CN114246081A - 一种单倍体诱导剂及其使用方法 - Google Patents

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李响
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Abstract

本发明属于植物育种领域。具体涉及一种单倍体诱导剂及其使用方法。本发明提供了一种单倍体诱导剂，利用该诱导剂能够低成本、高效率地获得植物单倍体种子，从而应用于植物育种。本发明公开了该诱导剂的具体成分，使用该诱导剂诱导玉米单倍体种子产生的具体方法以及高效率筛选可诱导单倍体的新化合物的方法。

Description

一种单倍体诱导剂及其使用方法
技术领域
本发明属于植物育种领域。具体涉及一种单倍体诱导剂及其使用方法。本发明提供了一种单倍体诱导剂，利用该诱导剂能够低成本、高效率地获得植物单倍体种子，从而应用于植物育种。本发明公开了该诱导剂的具体成分，使用该诱导剂诱导玉米单倍体种子产生的具体方法以及高效率筛选可诱导单倍体的新化合物的方法。
背景技术
单倍体在植物遗传育种中具有重要意义。单倍体育种一般只需要两年就能获得纯合的自交系，比常规方法缩短育种周期3-5年。同时，单倍体育种的选择效率更高，且有利于准确筛选隐性突变体。此外，单倍体技术还广泛应用于自交系的提纯复壮、遗传材料的创制以及作物数量遗传的应用研究等领域。
在单倍体育种领域，玉米单倍体育种技术的应用最为成功，这主要得益于天然玉米高频单倍体诱导系Stock 6等的应用。当Stock 6做父本时，可以形成只保留母本基因组的单倍体，结合R1-nj颜色标记，单倍体的选择效率大大提高。通过数十年的遗传改良，诱导率在10-12％的诱导系已经非常常见(Dong X,Xu X,Miao J,et al.Fine mapping ofqhir1 influencing in vivo haploid induction in maize[J].Theoretical&AppliedGenetics,2013,126(7):1713-1720.)。通过单倍体诱导系诱导获得DH纯系是目前玉米常规育种工作中最有经济意义的方法，美国是玉米单倍体诱导系育种的发源地，目前国外大约60％的马齿型自交系及30％的硬粒型自交系都由单倍体技术选育而来的(徐艳霞.Stock6在玉米自交系选育中的应用[J].黑龙江农业科学，2014，(11)：157-159.)。因此，单倍体诱导系的应用与发展在农作物遗传育种中具有重大意义。然而，具有天然诱导系功能的种质资源有限，通过传统育种培育诱导系也十分困难。另外，在玉米之外的作物上，由于没有类似Stock 6这样的天然诱导系，人工培育诱导系更加困难。
研究证实，单倍体诱导系Stock 6的诱导能力是受多个数量性状位点控制的遗传性状，其中两个主效QTL qhir1和qhir8，分别可以解释66％和20％的表型变异(Prigge V,Xu X,Li L,et al.New insights into the genetics of in vivo induction ofmaternal haploids,the backbone of doubled haploid technology in maize[J].Genetics,2012,190(2):781-93.)。其中qhir8位点被精细定位在789kb的区间内(Liu C,Li W,Zhong Y,et al.Fine mapping of qhir8 affecting in vivo haploid inductionin maize[J].Theoretical and Applied Genetics,2015,128(12):2507-2515.)；qhir1位点也已经被精细定位和克隆，并明确了控制该位点的功能基因为ZmPLA1/MATL/NLD(Liu C,Li X,Meng D,et al.A 4-bp Insertion at ZmPLA1 Encoding a PutativePhospholipase A Generates Haploid Induction in Maize[J].Mol Plant,2017,10(3):520-522；Kelliher T,Starr D,Richbourg L,et al.MATRILINEAL,a sperm-specificphospholipase,triggers maize haploid induction[J].Nature,2017,542(7639):105-109；Gilles L M,Khaled A,Laffaire,J B,et al.Loss of pollen-specificphospholipase NOT LIKE DAD triggers gynogenesis in maize[J].The EMBO Journal,2017,36(6):707-717.)。ZmPLA1/MATL/NLD基因编码一种磷脂酶，突变失活后能够造成精细胞DNA断裂，从而产生只含有母本基因组的单倍体。至于磷脂酶突变后为何会造成DNA断裂尚不清楚。
