CN103289902A

CN103289902A - 一株棘孢木霉及其生物制剂和在防治黄瓜疫霉病中的应用

Info

Publication number: CN103289902A
Application number: CN2013101596065A
Authority: CN
Inventors: 习平根; 姜子德; 袁玉花; 李敏慧; 骆晶晶; 李升浩
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2013-05-02
Filing date: 2013-05-02
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2033-05-02
Also published as: CN103289902B

Abstract

本发明属于生物农药领域，公开了一株棘孢木霉及其生物制剂和在防治黄瓜疫霉病中的应用。将该株棘孢木霉命名为棘孢木霉（Trichoderma asperellum）PD-19，于2013年4月1日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO:M2013113。该菌株由黄瓜根际土壤分离得到，能适应本地的自然环境；对黄瓜疫霉病菌具有强烈的寄生抑制作用，而且来源环保无毒性，对生态环境影响小；培养条件要求低，具有很好的开发应用前景。

Description

一株棘孢木霉及其生物制剂和在防治黄瓜疫霉病中的应用

技术领域

本发明属于生物农药领域，特别涉及一株棘孢木霉及其生物制剂和在防治黄瓜疫霉病中的应用。

背景技术

黄瓜（Cucumis sativas L.）是一种重要的瓜类蔬菜作物，在我国种植广泛，具有极高的经济价值。近年来，随着黄瓜连作和种植面积的扩大，黄瓜疫霉病（Phytophthora melonis Katsura）已成为影响黄瓜生产的限制因子之一。在广东省各市、县（区）调查发现，该病害在全生育期均可发生，为害严重时可导致植株枯死，部分田块发病率高达40%以上，给黄瓜安全生产造成严重威胁。目前，生产上对该病害的控制主要以化学药剂防治为主。

木霉菌（Trichoderma spp.）是一种广谱性的拮抗丝状真菌，有多个木霉种在植物病害生物防治中具有重要的地位。产祝龙等报道了哈茨木霉（T.harzianum）对水稻恶苗病菌的拮抗作用，胡明江等报道了康宁木霉（T.koningii）对大白菜软腐病的防治作用，张海军报道绿色木霉（T.viride）对棉花枯萎病菌有显著的抑菌作用。对于棘孢木霉（Trichoderma asperellum），夏伟等报道了该菌对立枯丝核菌的拮抗机制，Kolombet等报道了该菌对小麦赤霉病的生防作用，庞漫宇等克隆了该菌的木聚糖酶I基因，汤伟等克隆了该菌的几丁质酶基因。Lorito等报道木霉几丁质酶对多种植物病原真菌有拮抗作用，转化到作物中可表现出广谱的抗病性，且其生物防治效果要优于植物、细菌和其他真菌的几丁质酶。

因此，棘孢木霉作为一类重要的自然资源，已引起国内外研究者的广泛关注，具有开发生物农药的潜力。

发明内容

为了克服上述现有技术防治黄瓜疫霉病的缺点与不足，开发棘孢木霉的应用，本发明的首要目的在于提供一株以黄瓜根际微生物为筛选对象，分离得到的对黄瓜疫霉病菌有寄生作用的棘孢木霉，命名为棘孢木霉（Trichodermaasperellum）PD-19，为黄瓜疫霉病的生物防治奠定基础。

本发明另一目的在于提供一种基于上述棘孢木霉制备得到的生物制剂。

本发明再一目的在于提供上述棘孢木霉在防治黄瓜疫霉病中的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

一株棘孢木霉，将其命名为棘孢木霉（Trichoderma asperellum）PD-19，保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC No：M2013113，保藏时间为2013年4月1日。

所述的棘孢木霉在PDA培养基上26～28℃培养，菌落绿色，形成同心环，在同心环上产生稠密的分生孢子，气生菌丝稀少，菌落背面略带浅黄绿色；分生孢子梗形成垫状至球形丛束，初级分枝与主枝呈直角，多数对生，瓶梗瓶状至安瓶状。

