WO2021213152A1 - 一种油梨未成熟胚的体外拯救方法 - Google Patents

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王甲水
李艳霞
刘远征
马蔚红
臧小平
张贺
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中国热带农业科学院海口实验站
中国热带农业科学院三亚研究院
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Definitions

  • the present invention studies this problem and proposes a method to solve the zygotic embryo rescue of the fallen hybrid avocado fruit, thereby effectively improving the survival rate of the hybrid avocado zygotic embryo, increasing the success rate of the avocado hybridization, and saving the hybrid offspring. Reduce the loss of hybrid offspring, ensure the genetic integrity of the hybrid population, and provide key technologies for avocado hybrid breeding and genetic research.
  • the basal medium is the basic nutrient solution for the germination of seed embryos, which is composed of macroelements, trace elements, iron salts, and organic components;
  • step (3) of the method according to the invention for the seed embryos within 100 days of pollination, if the initial companion culture effect is not good or the development is not good, the seed coat is removed and the seed is disinfected, and the pre-culture medium is used Keep the seeds growing at a temperature of 25°C ⁇ 1°C, and carry out 16 hours of light irradiation during the growth period (as shown in Figure 2). When the seeds return to normal growth, follow the steps above to continue the rescue of immature embryos;
  • step (3) of the method of the present invention acid is used to adjust the pH of the medium to 5.74.
  • the acid reagent is hydrochloric acid.
  • step (3) of the method of the present invention the sterilization conditions are: autoclave sterilization at 121° C. and 0.1 MPa for 15-20 minutes.
  • the conditions of the light culture are: irradiated by a Grolux lamp tube; preferably, the irradiation intensity is 40 mmol.m -2 .s -1 .
  • the invention provides an in vitro culture and rescue technology for immature embryos of avocado.
