CN103202228B - 紫背天葵叶片一步成苗高效离体繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种药食同源濒危植物秋海棠科紫背天葵一步成苗高效离体繁殖方法。本发明所述的方法包括：培养基准备，采用调整后的培养基，包括配制、分装和灭菌；采用紫背天葵无菌苗叶片为外植体，直接进行无菌接种；将接好种的培养瓶移入培养室，在适宜的条件下培养70～80天，单个外植体诱导成苗数20株以上；不经炼苗，将再生植株开瓶移栽至适宜的条件培养，商品种苗成活率达100％。根据本发明所述的方法，紫背天葵组织培养成苗再生周期短，有效保持原种特性，显著提高无性繁殖系数，且操作简便，培养程序简单，明显降低育苗成本，可作为秋海棠科紫背天葵优质种苗工厂化生产的有效技术。

Description

紫背天葵叶片一步成苗高效离体繁殖方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及珍稀濒危植物快繁育苗的组织培养方法，具体涉及对药食同源植物秋海棠科紫背天葵的叶片组织培养的一步成苗快速繁殖方法。

背景技术

[0002] 紫背天葵fimbristipulata Hance)为秋海棠科秋海棠属肉质草本植物，中国特有物种， 别名丹叶、红天葵、散血子，常见于海拔20(Tl 120 m的沟谷地带、悬崖石缝或疏林下长有苔藓的潮湿岩石上，喜温暖湿凉气候，一般呈簇生或丛生的居群分布，伴生植物有苔藓、小型蕨类、灌木等。紫背天葵在广东的深圳、东莞、肇庆和蕉岭等地均有分布，但以肇庆鼎湖山的紫背天葵最为有名，其模式标本即采自广东鼎湖山。紫背天葵分布虽广，但被限制在特殊的生境中，以云海雾气、烟云缭绕的山谷石壁处生长最佳，种群呈离散性分布，种群数量极易受到环境变化的影响。

[0003] 紫背天葵叶富含花色苷，其味酸涩、性凉，既可入药，亦可作保健饮品，具清热解毒、止渴生津、活血消肿、润燥止咳的功效，全株具有较高的观赏价值和药用保健价值。然而，由于其险峻的适生环境、较低的生物产量，加上长期的破坏性采摘，导致野生资源日益枯竭，现已被《中国的珍稀植物》一书评估为漸危物种的低危等级(Lower Risk, LR)。

[0004] 紫背天葵种子繁殖萌发率极低，通过球茎进行分株繁殖系数较低、难以满足市场的需求。利用组织培养技术是加快紫背天葵大规模繁殖的有效途径。现有文献通常取其无菌苗叶片为外植体，进行胚状体的细胞诱导，或通过愈伤组织的诱导和再分化形成不定芽，或由不定芽、球茎芽或球茎等紫背天葵离体组织或器官分化出丛生芽，然后再转接到生根培养基诱导生根，最后形成完整的植株。再生植株(通常称为瓶苗)仍需要经过炼苗程序后才可移栽，最终形成商品种苗。可见，迄今紫背天葵的快繁技术仍然沿用传统的组织培养方式，要经过初代培养、继代培养、生根培养和炼苗移栽等多个阶段，程序繁琐，费工耗时，存在育苗周期长，种质易产生变异，成本较高等缺点。因此，有必要研究其简便、高效的一步成苗技术。一步成苗法就是外植体在脱分化后，不需要转移到分化培养基上，而是直接在原培养基上再分化，分化的顺序通常是先根后芽，直至形成健壮的全苗。它具有再生周期短，再生频率高，易操作，培养程序简单，不影响增殖率，保持原种特性和便于大规模生产等良好特征。

发明内容

[0005] 本发明目的在于提供一种濒危植物紫背天葵一步成苗快速繁殖技术，达到一次外植体诱导即得到大量商品幼苗的效果。它能够显著简化育苗程序、缩短育苗周期、提高无性繁殖系数、降低了变异频率、而且操作简便，是实现紫背天葵优质种苗工厂化生产的有效途径。同时，可为同类植物的增殖与生根一体化繁殖提供技术依据。