一种生物制剂，基于上述棘孢木霉制备得到。

所述的生物制剂由棘孢木霉经液体发酵制备得到，优选包含以下步骤：将棘孢木霉接种至PD液体培养基培养，即可获得生物制剂。

所述PD液体培养基的pH值为7.0。

所述的培养指在26～28℃，摇床震荡速率为180～200rpm下培养2～3d。

上述生物制剂在防治黄瓜疫霉病中的应用。

上述棘孢木霉在防治黄瓜疫霉病中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：

1、本发明得到的棘孢木霉来源于本地黄瓜根际土壤，能适应本地的自然环境；

2、本发明的生物制剂对黄瓜疫霉病菌具有强烈的抑制作用，而且该生物制剂来源环保无毒性，对生态环境影响小；

3、本发明得到的棘孢木霉，培养条件要求低，具有很好的开发应用前景。

附图说明

图1为棘孢木霉在PDA培养基上的单菌落背面图。

图2为棘孢木霉对黄瓜疫霉病菌的抑制作用结果图。

图3为棘孢木霉对黄瓜疫霉病菌的寄生作用测定的结果图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：棘孢木霉的分离、纯化和保藏

（1）PDA培养基的配置：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸0.5h，纱布过滤，再加20g葡萄糖和20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，121℃灭菌20min，分装入培养皿中冷却后贮存备用。

（2）棘孢木霉的分离、纯化：

称取50g新鲜黄瓜根际土样（该土样为患病黄瓜根际土样，取自深圳市郊区）加入盛有450mL0.9wt%生理盐水的1000mL三角瓶中。置摇床振荡20min左右，制备得到稀释倍数为10^-1的土壤稀释液；取1mL10^-1土壤稀释液加入到盛有9mL0.9%生理盐水的试管中，制备得到稀释倍数为10^-2的土壤稀释液；依此类推，将土壤液进行梯度稀释。取100μL稀释液（稀释倍数分别为：10^-1、10^-2和10^-3）涂布在步骤（1）制备得到的PDA培养基上，每个稀释倍数重复3次，26℃培养3d。待长出真菌菌落再挑边缘菌丝进行纯化，获得纯化菌株。

所述纯化所得菌株经ITS序列分析，其序列（如下所示）与GenBank中登陆号为GQ131390.1的Trichoderma asperellum Samuels同源性达99%，证实其分类命名为棘孢木霉（Trichoderma asperellum），命名为棘孢木霉（Trichoderma asperellum）PD-19。序列片段如下：

TCTACCTGATCCGAGGTCACATTTCAGAAAGTTGGGTGTTTTACGGACGTGGACGCGCCGCGCTCCCGGTGCGAGTTGTGCAAACTACTGCGCAGGAGAGGCTGCGGCGAGACCGCCACTGTATTTAGGGGCCGGCACCCGTGTGAGGGGTCCCGATCCCCAACGCCGATCCCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTTGAATTTTTGCTCAGAGCTGTAAAGAAATACGTCCGCGAGGGGACTACAGAAAGAGTTTGGTTGGTTCCTCCGGCGGGCGCCTGGTTCCGGGGCTGCGACGCACCCGGGGCGTGACCCCGCCGAGGCAACAGTTTGGTAACGTTCACATTGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTT。

棘孢木霉在PDA培养基上27℃培养，菌落绿色，形成同心环，在同心环上产生稠密的分生孢子，气生菌丝稀少，菌落背面略带浅黄绿色；分生孢子梗形成垫状至球形丛束，初级分枝与主枝呈直角，多数对生，瓶梗瓶状至安瓶状（见图1）。

（3）棘孢木霉的保藏：将该菌株于2013年4月1日保藏于中国湖北武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2013113。

实施例2：对峙培养法测定棘孢木霉的活性

（1）PDA培养基的制备同实施例1。

（2）PD培养液的制备：称取200g马铃薯切成小块，加水煮沸20～30min，至能被玻璃棒戳破，用八层纱布过滤；滤液加热，加入葡萄糖20g，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000mL，分装于锥形瓶（每瓶100mL培养液），加塞、包扎，121℃灭菌20min，冷却后贮存备用。

（3）棘孢木霉菌饼的制备：将棘孢木霉接种于PDA培养基平板活化培养3d后，用直径5mm的打孔器打孔制成菌饼。

（4）棘孢木霉培养滤液的制备：取3个步骤（3）制备得到的棘孢木霉菌饼接入步骤（2）制备得到的PD培养液锥形瓶中，置于27℃，摇床速率为200rpm下培养6d，将获得的培养液于12,000rpm离心10min，取上清液，再用0.2μm的过滤器滤除菌体，获得培养滤液。

