CN115812602A - 一种油茶高效组织培养及植株再生的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种油茶高效组织培养及植株再生的方法，涉及植物组培技术领域，包括以下步骤：(1)将油茶幼苗在无菌苗培养基中培养至茎尖长度30‑50mm，得茎尖组织；(2)将茎尖组织转入分化培养基中培养至伤口处愈伤组织分化出绿色芽点，芽点伸长至10mm，获得不定芽；(3)将不定芽转入壮苗培养基中培养至高度≥20mm，得健壮不定芽；(4)将健壮不定芽转入生根培养基中培养至3‑4条幼根形成，得无菌苗；(5)炼苗移栽。与现有技术相比，本发明方法具有生根效率高，生根时间短且根系健壮的特点。
Description
技术领域
本发明涉及植物组培技术领域，更具体的说是涉及一种油茶高效组织培养及植株再生的方法。
背景技术
油茶泛指山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)中具有生产价值的油用物种，是我国重要的木本油料树种，也是世界四大木本油料作物之一。
油茶种子富含油脂，其脂肪酸组成主要为8.8％棕榈酸(C16:0)、1.1％硬脂酸(C18:0)、82.3％油酸(C18:1)、7.4％亚油酸(C18:2)、0.2％亚麻酸(C18:2)。茶油的不饱和脂肪酸含量是目前食用油中最高的，达到90％以上，其中油酸含量在80％左右，是一价不饱和脂肪酸，在空气中不易氧化，比较耐储藏。茶油中含有维生素A、维生素E、维生素D和胡萝卜素等，具有与橄榄油类似的优良特性。除此茶油中含有较高含量的保健类物质角鲨烯，随着深海鲨鱼资源的逐渐匮乏，油茶可成为潜在的角鲨烯的来源。油茶还是优良的木本经济林树种，经济效益明显。
目前油茶组织培养技术还不成熟，虽然有部分研究报道，但大多数存在不定芽诱导效率较低，外植体获取困难，生根效率极低且周期长达2个月以上，转化效率极低，导致油茶转基因育种困难重重。严重阻碍了油茶功能基因鉴定和转基因育种的进展。
因此，提供一种油茶高效组织培养及植株再生的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种油茶高效组织培养及植株再生的方法，利用本发明方法进行油茶组织培养，具有生根效率高，生根时间短且根系健壮的特点。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种油茶高效组织培养及植株再生的方法，包括以下步骤：
(1)将油茶幼苗在无菌苗培养基中培养至茎尖长度30-50mm，得茎尖组织；
(2)将茎尖组织转入分化培养基中培养至伤口处愈伤组织分化出绿色芽点，芽点伸长至10mm，得不定芽；
所述分化培养基成分为MS培养基+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+椰汁50mL/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8；
(3)将不定芽转入壮苗培养基中培养至高度≥20mm，得健壮不定芽；
所述壮苗培养基成分为MS培养基+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+椰汁50mL/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8；
(4)将健壮不定芽转入生根培养基中培养至3-4条幼根形成，得无菌苗；
所述生根培养基成分为1/8MS培养基+IBA2.4mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，PH5.8；
(5)炼苗移栽。
优选的，步骤(1)-(4)的培养温度均为25℃，光照强度均为3000lux，时长16h/天。
优选的，步骤(1)所述无菌苗培养基成分为MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂7g/L,pH5.8-6.0。
优选的，步骤(2)所述共培养培养基每两周更换一次。
优选的，步骤(5)所述炼苗移栽具体为将无菌苗转入无菌苗培养基中，培养至根系发达且苗高≥6cm时，再转入泥炭土与蛭石体积比为1:1的栽培基质中置于光照培养箱内培养1月后，移栽至遮阴棚内培养2月，转入野外林地栽培。
更优选的，步骤(5)在移栽至遮阴棚后对光照和温度无要求，移栽至遮阴棚前要求25℃，光照强度为3000lux，时长16h/天。
优选的，还包括构建质粒单克隆农杆菌侵染茎尖组织，转入共培养培养基2-4天后，再转入筛选培养基培养至不定芽生成步骤，获得转基因油茶。
更优选的，所述构建质粒单克隆农杆菌侵染茎尖组织具体为：将含有双元植物表达载体pCAMBIA1302-Ca-αCT的农杆菌GV3101单克隆于含卡那霉素50mg/L和利福平25mg/L的YM培养基上划线，28℃培养3天，收集农杆菌菌体，将其悬浮于去掉琼脂的分化培养基中，晃动30min后至菌体OD600为0.3-0.6，再添加终浓度为100μmol/L的乙酰丁香酮，得侵染液；
侵染时，用灭菌针刺扎茎尖生长点10次以上，每40-50个茎尖片加100mL侵染液，侵染时间60分钟，将茎尖组织取出吸干残留侵染液后转入共培养培养基培养2-4天；
再转入筛选培养基中培养至不定芽生成，继续后序步骤(3)-(5)；
所述共培养培养基成分为MS培养基+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+椰汁50mL/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+乙酰丁香酮100μmol/L,pH5.8。
所述筛选培养基成分为MS培养基+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+椰汁50mL/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+卡那霉素40mg/L+头孢霉素300mg/L,pH5.8。