[0006] 本发明所述的一种紫背天葵叶片一步成苗高效离体繁殖方法，包括以下步骤:(I)培养基准备，包括:配制、分装、灭菌；所述培养基的配制是:每升MS基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤即6-BA 0.25~0.5 mg、α -萘乙酸即NAA 0.4~0.8 mg、吲哚丁酸即IBA 0.2 mg、卡拉胶7 g、鹿糖3(T40 g,混合后培养基的pH调节至6.0 ;所述培养基的分装是:将配制后的培养基加热至琼脂完全溶解，趁热均匀地分装于干净的培养瓶中；所述培养基的灭菌是:将加入培养基的培养瓶在121°C、105 Kpa下灭菌15分钟，灭菌后冷却备用；(2)外植体处理和接种，包括:采用紫背天葵无菌苗叶片为外植体，直接进行无菌接种，即在无菌条件下，将组织培养无菌苗置于无菌工作台上切取叶片，将叶片接种于准备好的培养基上，无菌密封瓶口 ；(3)培养，包括:将接好种的培养瓶移入培养室进行幼苗的诱导与培养，形成健壮的紫背天葵再生苗丛，用于开瓶移栽；(4)再生植株移栽:不经炼苗，将步骤(3)得到的再生植株直接开瓶移栽至适宜的条件培养。

[0007] 根据本发明所述的方法的进一步特征，所述步骤(1)中，所述培养基为:每升MS基本培养基中添加6-BA 0.25~0.5 mg、NAA 0.4~0.8 mg、IBA 0.2 mg、卡拉胶7g、鹿糖30~40g。

[0008] 根据本发明所述的方法的进一步特征，所述步骤(2)中，采用叶径为0.8~1.5 cm的紫背天葵无菌苗叶片为外植体，直接进行无菌接种。

[0009] 根据本发明所述的方法的进一步特征，所述步骤(3)中，幼苗的培养条件为:温度为25 + 1 °C，光照强度为8~10 μ mol.m^2.s—1，光照时间为每天10小时，培养时间为70~80天。培养期间勤检查，发现污染苗及时去除。 [0010] 根据本发明所述的方法的进一步特征，所述步骤(3)中，所述苗丛开瓶移栽前，以15 μ mol.m-2.s_1光照强度加强光照10天。

[0011] 根据本发明所述的方法的进一步特征，所述步骤(4)中，簇生的组织培养苗直接或分散为带有3飞个植株的丛苗形式进行移栽。

[0012] 根据本发明所述的方法的进一步特征，所述步骤(4)中，移栽基质采用完全泥炭土，调苄基质的pH缓冲范围在4.0-4.5之间。

[0013] 根据本发明所述的方法的进一步特征，所述步骤(4)中，移栽基质采用泥炭土:珍珠岩为3:1 C V/V)的混合基质，调苄基质的pH缓冲范围在4.0-4.5之间。

[0014] 根据本发明所述的方法的进一步特征，所述步骤(4)中，移栽后的培养条件为:白天温度为25 V，晚上温度为22°C，也就是25°C /22°C (光/暗)；相对湿度为90%，光照强度15-18 μ mol.m-2.s'光照时间为每天12小时。

[0015] 根据本发明所述的方法的进一步特征，所述步骤(4)中，移栽后的培养液为自来水或者1/4 MS培养液。

[0016] 实验表明，上述移栽符合野生紫背天葵居群丛生的特性，种苗生长较快，35天后幼苗的成活率达到100%，且长势茁壮，因而人工培养的紫背天葵较好保持原种特征。

[0017] 本发明具有如下的优点和效果:

[0018] 1、经实验证明，在本发明所述方法中，采用MS+0.25、.5 mg/L 6-BA+0.4^0.8 mg/LΝΑΑ+0.2 mg/L IBA+30^40 g/L蔗糖+7 g/L卡拉胶作为紫背天葵一步成苗的诱导培养，外植体诱导为丛芽的发生率达到100%，单个外植体平均成苗数25~30株，组织培养苗生长良好，基本保持原种特性，品质地道。

