自交或杂交育种等方式进行，但这些方法存在育种周期长、自交不亲合等问题，不能满足当前对新品种的快速需求。为快速解决杂交种一代选育方式，可通过自然加倍单倍体或者人工加倍技术。但在瓜类作物中，自发产生单倍体的频率极低，现常见的诱导获得单倍体植株的方法主要有花药培养、未受精子房诱导、辐射花粉诱导等手段。目前南瓜属、葫芦属、西瓜属和苦瓜属等5个属均已获得了单倍体，有的已在育种中应用，但丝瓜单倍体技术还鲜有报道，主要因为胚状体诱导技术难，诱导发生率极低，仅为0.1％。

综上，如何提供一种提高丝瓜辐射诱变胚状体诱导率的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种提高丝瓜辐射诱变胚状体诱导率的方法。本发明主要通过辐射诱变技术诱导丝瓜胚状体发生，并通过克服辐射剂量不确定、污染率高、培养条件不适应等培养过程中的一些技术瓶颈，提高胚状体诱导率，再形成再生植株，促进单倍体或双单倍体植株的形成，缩短育种年限，为丝瓜单倍体育种技术提供技术支撑。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种提高丝瓜辐射诱变胚状体诱导率的方法，包括如下步骤：

(1)花粉辐射处理：

对雄花花粉进行辐照处理，辐照剂量为200～300Gy，辐照时间为60min；

(2)辐射花粉授粉：

取辐照处理后的雄花花粉对雌花进行授粉处理，授粉后进行常规栽培管理；

(3)消毒处理：

授粉后18天对丝瓜进行消毒处理，将丝瓜经流水冲洗、75％的乙醇消毒后，取丝瓜种子接种到MS培养基；

(4)培养处理：

转到组培室进行常规培养。

进一步的，步骤(1)中所述辐照剂量为200Gy。

进一步的，辐照前一天下午对雄花进行夹花处理，次日早上8:30～10:00进行辐照处理。

进一步的，所述步骤(2)中，辐照处理当天下午对雌花进行夹花处理，辐照处理次日早上8:30～10:00进行授粉处理，授粉后立即进行套袋处理。

进一步的，所述步骤(3)的具体操作为：授粉18天后，用流水冲洗丝瓜表面2～3min，吸水纸吸干表面水分，再用75％乙醇对丝瓜果实表面进行消毒后拿进无菌操作台，在无菌操作台内用75％乙醇擦拭丝瓜果实表面，之后用无菌手术刀将丝瓜果实剖开分离种子接种到MS培养基。

进一步的，所述MS培养基的配方为：MS+30g/L蔗糖+0.2mg/L 6-BA+7g琼脂，pH值5.8～6.0。

进一步的，所述步骤(4)常规培养之前可进行32℃热激培养。

进一步的，所述步骤(4)的具体操作为：将接种到MS培养基中的种子置于32℃黑暗条件下培养1～2天，之后转到25℃组培室进行常规培养。

进一步的，所述丝瓜品种为泰州香丝瓜。

所取得的有益效果：试验结果和丝瓜品种会有一定的关系，首先要选择耐褐变的品种，否则试验过程中容易褐变，影响出胚。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：。

本发明通过克服丝瓜花粉辐射剂量不确定、污染率高、培养条件不适应等培养过程中的一些技术瓶颈，探寻到丝瓜花粉辐射诱变的最佳剂量、较低污染率方法、最优培养基配方和培养条件，可显著提高胚状体诱导率，促进诱导再生植株的形成。通过本发明方法形成的单倍体或双单倍体植株可缩短育种年限，为丝瓜单倍体育种技术提供技术支撑。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明辐射前和不同辐射剂量对花粉活力的影响，其中A为花粉辐射前活力，B为花粉辐射后活力(200Gy)，C为花粉辐射后活力(300Gy)，D为花粉辐射后活力(400Gy)，(1)、(2)、(3)为取的三个不同的视野；

图2附图为本发明不同消毒方法对胚状体污染率的影响，其中A为方法一，B为方法二；

图3附图为采用本发明方法诱导的胚状体。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。

实施例1

供试丝瓜品种为泰州香丝瓜，由江苏省农业科学院泰州农科所提供。试验材料于2021年7月15日播种，8月9日定植在江苏省农业科学院泰州农科所试验基地的塑料大棚中，10月15日开始取样进行辐射花粉处理。

(1)辐射花粉剂量的选择

辐射花粉前，选择生长势较强的丝瓜品种，于开花前1天下午对雄花进行夹花处理以防授粉；第二天早上8点半～10点之间摘取夹好的雄花迅速放到自封袋并放到准备好的冰盒里，保证花粉活力。然后立即送去辐照中心进行辐射处理。辐射剂量分别为200Gy、300Gy、400Gy的γ射线辐照处理，每个剂量处理时间均为60分钟。

对辐照前和辐照后的花粉活力进行检测，可参照张琛等研究中利用TTC法进行活力测定的方法设计花粉活力测定试验。具体操作步骤为：取各个处理花粉少许放在干洁的载玻片上，加1～2滴0.5％TTC溶液，搅匀后盖上盖玻片，并用清水作对照。置35℃恒温箱中，30min后镜检，凡被染为红色的花粉活力强，淡红次之，无色者为没有活力或不育花粉。每片取3个视野，统计花粉的染色率，以染色率表示花粉的活力百分率。