  • zygotic embryos at different development stages are induced to mature under in vitro conditions, the embryos are induced to germinate after maturation to form healthy plants.
  • the technology of the present invention can increase the recovery rate of hybrid avocado seeds and reduce the waste of hybrid results.
  • Fig. 1 is a schematic flowchart of an embodiment of the method of the present invention
  • the present invention provides a method for rescuing immature embryos of avocado, which includes the following steps:
  • Zygotic embryos whose embryo maturity is below 80% are the objects to be rescued.
  • the rescue success rate is lower than for embryos with high maturity.
  • the rescue success rate can reach more than 95%, and most of the seed embryos are rescued and recovered.

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Abstract

提供了一种油梨未成熟胚的体外拯救方法，包括：收集未成熟的油梨杂交果实，从消毒后的果实中剥离出未成熟的合子胚；根据合子胚的成熟度，选择不同的培养基促使合子胚的成熟；油梨种胚发芽后，在光照条件下长成正常的植株。本发明可有效提高杂交油梨合子胚的成活率，提高油梨杂交成功率，拯救杂交后代，减少了杂交后代丢失，保证杂交群体的遗传完整性。

Description

一种油梨未成熟胚的体外拯救方法 技术领域
本发明涉及一种经济果树育种领域，具体地涉及一种油梨未成熟胚的体外拯救方法。
背景技术
油梨杂交育种是创造遗传变异、改良遗传特性，培育优良植物新品种的主要技术。通过油梨的种间杂交，可以将同一物种内的两个或多个优良性状集中在一个新品种中。另外，种间杂交还可以产生杂种优势，获得比亲本品种更强或表现更好的新品种。
然而，油梨幼果具有很高的脱落率。利用杂交方法进行杂交，杂交的果实会大量落果，能正常在树上发育的很少，导致油梨杂交培育材料巨大丢失，这也是油梨杂交育种中存在的重大难题。本发明就这一难题进行了研究，提出一种解决脱落的杂交油梨果实合子胚拯救成熟的方法，从而有效提高杂交油梨合子胚的成活率，提高油梨杂交成功率，拯救杂交后代，减少了杂交后代丢失，保证杂交群体的遗传完整性，为油梨杂交育种和遗传研究等提供关键技术。
发明内容
针对现在技术中存在的问题，本发明提供一种利用未成熟胚进行体外培养，从脱落的油梨果实中培养出成熟的油梨种子胚胎的方法。拯救后的油梨种子可以发芽并生长成正常的杂交油梨植株。
在本发明中，“种胚”、“合子胚”、“胚体”均是指本发明的方法所拯救的核心对象，在本发明的语境下，这些术语可以互换。在不同的具体语境下，采用不同的术语。
本发明的拯救未成熟的油梨种胚方法使用到的培养基包括：
(1)基础培养基
基础培养基是种胚萌发的基础营养液，由大量元素、微量元素、铁盐、有机成分组成；
(2)萌发培养基
萌发培养基是种胚萌发的营养液，由基础培养基+6-苄胺基嘌呤(6-BA)+琼脂粉+蔗糖组成；
(3)陪护培养基
对于成熟度低于80％的油梨种胚，由于成熟度低，因此需要采用陪护培养基进行人工促进种胚的生长；陪护培养基由全强度或半强度的基础培养基+酪蛋白水解物或谷氨酸+琼脂粉+蔗糖组成。
如图1所示，本发明的方法包括以下步骤：
(1)外植体前处理
收集未成熟的油梨落果，从消毒后的果实中剥离出未成熟的合子胚；
根据实践经验，判断合子胚的成熟度；对于胚成熟度为80％-100％的合子胚，直接萌发培养；对于成熟度为80％以下的合子胚，则先进行陪护培养至80-100％的成熟度，然后再进行萌发培养；
(2)根据配方配制基础培养基、陪护培养基和萌发培养基；
其中，基础培养基的配方为：