人工突变ZmPLA1/MATL/NLD基因或使用单倍体诱导系培育新诱导系品种是创制新单倍体诱导系的一种方法，然而该方法需要特定的分子技术平台，也需要长时间的选育工作(包括突变基因型的筛选和其他农艺性状的筛选)，单倍体诱导系的创制效率依然很低。
此外，开发特定的化学诱导剂，通过直接处理植物的方式也可诱导单倍体的产生。例如，使用氟乐灵、甲基胺草磷或炔苯酰草胺、秋水仙素等处理花丝，诱导孤雌生殖，从而产生单倍体(沈阳特亦佳玉米科技有限公司.一种化学诱导玉米孤雌生殖的处理方法：CN201410405168.0[P].2015-05-13.)；或使用脂质或磷脂酶抑制剂或脂肪酸去饱和酶抑制剂处理植物生殖组织，通过抑制ZmPLA1/MATL/NLD基因所编码的磷脂酶诱导单倍体。然而这些诱导剂的诱导效率均不高，其中最有活性的甲基α-亚麻酰基氟膦酸酯(MALFP，一种有效的磷脂酶抑制剂)最高仅达到8.9％的诱导率(先正达参股股份有限公司.单倍体诱导组合物及其使用方法：CN201680067447.8[P].2018-12-21.)，而且已公开的这些化学诱导剂还具有成本高、配制难、对人畜有毒或对环境无害等缺陷。
单倍体产生的原因尚不明确成为了不能有针对性地找到高效化学诱导剂的关键。为了解决上述问题，本发明在转录组和蛋白组学水平上对单倍体植株进行了更深入地分析，发现活性氧升高是精细胞DNA断裂和单倍体产生的关键原因。因此，凡是能促进植物生殖组织活性氧升高的化合物都可以配制成潜在的单倍体诱导剂。沿着这样的思路，通过进一步地测试，本发明提供了一种新的筛选单倍体诱导剂的方法，获得了更加高效的单倍体化学诱导剂，并开发了利用上述单倍体诱导剂诱导单倍体种子的方法。
发明内容
本发明的目的之一在于公开一种筛选单倍体诱导化合物的方法。
本发明的目的之二在于提供一种单倍体诱导化合物和该化合物配制而成的单倍体诱导剂。
本发明的目的之三在于公开一种利用上述单倍体诱导剂诱导单倍体种子的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种能诱导单倍体的化合物的筛选方法，其特征在于，使用含有待测化合物的试剂处理植物的生殖组织，检测处理后组织的活性氧含量，导致活性氧含量升高的化合物即为所述的化合物；在一些实施方案中，上述活性氧含量检测方法为荧光法。
在一些实施方案中，上述的生殖组织为花粉。
另一方面，本发明还提供了一种能诱导单倍体的化合物，其特征在于，含有上述化合物的试剂能够提高植物生殖组织活性氧含量。
在一些实施方案中，上述化合物包括表5中1-16号化合物。
另一方面，本发明还提供了一种单倍体诱导剂，其特征在于，将能够提高植物生殖组织活性氧含量的化合物以一定浓度溶解或乳化在合适的配制品中。
在一些实施方案中，上述的化合物选自表5中列出的1-16号化合物中的一种或几种。这些化合物包括：活性氧降解途径酶的抑制剂(如过氧化物酶抑制剂甲巯咪唑)，活性氧诱导剂(如二苯基氯化碘盐Diphenyleneiodonium Chloride，DPI)，信号途径(如氯化钙CaCl2、硝酸钙Ca(NO3)2、环磷酸腺苷cAMP、三磷酸肌醇IP3(1,3,4)、1,2-十八酰磷酯酰肌醇-双-4,5-磷酸PI(4,5)PP_18:1)，细胞骨架稳定性相关(如Jasplakinolide、CucurbitacinE、红海海绵素B Latrunculin B、红海海绵素A Latrunculin A、布比他汀blebbistatin)，卵磷脂平衡相关(如卵磷脂PC_18:1、磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C D609、磷酸胆碱CP、磷脂酶D抑制剂FIPI)。