经由上述的技术方案可知，本发明公开提供了一种油茶高效组织培养和转基因植株再生方法，具有生根效率高，生根时间短且根系健壮的特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明实施例茎尖组织的获取示意图；
图2附图为本发明实施例验证农杆菌GV3101感受态转化效果示意图，其中M:DL2000Marker；1-8:α-CT-1302inGV3101，其中6为阴性；
图3附图为本发明实施例茎尖组织抗性筛选示意图；
图4附图为本发明实施例不定芽生根示意图；
图5附图为本发明实施例移栽成活的转基因株系；
图6附图为本发明实施例转基因油茶株系分子鉴定图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种油茶高效组织培养及植株再生的方法，本发明所涉及的试剂和材料如无特殊提及，均为市售可得，例如椰汁可用市售UFC牌100％纯椰子水，所涉及的方法均为常规方法，在此不再一一赘述。
实施例1油茶组培和再生
1.将油茶幼苗在无菌苗培养基中培养，培养温度25℃，光照强度为3000lux，时长16h/天，培养至茎尖长度30-50mm，得茎尖组织；
其中，无菌苗培养基成分为MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂7g/L,pH5.8-6.0。
2.将茎尖组织转入分化培养基中培养，培养温度25℃，光照强度为3000lux，时长16h/天，诱导至伤口处愈伤组织分化出绿色芽点，芽点伸长至10mm左右得不定芽；期间，每两周更换一次共培养培养基。
其中，分化培养基成分为MS培养基+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+椰汁50mL/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8；
3.将不定芽转入壮苗培养基中培养至高度≥20mm，得健壮不定芽；期间培养温度25℃，光照强度为3000lux，时长16h/天。
其中，壮苗培养基成分为MS培养基+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+椰汁50mL/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8。
4.将健壮不定芽转入生根培养基中培养至根系形成，得无菌苗；期间培养温度25℃，光照强度为3000lux，时长16h/天。
其中，生根培养基成分为1/8MS培养基+IBA2.4mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，PH5.8。
5.炼苗移栽：将无菌苗转入无菌苗培养基中，培养至根系发达且苗高≥6cm时，再转入泥炭土与蛭石体积比为1:1的栽培基质中置于光照培养箱内培养(25℃，3000lux，16h/天)1月后，移栽至遮阴棚内培养2月，对光照和温度无要求，转入野外林地栽培。
其中，无菌苗培养基成分为MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂7g/L,pH5.8-6.0。
实施例2转基因油茶组培和再生
1.将油茶幼苗在无菌苗培养基中培养，培养温度25℃，光照强度为3000lux，时长16h/天，培养至茎尖长度30-50mm，得茎尖组织(参见附图1)；
其中，无菌苗培养基成分为MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂7g/L,pH5.8-6.0。
2.构建质粒单克隆农杆菌
(1)基因序列克隆：
以油茶基因组为参考，设计扩增Ca-αCT引物，引物序列为(序列1和2)，在长林4号油茶中扩增cDNA序列并交由浙江尚亚公司测序，测序序列如下(序列3).
F1:5’-ATGACTACAGTATCACTGATAGCTGGC-3’，SEQ IDNO.1，
R1:5’-TCAATTTATAACCCTAGAAACATACCCC-3’，SEQ IDNO.2。
ATGACTACAGTATCACTGATAGCTGGCAACGGTGTGAGGGGAAGAGGAGGTGAAGACTTGGGTTCTCTGTTTTGGTCGCATTTACATTTTGGCAATGAGTTCCTGGCAAGTGATTCACCGATAAGTTTGTTTAGAAACTTAAATGGCATTTGGTGGAGGGATTTGGGAGGCTCCAGGATCAGACGGGGGTGCAAATTTTGCGTTGTTGCAAAGGTTAGAAAGGGGAAGAAGCACGATTACCCGTGGCCCGATGATATTGATCCAAATACCAGTGCACCCTTGACTTACCTCTCTTACTTCAAGCCTATGTCAGAGAAACCCAAACCAGTGACACTTGCCTTTGAGAAGCCACTGGTTGATTTGGAAAAAAAGATCATTGAGGTACGCAGAATGGCTGATGAAACTGGTTTGGATTTCAGTGACCAAATTAGTGCTTTGAAAAACAAGTATCAACAGGCTCTTAAGGATTTATACATGCATTTGACACCCATACAACGCCTTAATATTGCTCGACATCCTAATAGGCCTACTGTTCTTGATCATATCTTTAACATCACTGAGAAGTGGGTGGAACTCCACGGAGATCGTGCAGGCTATGACGATCCAGCTATCGTGACTGGCATTGGGAGCATGGATGGCAAAAGCTACATGTTCATAGGACATCGGAAAGGAAGGAACACAAAGGAAAATATTGCACGTAACTTTGCAATGCCAACTCCTCAAGGGTATGTTTCTAGGGTTATAAATTGA，SEQ ID NO.3。
PCR反应体系及程序参考2×FlashHotStartMasterMix(Dye).
