JPH05184252A - カラマツ属植物の大量増殖法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 カラマツ属植物の組織片を組織培養して高い
再生率で植物体を増殖する方法を提供することを目的と
する。 【構成】 ニホンマツとグイマツの交雑種の２年生の実
生苗から茎頂を含む２ｃｍの長さの枝を切り取って表面
殺菌し、成長点を含む３ｍｍの大きさの茎頂部を切り取
り、これをＭＳ培地を１／２に希釈し、ショ糖３％、ベ
ンジルアデニン０．５ｍｇ／ｌ、寒天０．７％を加えた
培地に植え付けカルスを誘導した。カルスを誘導した同
じ培地にナフタレン酢酸０．０１ｍｇ／ｌを添加した培
地上に上記カルスを移植し、シュートを再生した後、こ
のシュートを、ＭＳ培地を１／４に希釈し、これにショ
糖１％、インドール−３−酪酸０．５ｍｇ／ｌ及び寒天
０．７％を添加した培地に移植して発根させた。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はカラマツ属植物の組織培
養による大量増殖法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】カラマツ属植物は世界的に１５種あり
（世界の針葉樹 杉本順一 １９８７参照）、わが国で
はニホンカラマツだけが北緯３８度５分〜８分までの寒
冷地に天然分布している。造林面積は１９７０年現在で
は１１０万５０７１ｈａ（農林業センサス １９８０）
あり、造林地は天然分布と同様に寒冷地に多い。寒冷な
地域での林業を考えるとき、気象条件や地質条件からみ
てもカラマツ属以外の樹種では早成樹種として生育でき
ないような場所が多く、寒冷地での造林にはカラマツ属
植物は欠かせない樹種である。

【０００３】カラマツ属植物の材質は、堅く耐腐力もあ
り、枕木、橋梁、船などに用いられている。また、パル
プ材としても用いられている。ただ、木理の旋回性に基
づく製材時における材面の繊維傾斜のために起こる捩
れ、野鼠被害、病害などの問題がある。これらの問題を
解決するためには育種等による品種改良および改良品種
のクローン増殖が必要となる。

【０００４】しかし、カラマツ属植物は挿し木が困難で
あるため育種苗の増殖には、採種園産種子による実生繁
殖或いは接木による増殖しか方法が無かった。前者の実
生繁殖による場合は、苗木の遺伝的性質が安定しない欠
点があり、また後者の場合遺伝的には均一の苗木を増殖
できるが大量に増殖することは不可能に近い。しかし、
最近になって組織培養の技術が発達し、すでに組織培養
を用いた大量増殖は、ラン類を中心に花卉類、野菜類に
おいて活発に行われている。

【０００５】そして、この方法によるクローンの増殖は
材木にも応用され、特に針葉樹においては、９科４８樹
種においてクローン増殖の可能性が認められている（佐
々木恵彦編著 森林のバイオテクノロジー １９８
７）。しかし、これらの多くは芽生えの一部の組織を用
いており、育種効果の明らかになっている成木からの組
織培養は困難であると考えられている。また、米国のウ
ェハウザー社（Weyerhaeuser Company）は、ダグラスフ
ァーとテーダマツ、センペルセコイアについての組織培
養による大量増殖方法に関する発明（米国特許 第４２
１７７３０号明細書と第４３５３１８４号明細書）を完
成している。

【０００６】カラマツ属植物の組織培養の例としては、
黒丸（日林誌、第６９巻、９号、３５５〜３５８頁、１
９８７年）が、ニホンカラマツ（Larix leptrepis ）と
グイマツ（L. gmelini）との交雑種の芽生えから不定芽
による増殖を行っている。また、板鼻（日林東北支論３
９、５３〜５４頁、１９８７年および日林東北支論３
９、５５〜５６頁、１９８７年）は、２６年生のニホン
カラマツの芽を用いて培養を行い個体再生を行ってい
る。しかしながらこれらの報告は、大量増殖の可能性を
示唆するにとどまり、まだ事業的に大量増殖を行えるほ
ど増殖率が高いものではない。

