CN103262746A - 一种柑橘成年态外植体材料的幼态化处理方法 - Google Patents
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Abstract
一种柑橘成年态外植体材料的幼态化处理方法，包括以下步骤：（1）将柑橘成年态接穗反复嫁接于幼年砧木上；（2）外植体材料的获得；（3）不定芽再生。本发明将成年态接穗反复嫁接于实生砧木上的幼态化方法，适合柑橘多个品种；经过处理后的柑橘成年态材料污染率低，甚至为0；不定芽再生效率高，不定芽诱导率高达67.7%以上，特别适合于冰糖橙、糖橙等柑橘主栽品种的成年态外植体材料的幼态化。
Description
技术领域
本发明涉及一种成年态外植体材料的幼态化处理方法，尤其是涉及一种柑橘成年态外植体材料的幼态化处理方法。
背景技术
柑橘是世界第一大水果，世界柑橘栽种面积达872万公顷，柑橘年产量超过1.237亿吨。我国柑橘面积已超过221万公顷，产量近2890万吨，居世界第一位。在柑橘育种研究中，利用转基因技术进行柑橘品种改良，与常规育种方法相比，具有目的基因来源广，转化系统不受基因型限制，能定向改变目标性状等优点。但目前在柑橘的遗传转化受体系统中，外植体多采用幼年材料，延长了转基因育种周期。为克服实生态外植体再生植株童期长的问题，必须使用成年态外植体材料进行遗传转化。但是，柑橘成年态材料随着成熟特征的出现，在离体培养中外植体细胞分化困难，并且污染严重，导致柑橘成年态节间茎段遗传转化研究进展缓慢，严重限制了柑橘转基因实用化进程。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种柑橘成年态外植体材料的幼态化处理方法，经过处理后的柑橘成年态材料污染率低，不定芽再生效率高。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种柑橘成年态外植体材料的幼态化处理方法，包括以下步骤：
（1）将柑橘成年态接穗反复嫁接于幼年砧木上：首先以嫁接5年以上母树上的饱满芽为接穗，一年生直径达到0.6 cm以上的盆栽实生酸橙为砧木，采用“芽接法”进行嫁接，嫁接口为离土面（根颈处）向上10-15 cm处，嫁接苗生长一年后，取饱满芽为接穗，一年生直径达到0.6 cm以上的盆栽实生酸橙为砧木，再次采用“芽接法”进行嫁接，嫁接口为离土面（根颈处）向上10-15 cm处；嫁接后，将砧木在嫁接口往上8-12cm处沿嫁接面的侧面向下弯曲进行弯砧处理；之后，及时抹掉砧木上萌发的萌蘖，并在嫁接芽萌发后基部叶片达到最大时剪去嫁接口以上砧木部分；所有嫁接材料培养于温室中，温度为24-26℃；
（2）外植体材料的获得： 按步骤（1）反复嫁接幼态化处理后，接穗芽直接萌发后获得的半木质化新梢为第1次梢，第1次梢生长老熟后留3-4个饱满芽进行短剪，萌发的半木质化新梢为第2次梢；取步骤（1）反复嫁接幼态化处理后，长20 cm以上的成年态半木质化的第1或第2次新梢的节间茎段作为再生和转化的外植体材料；将枝梢剪下，装入洁净塑料袋中，带回室内，在无菌条件下，先用棉花蘸取体积浓度为0.4-0.6%（v/v）的次氯酸钠溶液对枝梢进行擦拭，然后切割成4-6cm的茎段，用体积浓度为70-75%的乙醇浸泡30-35s，用体积浓度为1.5-2%（v/v）的次氯酸钠溶液加2-3滴吐温浸泡20-22 min，无菌水冲洗3-4次，去除两端与次氯酸钠溶液直接接触的部分，然后切割成0.8-1.2 cm的节间茎段，备用；
（3）不定芽再生：将步骤（2）中获得的节间茎段外植体培养于再生培养基上，所述再生培养基包含MS无机盐以及1 mg/l 烟酸（Nicotinic acid, VPP）， 0.2 mg/l 盐酸硫胺（Thiamine hydrochloride, VB1），1 mg/l 盐酸吡哆醇（Pyridoxine hydrochloride, VB6），并添加3 mg/l 6-苄基腺嘌呤（6-benzylaminopurine, BAP），3%蔗糖和5.5g/l琼脂，pH值为5.7，培养温度26-28℃，完全暗培养14-16d后转入光照强度42-45μmol/m2/s，光照时间每天14-16 h，每2个星期继代培养一次，共继代1-2次，即成。
本发明将成年态接穗反复嫁接于实生砧木上的幼态化方法，适合柑橘多个品种；经过处理后的柑橘成年态材料污染率低，甚至为0；不定芽再生效率高，不定芽诱导率高达67.7%以上，特别适合于冰糖橙、糖橙等柑橘主栽品种的成年态外植体材料的幼态化。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1 冰糖橙成年态材料例
本实施例供试材料为冰糖橙，具体包括以下步骤：