体系：
程序：
(2)载体构建
①线性化载体制备：通过双酶切获得线性化的载体
将上述试剂及质粒加到小的PCR管中，吸打混匀，37℃,3h，回收,备用。
②引物设计
为保证目的序列的一致性，模板利用基因克隆后鉴定所得的序列，根据无缝组装的特点。设计带有载体接头的引物序列，引物序列为：
F2:5’-acgggggactcttgaccatgATGACTACAGTATCACTGATAGC TGGC-3’，SEQ IDNo.4，
R2:5’-agttcttctcctttactagtTCAATTTATAACCCTAGAAACATACC CC-3’，SEQ IDNO.5。
③PCR扩增：反应体系和程序同(1)基因克隆步骤。
④重组反应
⑤转化大肠杆菌DH5α
⑥阳性克隆鉴定
挑取过夜培养的单菌落到含卡纳抗性的LB，震荡摇菌，然后进行菌落PCR验证，引物用基因引物，PCR体系为
PCR验证正确的进行测序，测序结果对的即为重组载体。
(3)转化农杆菌
将鉴定阳性的大肠杆菌过夜摇菌后提取质粒，利用电击法将质粒转入农杆菌GV3101感受态，涂板后挑取阳性克隆摇菌后菌落PCR验证(结果参见附图2)，引物和PCR体系同大肠杆菌验证。阳性菌加甘油后冷冻保存备用。
3.将含有双元植物表达载体pCAMBIA1302-Ca-αCT的农杆菌GV3101单克隆于含卡那霉素50mg/L和利福平25mg/L的YM培养基上划线，28℃培养3天，收集农杆菌菌体，将其悬浮于去掉琼脂的分化培养基(MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+椰汁50mL/L+蔗糖30g/L，pH5.8)中，晃动30min后至菌体OD600为0.3-0.6，再添加终浓度为100μmol/L的乙酰丁香酮，得侵染液；
侵染时，用灭菌针刺扎步骤1茎尖组织的生长点10次以上，每40-50个茎尖片加100mL侵染液，侵染时间60分钟，将茎尖组织取出吸干残留侵染液后转入共培养培养基(MS培养基+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+椰汁50mL/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+乙酰丁香酮100μmol/L，pH5.8)培养2-4天；再转入筛选培养基(MS培养基+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+椰汁50mL/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+卡那霉素40mg/L+头孢霉素300mg/L,pH5.8)中培养(参见附图3)，期间每两周更换一次培养基，四周后逐渐有不定芽生成(参见附图4)；
该步骤培养温度25℃，光照强度为3000lux，时长16h/天。
4.将不定芽转入壮苗培养基中培养至高度≥20mm，得健壮不定芽；期间培养温度25℃，光照强度为3000lux，时长16h/天。
其中，壮苗培养基成分为MS培养基+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+椰汁50mL+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8。
5.将健壮不定芽转入生根培养基中培养至根系形成，得无菌苗；期间培养温度25℃，光照强度为3000lux，时长16h/天。
其中，生根培养基成分为1/8MS培养基+IBA2.4mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，PH5.8。
6.炼苗移栽：将无菌苗转入无菌苗培养基中，培养至根系发达且苗高≥6cm时，再转入泥炭土与蛭石体积比为1:1的栽培基质中置于光照培养箱内培养(25℃，3000lux，16h/天)1月后，移栽至遮阴棚内培养2月，对光照和温度无要求，转入野外林地栽培(参见附图5)。
其中，无菌苗培养基成分为MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂7g/L,pH5.8-6.0。
7.油茶转基因的分子鉴定：剪取栽培成活的转基因苗叶片，提取DNA，采用pCAMBIA1302载体通用引物进行PCR反应检测验证转基因油茶苗存在外源基因插入(参见附图6)。PCR体系同菌液PCR验证体系，模板改为提取的DNA溶液1ul,扩增程序同同菌液PCR。
对比例不同培养基组培方式
对比例1与实施例1的区别仅在于，本对比例中生根培养基的配为：1/8MS培养基+IBA2.0mg/L+NAA2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，PH5.8。
对比例2与实施例1的区别仅在于，本对比例中生根培养基的配为：1/8MS培养基+IBA3.0mg/L+NAA2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，PH5.8。
对比例3与实施例1的区别仅在于，本对比例中生根培养基的配为：1/8MS培养基+IBA3.5mg/L+NAA2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，PH5.8。
对比例4与实施例1的区别仅在于，本对比例中生根培养基的配为：1/8MS培养基+IBA4.0mg/L+NAA2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，PH5.8。
对比例5与实施例1的区别仅在于，本对比例中生根培养基的配为：1/8MS培养基+IBA2.4mg/L+NAA1.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，PH5.8。