Figure PCTCN2021084039-appb-000001
Figure PCTCN2021084039-appb-000002
陪护培养基的配方a、b、c、d、e和f的配方如下：
a.半强度的基础培养基
300～500mg/L酪蛋白水解物
8～12％椰子水
8～12％蔗糖
1～3g/L琼脂粉；以及
b.半强度的基础培养基
300～500mg/L谷氨酰胺
8～12％椰子水
8～12％蔗糖
1-3g/L琼脂粉
c.半强度的基础培养基
300-500mg/L酪蛋白水解物
8-12％椰子水
4-6％蔗糖
2-4g/L琼脂粉；以及
d.半强度的基础培养基
300-500mg/L谷氨酰胺
8-12％椰子水
4-6％蔗糖
2-4g/L琼脂粉；
e.基础培养基
300-500mg/L酪蛋白水解物
8-12％椰子水
2-4％蔗糖
4-6g/L琼脂粉；以及
f.基础培养基
300-500mg/L谷氨酰胺
8-12％椰子水
2-4％蔗糖
4-6g/L琼脂粉；
分别根据陪护培养基a、b、c、d、e和f的配方，将椰子水以外的各个成分加到容器中，搅拌，然后将各个培养基的pH调节至5.5-6.5，将培养基进行灭菌、冷却处理后，将过滤并灭菌后的椰子水加入冷却的灭菌培养基中，得到陪护培养基a、b、c、d、e和f；
萌发培养基的配方为：
基础培养基
2.0-4.0μM 6-苄胺基嘌呤(6-BA)
4-8g/L琼脂粉
2.5-3.5％蔗糖；
(3)初始陪护培养基的选择
根据不同的合子胚的成熟度选择相应的陪护培养基的配方；
对于授粉后100天内的种胚，选择陪护培养基a或b中的任意一种作为初始陪护培养基；
对于授粉后100天至200天的种胚，选择陪护培养基c或d中的任意一种作为初始陪护培养基；
对于授粉后200天之后的种胚，选择陪护培养基e或f中的一种作为初始陪护培养基。另外，对于授粉后200天之后的种胚，是比较成熟的种胚，也可以采用萌发培养基直接进行萌发培养；
(4)合子胚的陪护培养以及陪护培养基的选择和更换
在合子胚的前心形期，采用陪护培养基a或b进行陪护培养(这个时间的陪护培养也可以称为“初级陪护培养”)；当将合子胚培养到鱼雷期时，更换为陪护培养基c或d进行陪护培养(这个时间的陪护培养也可以称为“一级陪护培养”)；在合子胚培养至成熟期时更换为陪护培养基e或f进行陪护培养(这个时间的陪护培养也可以称为“陪护培养”)。
将合子胚培养至成熟期的时间设定在10周内，在这10周内，无论是合子胚属于哪个成熟度，10周内基本都能通过陪护培养而培养至成熟期。随着合子胚成熟度的提高，需要不断更换陪护培养基。一般地，在针对某个成熟度的合子胚采用相应的陪护培养基进行培养，随着成熟度的提高，每隔3-4周后更换用于更高成熟度的陪护培养基。例如，在前心形采用陪护培养基a进行陪护培养，经过3-4周后，合子胚发展到了鱼雷期，此时，将陪护培养基更换为陪护培养基c进行进一步的陪护培养。
经陪护培养，合子胚已发展到成熟期，然后进行萌发培养；
未成熟合子胚的陪护培养在黑暗条件下进行。
(5)萌发培养
将上面陪护培养得到的种胚放入萌发培养基中，在25℃±1℃进行萌发培养，以维持合子胚的生长；在萌发培养期间进行光照培养，直至培养成正常生根小苗。在萌发期间，通过在陪护培养基上部分去除子叶诱导胚胎发芽；在15周期间进行发芽，大约每隔3周更换萌发培养基。
根据本发明的方法，在步骤(1)中，对落果表面和种子进行灭菌处理。
根据本发明的方法，所述灭菌处理包括：采用0.5v/v％次氯酸钠溶液中浸泡，然后在无菌蒸馏水中漂洗三次；优选地，所述0.5v/v％次氯酸钠溶液还含有10滴/L的吐温20。
根据本发明的方法，在步骤(2)中，所述萌发培养基的配方为：
基础培养基
2.22μM 6-BA
6g/L琼脂粉
2.5-3.5％蔗糖；
其中，所述基础培养基的配方为：
Figure PCTCN2021084039-appb-000003
Figure PCTCN2021084039-appb-000004
根据本发明的方法，在步骤(2)中，陪护培养基a、b、c、d、e、f的配方如下：
a.半强度的基础培养基
400mg/L酪蛋白水解物
10％椰子水
10％蔗糖
2g/L琼脂粉；以及
b.半强度的基础培养基
400mg/L谷氨酰胺
10％椰子水
10％蔗糖
2g/L琼脂粉
c.半强度的基础培养基
400mg/L酪蛋白水解物
10％椰子水
5％蔗糖
3g/L琼脂粉；以及
d.半强度的基础培养基培养基
400mg/L谷氨酰胺
10％椰子水
5％蔗糖
3g/L琼脂粉；
e.基础培养基
400mg/L酪蛋白水解物
10％椰子水
3％蔗糖
5g/L琼脂粉；以及
f.基础培养基
400mg/L谷氨酰胺
10％椰子水
3％蔗糖
5g/L琼脂粉。