【０００７】また外国樹種では、Vladimir Chalupa（Co
mmunication Institute ForestalisChchosloveniae 、v
ol.１３、７〜３９頁、１９８３）が、Larix decidura
の播種後３カ月の実生苗の茎頂を用い植物体を再生して
いる。この方法はいわゆる成長点培養であり、１茎頂か
ら１個体の増殖である。またLaliberte ＆ Lalonde（A
mer. J. Bot. 、vol.７５、７６７〜７７７頁、１９８
８年）がL. Xeurolepis の１２年生成木の初生芽（prim
ordial shoot）を培養して植物体を再生させている。こ
の方法で使用している培地はカルス誘導にはＳＨ改変培
地、シュート再分化と発根にはＤＣＲ培地、またカルス
誘導ホルモンとしてベンジルアデニン（ＢＡ）を、シュ
ートからの発根ホルモンとしてＢＡとインドール酪酸
（ＩＢＡ）を使用しているが、カルスの生存率が３０〜
４４％、シュートからの発根率が２２％と極めて低い。

【０００８】これらの方法では、外植体からの植物体の
再生にＢＡを３．０ｍｇ／ｌの濃度、あるいはナフタレ
ン酢酸（ＮＡＡ）を０．３ｍｇ／ｌおよびゼアチンを
０．０１ｍｇ／ｌの濃度で使用している。また、カルス
誘導には、ＢＡを０．２５〜１０μＭ（約０．０５６〜
２．２５３ｍｇ／ｌ）の濃度で使用している。また、こ
の誘導したカルスからのシュートの再分化にはカルス誘
導と同じ濃度のＢＡを使用している。さらに、再分化シ
ュートからの発根にはＢＡを５．０μＭ（約１．１２７
ｍｇ／ｌ）の濃度で、ＩＢＡを１．０μＭ（約０．２０
３ｍｇ／ｌ）の濃度で組み合わせて使用している。

【０００９】体細胞胚を作出してこれから植物体の再生
に関する報告は、Klimaszewska（Plant Science 、vol.
６３、９５〜１０３頁、１９８９年）がL. Xeurolepis
の胚を用いて行った試験が最初の例である。この他に、
Nagmani ＆ Bonga （Can. J. For. Res. 、vol.１５、
１０８８〜１０９１頁、１９８３年）とvon Aderkas＆
Bonga （Amer. J. Bot. 、vol.７５、６９０〜７００
頁、１９８８）は、L.decidura の胚を用いてカルスを
誘導し、このカルスを振蘯培養することによって胚様体
を作出した。さらに、von Aderkas et al （Can. J. Bo
t.、vol.２０、９〜１４頁、１９８９）は、L.leptrepi
s とL.decidura、およびこれらの交雑種（L. Xeurolepi
s ）の胚乳と胚を用いてカルスを誘導し、このカルスを
振蘯培養することにより半数体と２倍体の胚様体を作出
し、この胚様体から植物の再生を行っているが。これら
の方法も基礎的なものでその再生度が低い欠点がある。

【００１０】同じカラマツの名前でアキカラマツの組織
培養方法が特公昭６１−２０５４８２号公報に掲載され
ているが、このアキカラマツはキンポウゲ科カラマツソ
ウ属の多年生草本で、本発明のカラマツ属植物とは全く
異なる植物である。また、木本性植物では、アスナロ属
植物の組織培養方法が特開平２−３８３２２３号公報に
掲載されているが、これはカルスから不定根を誘導した
だけであり、植物体の再生には至っていない。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、これまで接
ぎ木に頼っていたカラマツ属植物クローンを組織培養に
よって大量に増殖する方法である。さらに、従来のカラ
マツ属植物の組織培養技術はまだ基礎的な研究に留まっ
ており、使用できる組織が茎頂や芽生えの胚軸等だけで
あるだけでなく、その植物体への再生率も低い。本発明
は頂芽の茎頂だけでなく、側芽の茎頂および枝を組織培
養して高い再生率で植物体を増殖する方法を提供するも
のである。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、カラマツ属植
物の組織片をオーキシン系植物ホルモン０〜０．０１ｍ
ｇ／ｌ、サイトカイニン系植物ホルモン０．０１〜５．
０ｍｇ／ｌを含む培地を用いて無菌的にカルスを誘導
し、次いで誘導されたカルスをオーキシン系植物ホルモ
ン０〜０．１ｍｇ／ｌを含む培地を用いてシュートを再
生し、次いで再分化さたシュートを少なくとも１種類以
上のオーキシン系植物ホルモン０．２〜３．０ｍｇ／ｌ
を含む培地にて発根させることを特徴とするカラマツ属
植物の大量増殖方法である。