[0019] 2、经实验证明，在本发明所述方法中，采用紫背天葵无菌苗叶片作为外植体，外植体的成活率达到100% (污染率为零)，诱导率为93.7%以上，每个外植体都可以直接诱导并分化出多个不定芽点。[0020] 3、经实验证明，在本发明所述方法中，外植体优选培养条件中，以光照强度10μ mol.m-2 «s—1，培养时间为7(T80 d，丛苗的生长质量状况最佳，单株叶数3飞片，球茎直径约1.7~3.5 mm,苗丛根系长度为2.0~3.8 cm,苗高2.5~3.3 cm。组织培养苗开瓶移栽前，适度加强光照(约15 μ mol.m_2.s—1) 10天左右，苗丛生长更为健壮。

[0021] 4、经实验证明，在本发明所述方法中，不经炼苗，簇生的组织培养苗可直接或分散移栽，移栽的成活率达到90%以上，其中，将簇生的组织培养苗分散为带有3飞个球茎的丛芽形式，移栽到[泥炭土:珍珠岩=3:1 (V/m的混合基质中培养，35天后丛苗的成活率达到100%，且长势茁壮。

[0022] 5、与现有的繁殖技术相比，本发明所述技术方法极显著简化了紫背天葵育苗程序，缩短育苗周期，提高无性繁殖系数，保持原种特性，培养程序简单，达到一次外植体诱导即获得大量商品幼苗的效果，是实现濒危植物紫背天葵优质种苗工厂化生产的有效途径。

[0023] 6、本发明所述方法无需专有设备，克服外植 体的细菌污染对育苗造成的影响，操作简便。

[0024] 综上所述，本发明以紫背天葵叶片为材料，研究不同生长调节剂组合配方对紫背天葵一步成苗的影响，通过筛选培养基组分，优化培养条件，简化组织培养技术流程，探索出不经过传统组织培养多环节交替接续程序的一步成苗快繁方法，建立了濒危药食同源植物秋海棠科紫背天葵离体快繁的高效、简便、稳定的实用技术体系，达到一次接种则培育成健壮全苗，并显著提高无性繁殖系数，可直接应用于紫背天葵商品种苗的工厂化生产。

具体实施方式

[0025] 材料及试剂

[0026] 材料:紫背天葵无菌苗来源于广东省鼎湖山国家级自然保护区天溪片区，为道地野生种源，经初代培养后取其无菌叶片作为外植体。

[0027] 试剂:6-BA (6-苄氨基腺嘌呤，纯度≥98%，水分≤0.5%)、NAA (萘乙酸，纯度99.9%),IBA (吲哚丁酸，纯度99.9%)以及配制MS培养基的其他试剂(分析纯AR)，均从上海山浦化工有限公司购买。

[0028] 仪器及培养条件

[0029] 上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产的YXQ-LS-75SII型立式压力蒸汽灭菌器，供培养基灭菌之用；苏州净化设备有限公司生产的SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台，供材料转接之用。转接后均置于温度(25±1)°C，相对湿度65~70%，光照强度8~10μ mol.m_2.s—1的培养室中培养,光照时间每天10 h。

[0030] 实施例1:

[0031 ] (I)培养基的配制:以MS为基本培养基，每升添加6-BA 0.25 mg,NAA 0.4 mg和IBA

0.2 mg、卡拉胶7 g、鹿糖30 g,混合后培养基的pH调节至6.0 ;每瓶分装约30 mL,置于灭菌条件设为:121°C、105 Kpa的高压灭菌锅内灭菌15分钟，取出培养瓶，冷却备用；

[0032] (2)外植体处理和接种:按常规接种方式，切取叶径约为0.8^1.5 cm的紫背天葵无菌苗叶片为外植体，将叶片直接接种于上述的培养基(MS+0.25 mg/L 6-BA+0.4 mg/LΝΑΑ+0.2 mg/L IBA+30 g/L蔗糖+7 g/L卡拉胶)中，每瓶接种2个外植体，无菌密封瓶口 ；