在一些实施方案中，上述的诱导剂为大豆卵磷脂或甲巯咪唑以一定浓度溶解在合适的配制品中；在一些实施方案中，上述的诱导剂为大豆卵磷脂以0.8-4mg/mL的浓度溶解在合适的配制品中；在一些实施方案中，上述的诱导剂为甲巯咪唑以小于0.16mg/mL的浓度溶解在合适的配制品中；在一些实施方案中，上述的诱导剂为大豆卵磷脂以0.8mg/mL的浓度溶解在合适的配制品中。
在一些实施方案中，上述的配制品为石蜡油或40％蔗糖溶液。
另一方面，本发明还提供了一种用于诱导植物单倍体种子产生的方法，其特征在于，所述方法包括用上述任意一项所述的单倍体诱导剂处理植物的生殖组织，其中所述处理发生在紧接授粉之前、授粉期间或紧接授粉之后，并且其中产生了至少一个单倍体种子。
在一些实施方案中，上述的植物包括玉米、棉花、水稻、油菜、高粱、小麦。
本发明的优点及有益效果如下：
1、明确了单倍体产生和活性氧升高之间的关系，从而开发出更有效的单倍体诱导化合物筛选方法。
2、依据上述方法获得了一系列潜在的高效单倍体诱导剂，其中以0.8-4mg/mL浓度溶解在石蜡油中的大豆卵磷脂试剂或以小于0.16mg/mL浓度溶解在石蜡油中的甲巯咪唑试剂能够成功诱导玉米单倍体。
3、以0.8mg/mL浓度溶解在石蜡油中的大豆卵磷脂试剂成本低、诱导效果好、无毒无害、配制容易，可以作为玉米及其他植物单倍体诱导剂大规模使用。
4、基于上述的单倍体诱导剂提供了一种单倍体诱导的方法，该方法诱导率高、操作方便、不需要特殊的仪器，可以大规模应用。
附图说明
图1玉米单倍体和二倍体中的差异基因所属的功能群组。ROS&sress：活性氧；TCA&Respiratory chain：线粒体代谢；Glycolysis&PPP&amino metabolism：细胞质代系；Cellwall：细胞壁；cytoskeleton dynamics：细胞骨架；Ubiquitin ligases&Proteasome：蛋白质降解；DNA repair&protein folding：蛋白质DNA修复；Translation&ribosome stress：蛋白翻译；vesicle&ER stress：内膜系统；signal：细胞信号；Lipid balance：脂质平衡。
图2卵磷脂处理(上图)和未处理(下图)精细胞的DNA测序结果；横轴表示染色体位置(深色点和浅色点分别代表奇数和偶数染色体)，纵轴表示片段化程度。黑线表示片段化程度均值。
图3橙色荧光法检测未处理(上图)和磷酸胆碱(序号14，下图)处理的花粉细胞内的活性氧含量。A：荧光照片。图片每个像素对应的明亮度值(B)和红光值(C)被统计。其峰值对应的横坐标代表了该图片最多像素所对应的色值，该色值即可代表细胞的荧光强度(即活性氧含量)。
具体实施方式
提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。
如本文所用，“玉米”是任何玉米植物并包括可以与玉米育种的所有植物品种，包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。“植物”包括对整株植物、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及它们的子代的标引。植物细胞包括但不限于来自种子、悬浮培养物、胚芽、分生区域、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子的细胞。“子代”包含植物的任何后续世代。
在本申请中，将词语“包括”、“包含”或其变体应理解为除所描述的元素、数或步骤外，还包含其它元素、数或步骤。
除非另外指明，本说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、反应条件等的所有数字应被理解为在所有情况下用术语“约”来修饰。如本文所使用的术语“约”，当指代可测量的值例如质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的量时，意味着涵盖在一些实施例中与规定量相比±20％的变化、在一些实施例中与规定量相比±10％的变化、在一些实施例中与规定量相比±5％的变化、在一些实施例中与规定量相比±1％的变化、在一些实施例中与规定量相比±0.5％的变化、以及在一些实施例中与规定量相比±0.1％的变化，因为此类变化适合于执行所披露的方法和/或使用所披露的组合物、核酸、多肽等。因此，除非相反地指出，在本说明书和所附权利要求书中所列出的数值参数是可以取决于试图通过本申请披露的主题获得的期望特性而变化的近似值。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的分子克隆实验手册(SambrookJ&Russell D W,Molecular cloning:alaboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例
