CN113597917A - 一种稻曲病菌人工接种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种稻曲病菌人工接种方法，包含以下步骤：1)采集发病稻田稻曲球，分离纯化并通过液体培养得到菌丝+分生孢子混合液作为接种体备用；2)将水稻按常规播种时间往后推迟15天播种，移栽至水泥槽中；3)接种时间选择破口前3‑5天的傍晚进行，用手持喷雾器将接种混体进行喷雾接种，保证喷雾均匀，连续喷2天；4)接种后的植株用黑布遮阴2天，接种当晚不进行喷水保湿，次日开始定时喷雾保湿，2天后取下黑布正常光照，继续保持90％相对湿度直至破口后3天。本发明通过调节水稻播种时间，稳定诱发稻曲病，使发病率达80％以上；成本低、工作量较小、操作简便、结果可靠，对水稻发育影响小，适合批量的水稻品种稻曲病抗性鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和农业种植领域，具体为一种稻曲病菌人工接种方法。
背景技术
水稻稻曲病是由稻曲病菌引起的一种穗部真菌病害，近些年随着我国，不仅对水稻产量造成损失，而且可产生真菌毒素，威胁人畜健康，由于近些年耕作制度的变化和杂交水稻推广面积的不断增加，稻曲病逐渐上升为主要病害。2019年，嘉兴发病最重的田块病穗率接近60％，产量损失约30％，选育抗病品种是目前最有效的解决方法，然而由于稻曲病只在穗部发病，且发病条件相对苛刻。
目前室内人工注射接种可以较好的控制发病条件(申请号201110028735.1)，但设备成本高且耗时耗力，不适合大批量种质抗病筛选。另有专利公开了一种通过田间撒施菌土(申请号201910776427.3)或稻曲球厚垣孢子喷雾(申请号201510836639.8)等进行稻曲病抗病测定的方法，该方法虽然可进行大批量抗性测定，但是发病率普遍较低，而且不同品种破口期不同，田间气候多变，发病率和抗性不一定完全相关。因此建立一套接种便利、结果高效稳定的稻曲病接种方法仍是现金稻曲病研究的重要任务。
发明内容
针对上述存在的技术不足，本发明的目的是提供一种稻曲病菌人工接种方法，进行批量的水稻材料的稻曲病抗性测定，解决了目前室内人工注射接种成本高、费时费力的问题，同时避免了大田接种发病率过低的问题。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种稻曲病菌人工接种方法，包含以下步骤：
1)采集发病稻田稻曲球，分离纯化，并通过液体培养得到菌丝+分生孢子混合液，作为接种体备用；
2)将水稻按常规播种时间往后推迟15天播种，苗期进行常规水肥管理，移栽至水泥槽中，移栽前施三元复合肥20kg/667㎡、尿素10kg/667㎡，分蘖初期施肥磷肥15kg/667㎡、尿素10kg/667㎡，孕穗初期施肥钾肥5kg/667㎡、尿素10kg/667㎡；
3)接种时间选择破口前3-5天的傍晚进行，用1L的手持喷雾器将接种混体进行喷雾接种，保证喷雾均匀，连续喷2天；
4)接种后的植株用黑布遮阴2天，接种当晚不进行喷水保湿，次日开始定时喷雾保湿，保持相对湿度在95％以上，2天后取下黑布正常光照，继续保持90％相对湿度直至破口后3天，保持温度在24-32℃，温度过高时用遮阳网进行遮阳；
5)水稻黄熟期，稻曲病发病稳定，割下所有稻穗，统计接种穗发病率和病穗平均病粒数，调查发病情况。