（1）首先以嫁接5年以上母树上的饱满芽为接穗，一年生直径达到0.6 cm以上的盆栽实生酸橙为砧木，采用‘芽接法’进行嫁接，嫁接口为离土面（根颈处）向上12 cm处，嫁接苗生长一年后，取饱满芽为接穗，一年生直径达到0.6 cm以上的盆栽实生酸橙为砧木，再次采用‘芽接法’进行嫁接，嫁接口为离土面（根颈处）向上12 cm处，嫁接后，将砧木在嫁接口往上10 cm处沿嫁接面的侧面向下弯曲进行弯砧处理，之后，及时抹掉砧木上萌发的萌蘖，并在嫁接芽萌发后基部叶片达到最大时剪去嫁接口以上砧木部分，所有嫁接材料培养于温室中，温度为26℃；
（2）按步骤（1）反复嫁接幼态化处理后，接穗芽直接萌发后获得的半木质化新梢为第1次梢，第1次梢生长老熟后留4个饱满芽进行短剪，萌发的半木质化新梢为第2次梢；取步骤（1）反复嫁接幼态化处理后，长20 cm以上的成年态半木质化的第1或第2次新梢的节间茎段作为再生和转化的外植体材料；将枝梢剪下，装入洁净塑料袋中，带回室内，在无菌条件下，先用棉花蘸取体积浓度为0.5%的次氯酸钠溶液对枝梢进行擦拭，然后切割成5 cm的茎段，用体积浓度为75%的乙醇浸泡30 s，2%（v/v）的次氯酸钠溶液加3滴吐温浸泡20 min，无菌水冲洗4次，去除两端与次氯酸钠溶液直接接触的部分，然后切割成1 cm的节间茎段，获得200个外植体材料，备用；
（3）将步骤（2）中获得的节间茎段外植体培养于再生培养基上，所述再生培养基包含MS无机盐以及1 mg/l 烟酸（Nicotinic acid, VPP）， 0.2 mg/l 盐酸硫胺（Thiamine hydrochloride, VB1），1 mg/l 盐酸吡哆醇（Pyridoxine hydrochloride, VB6），并添加3 mg/l 6-苄基腺嘌呤（6-benzylaminopurine, BAP），3 %蔗糖和5.5 g/l琼脂，pH值为5.7，培养温度26℃，完全暗培养15 d后转入光照强度45 μmol/m2/s，光照时间每天16 h，每2个星期继代培养一次，共继代2次，即成。
本实施例中不定芽再生率高达67.7%，污染率下降至0.63 %。（不定芽再生率的检测方法标准是再生不定芽的外植体数除以总的用于再生的外植体数×100%；污染率的检测方法标准是污染的外植体数除以总的用于再生的外植体数×100%）
实施例2 埃及糖橙成年态节间茎段转化例
供试材料为埃及糖橙，幼态化处理方法同实施例1，通过此方法，采用200个节间茎段，本实施例中不定芽再生率高达72.4%，污染率下降至0。
Claims (1)
1.一种柑橘成年态外植体材料的幼态化处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将柑橘成年态接穗反复嫁接于幼年砧木上：首先以嫁接5年以上母树上的饱满芽为接穗，一年生直径达到0.6 cm以上的盆栽实生酸橙为砧木，采用“芽接法”进行嫁接，嫁接口为离土面向上10-15 cm处，嫁接苗生长一年后，取饱满芽为接穗，一年生直径达到0.6 cm以上的盆栽实生酸橙为砧木，再次采用“芽接法”进行嫁接，嫁接口为离土面向上10-15 cm处；嫁接后，将砧木在嫁接口往上8-12cm处沿嫁接面的侧面向下弯曲进行弯砧处理；之后，及时抹掉砧木上萌发的萌蘖，并在嫁接芽萌发后基部叶片达到最大时剪去嫁接口以上砧木部分；所有嫁接材料培养于温室中，温度为24-26℃；
（2）外植体材料的获得： 按步骤（1）反复嫁接幼态化处理后，接穗芽直接萌发后获得的半木质化新梢为第1次梢，第1次梢生长老熟后留3-4个饱满芽进行短剪，萌发的半木质化新梢为第2次梢；取步骤（1）反复嫁接幼态化处理后，长20 cm以上的成年态半木质化的第1或第2次新梢的节间茎段作为再生和转化的外植体材料；将枝梢剪下，装入洁净塑料袋中，带回室内，在无菌条件下，先用棉花蘸取体积浓度为0.4-0.6%的次氯酸钠溶液对枝梢进行擦拭，然后切割成4-6cm的茎段，用体积浓度为70-75%的乙醇浸泡30-35s，用体积浓度为1.5-2%的次氯酸钠溶液加2-3滴吐温浸泡20-22 min，无菌水冲洗3-4次，去除两端与次氯酸钠溶液直接接触的部分，然后切割成0.8-1.2 cm的节间茎段，备用；
（3）不定芽再生：将步骤（2）中获得的节间茎段外植体培养于再生培养基上，所述再生培养基包含MS无机盐以及1 mg/l 烟酸，0.2 mg/l 盐酸硫胺，1 mg/l 盐酸吡哆醇，并添加3 mg/l 6-苄基腺嘌呤，3%蔗糖和5.5g/l琼脂，pH值为5.7，培养温度26-28℃，完全暗培养14-16d后转入光照强度42-45μmol/m2/s，光照时间每天14-16 h，每2个星期继代培养一次，共继代1-2次，即成。
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