CN102696487A - 一种蟆叶秋海棠叶片离体再生体系建立的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蟆叶秋海棠叶片离体再生体系建立的方法，该方法包括以下步骤：(1)选取外植体并进行消毒；(2)将处理后的叶片切割后，进行不定芽诱导培养；(3)高压静电场处理；(4)将叶片诱导的不定芽进行继代增殖培养；(5)对继代增殖培养后的试管苗进行生根培养；(6)扦插生根。采用该繁殖方法对蟆叶秋海棠进行组织培养，一个培养周期(51d)增殖率为243.1倍，繁殖速度快，有效解决了蟆叶秋海棠种苗繁殖的难题。

Description

一种蟆叶秋海棠叶片离体再生体系建立的方法

技术领域

本发明具体涉及一种蟆叶秋海棠(Begonia rex)组织培养的繁殖方法。

背景技术

蟆叶秋海棠(Begonia rex)，秋海棠科(Begoniaceae)秋海棠属(Begonia)多年生草本观叶植物，原产巴西和鳊东部一带，叶形优美，叶色绚丽，是室内极好的观叶植物。性喜温暖、湿润、半阴及空气湿度大的环境，忌强光直射。生长适温为22-25℃，不耐高温，气温超过32℃则生长缓慢。

蟆叶秋海棠，根茎肥厚，粗短，叶宽卵形，边缘有深波状齿牙。叶绿色，叶面上有深绿色纹，中间有银白色斑纹，叶背为紫红色。叶和叶柄上密生茸毛，花较小，为淡红色。6-9月开花，聚伞花序，花朵饱满呈水红色，袅娜娇艳，亦颇具观赏价值

然而，作为秋海棠属植物的一种，其种子不易获得，有性繁殖能力弱，且后代多变异，优良性状难以保持。植物组织培养技术作为当代新兴的生物技术方法之一，具有繁殖系数高、遗传性状稳定、不受季节限制等诸多优点，因而十分适用于优秀观赏植物的推广繁殖，目前已广泛应用于马蹄莲、兰花、菊花、月季等观赏植物的再生产，秋海棠属植物中也有许多品种组培成功。但关于蟆叶秋海棠组织培养的报道较少，何勇等通过蟆叶秋海棠的幼嫩叶片外植体进行组织培养，得出了再生植株，但只是重点研究了愈伤组织的诱导试验，并没有对增殖方法进行摸索(《蟆叶秋海棠离体培养的研究》，湖北农业科学，2009年第8期，1814-1816页)，本申请实验室之前申请相关专利申请201010504126扦插时间较长，且增殖率较低。本申请课题组曾发表文章《蟆叶秋海棠“光灿”组织培养技术研究》，江西农业学报，2011年12期，然而，其整体增殖率较低，一个培养周期(70d左右)增殖率仅为80.5倍，且组培周期相对较长，现有技术中亟需一种蟆叶秋海棠高效离体快繁方法。

发明内容

本发明的目的是为了建立蟆叶秋海棠组织培养繁殖体系。

为了达到上述目的，本发明提供了一种蟆叶秋海棠叶片离体再生体系建立的方法，包括如下步骤：

(1)外植体的选取与消毒：选取3个月左右叶龄的叶片作为外植体，冲洗干净后，进行消毒，消毒过程为：先以适量洗衣粉溶液浸泡清洗，后用自来水反复冲洗，放入质量份数为3％的H₂O₂中浸泡3min，取出后立即转入含有2％(质量浓度)吐温-80的0.1％升汞溶液中消毒3min，再以无菌水冲洗5-6次，每次6-8min，消毒滤纸吸干表面水分，将叶片边缘切除后切成0.5-1cm²的方形小块。

(2)不定芽的诱导：取步骤(1)中处理得到的外植体，切割为0.5-1.0cm²大小的方块，将叶片以远轴面接种于诱导培养基中进行不定芽的诱导，培养温度为25±2℃，首先在黑暗中培养24h，然后进行正常光照培养15d；所述正常光照培养条件为：光照时间为14h/d，光照强度为1300lx；所述诱导培养基为MS+0.8mg/L6-BA+0.3mg/L IBA+0.5mg/L GA₃，pH值为6.0；