实施例1分析单倍体形成的直接原因和机制
为了分析单倍体形成的直接原因和机制，本发明利用玉米单倍体和二倍体材料，从转录组和蛋白组学水平上进行了深入分析，找出材料间存在的差异基因或蛋白，并通过聚类分析揭示与单倍体形成有关的生化反应。
1、转录组分析
为了能够明确单倍体产生的机制和原因，本发明以玉米为例，分析了B73自交系和B73-inducer诱导系花药中的转录组差异，该诱导系来自中国农业大学陈绍江课题组育成的材料，含有80％B73背景(Liu C,Li X,Meng D,et al.A4-bp Insertion at ZmPLA1Encoding a Putative Phospholipase A Generates Haploid Induction in Maize[J].Mol Plant,2017,10(3):520-522.)。结果显示B73自交系和B73-inducer诱导系存在着22,701个表达基因，其中有1,359个表达基因在B73自交系和B73-inducer诱导系间表达存在差异，这表明这些基因与单倍体诱导和形成有关。
2、转录组分析
此外，本发明分析了ZmPLA1基因突变体(人工创制，过程参见：Liu C,Li X,MengD,et al.A 4-bp Insertion at ZmPLA1 Encoding a Putative Phospholipase AGenerates Haploid Induction in Maize[J].Mol Plant,2017,10(3):520-522.)和野生型玉米花粉中蛋白组、蛋白磷酸化组、蛋白巴豆酰化组、蛋白氧化组上的差异。
对于蛋白组、蛋白磷酸化组、蛋白巴豆酰化组三个组学数据，突变体和野生型的各三个生物学重复的花粉样品进行蛋白质抽提(尿素法)，胰蛋白酶解和TMT(Tandem masstag，串联质谱标签)标记。6个样品混合后，可直接进行LC-MS(液相色谱质谱联用)检测用于定量蛋白组①；也可经过S/T磷酸化亲和富集后，进行LC-MS检测用于定量蛋白的磷酸化组②；也可经过K巴豆酰化抗体富集后，进行LC-MS检测用于定量蛋白的巴豆酰化组③。以上分析的具体操作方法如下：
1)蛋白抽提。
样品从-80℃取出，称取适量组织样品至液氮预冷的研钵中，加液氮充分研磨至粉末。各组样品分别加入粉末4倍体积裂解缓冲液(8M尿素，1％TritonX-100，10mM二硫苏糖醇，1％蛋白酶抑制剂，3μM TSA，50mM NAM)，超声裂解。4℃，20000g离心10min，取上清并加入终浓度为20％的三氯乙酸，4℃静置2h。4℃，12000g离心3min，弃上清，沉淀用预冷的丙酮洗涤三次。最后沉淀用8M尿素复溶，利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。
2)胰蛋白酶解。
蛋白溶液中加入二硫苏糖醇使其终浓度为5mM，56℃还原30min。之后加入碘代乙酰胺使其终浓度为11mM，室温避光孵育15min。最后将样品的尿素浓度稀释至低于2M。以1:50的质量比例(胰酶：蛋白)加入胰酶，37℃酶解过夜。再以1:100的质量比例(胰酶：蛋白)加入胰酶，继续酶解4h。
3)TMT标记肽段。
胰酶酶解的肽段用Strata X C18(Phenomenex)除盐后真空冷冻干燥。以0.5MTEAB溶解肽段，根据TMT试剂盒操作说明标记肽段。操作简略步骤为：标记试剂解冻后用乙腈溶解，与肽段混合后室温孵育2h，标记后的肽段混合后除盐，真空冷冻干燥。各样品TMT标记信息见图1。
图1各样品TMT标记信息
Figure BDA0003428125520000081
4)修饰富集(仅针对蛋白磷酸化组和蛋白巴豆酰化组)。
磷酸化富集。将肽段溶解在富集缓冲溶液中(50％乙腈/6％三氟乙酸)，转移上清液至提前洗涤好的IMAC材料中，放置于旋转摇床上温和摇晃孵育。孵育结束后依次使用缓冲溶液50％乙腈/6％三氟乙酸和30％乙腈/0.1％三氟乙酸洗涤树脂3次。最后使用10％氨水洗脱磷酸肽，收集洗脱液并真空冷冻抽干。抽干后按照C18 ZipTips说明书除盐，真空冷冻抽干后供液质联用分析。