【００１３】以下に本発明を詳細に説明する。カラマツ属植物の組織 本発明に適用できるカラマツ属植物としては、ニホンカ
ラマツ（Larix leptrepis ）、グイマツ（L.gmelini
）、チョウセンカラマツ（L.olgensis）など日本で造
林されている樹種、またオウシュウカラマツ（L. decid
ua）、アメリカカラマツ（L.laricina）などの外国樹種
の他、これらの種間雑種がある。また、組織培養に用い
る組織片（外植体）としては、頂芽および腋芽における
茎頂、枝における形成層、針葉における葉肉組織等のよ
うに、分裂細胞を持っている組織であれば良いが、特に
茎頂と枝を使用するのが有効である。

【００１４】培地 本発明に使用する培地は植物の組織培養に一般に用いら
れる培地を広く用いることができる。例えば、ガンボー
グＢ５培地、ムラシゲ・スクーグ培地、Litvayの培地
（ＬＭ培地）、Woody plant medium培地（ＷＰＭ培
地）、white の培地（White 培地）、井出・斎藤培地
（ＩＳ培地）あるいはこれらの培地の組成を改変した培
地などである。

【００１５】植物ホルモン また、培地に加える植物ホルモンとしては、ナフタレン
酢酸（ＮＡＡ）、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）、イ
ンドール−３−酪酸（ＩＢＡ）、２，４−シクロフェノ
キシ酢酸（２，４−Ｄ）、インドール−３−プロピオン
酸（ＩＰＡ）、ベンゾフラン−３−酢酸（ＢＦＡ）、フ
ェニル酪酸（ＰＢＡ）、およびこれらの誘導体等のオー
キシン類、およびベンジルアデニン（ＢＡ）、カイネチ
ン、ゼアチン、２−イソペンテニルアデニン（２ｉ
Ｐ）、（２−クロル−４−ピリジル）−３−フェニル尿
素（４ＰＵ）等のサイトカイニン類を例示できる。

【００１６】カルスの誘導 上記の培地にサイトカイニン類およびサイトカイニン類
とオーキシン類とを組み合わせた植物ホルモン及びショ
糖を添加した固体もしくは液体培地に、表面殺菌を行っ
たカラマツ属植物の組織片を植え付ける。

【００１７】培養条件は気温１５〜３０℃、１０００〜
２００００ｌｕｘの照度で明期１０〜１６時間、暗期１
４〜８時間を与え培養する。組織片植え付け後、約２週
間程度で組織片のカルス化が始まり、約４週間後には直
径５〜１５ｍｍ程度のカルスに生長する。

【００１８】植物体の再生 上記によって誘導されたカルスを、前述の培地にオーキ
シン類の植物ホルモンおよびショ糖を添加した液体もし
くは固体培地に移植する。培養条件は、カルス誘導の条
件と同様である。

【００１９】カルス移植後、１〜２週間程度でシュート
の再分化が確認できる。約４週間後には、５〜１５ｍｍ
の長さのシュートが１０〜４０本程度カルスから再分化
する。シュート再分化に用いた培地を１／２〜１／４程
度に希釈し、これにオーキシン類を１種類もしくは２種
類以上を組み合わせて添加した培地に再分化したシュー
トをカルスから切り放し移植を行う。このとき、培地の
ショ糖濃度はできるだけ低くした方がよい。場合によっ
てはショ糖は添加しなくてもよい。発根時の培養条件
は、カルス誘導、シュート再分化時の条件と同様であ
る。

