CN104830707A - 一种源于象草的内生鞘氨醇单胞菌及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种源于象草的内生鞘氨醇单胞菌及其用途，具体涉及一种促进杂交狼尾草生长发育功能的植物内生菌鞘氨醇单胞菌的分离、培养方法和用于促进杂交狼尾草苗生长的用途，属于农业应用微生物技术领域；该内生鞘氨醇单胞菌为象草内生菌菌株pp01，分类名为鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas sp. pp01，于2014年7月4号在中国微生物保藏中心保藏，保藏号CGMCC 9414；该菌株是一种优良的植物促生内生菌菌株，具产IAA、固氮、产铁载体等特性，且在植物根部有很好的定殖能力；利用该菌株侵染杂交狼尾草，能显著提高处理植株对盐胁迫的抗性，促进植物生长发育，其地上部鲜重相对未接种的阴性对照组增加101.1％；干重相增加138.6％；植株高度增加42.4％；本发明可用于促进盐碱边际土地植物的生长发育，对于微生物肥料研制，盐碱边际土地资源的利用有重要作用。

Description

一种源于象草的内生鞘氨醇单胞菌及其用途

技术领域

本发明涉及一种源于象草的内生鞘氨醇单胞菌及其用途，具体涉及一种促进杂交狼尾草生长发育功能的植物内生菌鞘氨醇单胞菌的分离、培养方法和用于促进杂交狼尾草苗生长的用途，属于农业应用微生物技术领域。

背景技术：

象草（Pennisetum purpureum schum）及杂交狼尾草作为禾本科多年生C4草本植物，是热带和亚热带地区广泛栽培的一种优质、高产、用途广泛的牧草。近年来，以其生物量大，再生能力强，纤维素、半纤维素含量高，生态适应性强，适应性广及利用年限长等特性，是能源作物的首选资源之一。我国具有大面积的宜能边际性土地，据预测，我国边际性土地的生物质生产潜力超过2亿吨标准煤。因此，在宜能边际性土地种植象草等能源草，开发生物质能源，符合我国“不与粮争地，不与人争粮”的能源发展目标。但是这些区域生产条件较差，缺乏灌溉保障，盐碱危害严重，影响象草、杂交狼尾草的产量。

植物促生内生菌（Plant Growth-Promoting bacteria endophyte, PGPE）是指一类能够定殖在植物体内，并与植物体形成特异的共生关系，并因此对双方都有益处的细菌。它对提高土壤中营养物质的利用率、增强植物对逆境的适应性及耐受性，促进植物的生长发育有重要作用，成为可持续性农业的重要发展方向。植物促生内生菌可以通过固氮作用、分泌植物生长调节物质、合成铁载体及抑制一些疾病的发生等方式促进植物的生长。

虽然现在已经筛选到多种促生长作用的植物内生细菌，主要是来自水稻,玉米,小麦,甘庶，苹果，柑橘，高丛蓝莓，桑葚，杏，它们在正常或胁迫条件下能促进植物健康生长，提高其产量（(1) Kloepper, J.W. 1994. Plant growth promoting bacteria (other systems) . In: Okon, J. (Ed.), Azospirillum/Plant Association. CRC Press, Boca Raton, pp. 137–154.；(2) De Silva, A., Petterson, K., Rothrock, C., Moore, J. Growth promotion of high bush blue berry by fungal and bacterial inoculants.  2000. HortScience 35, 1228–1230.；(3) Sudhakar, P., Chattopadhyay, G.N., Gangwar, S.K., Ghosh, J.K. Effect of foliar application of Azotobacter, Azospirillum and Beijerinckia on leaf yield and quality of mulberry (Morus alba), 2000, J. Agric. Sci. 134, 227–234.；(4) Esitken, A., Karlidag, H., Ercisli, S., Sahin, F. Effects of foliar application of Bacillus substilis Osu-142 on the yield, growth and control of shot-hole disease (Coryneum blight) of apricot, 2002, Gartenbauwissenschaft 67, 139–142.；（5）Esitken, A., Karlidag, H., Ercisli, S., Turan, M., Sahin, F. The effect of spraying a growth promoting bacterium on the yield, growth and nutrient element composition of leaves of apricot（Prunus armeniaca L. cv. Hacihaliloglu）, 2003, Aus. J. Agric. Res. 54, 377–380）。但是没有专门来源于象草的促生内生菌，本发明提供的来源于象草的优良促生内生菌鞘氨醇单胞菌，为更有效地增强象草、杂交狼尾草的抗逆性、提高其在沿海滩涂、盐碱地、贫瘠地等边际性土地的产量提供保障。