在根据发明方法的步骤(3)中，对于授粉后100天内的种胚，若选择初始陪护培养效果不佳或发育不好的，则在将种子剥去种皮、消毒后，采用前培养基使种子在25℃±1℃的温度下维持生长，在维持生长期间进行16小时的光照射(如图2所示)，待种子恢复正常生长时，按照上述步骤继续未成熟胚的拯救；
其中，前培养基的配方为：
半强度的基础培养基
2.0-2.5μM 6-苄胺基嘌呤
4-8g/L琼脂粉
2.5-3.5％蔗糖。
在本发明的方法的步骤(3)中，采用酸将培养基的pH调节至5.74。优选地，所述酸试剂为盐酸。
在本发明的方法的步骤(3)中，所述灭菌的条件为：在121℃和0.1MPa下高压灭菌15-20分钟。
在本发明的方法的步骤(5)中，所述光照培养的条件为：通过Grolux灯管照射；优选地，照射强度为40mmol.m -2.s -1。
对于胚成熟度为80-100％之间的合子胚，一般无需拯救种胚，可以将成熟度为80-100％的种胚直接放入萌发培养基中进行萌发培养。
本发明提供了一种油梨未成熟胚的体外培养拯救技术，当处于不同发育阶段的合子胚在体外条件下诱导成熟，成熟后诱导胚萌发，形成健康植株的技术。本发明的技术可以提高杂交油梨种子的回收率，减少杂交成果的浪费。
附图说明
图1是本发明方法的一种实施方式的流程示意图；
图2是本发明方法的另一种实施方式的流程示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步说明本发明。
本发明提供了一种油梨未成熟胚的拯救方法，所述方法包括的如下步骤：
(1)外植体的前处理
生理落果、其他脱落以及需要胚拯救的材料，最好选择落果或落实48小时内，进行胚拯救，有助于提高拯救的成功率。
收获后，通过放入含有10滴/L的吐温20的0.5％(v/v)次氯酸钠溶液中10分钟浸泡对果实进行表面灭菌，然后在无菌蒸馏水中漂洗三次。通过在落果和种胚进行消毒，可以保证种胚处于无菌状态，确保种胚拯救的成功率和结果的正确性。
在无菌条件下纵向切割灭菌的果实，取出种子，通过0.5％(v/v)次氯酸钠溶液中10分钟浸泡对果实进行表面灭菌，然后在无菌蒸馏水中漂洗三次。消毒后的种子，小心地剥离出未成熟的合子胚。
(2)胚基本成熟培养方法
根据实践经验，判断合子胚的成熟度。对于胚成熟度为80％-100％的合子胚，直接萌发培养。将胚成熟度为80％-100％的合子胚放入萌发培养基中进行萌发培养，根据油梨的发育状况和胚成熟度选择萌发培养基的强度；可根据油梨不同发育情况和胚成熟度选择培养基强度，如果成熟度低选择液体培养基，成熟度中等选择半固体培养基，同时根据胚发育情况，由液体培养基逐步变成半固体培养，最后为固体培养。
胚成熟度为80％以下的合子胚是需要拯救的对象。
选取胚成熟度为80％以下的合子胚，先进行陪护培养至80-100％的成熟度，然后再进行萌发培养。
陪护培养至萌发培养需要用到的培养基包括：(1)基础培养基、(2)萌发培养基和(3)陪护培养基。
下面介绍如上列举的三种培养基的配方以及配制方法。
萌发培养基的配方为：
基础培养基
2.22μM 6-BA
6g/L琼脂粉
3％蔗糖；
其中，基础培养基的配方为：
Figure PCTCN2021084039-appb-000005
Figure PCTCN2021084039-appb-000006
注：在上表中，铁盐在组织培养中首先将乙二胺四乙酸二钠(Na 2·EDTA)和硫酸亚铁FeSO 4· 7H 2O分别溶解后，在相互混合配制获得。
①根据不同的胚胎成熟选择陪护培养基
从油梨种子落果中选取120个授粉后100日内、授粉后100d-200d的和授粉后200d后的种胚，分别采用以下培养基进行培养：
陪护培养基a、b、c、d、e、f的配方以及选择原则如下。
对于授粉后100天内的种胚，选择陪护培养基a或b中的任意一种进行陪护培养。
a.半强度的基础培养基
400mg/L酪蛋白水解物
10％椰子水
10％蔗糖
2g/L琼脂粉；以及
b.半强度的基础培养基
400mg/L谷氨酰胺
10％椰子水
10％蔗糖
2g/L琼脂粉
对于授粉后100天至200天的种胚，选择陪护培养基c或d中的任意一种进行陪护培养。
c.半强度的基础培养基
400mg/L酪蛋白水解物
10％椰子水
5％蔗糖
3g/L琼脂粉；以及
d.半强度的基础培养基培养基
400mg/L谷氨酰胺
10％椰子水
5％蔗糖
3g/L琼脂粉；
对于授粉后200天以后的种胚，选择陪护培养基e或f中的任意一种进行陪护培养。
e.基础培养基
400mg/L酪蛋白水解物
10％椰子水
3％蔗糖
5g/L琼脂粉；以及
f.基础培养基
400mg/L谷氨酰胺
10％椰子水
3％蔗糖
5g/L琼脂粉。
对120个种胚及其陪护培养基的配方的分配如下表1所示。