【００２０】発根培地へ移植後、早いもので約２週間程
度で発根が認められる。この後２〜３週間で順化を行え
るような状態まで根が発達する。この発根個体を従来知
られている方法によって順化することにより、健全な苗
木を多数得ることができる。

【００２１】

【実施例】以下、本発明を実施例によって具体的に説明
する。 実施例−１外植体とその表面殺菌方法 ニホンカラマツとグイマツの交雑種の２年生の実生苗か
ら茎頂を含む２ｃｍの長さの枝を切り取って７０％メタ
ノールに２分間浸漬し（このうち１分間は超音波洗浄を
行う）、この後１０倍に希釈したアンチホルミンに２０
分浸漬する（このうち５分間は超音波洗浄を行う）こと
により表面殺菌を行った。この後滅菌水で３回すすい
だ。

【００２２】カルス誘導の培地及び植物ホルモン ＭＳ培地を１／２に希釈し、これにショ糖３％を添加
し、最適濃度を明らかにするために、表１に示す各種の
濃度のＢＡを加えｐＨ５．８に調製した。この培地を１
００ｍｌ容量のガラス製の三角フラスコに４０ｍｌずつ
分注し、さらに寒天０．７％を加えオートクレーブによ
って滅菌した（１２１℃、１．２ｋｇ／ｃｍ² 、１５分
間）。

【００２３】

【表１】

【００２４】茎頂の植え付け及び培養条件 これに前述の表面殺菌した茎頂を含む枝から成長点を含
む３ｍｍの大きさの茎頂部分を切り取って、これを１フ
ラスコ当り２茎頂ずつ植え付け、２５℃で１６時間明期
（２０００lux ）、８時間暗期の培養条件で１カ月培養
し、カルスを誘導した。この結果、表１に示したように
カルス誘導率はＢＡの濃度が０．５ｍｇ／ｌのものが最
も良かったので、カルス誘導に使用するホルモンはＢＡ
を０．５ｍｇ／ｌの濃度とした。得られたカルスの写真
を図１に示す。

【００２５】シュートの再分化 カルスを誘導した同じ培地にシュートを再分化させるた
めに使用するホルモンの種類と濃度を明らかにするため
にＮＡＡおよびＩＢＡを表２に示す種々の濃度でそれぞ
れ添加し、ｐＨ５．８に調製して１００ｍｌ容量のガラ
ス製の三角フラスコに４０ｍｌずつ分注した。これに寒
天０．７％を加えオートクレーブによって滅菌した。

【００２６】

【表２】

【００２７】この培地に先に誘導したカルスを直径５〜
１０ｍｍ程度に分割して各ホルモン濃度毎に、１フラス
コ当り２個ずつ移植した。なお、培養条件はカルス誘導
の際と同じとし、１カ月培養しシュートの再分化率を調
べた。この結果、シュート再分化率の最も高かったのは
ＮＡＡを０．０１ｍｇ／ｌまたは０．０５ｍｇ／ｌ添加
したものであった。

【００２８】培養後１カ月の段階で、カルスは１．５〜
２ｃｍ程度の大きさに生長し、さらにここからシュート
が１カルス当り２０〜３０本再分化した。これを同じ組
成の培地に移植し、さらに１カ月培養した。この時シュ
ートの数は３０〜４０本程度で３〜４ｃｍの大きさにな
った。この時点でシュートをカルスから切取り、次の述
べる発根培地に移植した。得られたシュートの写真を図
２に示す。

