CN108308030A

CN108308030A - 一种促进油梨茎段诱导愈伤组织及无菌芽的方法

Info

Publication number: CN108308030A
Application number: CN201810296973.2A
Authority: CN
Inventors: 许文天; 王松标; 高玉尧; 武红霞; 罗纯; 梁清志; 姚全胜
Original assignee: South Subtropical Crops Research Institute CATAS
Current assignee: South Subtropical Crops Research Institute CATAS
Priority date: 2018-04-04
Filing date: 2018-04-04
Publication date: 2018-07-24

Abstract

本发明公开了一种促进油梨茎段诱导愈伤组织及无菌芽的方法。本发明所述方法包括如下步骤：（1）外植体的选取；（2）外植体预处理；（3）消毒；（4）接种；（5）培养；（6）获得愈伤组织及再生芽。本发明具有以下有益效果：（1）利用油梨半童期茎段作为外植体进行组织培养，相对于成年态茎段，其再生芽的萌动率更高，且组织不容易坏死；（2）半童期的茎段较成年态茎段容易消毒，通过严格控制消毒剂的时间和浓度，以不达到影响诱导效果和破坏外植体的组织结构，通过本发明能将污染率控制在15%以下；（3）通过黑暗培养，7d即可诱导出愈伤组织，15d诱导出再生芽，再经过15d光照培养后愈伤组织活力较高，再生芽生长较快。

Description

一种促进油梨茎段诱导愈伤组织及无菌芽的方法

技术领域

本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种促进油梨茎段诱导愈伤组织及无菌芽的方法。

背景技术

油梨(Persea americana Mill.)属樟科（Lauraceae）油梨属多年生常绿乔木果树，又名牛油果，原产于中南美洲，是理想的高能低糖水果，具有“森林黄油”等美誉。我国于二十世纪八十年代开始规模化引种试种，主要集中在广西、海南等地。近年来，随着人们生活质量提高，在我国热区发展油梨具有显著经济效益。

目前，生产上优良砧木的匮乏及繁育极大限制了我国油梨种植和产业的发展。近年来中国热到农业科学院南亚热带作物研究所引进一种抗寒、耐盐碱砧木’Dusa’，具有较大发展和利用前景。但目前尚缺乏这种优良砧木经济、高效的快繁体系。离体茎段培养可以维持母株优良性状，具有培养周期短，繁殖快，可脱除病毒，经济效益好等优点，是实现油梨砧木快繁最可靠的微繁殖方法。在以油梨茎段为外植体诱导愈伤组织或无菌芽时，通常成年态外植体形态发生能力显著低于童期材料，且其内生菌复杂，消毒困难，污染率较大，组织容易坏死，难以进行规模化生产。

发明内容

本发明为了克服现有技术中油梨成年态茎段外植体脱分化能力低、消毒困难及培养物组织易坏死等缺陷，提供一种促进油梨茎段诱导愈伤组织及无菌芽的方法；该方法操作简便，可显著提高愈伤组织和再生芽的诱导率，并显著降低污染率，且通过该方法可以得到质量较好的愈伤组织和无菌芽，实现油梨成年态茎段离体高效快繁的作用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种促进油梨茎段诱导愈伤组织及无菌芽的方法，包括如下步骤：

（1）外植体的选取：从成年油梨植株上选取接穗，嫁接到实生苗上，次年，当实生苗上重新抽发出新的枝条时，取抽发出的新枝条中上部带腋芽的半木质化枝条，即半童期枝条；用消毒过的剪刀截取半童期枝条上健康且无病虫害的长茎段，茎段20cm长，直径0.5-1cm；

（2）外植体预处理：将上述选好的长茎段迅速带回室内，去掉叶片，用消毒剪刀剪成5-8cm长段，置于干净的容器中，于自来水下流水冲洗30min；

（3）消毒：将上述预处理后的长茎段置于灭菌过的超净工作台上，先用75%酒精消毒30s，然后用0.1%升汞消毒7min，接着用2%次氯酸钠溶液消毒10min，最后用无菌水冲洗4次；