巴豆酰化富集。将肽段溶解在IP缓冲溶液中(100mM NaCl，1mM EDTA，50mM Tris-HCl，0.5％NP-40pH 8.0)，均分两份，用不同批次的巴豆酰化树脂进行两次富集。转移上清液至提前洗涤好的巴豆酰化树脂中(抗体树脂货号PTM-503，来源于杭州景杰生物科技有限公司，PTM Bio)，放置于4℃环境的旋转摇床上，温和摇晃并过夜孵育。孵育结束后依次使用IP缓冲溶液洗涤树脂4次，去离子水洗涤两次。最后使用0.1％三氟乙酸洗脱液，将树脂结合的肽段洗脱下来，共洗脱三次，收集洗脱液并真空冷冻抽干。抽干后按照C18 ZipTips说明书除盐，真空冷冻抽干后供液质联用分析。
5)LC-MS分析。
肽段用液相色谱流动相A相溶解后使用EASY-nLC 1200超高效液相系统进行分离。流动相A为含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液；流动相B为含0.1％甲酸和90％乙腈的水溶液。液相梯度设置：0～38min，8％-23％B；38～52min，23％-35％B；52～56min，35％-80％B；56～60min，80％B，流速维持在700nL/min。
肽段经由超高效液相系统分离后被注入NSI离子源中进行电离然后进QExactiveTM HF-X质谱进行分析。离子源电压设置为2.0kV，肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的Orbitrap进行检测和分析。一级质谱扫描范围设置为350-1600m/z，扫描分辨率设置为60,000；二级质谱扫描范围则固定起点为100m/z，Orbitrap扫描分辨率设置为30,000。数据采集模式使用数据依赖型扫描(DDA)程序，即在一级扫描后选择信号强度最高的前20肽段母离子依次进入HCD碰撞池使用28％的碎裂能量进行碎裂，同样依次进行二级质谱分析。为了提高质谱的有效利用率，自动增益控制(AGC)设置为1E5，信号阈值设置为50000ions/s，最大注入时间设置为100ms，串联质谱扫描的动态排除时间设置为15秒避免母离子的重复扫描。
6)数据库搜索。
二级质谱数据使用Maxquant(v1.5.2.8)进行检索。检索参数设置：数据库为UniProt Zea mays(99369条序列)，添加了反库以计算随机匹配造成的假阳性率(FDR)，并且在数据库中加入了常见的污染库，用于消除鉴定结果中污染蛋白的影响；酶切方式设置为Trypsin/P；漏切位点数设为4；肽段最小长度设置为7个氨基酸残基；肽段最大修饰数设为5；First search和Main search的一级母离子质量误差容忍度分别设为20ppm和5ppm，二级碎片离子的质量误差容忍度为0.02Da。将半胱氨酸烷基化设置为固定修饰，可变修饰为甲硫氨酸的氧化，蛋白N端的乙酰化，赖氨酸的巴豆酰化。定量方法设置为TMT-6plex，蛋白鉴定、PSM鉴定的FDR都设置为1％。
对于蛋白半胱氨酸残基(C)氧化组学数据，突变体和野生型的各三个生物学重复先经历了蛋白质抽提(酚抽提法)，C巯基封闭，还原氧化型的巯基，IodoTMT标记。6个样品混合后，经过胰蛋白酶解，TMT亲和富集后，进行LC-MS检测用于定量蛋白的氧化组④。方法如下：
样品从-80℃取出，称取适量组织样品至液氮预冷的研钵中，加液氮充分研磨至粉末。各组样品分别加入粉末4倍体积酚抽提缓冲液(含1％蛋白酶抑制剂，25mM IAA，2mMEDTA)，超声裂解之后，再加入碘乙酰胺(IAA)使其终浓度为25mM，室温避光孵育45min。加入等体积的Tris平衡酚，4℃，5500g离心10min，取上清并加入5倍体积的0.1M乙酸铵/甲醇沉淀过夜，蛋白沉淀分别用甲醇和丙酮进行洗涤。最后沉淀用HES Buffer(50mM HEPES pH8.0，1mM EDTA，0.2％SDS)复溶，利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。
各取100μg样品，用HES Buffer补至体积一致，根据iodoTMT试剂盒操作说明标记蛋白。步骤同上和各样品标记信息同上。
蛋白沉淀用100mM碳酸氢铵打散蛋白。以1：50的质量比例(胰酶：蛋白)加入胰酶，37℃酶解过夜。加入二硫苏糖醇使其终浓度为5mM，56℃还原30min。之后加入碘代乙酰胺使其终浓度为11mM，室温避光孵育15min。再以1:100的质量比例(胰酶：蛋白)加入胰酶，继续酶解4h。胰酶酶解的肽段除盐后真空冷冻干燥。