[0033] (3)培养:将接种后的培养瓶移入培养室进行培养，培养条件为:温度25±1 °C，空气相对湿度65~70%,光照强度8~10 μ mol.m-2 光照时间10 h/天。培养15天后,外植体的成活率100%，叶片膨大，叶缘上翘，出现淡黄色透明的愈伤细胞(或组织)，诱导率93%。然后叶缘愈伤组织表层细胞或叶片表面细胞分化出密集的芽点，芽点渐渐增大形成绿色的球状体，并有叶芽结构，分化率为100%。培养35天后，部分芽点形成密集的不定芽丛生状态，外植体叶片转变为块状的芽丛，芽丛高度约0-6 mm,芽丛分化率100%。培养50天后，苗丛开始形成，基部有淡白色鱼卵状球茎形成，叶细小，颜色黄绿。培养65天后，苗丛基本形成，黄绿色，球茎基本显现并增大，部分未转化为幼苗的芽丛组织黄化或枯萎，成苗率为75%。培养80天，即可获得簇生的无菌苗，再生植株形态结构完整。此时开瓶定苗，每个外植体诱导苗数大于20株，苗 丛平均高度2.33 cm,球茎直径范围1.7~3.0 mm,生根率100%，根长2.0-4.0cm，苗丛根系质量中等。

[0034] (4)组织培养苗移栽:瓶苗经适度加强光照(约15 μ mol.m-2 μ—1)培养10天左右，不经炼苗，将簇生的紫背天葵组织培养苗取出，流水清洗除去培养基后，直接移栽到泥炭土3:珍珠岩I (Κ/Κ)的混合基质中，置于温度为25°C /22°C (光/暗)，相对湿度为90%，光照强度15-18 μ mol.m_2.s—1的生长条件下进行人工培养，用自来水或者1/4MS培养液浇灌。35天后组织培养苗成活率为90%，生长较好。

[0035] 实施例2:

[0036] 其它操作同实施例1，所不同的是:步骤((I)中，培养基的配方为(MS+0.25 mg/L6-BA+0.6 mg/L ΝΑΑ+0.2 mg/L IBA+30 g/L 蔗糖 +7 g/L 卡拉胶);步骤((3)中，培养 15 天后，外植体的成活率100%，叶片明显膨大，叶缘上翘，愈伤细胞(或组织)的诱导率100%。培养35天后，外植体叶片转变为块状芽丛，分化率为100%，芽丛高度约0-7 mm，芽丛生长速度较快，并有少量完整叶片形成。同时，芽丛组织内侧发出白色绒毛状物，随后绒毛状物迅速生长为密被白色绒毛的细根，根组织比较丰富。培养45天后，苗丛开始形成，基部有球茎显现，叶片细小、展开，嫩绿色。培养65天后，苗丛形成，长势较好，部分未转化为幼苗的芽丛组织黄化或枯萎，成苗率为85%。培养75天左右，即可获得健壮簇生的无菌苗，再生植株形态结构完整。此时开瓶定苗，每个外植体诱导苗数大于25株，苗丛平均高度2.63 cm，球茎直径范围2.0-3.0 mm,表面有红褐色细胞层覆盖物，生根率100%，根长3.0-4.0 cm,苗丛根系密集、质量较好。步骤((4)中，不经炼苗，栽培基质为泥炭土 3:珍珠岩1(K/K)的混合基质，35天后幼苗生长状况良好，成活率100%。

[0037] 实施例3:

[0038] 其它操作同实施例2，所不同的是:步骤((I)中，培养基的配方为(MS+0.25 mg/L6-BA+0.8 mg/L ΝΑΑ+0.2 mg/L IBA+30 g/L 蔗糖 +7 g/L 卡拉胶);步骤((3)中，培养 15 天后，外植体的成活率100%，叶片显著膨大拱起，叶缘上翘，愈伤组织诱导率100%。培养35天后，外植体叶片已迅速转变为块状芽丛，分化率为100%，芽丛高度约tTl mm，芽丛生长旺盛，并有大量完整叶片形成。同时，芽丛基部有大量白色绒毛状细根生成，根系丰富。培养40天后，苗丛开始形成，基部球茎明显，叶片伸展，绿色。培养65天后，苗丛形成，长势旺盛，丛苗高度超过3.5 cm，成苗率为100%。培养70天左右，即可获得健壮簇生的无菌苗，再生植株形态结构完整健壮。此时开瓶定苗，每个外植体诱导苗数大于30株，苗丛平均高度3.55 cm,球茎直径范围2.0-3.5 mm，表面有红褐色细胞层覆盖物，生根率100%，根长2.5^3.5 cm，根系密集成丛，质量最优。步骤((4)中，35天后幼苗成活率100%，苗况茁壮。[0039] 实施例4:

[0040] 其它操作同实施例1，所不同的是:步骤((I)中，培养基的配方为(MS+ 0.5 mg/L6-BA+0.4 mg/L ΝΑΑ+0.2 mg/L IBA+30 g/L 蔗糖 +7 g/L 卡拉胶)；步骤((3)中，培养 15 天后，外植体的成活率100%，叶片膨大，叶缘上翘，出现淡黄色透明的愈伤细胞(或组织)，诱导率100%。培养35天后，外植体叶片转变为块状芽丛，分化率为100%，芽丛高度约0-3.5 mm，芽丛生长速度较慢。培养65天后，苗丛开始形成，矮小，大部分为皱褶的嫩叶，少量叶片展开，为嫩黄色不完全成熟的苗丛，成苗率为45%，部分未转化为幼苗的芽丛组织黄化并枯萎。此时，苗丛组织内侧发出白色绒毛状细根，不定根较多。培养80天左右，可获得簇生的无菌苗，再生植株形态结构基本完整。此时开瓶定苗，每个外植体诱导幼苗数大于12株，苗丛平均高度1.58 cm，球茎较小，直径范围1.2~2.5 mm，生根率90%，根长1.2~3.0 cm，苗丛根系稀疏。步骤((4)中，35天后组织培养苗成活率为80%，生长正常。

[0041] 实施例5: [0042] 其它操作同实施例4，所不同的是:步骤((I)中，培养基的配方为(MS+ 0.5 mg/L6-BA+0.6 mg/L ΝΑΑ+0.2 mg/L IBA+30 g/L 蔗糖 +7 g/L 卡拉胶);步骤((3 )中，培养 15 天后，外植体的成活率100%，诱导率100%。培养35天后，外植体叶片分化为块状芽丛，分化率100%，芽丛高度约0-4.0 mm，芽丛生长速度较慢。培养65天后，苗丛开始形成，矮小较弱，大部分为皱褶的嫩叶，少量叶片展开，为嫩黄色不完全成熟的苗丛，成苗率为57%，部分未转化为幼苗的芽丛组织黄化并枯萎。此时，苗丛组织内侧仅发出少量白色绒毛状细根。培养80天左右，可获得簇生的无菌苗，再生植株形态结构基本完整。此时开瓶定苗，每个外植体诱导幼苗数大于18株，苗丛平均高度1.56 cm，球茎较小，直径范围1.2~3.0 mm，生根率60%，根长

1.2~2.2 cm，苗丛根数较少。步骤((4)中，35天后组织培养苗成活率为60%，生长基本正常。

[0043] 实施例6:

[0044] 其它操作同实施例1或例2，所不同的是:步骤((I)中，培养基蔗糖为40 g/L ;步骤((3)中，培养15天后，外植体的成活率100%，诱导率100%。培养30天后，芽丛分化率为100%,丛芽高度约(Te.0 mm,生长速度较快。培养45天后，苗丛开始形成，基部有球茎显现，叶片展开、表面有明显白色小斑点，叶背面淡红色。培养65天后，苗丛形成，长势较好，成苗率为90%以上。培养75天左右，即可获得健壮簇生的无菌苗，再生植株形态结构完整，原种特征明显。步骤((4)中，不经炼苗，栽培基质为完全泥炭土或泥炭土 3:珍珠岩1(K/K)的混合基质均可，35天后幼苗长势良好道地，成活率100%。

[0045] 实施例7:

[0046] 其它操作同实施例3，所不同的是:步骤((I)中，培养基的配方为(MS+0.25 mg/L6-BA+0.8 mg/L ΝΑΑ+0.2 mg/L IBA+40 g/L 蔗糖 +7 g/L 卡拉胶);步骤((3)中，培养 15 天后，外植体的成活率100%，愈伤组织诱导率100%。培养30天后，芽丛分化率100%，芽丛高度约3~7mm。同时，芽丛基部有大量白色绒毛状细根生成，根系丰富。培养40天后，苗丛开始形成，基部球茎明显。培养65天后，苗丛长势旺盛，高度超过4.0 cm,叶片伸展，表面有明显白色小斑点，叶背面淡红色，球茎表面有红褐色细胞层覆盖物，成苗率为100%。培养70天左右，即可获得健壮簇生的无菌苗，原种特征明显。此时开瓶定苗，每个外植体诱导苗数大于30株，苗丛平均高度3.8 cm,球茎直径范围2.5~3.7 mm,生根率100%,根长2.7~3.5 cm,根系丰富。步骤((4)中，不经炼苗，栽培基质为完全泥炭土或泥炭土 3:珍珠岩1(K/K)的混合基质均可，35天后幼苗良好，基本保持原种特性，品质道地。