【００２９】シュートからの発根 培地はＭＳ培地の１／４希釈培地とし、これにショ糖１
％、寒天０．７％とし、オーキシンについてはその種類
と濃度を明らかにするためにＮＡＡとＩＢＡについて
０．１および０．５ｍｇ／ｌの濃度で添加した。培養条
件は、カルス誘導およびシュート再分化時と同様とし
た。この条件で、３カ月培養後発根が確認できた。な
お、表３に示した発根率は、シュート再分化率の高かっ
たＮＡＡ０．０１ｍｇ／ｌを添加した試験区から取った
シュートの発根率であるが、この結果から、ＩＢＡを
０．５ｍｇ／ｌの濃度で添加した培地で最も発根率が高
かった。

【００３０】

【表３】

【００３１】この後３カ月で順化可能となるように根が
発育した。この発根した個体をすでに明らかにされてい
る方法でパーライトに移植し、徐々に湿度を下げ、高照
度に移していくことによって約１カ月で順化を終了し、
正常な苗木となった。順化可能となるように発育した根
の状態を示す写真を図３に示す。この方法によって、１
個の茎頂から約９カ月で１０本の苗木が生産できた。

【００３２】実施例−２外植体とその表面殺菌方法 カラマツとグイマツの２年生の交雑種個体から当年生枝
部分を２ｃｍの長さに切り取って、実施例−１と同様の
方法で滅菌した。

【００３３】カルス誘導条件 ＭＳ培地の１／２希釈培地にショ糖３％を添加し、さら
にＢＡを０．５ｍｇ／ｌの濃度で添加し、ｐＨ５．８に
調製した。この培地を１００ｍｌ容量の三角フラスコに
４０ｍｌずつ分注し、寒天０．７％を加えオートクレー
ブによって滅菌した。

【００３４】外植体の植え付け及び培養条件 これに前述の表面殺菌したカラマツ交雑種の枝を１フラ
スコ当り２本ずつ植え付け、実施例−１と同じ条件で１
カ月培養し、カルスを誘導した。

【００３５】シュートの再分化 カルスを誘導したものと同じ培地にＮＡＡ０．０１ｍｇ
／ｌ及びショ糖を３％添加し、ｐＨ５．８に調製した。
この培地を１００ｍｌ容量の三角フラスコに４０ｍｌず
つ分注し、寒天０．７％を加えオートクレーブによって
滅菌した。この培地に誘導したカルスを直径５〜１０ｍ
ｍ程度分割し、１フラスコ当り２個のカルスを移植し
た。シュートの再分化率は６０％であった。

【００３６】培養後２週間の段階で、カルスは１．５〜
２ｃｍ程度に生長し、シュート数は１カルス当り２０〜
３０本再分化した。これをさらに１カ月培養し、シュー
ト数が３０〜４０本程度になった時点でシュートをカル
スから切取り、発根培地に移植した。

【００３７】シュートからの発根 このとき、培地はＭＳ培地の１／４希釈培地とし、これ
にショ糖１％、寒天０．７％およびＩＢＡを０．５ｍｇ
／ｌの濃度で添加した。この方法では、発根率は４０％
であった。移植後約１カ月から発根が認められ、２カ月
を過ぎると順化に出せるような状態まで根が発育する。
この後、順化を経て健全な苗木に生長した。この試験で
は、１本の枝から約７カ月で約２５本の苗木を生産する
ことができた。

【００３８】実施例−３外植体とその表面殺菌方法 カラマツとグイマツの１７年生の交雑種個体から当年生
枝部分を２ｃｍの長さに切り取って、実施例−１と同様
の方法で滅菌した。

【００３９】カルス誘導条件 ＭＳ培地の１／２希釈培地にショ糖３％を添加し、さら
に表４に示す濃度のＢＡおよびＮＡＡを組み合わせて添
加し、ｐＨ５．８に調製した。この培地を１００ｍｌ容
量の三角フラスコに４０ｍｌずつ分注し、寒天０．７％
を加えオートクレーブによって滅菌した。