（4）接种：用灭菌手术刀将上述消毒过的长茎段两端各切掉0.5cm，然后将剩余的长茎段切成长度1cm的带腋芽的段，接种在培养基MS+0.5mg/L 6-BA上；

（5）培养：将上述接种后的培养基放置在无菌培养室中暗处培养13-15天，之后转移到光照下培养；

（6）获得愈伤组织及再生芽：光照培养30天后，获取愈伤组织及再生芽。

更进一步的，所述无菌培养室温度为28±2℃，湿度为70-75%，光照为2000Lux。

本发明方法尤其适合的油梨植株品种为‘Dusa’品种。

现有技术对油梨愈伤组织的诱导及促进其芽分化的方法多是直接采用成年态或幼年态的外植体（包括茎段、叶片等），且不同品种诱导愈伤或芽的方法存在较大差异，尤其在外植体类型、激素配方、培养条件等存在较大差异，对于‘Dusa’品种不适用。而茎段外植体分为幼年态茎段和成年态茎段，一般成年态茎段分化能力弱，内生菌复杂难以消毒，培养过程中组织极易坏死，其组织培养较幼年态茎段难。本发明技术方案在研究对比了多种不同的激素配方、消毒方法、培养方式等，创新建立了茎段培养的方法，实现了油梨抗寒、耐盐碱砧木‘Dusa’的离体快繁。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

（1）利用油梨半童期茎段作为外植体进行组织培养，油梨半童期茎段具备一定程度幼年态特性，选择这种半童期枝条，相对于成年态茎段，其再生芽的诱导率更高，且组织不容易坏死；

（2）半童期的茎段较成年态茎段容易消毒，通过严格控制消毒剂的时间和浓度，以不达到影响诱导效果和破坏外植体的组织结构，通过本发明能将污染率控制在15%以下；

（3）通过黑暗培养，7d即可诱导出愈伤组织，15d诱导出再生芽，再经过15d光照培养后愈伤组织活力较高，再生芽生长较快。

采用本发明，外植体污染率为5%-13%，愈伤组织诱导率为56.7%-93.3%，无菌芽的诱导率为80%-90%，与已有技术相比，还具有如下优点：（1）消毒剂都是常规消毒剂，不需要二次消毒，一步到位；（2）容易获得无菌外植体；（3）能在短期内同时获得愈伤组织和再生芽，愈伤组织可以作为无菌芽的诱导材料，不需要消毒处理，再生芽在光照下生长较快，不容易出现坏死。

本发明为油梨优良砧木快繁寻求到一条新途径，有效控制了污染率，短期内能同时诱导高活力愈伤组织和大量再生苗，获得的愈伤组织可以进一步诱导再生芽，能传承母株优良性状，实现优良砧木快速、规模化繁殖的作用。

附图说明

图1为本发明实施例1所提供的‘Dusa’和‘Duke7’油梨愈伤组织及无菌芽诱导30d后生长情况，其中，A为‘Dusa’半童期茎段；B为‘Dusa’成年态茎段；C为‘Duke7’半童期茎段；D为‘Duke7’成年态茎段；图2为本发明实施例3所提供的不同培养方式下‘Dusa’油梨愈伤组织及无菌芽诱导30d后生长情况；A的培养方式为暗培养+半光照；B的培养方式为暗培养；C的培养方式为半光照培养。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例1采用以下步骤，对比以半童期茎段和成年态茎段两种不同外植体获得油梨植株茎段诱导愈伤组织及无菌芽的情况：

（1）不同外植体的获取

①半童期茎段的获取：分别从‘Dusa’、‘Duke7’成年油梨植株上选取接穗，嫁接到实生苗上，次年可以重新抽发出新的枝条，这些重新抽发的枝条中上部带腋芽的半木质化枝条，即半童期枝条，它们具备一定程度幼年态特性；选择这种半童期枝条，用消毒过的剪刀截取健康且无病虫害的长茎段，茎段长20cm，直径0.5-1cm；