[0047] 实施例8:

[0048] 其它操作同实施例4或例5，所不同的是:步骤((I)中，培养基蔗糖为40 g/L ;步骤((3)中，培养15天后，外植体的成活率100%，诱导率95%。培养35天后，外植体叶片分化为块状芽丛，分化率100%，芽丛高度约0-4.0 mm,芽丛生长速度较慢。培养65天后，苗丛开始形成，矮小，大部分为皱褶的嫩叶，少量叶片展开，表面有白色小斑点，成苗率为50%。培养80天左右，可获得簇生的淡红色组培苗，再生植株形态结构基本完整。步骤((4)中，栽培于完全泥炭土或泥炭土 3:珍珠岩1(K/K)的混合基质，35天后组织培养苗成活率为70%，生长正常。

[0049] 实施例9:

[0050] 其它操作同实施例1、2、3、4和5，所不同的是:步骤((4)中，瓶苗经适度加强光照(约15 μ mol.m_2.s—1)培养10天左右，不经炼苗，将簇生的紫背天葵组织培养苗取出，流水清洗除去培养基后，直接移栽到完全泥炭土基质中，置于温度为25°C /22°C (光/暗)，相对湿度为90%，光照强度15-1 8 μ mol.m_2.s—1的生长条件下进行人工培养，平常用自来水或者1/4MS培养液浇灌。35天后组织培养苗成活率为80-100%以上，生长正常。

Claims (7)

1.一种紫背天葵叶片一步成苗离体繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)培养基准备，包括:配制、分装、灭菌； 所述培养基的配制是:每升MS基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤即6-BA 0.25、.5 mg、α -萘乙酸即NAA 0.4~0.8 mg、吲哚丁酸即IBA 0.2 mg、卡拉胶7 g、蔗糖30~40 g，混合后培养基的pH调节至6.0 ; 所述培养基的分装是:将配制后的培养基加热至卡拉胶完全溶解，趁热均匀地分装于干净的培养瓶中； 所述培养基的灭菌是:将加入培养基的培养瓶在121°C、105 Kpa下灭菌15分钟，灭菌后冷却备用； (2)外植体处理和接种，包括:采用紫背天葵无菌苗叶片为外植体，直接进行无菌接种，即在无菌条件下，将组织培养无菌苗置于无菌工作台上切取叶片，将叶片接种于准备好的培养基上，无菌密封瓶口 ； (3)培养，包括:将接好种的培养瓶移入培养室进行幼苗的诱导与培养，形成健壮的紫背天葵再生苗丛，用于开瓶移栽；从外植体培养为幼苗的培养条件为:温度为25±1 °C，光照强度为8~10 μ mol.m_2.s—1，光照时间为每天10小时，培养时间为70~80天； (4)再生植株移栽:不经炼苗，将步骤(3)得到的再生植株直接开瓶移栽至适宜的条件培养；移栽后的培养条件为:白天温度为25°C，晚上温度为22°C，相对湿度为90%，光照强度15-18 μ mol.m-2.s'光照时间为每天12小时。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤(2)中，采用叶径为0.8^1.5 cm的紫背天葵无菌苗叶片为外植体，直接进行无菌接种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤(3)中，所述苗丛开瓶移栽前，以15 μ mol.m-2.s_1光照强度加强光照10天。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤(4)中，簇生的组织培养苗直接或分散为带有3飞个植株的丛苗形式进行移栽。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤(4)中，移栽基质采用泥炭土，调苄基质的pH缓冲范围在4.0-4.5之间。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤(4)中，移栽基质采用泥炭土:珍珠岩为3:1 C V/V)的混合基质，调苄基质的pH缓冲范围在4.0-4.5之间。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，移栽后的培养液为自来水或者1/4 MS培养液。