(3)高压静电场HVEF处理，利用高压静电场仪器，进行静电场处理，强度为5KV/cm，时间1小时；

(4)不定芽的继代增殖：将诱导得到的不定芽切割后，接入继代增殖培养基中进行继代培养20d，培养温度为25±2℃，光照时间为14h/d，光照强度为1600lx；所述继代增殖培养基为MS+1.2mg/L6-BA+0.2mg/L IBA+0.2mg/LKT，pH值为6.0；

(5)根的诱导：将步骤(4)中继代增殖得到的蟆叶秋海棠试管苗进行切割后，每株均有一个不定芽，接入生根培养基中进行生根培养15d，培养温度为25±2℃，光照时间为14h/d，光照强度为1600lx；所述生根培养基为1/2MS+0.2mg/L IBA+0.1mg/LNAA，pH值为6.0；待不定跟数5条左右，植株整体生长稳健时，可准备移苗出瓶。

以上所述诱导培养基、继代增殖培养基、生根培养基中均含有琼脂6.5g/L、蔗糖30g/L，且pH值为6.0。

(6)将培养瓶的瓶盖打开，炼苗2-3天，移栽入扦插基质中，所述扦插基质为：按照3∶2∶1∶1的重量比例将马肝土、黄土、泥炭土和珍珠岩混匀，地上部分喷洒0.1％的多菌灵，每天喷水2次，保证湿度，避免阳光直射。

对于本发明的进一步改进在于，所述步骤(1)中外植体的选取，以3个月叶龄的叶片为外植体，在诱导15后即可有效获得大量不定芽，数量多且生长迅速；

所述步骤(2)中的最佳暗培养时间为24h，最佳不定芽诱导培养时间为15d；所述步骤(4)中的最佳继代增殖培养时间为20d；所述步骤(5)中的最佳生根培养时间为15d。

本发明蟆叶秋海棠叶片离体再生体系建立的方法具有以下优点：

1外植体的消毒处理，本申请发明人经过大量创造性劳动及多因子实验，全面改进现有技术中的操作参数，发现，按照常规的消毒方式即洗衣粉浸泡-升汞消毒-无菌水冲洗，存在一定的污染率，而采用本申请的操作过程，不仅取得了理想的灭菌效果，还能够保证诱导培养所需的外植体数。

2外植体的放置方式：放置方式的不同导致培养效果不同，远轴面放置的外植体出芽早，数量多，增长极快，显著优于近轴面放置的叶片。

3组织培养方法其步骤都具有相似性，其结果却具有显著的不同，本领域公知组织培养方法一般分为暗培养和光培养两个阶段，暗培养一般是诱导愈伤组织，光培养诱导分化。暗培养要求避光，其实是防止迅速分裂的愈伤细胞老化，本申请发明人经过反复实验得出，蟆叶秋海棠先经过一段时间的暗培养，使外植体迅速分裂，然后光诱导培养，其萌发率最高，外植体出芽更加迅速，缩短组培时间。

4本领域公知，对于植物组培领域研究如何利用植物组织分化再生植株，提高植物的繁殖数量，是科学家研究重要的技术重点也是技术难点，而激素种类及激素浓度使用范围，培养基类型更是重中之重，本申请发明人经过大量创造性劳动，筛选的到最佳的蟆叶秋海棠诱导培养基、增殖培养基及生根培养基的成分及激素组合，不仅诱导、增殖效果明显，且出芽时间大大缩短，仅15d就能出芽，且增殖、生根效果显著。且对于蟆叶秋海棠而言，pH值要求相对严格，pH低于6.0的情况下培养材料生长两周会发黄及容易出现玻璃化现象，且生长缓慢，其最适pH为6.0。

5愈伤组织生长周期中因受损伤、营养状况、环境因子的限制和影响呈S型生长曲线，但是静电场的处理影响了膜的通透性及其它极性分子的运动，改善了细胞的吸收和转运物质能力，从而能够促进组织的生长，使得继代延迟期缩短，很快进入对数生长期。利用静电场处理，不同的强度和时间组合会产生不同的效果，如果处理电场强度过大，或处理时间过长，会使得植物细胞受到伤害甚至死亡，而电场强度过小或时间过短，又会造成处理效果不明显，本申请发明人经过大量实验得出对蟆叶秋海棠采用强度为5KV/cm，时间1小时的静电场处理可以显著改善生长状况，鲜重增加明显，生长速度为107.3mg/d，而不采用静电场处理，生长速度仅为81.5mg/d，生长速度提高了31％，大大促进了细胞的分裂和生长，缩短了离体培养的时间。