优选的，所述步骤1)中分离纯化得到菌丝+分生孢子混合液，具体步骤如下：将新鲜稻曲球用75％酒精消毒15s，再经5％次氯酸钠表面杀菌4min后，用无菌水漂洗3-4次；用灭菌滤纸将稻曲球表面水分吸干，切除外层组织，将内层白色菌丝置于PSA培养基上培养，28℃黑暗条件下培养9-11天，边缘长出新的白色菌丝，取边缘菌丝块置于PSB培养基，放入摇床，采用160rpm转速、28℃培养5-7天，得到孢子和菌丝混合液，将该混合液用4层灭菌纱布过滤掉菌丝获得分生孢子悬浮液，将分生孢子液适当稀释后，涂布在水琼脂平板上，显微镜下挑单孢置于新鲜的PSA培养基培养，即得到纯化的稻曲病菌株；稻曲病菌在PSA培养基上培养7-10天后，从菌落边缘取直径5mm的菌饼置于100ml PSB培养基，于摇床28℃、160rpm震荡培养5天，获得菌丝+孢子混合液；用便携式榨汁机处理40s，将混合液打碎成菌丝段+孢子混合液，加PSB培养基稀释调节浓度至显微镜400倍镜下能视野中看到45-55个孢子，作为接种体备用。
优选的，所述步骤2)中的水泥槽，长8米、宽1米、高0.8米，所述水泥槽顶部2米高处搭建设置遮阳网架；所述水泥槽上连接自来水管，水龙头安装电磁阀和定时器。
优选的，所述步骤4)中的定时喷雾，为早上6点开始定时喷雾保湿，白天2小时喷一次，晚上4小时喷一次，每次喷15分钟，阴雨天无需喷水。
优选的，所述步骤5)中，调查时排除无效穗，统计发病穗数和病例数，计算发病率及病情指数。
本发明的有益效果在于：本发明通过调节水稻播种时间，准确把握接种时间、合理控制接种条件，稳定诱发稻曲病，使发病率达80％以上；成本低、工作量较小、操作简便、结果可靠，对水稻发育影响小，适合批量的水稻品种稻曲病抗性鉴定。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1，采用如下方法人工诱发水稻稻曲病：
1)采集发病稻田稻曲球，分离纯化得到菌丝+分生孢子混合液，作为接种体备用；
2)将水稻按常规播种时间往后推迟15天播种，苗期进行常规水肥管理，移栽至水泥槽中，移栽前施三元复合肥20kg/667㎡、尿素10kg/667㎡，分蘖初期施肥磷肥15kg/667㎡、尿素10kg/667㎡，孕穗初期施肥钾肥5kg/667㎡、尿素10kg/667㎡；
3)接种时间选择破口前3-5天的傍晚进行，用1L的手持喷雾器将接种混合液进行喷雾接种，保证喷雾均匀，连续喷2天；
4)接种后的植株用黑布遮阴2天，接种当晚不进行喷水保湿，以免影响孢子附着，次日开始定时喷雾保湿，保持相对湿度在95％以上，2天后取下黑布正常光照，继续保持90％相对湿度直至破口后3天，保持温度在24-32℃，温度过高时用遮阳网进行遮阳。
5)水稻黄熟期，稻曲病发病稳定，割下所有稻穗，去除无效穗，统计接种穗发病率和病穗平均病粒数，调查发病情况。
进一步的，所述步骤1)中分离纯化得到菌丝+分生孢子混合液，具体步骤如下：将新鲜稻曲球用75％酒精消毒15s，再经5％次氯酸钠表面杀菌4min后，用无菌水漂洗3-4次；用灭菌滤纸将稻曲球表面水分吸干，切除外层组织，将内层白色菌丝置于PSA培养基上培养，28℃黑暗条件下培养9-11天，边缘长出新的白色菌丝，取边缘菌丝块置于PSB培养基，放入摇床，采用160rpm转速、28℃培养5-7天，得到孢子和菌丝混合液，将该混合液用4层灭菌纱布过滤掉菌丝获得分生孢子悬浮液，将分生孢子液适当稀释后，涂布在水琼脂平板上，显微镜下挑单孢置于新鲜的PSA培养基培养，即得到纯化的稻曲病菌株；稻曲病菌在PSA培养基上培养7-10天后，从菌落边缘取直径5mm的菌饼置于100ml PSB培养基，于摇床28℃、160rpm震荡培养5天，获得菌丝+孢子混合液；用便携式榨汁机处理40s，将混合液打碎成菌丝段+孢子混合液，加PSB培养基稀释调节浓度至显微镜400倍镜下能视野中看到45-55个孢子，作为接种体备用。