肽段用高pH反向HPLC分级，色谱柱为Agilent 300Extend C18(5μm粒径，4.6mm内径，250mm长)。操作如下：肽段分级梯度为8％-32％乙腈、pH 9.0，60min时间分离60个组分，随后肽段合并为4个组分，合并后的组分经真空冷冻干燥后进行后续操作。将肽段溶解在IP缓冲溶液中(100mM NaCl，1mM EDTA，50mM Tris-HCl，0.5％NP-40，pH 8.0)，转移上清液至提前洗涤好的Anti-TMT Antibody树脂中(抗体树脂货号Prod#90076，Thermo)，放置于4℃环境的旋转摇床上，温和摇晃并过夜孵育。孵育结束后依次使用IP缓冲溶液洗涤树脂4次，去离子水洗涤两次。最后使用0.1％三氟乙酸洗脱液，将树脂结合的肽段洗脱下来，共洗脱三次，收集洗脱液并真空冷冻抽干。抽干后按照C18 ZipTips说明书除盐，真空冷冻抽干后供液质联用分析。
肽段用液相色谱流动相A相溶解后使用EASY-nLC 1000超高效液相系统进行分离。流动相A为含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液；流动相B为含0.1％甲酸和90％乙腈的水溶液。液相梯度设置：0-24min，10％～25％B；24-32min，25％～36％B；32-36min，36％～80％B；36-40min，80％B，流速维持在350nL/min。
肽段经由超高效液相系统分离后被注入NSI离子源中进行电离然后进行QExactive Plus质谱分析。离子源电压设置为2.0kV，肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的Orbitrap进行检测和分析。一级质谱扫描范围设置为350-1800m/z，扫描分辨率设置为70,000；二级质谱扫描范围则固定起点为100m/z，Orbitrap扫描分辨率设置为17,500。数据采集模式使用数据依赖型扫描(DDA)程序，即在一级扫描后选择信号强度最高的前20肽段母离子依次进入HCD碰撞池使用30％的碎裂能量进行碎裂，同样依次进行二级质谱分析。为了提高质谱的有效利用率，自动增益控制(AGC)设置为5E4，信号阈值设置为5000ions/s，最大注入时间设置为200ms，串联质谱扫描的动态排除时间设置为30秒避免母离子的重复扫描。
二级质谱数据使用Maxquant(v1.5.2.8)进行检索。检索参数设置：数据库为UniProt Zea_mays(99368条序列)，添加了反库以计算随机匹配造成的假阳性率(FDR)，并且在数据库中加入了常见的污染库，用于消除鉴定结果中污染蛋白的影响；酶切方式设置为Trypsin/P；漏切位点数设为2；肽段最小长度设置为7个氨基酸残基；肽段最大修饰数设为5；First search和Main search的一级母离子质量误差容忍度分别设为20ppm和5ppm，二级碎片离子的质量误差容忍度为0.02Da。将可变修饰设置为甲硫氨酸的氧化，蛋白N端的乙酰化，Iodo TMT-6plex var。定量方法设置为IodoTMT-6plex，蛋白鉴定、PSM鉴定的FDR都设置为1％。
3、差异蛋白分析
经过以上操作，本发明鉴定到一系列有差异的蛋白，数量见表2。
表2各组差异蛋白的数量
Figure BDA0003428125520000121
1：差异幅度超过1.3倍。
将差异表达基因和蛋白量、磷酸化、巴豆酰化、氧化水平有差异的蛋白编码基因分为23个数据集合，分别为表达上调、下调，蛋白量上调、下调、上调加下调，磷酸化水平的上调、下调、上调加下调，相对于蛋白量变化的磷酸化水平上调、下调、上调加下调，巴豆酰化水平的上调、下调、上调加下调，相对于蛋白量变化的巴豆酰化上调、下调、上调加下调，氧化水平的上调、下调、上调加下调，相对于蛋白量变化的氧化上调、下调、上调加下调。
为了分析每个差异调控数据集中基因富集的功能，利用Fisher’s test检测每个差异调控数据的基因集合在GO、MaizeCyC、Mapman注释的基因集合中的富集情况。结果表明，这23个差异调控的基因数据集，显著富集(P<0.05)了1717个注释的基因集合，其中大部分基因注释可划分到11个功能群组(图1)，分别是：活性氧(Reactive oxygen species，ROS)、线粒体代谢、细胞质代系、细胞壁、细胞骨架、蛋白质降解、蛋白质DNA修复、蛋白翻译、内膜系统、细胞信号、和脂质平衡。其中，活性氧能影响其他的功能群组或者能被他们影响，处于中心的位置。这也暗示了在ZmPLA1突变体花粉中存在着活性氧紊乱的现象。因此，11个功能群组中鉴定到的差异蛋白可能潜在地影响花粉的活性氧水平。