表1
Figure PCTCN2021084039-appb-000007
(3)培养液的配制
将上述所有陪护培养基的pH用盐酸调节至5.5-6.5，将陪护培养基在121℃和0.1MPa下高压灭菌15-20分钟；将陪护培养基冷却处理后，将椰子水加入冷却、灭菌后的陪护培养基中；
(4)陪护培养基的选择和更换
在前心形期胚培养，选择a或b培养基，培养到鱼雷期后，选择c或d培养基，成熟期后选择e或f；
针对每个成熟度使用相应的陪护培养基的2-3周后，更换新培养基，或应根据种胚发育成熟情况更换针对下一个成熟度的陪护培养基，直至种胚成熟。
陪护培养，应在25℃±1℃的温度下，黑暗或弱光培养。
(5)萌发培养
陪护培养的种胚达到萌发时期时，将种胚放在萌发培养基培养。同时，通过在萌发培养基上部分去除子叶诱导胚胎发芽，间隔2-3周更换培养基。
萌发培养，在25℃±1℃的温度下维持生长。萌发培养在光照条件下进行，在萌发培养期间进行16小时的光周期培养。具体操作为：通过Grolux灯管照射，照射强度40mmol.m -2.s -1，在白天的太阳光源下，1KLux＝18μmol.m -2.s -1，促进植株的生长，直至培养成正常生根小苗。
表2 油梨种胚拯救结果汇总
Figure PCTCN2021084039-appb-000008
Figure PCTCN2021084039-appb-000009
由表2可知，对于成熟度较低的种胚(例如，授粉后100日内的种胚)，其拯救的成功率低于成熟度高的种胚。对于成熟度较高的、授粉后200日后的种胚，拯救成功率可达95％以上，实现了大部分种胚的拯救和回收。
通过本发明的方法，可以挽救油梨杂交培育过程脱落的果实，实现油梨脱落种子的回收和有效利用，减少杂交成果的丢失。本发明的技术可有效提高杂交油梨合子胚的成活率，提高油梨杂交成功率，拯救杂交后代，减少了杂交后代丢失，保证杂交群体的遗传完整性，为油梨杂交育种和遗传研究等提供关键技术。

Claims (9)

  1. 一种油梨未成熟胚的体外拯救方法，其特征在于，所述方法包括：
    (1)外植体前处理
    收集未成熟的油梨落果，从消毒后的果实中剥离出未成熟的合子胚；选取成熟度为80％以下的合子胚，陪护培养至80-100％的成熟度，然后再进行萌发培养；
    (2)根据配方配制基础培养基、陪护培养基和萌发培养基
    其中，基础培养基的配方为：
    基础培养基的成分     使用浓度(mg/L)
    大量元素：
    Figure PCTCN2021084039-appb-100001
    微量元素：
    Figure PCTCN2021084039-appb-100002
    铁盐：
    Figure PCTCN2021084039-appb-100003
    有机成分：
    Figure PCTCN2021084039-appb-100004
    Figure PCTCN2021084039-appb-100005
    陪护培养基a、b、c、d、e和f的配方如下：
    a.半强度的基础培养基
    300～500mg/L酪蛋白水解物
    8～12％椰子水
    8～12％蔗糖
    1～3g/L琼脂粉；以及
    b.半强度的基础培养基
    300～500mg/L谷氨酰胺
    8～12％椰子水
    8～12％蔗糖
    1-3g/L琼脂粉
    c.半强度的基础培养基
    300-500mg/L酪蛋白水解物
    8-12％椰子水
    4-6％蔗糖
    2-4g/L琼脂粉；以及
    d.半强度的基础培养基
    300-500mg/L谷氨酰胺
    8-12％椰子水
    4-6％蔗糖
    2-4g/L琼脂粉；
    e.基础培养基
    300-500mg/L酪蛋白水解物
    8-12％椰子水
    2-4％蔗糖
    4-6g/L琼脂粉；以及
    f.基础培养基
    300-500mg/L谷氨酰胺
    8-12％椰子水
    2-4％蔗糖
    4-6g/L琼脂粉；
    分别将椰子水以外的各个成分加到容器中，搅拌，然后将各个培养基的pH调节至5.5-6.5，将培养基进行灭菌、冷却处理后，将过滤并灭菌后的椰子水加入冷却的灭菌培养基中，得到陪护培养基a、b、c、d、e和f；
    萌发培养基的配方为：
    基础培养基
    2.0-4.0μM 6-苄胺基嘌呤
    4-8g/L琼脂粉
    2.5-3.5％蔗糖；
    (3)初始陪护培养基的选择
    根据不同的合子胚的成熟度选择相应的陪护培养基的配方；