辐射前和不同辐射剂量对花粉活力的影响见图1。

由图1可知，丝瓜花粉辐射前活力较强，染色后均为红色；进行200Gy和300Gy辐射后，花粉染色后均呈现红色，活力较强，而400Gy辐射后，花粉活力明显下降。

所以选择200Gy和300Gy辐射剂量较为适宜，有助于保持花粉活力。

(2)辐射花粉授粉及辐射后丝瓜坐果率和成熟种子饱满度统计

辐射当天下午对雌花进行夹花处理，第2天早晨8：30～10：00之间进行各个剂量的辐射花粉授粉工作，授粉后立即进行套袋处理，以免花粉受到污染。此后进行常规的栽培管理。授粉后7天统计坐果率；授粉50～55天后采收，统计种子饱满度。(见表1)。

表1不同剂量γ射线辐射后丝瓜坐果率和种子饱满度

表1看出，未进行辐射处理的丝瓜坐果率和成熟种子饱满度均最高，使用200Gyγ射线对丝瓜花粉进行辐射后，丝瓜坐果数和成熟种子饱满度较300Gy和400Gyγ射线处理后的高；300Gyγ射线处理和400Gyγ射线后的坐果率一样，但成熟种子饱满度300Gyγ射线处理显著高于400Gyγ射线处理的。说明200Gyγ射线处理对丝瓜种子发育无影响，400Gyγ射线处理影响种子的发育。

(3)不同消毒方法对果实和种子污染率及后期胚状体诱导率的影响

授粉后18天(此时种子嫩胚已呈饱满状态)采摘进行试验处理。

在接种前使用两种不同方法对丝瓜果实和种子进行消毒处理，对比两种消毒方法对种子的污染率及胚状体诱导率的影响。

方法一：用流水清水冲洗丝瓜表面2～3min，吸水纸吸尽表面水分，再用75％的乙醇对果实进行表面消毒后拿进无菌操作台；在操作台内再用75％的酒精擦拭果实表面，然后用无菌手术刀将丝瓜果实剖开分离种子接种到配好的MS培养基上进行培养。

方法二：先用流水清水冲洗丝瓜表面2～3min，吸水纸吸尽表面水分，放进无菌操作台，用无菌手术刀取出丝瓜种子，先用75％乙醇消毒30s后，再用7％的NaClO消毒10min，期间不断摇动；再用无菌水冲洗3次，每次3～5min；最后接种到配好的MS培养基中。

7～10天后统计种子污染率，培养30～35天后统计胚状体诱导率(见表2)。

表2不同消毒方法对丝瓜种子消毒的差异

通过表2看出，用方法二进行消毒后可显著降低丝瓜种子污染，降低污染率39.13％，但胚状体诱导率为0，而方法一虽污染率高，但能促进胚状体诱导率。可能是因为方法二的消毒时间和浓度对幼嫩种子的胚造成了损伤。

污染率代表照片见图2。

(4)培养基配方

将丝瓜种子消毒后，接种于MS培养基中，经过多次摸索后(尝试过的其他培养基都未出胚)形成培养基配方为：MS+30g/L蔗糖+0.2mg/L 6-BA+7g琼脂，pH值5.8～6.0。

(5)培养预处理

通过低温冷处理和高温热激处理，激发胚状体诱导，以常规处理为对照。具体步骤为：

方法一：将接种到MS培养基中的种子置于4℃低温黑暗条件下进行分别预处理1d和2d后，再转到25℃培养室中进行培养，观察低温处理对丝瓜胚状体诱导率的影响(见表3)。

方法二：将接种到MS培养基中的种子置于32℃高温黑暗条件下分别热激处理1d和2d后，再转到25℃组培室中进行培养，观察高温热激处理对丝瓜胚状体诱导率的影响(见表3)。

培养18～20天后观察丝瓜愈伤组织形成情况，30～35天后统计胚状体诱导率。

表3不同预处理培养对丝瓜愈伤组织形成和胚状体诱导率的影响

从表3可以得出，4℃分别进行冷处理1天和2天后丝瓜愈伤组织形成数和胚状体诱导数均为最低；32℃高温热激后有助于丝瓜愈伤组织形成和胚状体诱导，其中热激2天后愈伤组织发生数高于热激1天和不进行热激的，但胚状体诱导率与不进行热激处理的一样，均为1％。

综上所述，使用200Gyγ射线剂量对丝瓜花粉进行辐射处理，可显著提高丝瓜坐果率，且不影响丝瓜成熟种子的饱满度；使用方法一进行种子消毒处理加32℃热激预处理后再进行常规培养有助于提高辐射花粉后胚状体诱导率。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种提高丝瓜辐射诱变胚状体诱导率的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)花粉辐射处理：

(2)辐射花粉授粉：

(3)消毒处理：

(4)培养处理：

转到组培室进行常规培养。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述辐照剂量为200Gy。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，辐照前一天下午对雄花进行夹花处理，次日早上8:30～10:00进行辐照处理。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，辐照处理当天下午对雌花进行夹花处理，辐照处理次日早上8:30～10:00进行授粉处理，授粉后立即进行套袋处理。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)的具体操作为：授粉18天后，用流水冲洗丝瓜表面2～3min，吸水纸吸干表面水分，再用75％乙醇对丝瓜果实表面进行消毒后拿进无菌操作台，在无菌操作台内用75％乙醇擦拭丝瓜果实表面，之后用无菌手术刀将丝瓜果实剖开分离种子接种到MS培养基。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MS培养基的配方为：MS+30g/L蔗糖+0.2mg/L 6-BA+7g琼脂，pH值5.8～6.0。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)常规培养之前可进行32℃热激培养。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)的具体操作为：将接种到MS培养基中的种子置于32℃黑暗条件下培养1～2天，之后转到25℃组培室进行常规培养。

9.如权利要求1～8任一所述的方法，其特征在于，所述丝瓜品种为泰州香丝瓜。