发明内容：

    本发明的目的在于提供一种来源于象草的鞘氨醇单胞菌，该菌株能在植物内定殖，并具有分泌IAA、固氮、产铁载体等促生性能，可用于促进盐胁迫下的杂交狼尾草苗生长，有助于促进象草及杂交狼尾草作为能源草在在盐碱性边际土地上的种植。

    为了实现以上目的，本发明提供的技术方案是：

所述的来源于象草的鞘氨醇单胞菌是从象草植株中分离到的一株内生菌，经传统方法鉴定和分子鉴定表明它属于鞘氨醇单胞菌，将其命名为鞘氨醇单胞菌 pp01（Shingomonas sp. pp01），于2014年7月4号在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC 9414。

    本发明的象草内生菌鞘氨醇单胞菌 pp01，是按如下方法从象草中分离培养得到的：

    （1）取自江苏省农科院试验田的象草苏牧2号，取根部经表面消毒杀灭供试材料表面微生物，加适量石英砂研磨，加无菌水混匀，100μL涂布于LB固体培养基上，30℃，培养 48h；

（2）挑取单菌落在LB固体培养基上反复划线纯化，直到得到纯系菌株为止；

（3）将纯系菌株接种于LB液体培养基中，30℃培养18h，取菌液700μL加入质量浓度为50%的甘油300μL，混合后置于-70℃冰柜中冷冻保存；

（4）将所得的纯系菌株，通过侵染杂交狼尾草苗验证其促生长活性后，鉴定，并保存菌种，其中一株分离纯化所得的内生细菌命名为pp01。

本发明的象草内生菌鞘氨醇单胞菌 pp01，具有如下生物学特征：

1.菌落形态特征：在LB固体培养基上生长良好，菌落呈圆形，黄色，全缘，光滑，菌落中心突起脊状；

2.菌体形态特征：杆状，直径0.6~1.6μm，革兰氏阴性；

3.部分生理生化特征：可在LB培养基上良好生长，最适生长温度30℃，最适生长pH 6.0；

4.遗传学特征：根据《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠，蔡妙英，科学出版社，2001），本发明的鞘氨醇单胞菌CGMCC 9414形态特征与鞘氨醇属最接近，该鞘氨醇单胞菌经16S rDNA 通用引物27F和534R进行PCR 扩增部分基因序列（442bp）已向美国国家生物技术信息中心（NCBI）的Genbank基因序列数据库提交，登录号为KM220524。该鞘氨醇单胞菌CGMCC 9414 16S rDNA序列分析表明，与Genbank国际数据库中记录的最相似的菌株Sphingomonas paucimobilis DSM 30198（NR 104893.1）的相似性为98％。因此，该该鞘氨醇单胞菌CGMCC 9414应属于鞘氨醇单胞菌属（Shingomonas sp.）。

本发明的另一目的是提供该鞘氨醇单胞菌的用途。

所述的内生菌用于促进植物的生长，具体操作是：将杂交狼尾草种子消毒，置于1/2 MS 培养基，25℃，暗培养48小时催芽，将催芽后的种子播种于装满蛭石的盆钵中，苗长至10天左右，用pp01发酵原液灌根，侵染3天后，开始并每隔四天浇6㎎/mL盐水，20天后测量苗高并称鲜重。

    所述的内生菌能在植物体内定殖，是按如下方法进行验证：取上述灌根侵染鞘氨醇单胞菌pp01 3天的杂交狼尾草苗的根，经表面消毒，石英砂研磨，加无菌水混匀，100μL涂布于LB固体培养基上，30℃，培养 48h，观察菌落生长情况，并随机挑取3个单克隆，摇菌，经16SrDNA测序对菌株进行分子鉴定，以未侵染的杂交狼尾草苗根作为对照。