对比例6与实施例1的区别仅在于，本对比例中生根培养基的配为：1/8MS培养基+IBA2.4mg/L+NAA1.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，PH5.8。
对比例7与实施例1的区别仅在于，本对比例中生根培养基的配为：1/8MS培养基+IBA2.4mg/L+NAA2.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，PH5.8。
对比例8与实施例1的区别仅在于，本对比例中生根培养基的配为：1/8MS培养基+IBA2.4mg/L+NAA3.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，PH5.8。
效果例1
分别考察实施例1-2与对比例1-8诱导不定芽生根的生根率和根系状态，结果如表1所示。
表1
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (8)
1.一种油茶高效组织培养及植株再生的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将油茶幼苗在无菌苗培养基中培养至茎尖长度30-50mm，得茎尖组织；
(2)将茎尖组织转入分化培养基中培养至伤口处愈伤组织分化出绿色芽点，芽点伸长至10mm，获得不定芽；
所述分化培养基成分为MS培养基+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+椰汁50mL/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8；
(3)将不定芽转入壮苗培养基中培养至高度≥20mm，得健壮不定芽；
所述壮苗培养基成分为MS培养基+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+椰汁50mL/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8；
(4)将健壮不定芽转入生根培养基中培养至3-4条幼根形成，得无菌苗；
所述生根培养基成分为1/8MS培养基+IBA2.4mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，PH5.8；
(5)炼苗移栽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)-(4)的培养温度均为25℃，光照强度均为3000lux，时长16h/天。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述无菌苗培养基成分为MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂7g/L,pH5.8-6.0。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述分化培养基每两周更换一次。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述炼苗移栽具体为将无菌苗转入无菌苗培养基中，培养至根系发达且苗高≥6cm时，再转入泥炭土与蛭石体积比为1:1的栽培基质中置于光照培养箱内培养1月后，移栽至遮阴棚内培养2月，转入野外林地栽培。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(5)在移栽至遮阴棚后对光照和温度无要求，移栽至遮阴棚前要求25℃，光照强度3000lux，时长16h/天。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，还包括构建质粒单克隆农杆菌侵染茎尖组织，转入共培养培养基2-4天后，再转入筛选培养基培养至不定芽生成步骤，获得转基因油茶。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述构建质粒单克隆农杆菌侵染茎尖组织具体为：将含有双元植物表达载体pCAMBIA1302-Ca-αCT的农杆菌GV3101单克隆于含卡那霉素50mg/L和利福平25mg/L的YM培养基上划线，28℃培养3天，收集农杆菌菌体，将其悬浮于去掉琼脂的分化培养基中，晃动30min后至菌体OD600为0.3-0.6，再添加终浓度为100μmol/L的乙酰丁香酮，得侵染液；
侵染时，用灭菌针刺扎茎尖生长点10次以上，每40-50个茎尖片加100mL侵染液，侵染时间60分钟，将茎尖组织取出吸干残留侵染液后转入共培养培养基培养2-4天；
再转入筛选培养基中培养至不定芽生成，继续后序步骤(3)-(5)；
所述共培养培养基成分为MS培养基+6-BA2.0mg/L+NAA
0.5mg/L+椰汁50mL/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+乙酰丁香酮100μmol/L,pH5.8。
所述筛选培养基成分为MS培养基+6-BA2.0mg/L+NAA
0.5mg/L+椰汁50mL/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+卡那霉素40mg/L+头孢霉素300mg/L，pH5.8。
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|---|
| 毕方铖, 谭晓风, 张智俊, 陈永忠, 杨伟: "油茶离体培养诱导再生植株的研究", 经济林研究, vol. 22, no. 02, pages 5 - 9 * |
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| GR01 | Patent grant | ||
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