（5）活性测定：

①棘孢木霉对黄瓜疫霉病菌的抑制作用测定：将步骤（3）制得的棘孢木霉菌饼接种到PDA培养基平板的中央，在距该菌饼3cm处接种黄瓜疫霉病菌。用直径5mm的打孔器在PDA培养基上打孔，孔内加入80μL步骤（4）制得的棘孢木霉培养滤液，在距该孔3cm处接种黄瓜疫病菌菌块。结果如图2所示。

②棘孢木霉对黄瓜疫霉病菌的寄生作用的测定：以仅在平板中央接种黄瓜疫霉病菌菌饼为对照，3个重复，25℃恒温培养，当对照菌落直径达到6cm时，测量抑菌带宽度，观察霉菌。结果如图3所示。

结果分析：由图2和图3可知，棘孢木霉对黄瓜疫霉病菌具有明显的抑制作用，且作用表现为寄生关系；而棘孢木霉培养滤液对黄瓜疫霉病菌没有抑制作用。

实施例3：棘孢木霉防治黄瓜疫霉病

（1）PDA培养基的制备同实施例1。PD培养液的制备同实施例2。

（2）棘孢木霉菌饼的制备、黄瓜疫霉病菌培养同实施例2.

（3）棘孢木霉生物制剂的制备：取5个步骤（1）制备得到的菌饼接入含有100mL PD培养液的250mL三角瓶中，置于27℃，200rpm，摇床培养2d，用灭菌水配成浓度为约10⁸个/mL的菌体悬浮液，即得到棘孢木霉菌株PD-19生物制剂。

（4）花盆中装有灭菌土1.3kg，将10mL步骤（3）制得的棘孢木霉生物制剂混土（孢子浓度为1*10⁶个/g土）培养7d，再混入用匀浆机打碎了的半皿黄瓜疫霉病菌（步骤（2）培养得到），放置2d后植入黄瓜苗，跟踪调查防治效果。以加入10mL PD培养液为对照，3个重复，每次重复10株1叶1心的黄瓜幼苗（见表1）。

盆栽试验是在平均温度17.67℃，相对湿度60%的条件下进行的，第4天接有黄瓜疫霉菌的对照开始发病；在对照发病率超过60%的第10天开始调查，结果表明：接种棘孢木霉防治黄瓜疫病的效果可高达75.81%，此时黄瓜疫病的发病率和病情指数均最低，且重复性好；同时，在未混有病原菌的情况下，生防棘孢木霉并不引起黄瓜发病，说明该菌株不是黄瓜的病原菌，可以作为防治黄瓜疫病的田间施用菌株。

表1棘孢木霉对黄瓜疫霉病的生防作用

处理	发病率（%）	病情指数	防病效果（%）
				CK清水对照	0.00±0.00^b	0.00±0.00^b
PD-19	0.00±0.00^b	0.00±0.00^b
				黄瓜疫霉菌	65.48±7.81^a	49.85±8.30^a
PD-19+黄瓜疫霉菌	26.19±1.19^ab	12.06±2.93^ab	75.81±5.87^a

注：CK为清水对照；采用Duncan新复极差法进行方差分析，同组数据里相同字母表示差异不显著（P=0.05）。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一株棘孢木霉，其特征在于，将其命名为棘孢木霉（Trichodermaasperellum）PD-19，保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC No：M2013113，保藏时间为2013年4月1日。

2.根据权利要求1所述的棘孢木霉，其特征在于：所述菌株在PDA培养基上27℃培养，菌落绿色，形成同心环，在同心环上产生稠密的分生孢子，气生菌丝稀少，菌落背面略带浅黄绿色；分生孢子梗形成垫状至球形丛束，初级分枝与主枝呈直角，多数对生，瓶梗瓶状至安瓶状。

3.一种生物制剂，其特征在于：基于权利要求1所述棘孢木霉制备得到。

4.根据权利要求3所述的生物制剂，其特征在于通过包含以下步骤的方法制备得到：将棘孢木霉接种至PD液体培养基培养，获得生物制剂。

5.根据权利要求4所述的生物制剂，其特征在于：所述PD液体培养基的pH值为7.0。

6.根据权利要求4所述的生物制剂，其特征在于：所述的培养指在26～28℃，摇床震荡速率为180～200rpm下培养2～3d。

7.根据权利要求3～6任一项所述的生物制剂在防治黄瓜疫霉病中的应用。

8.权利要求1所述的棘孢木霉在防治黄瓜疫霉病中的应用。