本发明对所述鞘氨醇单胞菌CGMCC 9414经分泌植物生长素性能及固氮酶活性、产铁载体等促生性能测定及盆栽实验发现，鞘氨醇单胞菌 （Shingomonas sp.） pp01对杂交狼尾草有较强促生作用，体现在以下几方面：鞘氨醇单胞菌 （Shingomonas sp.） pp01能够分泌植物生长激素吲哚乙酸（IAA），有固氮能力，能够产铁载体；接种验证试验证明灌根处理三天，该鞘氨醇单胞菌pp01就能够在植物体内定殖，侵染效率为11.7cfu/g植物根鲜重；鞘氨醇单胞菌 （Shingomonas sp.） pp01菌株对杂交狼尾草苗灌根处理，植株地上部鲜重质量相对未接种的阴性对照组增加101.1%；干重质量相对未接种的阴性对照组增加138.6%；植株高度相对未接种的阴性对照组增42.4%。这表明鞘氨醇单胞菌 （Shingomonas sp.）pp01较高的促生能力，并能在植物体内定殖，可在植物生长过程中为其体输送必要的生长素，氮、铁等营养元素，增强对盐胁迫抗性能力，促生植物的生长发育，有利于其在农业生产上的应用。

本发明的有益效果：

与现有的技术相比本发明提供的植物促生菌，即鞘氨醇单胞菌pp01来源可靠，是专一地针对象草、杂交狼尾草筛选的促生内生菌菌株；能够分泌吲哚乙酸，并且具有固氮能力，产铁载体的能力，有效改善土壤中有效氮、铁元素的含量，提高土壤的培养条件；本发明对杂交狼尾草有较强的促生作用，分泌吲哚乙酸提高其耐盐能力，促进盐胁迫下植株的生长；固氮、产铁载体作用能促进植株对于氮、铁等微量元素的吸收；本发明对提高盐胁迫下杂交狼尾草地上部鲜重、干重、株高有特别显著的效果，为开发相关生物肥料奠定了基础，对提高杂交狼尾草在盐碱滩涂等边际土地的生物质产量有良好的应用前景。

附图说明

图1氨醇单胞菌 （Shingomonas sp.）pp01促生性能，其中 a:分泌植物生长素IAA ；b：产铁载体能力；c:固氮能力；

图2为蛭石盆栽的杂交狼尾草幼苗。其中CK表示以无菌水代替鞘氨醇单胞菌 （Shingomonas sp.）pp01菌液的阴性对照；

图3氨醇单胞菌 （Shingomonas sp.）pp01对盐胁迫下杂交狼尾草苗株高（㎝）的影响；

图4氨醇单胞菌 （Shingomonas sp.）pp01对盐胁迫下杂交狼尾草苗鲜重（g）的影响；

图5氨醇单胞菌 （Shingomonas sp.）pp01对盐胁迫下杂交狼尾草苗干重（g）的影响。

具体实施方式

 下面结合具体实施例对本发明进一步的阐述，以更好的理解本发明的内容。

实施例1：

鞘氨醇单胞菌pp01菌株的分离培养：

    本实施方式中促生植物内生鞘氨醇单胞菌pp01是从象草的根中分离到的，象草取自江苏省农科院试验田的象草苏牧2号，其分离方法如下：

（1）将象草根部用流水冲洗干净，取1g作为供试材料，依次用质量浓度为70%的酒精5分钟，无菌水冲洗3-5次，质量浓度为1%的次氯酸钠浸泡20min，杀灭供试材料表面微生物；

（2）在无菌环境中，供试材料用无菌水冲洗3次，取100μL最后1次无菌水冲洗液涂布于LB固体培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L）上培养48h，观察有无菌落产生；

（3）向供试材料加适量石英砂研磨，加5mL无菌水混匀，取100μL涂布于LB固体培养基上，30℃，培养 48h，挑取单菌落在LB固体培养基上反复划线纯化，直到得到纯系菌株为止；

（4）将纯系菌株接种于LB液体培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L）中，30℃培养18h，取菌液700μL加入质量浓度为50%的甘油300μL，混合后置于-70℃冰柜中冷冻保存；将其中一株分离纯化所得的内生细菌命名为pp01；