细胞产生的超氧根，在超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的作用下，转换成过氧根，在铁离子存在的条件下进行芬顿反应生产羟基自由基，羟基自由基是能攻击DNA的主要物质，生成羟基鸟嘌呤(Poprac P,Jomova K,Simunkova M,et al.TargetingFree Radicals in Oxidative Stress-Related Human Diseases[J].Trends PharmacolSci,2017,38(7):592-607.)。因此，活性氧是能够直接损伤DNA的物质。利用单核测序分析玉米stock6来源的单倍体诱导系，发现其精细胞中存在着高水平的DNA断裂(Li X,Meng D,Chen S,et al.Single nucleus sequencing reveals spermatid chromosomefragmentation as a possible cause of maize haploid induction[J].Nat Commun,2017,8(1):991.)。所以可以推测，单倍体诱导的过程可能与活性氧的增加有关。
4、单倍体诱导机制验证
为了进一步验证花粉中紊乱的活性氧是导致精细胞DNA片段化和单倍体诱导的直接原因，本发明选用过氧化物酶(peroxidase，POD，抑制活性氧产生)抑制剂甲巯咪唑(Methimazole，MMI)和活性氧诱导剂卵磷脂(phosphatidylcholine，PC)处理花粉，并检测处理后花粉中的DNA片段化情况(DNA片段化是单倍体的一个特征)。已知双氧水是能够造成DNA发生断裂的物质，可作为阳性对照。具体的处理方法如下：
收集玉米开花期的花粉，并分别置于87.6mM MMI(MMI干粉溶于40％蔗糖溶液)、0.0015％双氧水、40％蔗糖溶液、0.3mM PC(PC干粉溶于40％蔗糖溶液)中处理6h。在载玻片上释放出精细胞，分离单个精子用于扩增测序(使用sigma WGA4 kit，依据说明书操作)。测序结果显示检测到了精细胞的DNA片段化，并且起始于着丝粒区的(图2)。且相对于ck组，MMI、双氧水、PC处理的花粉中检测到了更高比例的片段化(表3)。该结果验证了ROS能导致生殖细胞DNA的片段化，从而证明了ROS对单倍体诱导的关键作用。
表3不同试剂产生的片段化玉米细胞
Figure BDA0003428125520000141
甲巯咪唑(MMI)是临床常用的抗甲状腺药，能够抑制细胞中活性氧的降解。卵磷脂(PC)能够直接诱导活性氧的产生。用它们处理玉米花粉均可以造成花粉中活性氧含量的升高，而这又造成了精细胞DNA的片段化。因此，使用促进植物生殖组织细胞中活性氧生成的化合物所配置的试剂能够诱导植物单倍体的产生。
实施例2不同诱导剂对玉米的单倍体诱导率评估
本发明进一步在甘肃张掖、云南西双版纳两个试验地点测试了不同浓度MMI和PC配制品试剂对玉米单倍体的诱导效率。由于玉米花粉遇水后会因渗透压过高而涨破，因此本发明选择石蜡油作为溶解MMI和PC的溶剂，以保持细胞的生理状态和渗透压。
将来自不同玉米材料的花粉用不同浓度的MMI/石蜡油、PC/石蜡油处理20min后，授粉，鉴定后代的染色体倍性，计算单倍体诱导率，评估不同诱导剂对玉米单倍体的诱导效率。具体操作步骤如下：
1、配置4组诱导试剂：
①1/5饱和浓度(<0.16mg/mL)MMI——称取0.02g MMI，加入50mL离心管，加入25mL石蜡油，于35℃摇床上摇48h，离心后，吸上清5mL至新50mL离心管，加入20mL石蜡油，再于35℃摇床上摇10h至完全溶解。0.02g MMI不能完全溶解于石蜡油中，因此1/5饱和浓度的MMI真实浓度会小于0.16mg/mL。
②4mg/mL PC——称取0.1g PC，加入50mL离心管，加入25mL石蜡油，于35℃摇床上摇48h至完全溶解。
③0.8mg/mL PC——称取0.02g PC，加入50mL离心管，加入25mL石蜡油，于35℃摇床上摇48h至完全溶解。
④ck——纯石蜡油25mL。
其中MMI为甲巯咪唑，产品编号M106466，CAS号60-56-0，品牌阿拉丁(Aladdin)；PC为大豆卵磷脂，产品编号L105733，CAS号8002-43-5，品牌阿拉丁(Aladdin)。
2、在田间收集适量供体玉米的花粉，加入相应的试剂，孵育20min即可。期间避免阳光直射和加温，温度保持在20℃以下，每5min颠倒一次。