    对于授粉后100天内的种胚，选择陪护培养基a或b中的任意一种作为初始陪护培养基；
    对于授粉后100天至200天的种胚，选择陪护培养基c或d中的任意一种作为初始陪护培养基；
    对于授粉后200天之后的种胚，选择陪护培养基e或f中的一种作为初始陪护培养基；
    (4)合子胚的陪护培养以及陪护培养基的选择和更换
    在合子胚的前心形期，采用陪护培养基a或b进行陪护培养；当将合子胚培养到鱼雷期时，采用陪护培养基c或d进行陪护培养；在合子胚培养至成熟期时采用陪护培养基e或f进行陪护培养；
    合子胚经陪护培养至成熟期后，采用萌发培养基进行萌发培养；
    陪护培养在黑暗条件下进行；
    (5)萌发培养
    将陪护培养得到的种胚放入萌发培养基中，在25℃±1℃进行萌发培养；在萌发培养期间进行光照培养，直至培养成正常生根小苗。
  2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，对落果表面和种子进行灭菌处理。
  3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述灭菌处理包括：采用0.5v/v％次氯酸钠溶液中浸泡，然后在无菌蒸馏水中漂洗三次；所述0.5v/v％次氯 酸钠溶液还含有10滴/L的吐温20。
  4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述萌发培养基的配方为：
    基础培养基
    2.22μM 6-BA
    6g/L琼脂粉
    2.5-3.5％蔗糖；
    其中，所述基础培养基的配方为：
    基础培养基的成分     使用浓度(mg/L)
    大量元素：
    Figure PCTCN2021084039-appb-100006
    微量元素：
    Figure PCTCN2021084039-appb-100007
    铁盐：
    Figure PCTCN2021084039-appb-100008
    有机成分：
    Figure PCTCN2021084039-appb-100009
  5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，陪护培养基a、b、c、d、e、f的配方如下：
    a.半强度的基础培养基
    400mg/L酪蛋白水解物
    10％椰子水
    10％蔗糖
    2g/L琼脂粉；以及
    b.半强度的基础培养基
    400mg/L谷氨酰胺
    10％椰子水
    10％蔗糖
    2g/L琼脂粉
    c.半强度的基础培养基
    400mg/L酪蛋白水解物
    10％椰子水
    5％蔗糖
    3g/L琼脂粉；以及
    d.半强度的基础培养基
    400mg/L谷氨酰胺
    10％椰子水
    5％蔗糖
    3g/L琼脂粉；
    e.基础培养基
    400mg/L酪蛋白水解物
    10％椰子水
    3％蔗糖
    5g/L琼脂粉；以及
    f.基础培养基
    400mg/L谷氨酰胺
    10％椰子水
    3％蔗糖
    5g/L琼脂粉。
  6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，对于授粉后100天内的种胚，若选择初始陪护培养效果不佳或发育不好的，则在将种子剥去种皮、消毒后，采用前培养基使种子在25℃±1℃的温度下维持生长，在维持生长期间进行16小时的光照射，待种子恢复正常生长后，继续未成熟胚的拯救；
    其中，前培养基的配方为：
    半强度的基础培养基
    2.0-2.5μM 6-苄胺基嘌呤
    4-8g/L琼脂粉
    2.5-3.5％蔗糖。
  7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，采用酸试剂将培养基的pH调节至5.74；所述酸试剂为盐酸。
  8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述灭菌的条件为：在121℃和0.1MPa下高压灭菌15-20分钟。
  9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述光周期培养的条件为：通过Grolux灯管照射，保证植株生长；照射强度为40mmol.m -2.s -1。
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