进一步的，所述PSA培养基中含有20％马铃薯、1.5％琼脂粉、2％蔗糖，所述PSB培养基中含有20％马铃薯、2％蔗糖。
进一步的，所述步骤2)中的水泥槽，长8米、宽1米、高0.8米，所述水泥槽顶部2米高处搭建设置遮阳网架；所述水泥槽上连接自来水管，水龙头安装电磁阀和定时器，定时喷雾，方便操作，在水泥槽内接种，方便控制环境条件，且相对于室内接种成本降低。
进一步的，所述步骤4)中的定时喷雾，为早上6点开始定时喷雾保湿，白天2小时喷一次，晚上4小时喷一次，每次喷15分钟，阴雨天无需喷水。
进一步的，水稻发病稳定期，调查发病率和病情指数，计算方法为：病穗率＝(病穗数)/(总穗数)×100％；病情指数＝(1级穗数×1+2级穗数×2+3级穗数×3+4级穗数×4+5级穗数×5)/(总穗数×5)×100
稻曲病的分级标准，参照唐春生(2001)。
0级：无症状
1级：每穗病粒数1个
2级：每穗病粒数2个
3级：每穗病粒数3-5个
4级：每穗病粒数6-9个
5级：每穗病粒数大于或等于10个
对比实验数据
不同接种体对稻曲病发病的影响：
将已获得的菌丝段+孢子混合液经四层纱布过滤，获得分生孢子液。然后将滤液用PSB培养基将孢子悬浮液稀释至显微镜400倍镜下看到45-55个孢子；取20粒上年保存的稻曲球，用粉碎机将稻曲球粉碎30s后，将粉末置于清水浸泡5-8小时，用4层纱布过滤掉谷粒残渣杂质，加水调节浓度至显微镜400倍镜下能视野中看到45-55个孢子，得到稻曲菌厚垣孢子液。
水稻孕穗期第七期末，即破口前3-5天，在下午17时，用1L的手持喷雾器分别将菌丝段+分生孢子混合液、分生孢子液和厚垣孢子液，分别进行喷雾接种，次日相同时间重复接种1次，接种后的植株用黑布遮阴保湿2天，次日早上6点开始定时喷雾，白天1h喷一次，晚上2h喷一次，一次喷15分钟，保持相对湿度在95％以上，2天后取下黑布正常光照，继续喷水保湿，保持90％相对湿度直至破口后3天，保持温度在24-32℃，中午温度高时可用遮阳网遮阴几个小时，如遇阴雨天气则无需喷水。
水稻破口前3-5天，用菌丝段+分生孢子液喷雾接种的病穗率可达81.03％，病情指数为44.14；稻曲病分生孢子液喷雾接种的病穗率和病情指数分别为80.2％和42.3；而稻曲病菌厚垣孢子液接种的病穗率仅为27.52％，病情指数为10.09，结果显示菌丝段+分生孢子液与单独分生孢子液接种发病率均显著高于厚垣孢子液接种，且前两者接种效果差异不显著，见表1，因此选择菌丝段+分生孢子液接种的方式。
表1不同接种体对稻曲病发病的影响
不同接种次数对稻曲病接种效果的影响：
水稻孕穗期第七期，既破口前3-5天，在下午17时，用1L的手持喷雾器将菌丝段+分生孢子混合液进行喷雾接种，接种后的植株用黑布遮阴2天，次日早上6时开始定时喷雾，白天1h喷一次，晚上2h喷一次，一次喷15分钟，保持相对湿度在95％以上，2天后取下黑布正常光照，继续喷水保湿，保持90％相对湿度直至破口后3天，分别设置重复接种1次，2次和3次的试验，对比发病效果；
结果表明，喷雾接种1次的发病率和病情指数分别为43.8％和19.5；喷雾接种2次和3次的发病率和病情指数较为接近，分别为81.03％、44.14和84.2％、45.2，因此为降低成本，选择连续2次接种就达到较为理想的效果。
表2不同接种次数对稻曲病发病的影响
不同接种期对稻曲病接种效果的影响：
分别设置孕穗初期(幼穗长5-10cm)、破口前3-5天(幼穗12-15cm)和齐穗期接种，在下午17时，用1L的手持喷雾器将菌丝段+分生孢子混合液进行喷雾接种，次日相同时间重复接种一次，接种后的植株用黑布遮阴2天，次日早上6时开始定时喷雾保湿，白天1h喷一次，晚上2h喷一次，一次喷15分钟，保持相对湿度在95％以上，2天后取下黑布正常光照，继续喷水保湿，保持90％相对湿度直至破口后3天。