6马肝土是长江下游地区特有的一种土壤，沙性强，干可固根，湿可保水，透水能力强，最适宜于插穗生根前的水分控制，其缺点是透水能力强，失水过快、容易风干，单一使用会使扦插苗成活后基部失水干枯。而黄土过于粘稠，不透气。泥炭土具有良好的通透性和较大的盐分平衡能力，珍珠岩吸水、透气，本申请发明人经过多年创造性劳动，进行筛选对比实验，从大量扦插基质中筛选得出马肝土、黄土，泥炭、珍珠岩这四种基质按照3∶2∶1∶1的重量比例结合使用，最适宜蟆叶秋海棠生根存活，各基质间互作互应，达到透气、保湿、固根的效果。既能够快速促进插穗生根，又可促进扦插成活后植株的生长。利用组合基质培养蟆叶秋海棠，能够快速有效的得到大量蟆叶秋海棠，解决其短缺的问题；通过对灭菌、高压静电场处理、基质、激素等操作的优化，能够使得蟆叶秋海棠增殖率达到243.1倍，成活后快速达到种苗规格，能够高效的得到蟆叶秋海棠种苗，大大满足了市场的需求。

具体实施方式

外植体筛选实施例：

1、外植体在培养基中的放置方式筛选

对于大小、形状、生长状态相近的外植体叶片，其放置方式的不同也导致培养效果不同。远轴面放置的外植体出芽早，数量多，增长极快，而近轴面放置的叶片则几乎没有芽点分化的出现，且放置30d以上则逐渐趋于褐化或萎蔫。

表1

培养基筛选实施例

2、不定芽诱导培养基的筛选

将消毒切割成0.5-1.0cm²的叶块，接入5种培养基中进行不定芽诱导培养10-20d，培养温度为25±2℃，光照时间为14h/d，光照强度为1300lx。发现不定芽诱导分化效果最好的培养基为MS+0.8mg/L6-BA+0.3mg/L IBA+0.5mg/L GA₃，pH值为6.0，诱导分化率为100％，且芽体生长迅速且旺盛，形状饱满，颜色新鲜翠绿。培养基中激素不添加IBA和NAA时，外植体的分化率相对

表2

较低，且分化形成的芽体长势不佳，形状单薄细弱，颜色呈淡黄或黄白色；而在MS+6-BA1.0mg.L^-1+NAA0.5mg.L^-1培养基中，虽然外植体的也有较高的出芽率，但增殖相对缓慢。

3、不定芽增殖培养基的筛选

将诱导得到的不定芽切割后，接入5种继代增殖培养基中进行继代培养20d，培养温度为25±2℃，光照时间为14h/d，光照强度为1600lx。试验发现在MS+1.2mg/L6-BA+0.2mg/LIBA+0.2mg/LKT培养基更适合于芽的增殖，其增殖系数最高且出芽极多，生长迅速，生成芽体粗壮稠密。

表3

4、生根培养基的筛选

将继代增殖得到的蟆叶秋海棠试管苗进行切割后，接入5种生根培养基中进行生根培养15d，培养温度为25±2℃，光照时间为14h/d，光照强度为1600lx。试验发现，相同激素浓度下，1/2MS相对更适合作为生根培养基，MS培养基则相对生根较慢；在相同培养基条件下，1/2MS+0.2mg/L IBA+0.1mg/LNAA浓度更适合生根。

表4

5高压静电场筛选实施例

6基质筛选实施例

方法实施例

1、选取10株健壮无病虫害的蟆叶秋海棠试验苗移入温室进行盆栽培养，剪取新萌发的3月叶龄的叶片，以幼嫩叶片为外植体。共剪取叶片30片。

2、将叶片冲洗干净后，进行消毒，消毒过程为：先以适量洗衣粉溶液浸泡清洗，后用自来水反复冲洗，放入质量份数为3％的H₂O₂中浸泡3min，取出后立即转入含有2％(质量浓度)吐温-80的0.1％升汞溶液中消毒3min，再以无菌水冲洗5-6次，每次6-8min，消毒滤纸吸干表面水分，将叶片边缘切除后切成0.5-1cm²的方形小块。共切取叶块200块，接种于诱导培养基诱导，培养温度为25±2℃，首先在黑暗中培养24h，然后进行正常光照培养15d；所述正常光照培养条件为：光照时间为14h/d，光照强度为1300lx；所述诱导培养基为MS+0.8mg/L6-BA+0.3mg/L IBA+0.5mg/LGA₃，pH值为6.0；