②成年态茎段的获取：分别从‘Dusa’、‘Duke7’成年油梨植株上选择中上部带腋芽的半木质化枝条，用消毒过的剪刀截取健康且无病虫害的长茎段，茎段20cm长，直径0.5-1cm；

（2）外植体预处理：将上述步骤①②分别截取的长茎段迅速带回室内，去掉叶片，用消毒剪刀剪成5-8cm长段，置于干净的容器中，于自来水下流水冲洗30min；

（4）接种：用灭菌手术刀将上述消毒过的长茎段两端各切掉0.5cm，然后将剩余的长茎段切成长度1cm的带腋芽的段，接种在培养基MS+0.5mg/L 6-BA上；不同外植体材料各接种茎段30个，各重复3次；

上述所获得的实验结果如表1所示；‘Dusa’和‘Duke7’油梨愈伤组织及无菌芽诱导30d后生长情况如图1所示，其中，A为‘Dusa’半童期茎段；B为‘Dusa’成年态茎段；C为‘Duke7’半童期茎段；D为‘Duke7’成年态茎段。

表1中的数据采用 SPSS Statistics 18.0 统计分析软件进行独立样本T检验（P≦ 0.05），数据后^**表示处理间差异显著。污染率（%）=（污染的外植体数/总外植体数）×100%；愈伤组织诱导率=（诱导出愈伤组织的外植体数/总外植体数）×100%；无菌芽的诱导率=（诱导出无菌芽的外植体数/总外植体数）×100%。

从表1中可以看出，无论是Dusa还是Duke7，其半童期茎段愈伤组织诱导率和无菌芽再生率均显著高于成年态茎段，而污染率显著低于成年态茎段，因此，半童期茎段外植体是更适合油梨茎段诱导愈伤组织及无菌芽的外植体。

实施例2采用以下步骤对比不同消毒方法对油梨茎段外植体诱导愈伤组织及无菌芽的影响：

（1）外植体的获取：从‘Dusa’成年油梨植株上选取接穗，嫁接到实生苗上，次年可以重新抽发出新的枝条，这些重新抽发的枝条中上部带腋芽的半木质化枝条，即半童期枝条，它们具备一定程度幼年态特性，选择这种半童期枝条，用消毒过的剪刀截取健康且无病虫害的长茎段，茎段20cm长，直径0.5-1cm；

（3）消毒：将上述预处理后的长茎段置于灭菌过的超净工作台上，采用如下不同的消毒方法：

方法1： 0.5%植物组培抗菌剂浸泡4h—75%酒精30s—0.1%升汞7min—无菌水冲洗4次；

方法2：75%酒精30s—0.1%升汞7min—无菌水冲洗4次；

方法3：75%酒精30s—0.1%升汞7min—2%次氯酸钠溶液10min—无菌水冲洗4次；

（4）接种：用灭菌手术刀将上述消毒过的长茎段两端各切掉0.5cm，然后将剩余的长茎段切成长度1cm的带腋芽的段，接种在培养基MS+0.5mg/L 6-BA上；不同消毒方法后接各接种茎段30个，各重复3次；

（5）培养：将上述接种后的培养基放置在无菌培养室中暗处培养13-15d，之后转移到光照下培养；

（6）获得愈伤组织及再生芽：培养30d后，获取愈伤组织及再生芽。

上述所获得的实验结果如表2所示。

表2中的数据采用 SPSS Statistics 18.0 统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较（P≦0.05），数据后字母不同表示处理间差异显著。污染率（%）=（污染的外植体数/总外植体数）×100%；愈伤组织诱导率=（诱导出愈伤组织的外植体数/总外植体数）×100%；无菌芽的诱导率=（诱导出无菌芽的外植体数/总外植体数）×100%。