结果显示，接种时期对稻曲病病穗率和病情指数影响很大，破口前3-5天接种效果做好，病穗率为81.03％，病情指数为44.14，见表3。
表3不同接种时期对稻曲病发病的影响
由此可见，在水稻破口前3-5天，使用菌丝段+分生孢子液喷雾接种2次，成本低，接种率高。
本发明通过调节水稻播种时间，准确把握接种时间、合理控制接种条件，稳定诱发稻曲病，使发病率达80％以上；成本低、工作量较小、操作简便、结果可靠，对水稻发育影响小，适合批量的水稻品种稻曲病抗性鉴定。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (5)
1.一种稻曲病菌人工接种方法，其特征在于，包含以下步骤：
1)采集发病稻田稻曲球，分离纯化，并通过液体培养得到菌丝+分生孢子混合液，作为接种体备用；
2)将水稻按常规播种时间往后推迟15天播种，苗期进行常规水肥管理，移栽至水泥槽中，移栽前施三元复合肥20kg/667㎡、尿素10kg/667㎡，分蘖初期施肥磷肥15kg/667㎡、尿素10kg/667㎡，孕穗初期施肥钾肥5kg/667㎡、尿素10kg/667㎡；
3)接种时间选择破口前3-5天的傍晚进行，用1L的手持喷雾器将接种混体进行喷雾接种，保证喷雾均匀，连续喷2天；
4)接种后的植株用黑布遮阴2天，接种当晚不进行喷水保湿，次日开始定时喷雾保湿，保持相对湿度在95％以上，2天后取下黑布正常光照，继续保持90％相对湿度直至破口后3天，保持温度在24-32℃，温度过高时用遮阳网进行遮阳；
5)水稻黄熟期，稻曲病发病稳定，割下所有稻穗，统计接种穗发病率和病穗平均病粒数，调查发病情况。
2.如权利要求1所述的一种稻曲病菌人工接种方法，其特征在于，所述步骤1)中分离纯化得到菌丝+分生孢子混合液，具体步骤如下：将新鲜稻曲球用75％酒精消毒15s，再经5％次氯酸钠表面杀菌4min后，用无菌水漂洗3-4次；用灭菌滤纸将稻曲球表面水分吸干，切除外层组织，将内层白色菌丝置于PSA培养基上培养，28℃黑暗条件下培养9-11天，边缘长出新的白色菌丝，取边缘菌丝块置于PSB培养基，放入摇床，采用160rpm转速、28℃培养5-7天，得到孢子和菌丝混合液，将该混合液用4层灭菌纱布过滤掉菌丝获得分生孢子悬浮液，将分生孢子液适当稀释后，涂布在水琼脂平板上，显微镜下挑单孢置于新鲜的PSA培养基培养，即得到纯化的稻曲病菌株；稻曲病菌在PSA培养基上培养7-10天后，从菌落边缘取直径5mm的菌饼置于100ml PSB培养基，于摇床28℃、160rpm震荡培养5天，获得菌丝+孢子混合液；用便携式榨汁机处理40s，将混合液打碎成菌丝段+孢子混合液，加PSB培养基稀释调节浓度至显微镜400倍镜下能视野中看到45-55个孢子，作为接种体备用。
3.如权利要求1所述的一种稻曲病菌人工接种方法，其特征在于，所述步骤2)中的水泥槽，长8米、宽1米、高0.8米，所述水泥槽顶部2米高处搭建设置遮阳网架；所述水泥槽上连接自来水管，水龙头安装电磁阀和定时器。
4.如权利要求1所述的一种稻曲病菌人工接种方法，其特征在于，所述步骤4)中的定时喷雾，为早上6点开始定时喷雾保湿，白天2小时喷一次，晚上4小时喷一次，每次喷15分钟，阴雨天无需喷水。
5.如权利要求1所述的一种稻曲病菌人工接种方法，其特征在于，所述步骤5)中，调查时排除无效穗，统计发病穗数和病例数，计算发病率及病情指数。
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