外植体接于诱导培养基4d后开始出现细菌污染，污染率达2.5％，剩余未污染叶块195块。接种7d后，叶柄开始弯曲，10d后开始有外植体边缘长出颗粒状芽体，芽体生长旺盛，形状饱满，颜色新鲜翠绿。15d后诱导率达到100％，即195块，平均每块长有不定芽1.21个。

3、高压静电场HVEF处理，利用高压静电场仪器，进行静电场处理，强度为5KV/cm，时间1小时；

4、将诱导得到的不定芽切割后，接入继代增殖培养基中进行继代培养20d，培养温度为25±2℃，光照时间为14h/d，光照强度为1600lx；所述继代增殖培养基为MS+1.2mg/L6-BA+0.2mg/L IBA+0.2mg/LKT，pH值为6.0；

共接入236个不定芽，经过20d的继代增殖培养，不定芽增殖迅速，芽体粗壮，236个不定芽中221个增殖出芽，平均增殖系数达11倍。

5、根的诱导：将步骤4中继代增殖得到的蟆叶秋海棠试管苗进行切割后，每株均有一个不定芽，接入生根培养基中进行生根培养15d，共接入不定芽2431，培养温度为25±2℃，光照时间为14h/d，光照强度为1600lx；所述生根培养基为1/2MS+0.2mg/L IBA+0.1mg/LNAA，pH值为6.0；15d后，在不定芽基部长出2-3条不定根，生根苗共2431株，生根率为100％。至此，以最初10株蟆叶秋海棠为基数，一个培养周期(51d)增殖率达到了243.1倍。

6将培养瓶的瓶盖打开，炼苗2-3天，移栽入扦插基质中，所述扦插基质为：按照3∶2∶1∶1的重量比例将马肝上、黄土、泥炭土和珍珠岩混匀，地上部分喷洒0.1％的多菌灵，每天喷水2次，保证湿度，避免阳光直射。蟆叶秋海棠生根迅速，生长状况良好，能够高效的得到蟆叶秋海棠种苗，大大满足了市场的需求。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (2)

1.一种蟆叶秋海棠叶片离体再生体系建立的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)外植体的选取与消毒：选取3个月左右叶龄的叶片作为外植体，冲洗干净后，进行消毒，消毒过程为：先以适量洗衣粉溶液浸泡清洗，后用自来水反复冲洗，放入质量份数为3％的H₂O₂中浸泡3min，取出后立即转入含有2％(质量浓度)吐温-80的0.1％升汞溶液中消毒3min，再以无菌水冲洗5-6次，每次6-8min，消毒滤纸吸干表面水分，将叶片边缘切除后切成0.5-1cm²的方形小块。

(2)不定芽的诱导：取步骤(1)中处理得到的外植体方形小块，将叶片以远轴面接种于诱导培养基中进行不定芽的诱导，培养温度为25±2℃，首先在黑暗中培养24h，然后进行正常光照培养15d；所述正常光照培养条件为：光照时间为14h/d，光照强度为1300lx；所述诱导培养基为MS+0.8mg/L6-BA+0.3mg/L IBA+0.5mg/L GA₃，pH值为6.0；

(3)高压静电场HVEF处理：强度为5KV/cm，时间1小时；

(4)不定芽的继代增殖：将诱导得到的不定芽切割后，接入继代增殖培养基中进行继代培养20d，培养温度为25±2℃，光照时间为14h/d，光照强度为1600lx；所述继代增殖培养基为MS+1.2mg/L6-BA+0.2mg/L IBA+0.2mg/LKT，pH值为6.0；

(5)根的诱导：将步骤(4)中继代增殖得到的蟆叶秋海棠试管苗接入生根培养基中进行生根培养15d，培养温度为25±2℃，光照时间为14h/d，光照强度为1600lx；所述生根培养基为1/2MS+0.2mg/L IBA+0.1mg/LNAA，pH值为6.0；待不定跟数5条左右，植株整体生长稳健时，可准备移苗出瓶。

(6)将培养瓶的瓶盖打开，炼苗2-3天，移栽入扦插基质中，所述扦插优选为：按照3∶2∶1∶1的重量比例将马肝土、黄土、泥炭土和珍珠岩混匀，地上部分喷洒0.1％的多菌灵，每天喷水2次，保证湿度，避免阳光直射。

2.通过权利要求1所述方法制备的蟆叶秋海棠种苗。