从表2中可以看出，半童期茎段采用消毒方法3后愈伤组织诱导率和无菌芽再生率显著提高，污染率显著降低。因此，消毒方法3是更适合油梨茎段诱导愈伤组织及无菌芽的消毒方法。

实施例3采用以下步骤对比不同培养方式下油梨茎段外植体诱导愈伤组织及无菌芽的情况：

（5）培养：将上述接种后的培养基放置在无菌培养室中培养，分为暗培养、半光照培养（光照12h，黑暗12h，光照强度2000lux）、暗培养+半光照培养（各培养15d），不同培养方式的外植体材料各接种茎段30个，各重复3次进行对比；

上述所获得的实验结果如表3所示，培养结果如图2，图中A的培养方式为暗培养+半光照；B的培养方式为暗培养；C的培养方式为半光照培养。

表3数据采用 SPSS Statistics 18.0 统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较（P≦0.05），数据后字母不同表示处理间差异显著。污染率（%）=（污染的外植体数/总外植体数）×100%；愈伤组织诱导率=（诱导出愈伤组织的外植体数/总外植体数）×100%；无菌芽的诱导率=（诱导出无菌芽的外植体数/总外植体数）×100%。

从表3中可以看出，半童期茎段采用不同培养方式其污染率无显著差异，而愈伤诱导率及无菌芽再生率有差异，其中暗培养+半光照培养（各培养15d）下愈伤诱导率及无菌芽诱导率均最佳。因此，暗培养+半光照培养（各培养15d）是更适合油梨茎段诱导愈伤组织及无菌芽的培养方法。

实施例4采用以下步骤对比培养基不同6-BA浓度对油梨茎段外植体诱导愈伤组织及无菌芽的影响：

（1）外植体的获取：从‘Dusa’成年油梨植株上选取接穗，嫁接到实生苗上,次年可以重新抽发出新的枝条，这些重新抽发的枝条中上部带腋芽的半木质化枝条，即半童期枝条，它们具备一定程度幼年态特性，选择这种半童期枝条，用消毒过的剪刀截取健康且无病虫害的长茎段，茎段20cm长，直径0.5-1cm；

（4）接种：用灭菌手术刀将上述消毒过的长茎段两端各切掉0.5cm，然后将剩余的长茎段切成长度1cm的带腋芽的段，接种在含有不同浓度6-BA(0、0.5、1、2、4mg/L)的MS培养基上。不同培养基的外植体材料各接种茎段30个，各重复3次；

上述所获得的实验结果如表4所示。

表4数据采用 SPSS Statistics 18.0 统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较（P≦0.05），数据后字母不同表示处理间差异显著。愈伤组织诱导率=（诱导出愈伤组织的外植体数/总外植体数）×100%；无菌芽的诱导率=（诱导出无菌芽的外植体数/总外植体数）×100%。

从表4中可以看出，不同浓度6-BA对茎段外植体诱导愈伤组织及无菌芽的影响差异显著，随着6-BA浓度升高，愈伤组织诱导率及无菌芽再生率呈现先增后降低的趋势，其中6-BA浓度为0.5 mg/L时，愈伤组织诱导率及无菌芽再生率最高。因此，0.5mg/L 6-BA是油梨茎段诱导愈伤组织及无菌芽的最佳浓度。

通过上述实施例1-4可以看到，采用本发明的方法，利用油梨半童期茎段作为外植体进行组织培养获得油梨茎段诱导愈伤组织及无菌芽，具有外植体污染低，愈伤组织诱导率高，无菌芽的诱导率高，愈伤组织活力较高、再生芽生长较快、步骤简便等特点。

Claims

1.一种促进油梨茎段诱导愈伤组织及无菌芽的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述无菌培养室温度为28±2℃，湿度为70-75%，光照为2000Lux。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述油梨植株品种为Dusa。