3、用软毛刷(例如毛笔、天平刷等)将处理后的花粉均匀涂抹在受体花丝上，并避免诱导剂接触到穗轴，套袋。种子成熟后检测染色体倍性，评估单倍体的诱导率。结果见表4。
单倍体诱导率会受到试验地点环境的影响而有差异，在不同玉米材料中也有差异。不过综合来看，①号试剂0.16mg/mL MMI；②号试剂4mg/mL PC；③号试剂0.8mg/mL PC均能够诱导出单倍体。其中③号试剂0.8mg/mL PC对单倍体的诱导效果最好，诱导率最高可达到17.2％。此外，饱和浓度的MMI处理玉米花粉后，MMI的毒性会导致玉米不育，因此不能应用于单倍体诱导。
表4不同试剂对玉米单倍体的诱导率评估
Figure BDA0003428125520000161
实施例3高效筛选新单倍体诱导化合物的方法
活性氧含量与细胞信号、细胞骨架、代谢、脂质平衡、胁迫等多个生物学途径有关，因此能够影响细胞活性氧含量的化学物质十分多，能够导致植物生殖组织活性氧含量升高的化学物质也是潜在的可被开发的单倍体诱导剂。由于单倍体的鉴定过程相对复杂，因此筛选鉴定新的单倍体诱导化合物成本高、周期长，而活性氧含量的检测相对容易，因此，通过检测植物生殖组织的相对活性氧含量能够简单高效地测试筛选潜在的单倍体诱导化合物。本发明提供了一种通过相对活性氧含量筛选潜在单倍体诱导化合物的方法，具体为：将花粉倒入15mL的40％蔗糖溶液中，颠倒混合水化成悬浮液。用剪过的枪头转移200μL花粉悬浮液到1.5mL离心管，再加入200μL 2×终浓度的表5中所列的1-26号化合物溶解在40％蔗糖溶液中所配制的试剂。室温～20℃孵育30min，每5min颠倒混匀一次。利用ROS检测试剂盒(荧光法，MAK144，sigma)检测ROS含量。加入0.4μL ROS detection reagent，颠倒后，孵育30min，用显微镜观察照相。分析相片的红色道或明道，以占比最大的波长光强度代表活性氧含量，以相比对照(40％蔗糖)活性氧含量的比例表示相对活性氧含量。
本发明以玉米花粉为例，测试了一系列可能影响活性氧含量的化合物对玉米花粉中活性氧含量的实际影响情况。经鉴定，1-16号化合物所配制的试剂提高了玉米花粉中相对活性氧的含量，是玉米单倍体诱导剂的候选化合物，结果见表5。
这些化合物主要选自：活性氧降解途径酶的抑制剂(如过氧化物酶抑制剂甲巯咪唑)，活性氧诱导剂(如二苯基氯化碘盐Diphenyleneiodonium Chloride，DPI)，信号途径(如氯化钙CaCl2、硝酸钙Ca(NO3)2、环磷酸腺苷cAMP、三磷酸肌醇IP3(1,3,4)、1,2-十八酰磷酯酰肌醇-双-4,5-磷酸PI(4,5)PP_18:1)，细胞骨架稳定性相关(如Jasplakinolide、Cucurbitacin E、红海海绵素B Latrunculin B、红海海绵素A Latrunculin A、布比他汀blebbistatin)，卵磷脂平衡相关(如卵磷脂PC_18:1、磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C D609、磷酸胆碱CP、磷脂酶D抑制剂FIPI)。
其中，1号化合物氯化钙(CaCl2)对活性氧含量的提升最明显。12号化合物为实施例2中所用到的甲巯咪唑(MMI)，配制品溶剂和浓度不同。15号化合物为18:1侧链的卵磷脂，与实施例2中所用到的大豆卵磷脂具有相同的极性基团(胆碱)、磷酸基和甘油骨架，脂肪酸链存在差别。图3展示了14号试剂磷酸胆碱处理玉米花粉后的活性氧鉴定荧光照片。
表5不同化合物对玉米花粉活性氧含量的影响
Figure BDA0003428125520000181
所有试剂均溶解于40％蔗糖中。相对活性氧含量数据来自6-7次的测定结果。
1-16号化合物所配制的试剂可进一步利用实施例2所述或类似的方法验证和评估其对玉米、棉花、水稻、油菜、高粱、小麦等植物的单倍体诱导率。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (2)

1.一种能诱导玉米单倍体的化合物的筛选方法，其特征在于，使用含有待测化合物的试剂处理玉米的花粉组织，检测处理后组织的活性氧含量，导致活性氧含量升高的化合物即为所述的化合物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活性氧含量检测方法为荧光法。
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