【００４０】

【表４】

【００４１】茎頂の植え付け及び培養条件 これに前述の表面殺菌したカラマツ交雑種の茎頂を１フ
ラスコ当り２茎頂ずつ植え付け、実施例−１と同じ条件
で１カ月培養し、カルスを誘導した。この結果、カルス
誘導率はＢＡ０．５ｍｇ／ｌ＋ＮＡＡ０．０１ｍｇ／ｌ
の組み合わせが最も高かったが、後述するシュート再分
化率はＢＡ０．１ｍｇ／ｌ＋ＮＡＡ０．０１ｍｇ／ｌの
組み合わせが最も高かったので、これをカルス誘導の適
正ホルモンの組み合わせとした。

【００４２】シュートの再分化 カルスを誘導したものと同じ培地にＮＡＡ０．０１ｍｇ
／ｌ及びショ糖を３％添加し、ｐＨ５．８に調製した。
この培地を１００ｍｌ容量のガラス製三角フラスコに４
０ｍｌずつ分注し、寒天０．７％を加えオートクレーブ
によって滅菌した。この培地に誘導したカルスを直径５
〜１０ｍｍ程度分割して、１フラスコ当り２個のカルス
を移植した。各ホルモンの組み合わせによって誘導した
各カルスのシュートの再分化率を表５に示す。

【００４３】

【表５】

【００４４】培養後２週間の段階で、カルスは１．５〜
２ｃｍ程度に生長し、シュート数は１カルス当り２０〜
３０本再分化した。これをさらに１カ月培養し、シュー
ト数を３０〜４０本程度になった時点でシュートをカル
スから切取り、発根培地に移植した。

【００４５】シュートからの発根 このとき、培地はＭＳ培地の１／４希釈培地とし、これ
にショ糖１％、寒天０．７％加え、さらに表６に示した
ようにオーキシンとしてＮＡＡとＩＢＡを種々の割合で
それぞれ添加した。

【００４６】

【表６】

【００４７】移植後約１カ月から発根が認められた。こ
の時、発根率は表６に示すようにＮＡＡ１．０ｍｇ／ｌ
＋ＩＢＡ０．５ｍｇ／ｌの組み合わせが発根率が高かっ
た。２カ月を過ぎると順化に出せるような状態まで根が
発育する。この後、順化を経て健全な苗木に生長する。
この方法によって、１個の茎頂から約５カ月で約３０本
の苗木を生産することができた。

【００４８】

【発明の効果】本発明によって、いままで接ぎ木によっ
てしかクローン増殖ができなかったカラマツ属植物が茎
頂だけでなく、芽、枝、針葉等の組織培養によって大量
に増殖できるようになった。この方法によって、有用で
かつ優れた形質を持つカラマツ属植物効率よく大量に増
殖することが可能となった。

【図面の簡単な説明】

【図１】ニホンカラマツとグイマツの交雑種成木茎頂か
ら誘導されたカルスを示す図

【図２】図１に示すカルスから再分化したシュートを示
す図

【図３】カルスから再分化したシュートの発根した状態
を示す図

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【手続補正書】

【提出日】平成４年１２月２２日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１】ニホンカラマツとグイマツの交雑種成木茎頂か
ら誘導されたカルスを示す写真

【図２】図１に示すカルスから再分化したシュートを示
す写真

【図３】カルスから再分化したシュートの発根した状態
を示す写真

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 カラマツ属植物の組織片をオーキシン系
   植物ホルモン０〜０．０１ｍｇ／ｌ、サイトカイニン系
   植物ホルモン０．０１〜５．０ｍｇ／ｌを含む培地を用
   いて無菌的にカルスを誘導し、次いで誘導されたカルス
   をオーキシン系植物ホルモン０〜０．１ｍｇ／ｌを含む
   培地を用いてシュートを再生し、次いで再分化したシュ
   ートを少なくとも１種類以上のオーキシン系植物ホルモ
   ン０．２〜３．０ｍｇ／ｌを含む培地にて発根させるこ
   とを特徴とするカラマツ属植物の大量増殖法。
2. 【請求項２】 カラマツ属植物の組織片が茎頂、および
   枝である請求項１に記載したカラマツ属植物の大量増殖
   方法。