其中步骤2目的是验证供试材料表面微生物是否能全部杀死，若有菌落产生，则证明材料表面微生物没有全部杀死，反之则无。

经上述方法筛选的菌株，用通用引物27F和534R PCR 扩增16S rDNA基因序列，产物送生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果在Genbank国际数据库中blast分析，与Sphingomonas paucimobilis DSM 30198（NR 104893.1）的相似性为98％。结合该菌的菌落特征，将该鞘氨醇单胞菌CGMCC 9414鉴定为鞘氨醇单胞菌属（Shingomonassp.），于2014年7月4号在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC 9414。

实施例2 ：

鞘氨醇单胞菌pp01的培养制种方法，按照以下步骤进行：

取-70℃冷冻保存的鞘氨醇单胞菌CGMCC 9414菌液，划线接种于LB固体培养基上，30℃恒温箱中培养1820h，挑取单菌落接种于5mL的LB液体培养基中，30℃震荡培养1820h，得活化菌液；

将1mL活化菌液接种于装有100mL LB液体培养基的500mL三角瓶中，30℃，150250r/min振荡培养12h16h，得到OD约为2的处于对数生长期的发酵液；

实施例3：

鞘氨醇单胞菌 pp01促生性能的检测

   1. 分泌植物生长激素（IAA）性能检测

    根据参考文献（Sheng XF,Xia JJ, Liang CY, He LY, Qian M. Characterization of heavy metal-resistant endophytic bacteria from rape (Brassica napus) roots and their potential in promoting the growth and lead accumulation of rape, 2008, Envrionmental pollution, 156:1164~1170）所述的 Salkowski 比色法测定鞘氨醇单胞菌pp01分泌植物生长激素（IAA）性能。

    将活化的鞘氨醇单胞菌（Shingomonassp.）pp01菌液接种于终浓度为0.5mg/mL的SMS培养基中，30℃摇床，180rpm 震荡培养4d。取1mL菌悬液（发酵液）加入2mL的Salkowski’s显色剂（50mL35%HC104+lmL 0.5M FeCl3）充分混合，在室温下反应20min，出现粉红色的为阳性，说明此菌株能够产生IAA，而且红色越深说明产IAA的能力越强。将加入1mL 50mg/L IAA的比色液作为对照。实验设三次重复。

    SMS培养基配方为：蔗糖10g、（NH4）2SO4 1g、K2HPO4 2g、MgSO4 0.5g、NaCl 0.1g、酵母粉0.5g、CaCO3 0.5g，调节pH为7.2。

    Salkowski’s显色剂：250ml去离子水、150ml浓硫酸、7.5ml 0.5mol/L的FeCl3H2O。

    结果显示，在鞘氨醇单胞菌（Shingomonassp.）pp01菌悬液滴加Salkowski比色液后，菌液颜色变红，表明鞘氨醇单胞菌（Shingomonassp.）pp01能够分泌植物生长激素（IAA）（图1 a）。

产铁载体能力检测

根据参考文献（Vendan, Regupathy Thamizh; Yu, Young Joon; Lee, Sun Hee; Rhee, Young Ha. Isolation and characterization of plant growth promoting endophytic diazotrophic bacteria from  Korean rice cultivars. The Journal of Microbiology 48.5,(Oct 2010) : 559-65）所述：将四种溶液混合均匀后，制成铁载体检测平板。将活化的菌种点接在铁载体检测培养基上，在30℃下倒置培养，观察平板上的颜色变化，若平板上菌落周围产生了橙色圈就证明产生了铁载体。四种溶液的配方为：

溶液一：60.5 mg CAS 溶解于50 mL 水，10 mL 三价铁溶液（1mM FeCl36H2O，10 mM HCl），两者混合均匀，将72.9 mg HDTMA（十六烷基三甲基溴化铵）溶解于40 mL水中，然后缓慢搅拌加入以上混合溶液中，将上述深蓝色混合溶液在121℃下高压蒸汽灭菌20min，冷却至50℃。

溶液二：将0.3 g KH2PO4，0.5 gNaCl及1.0 g NH4Cl溶解于750mL水中，再加入30.24 g PIPES（哌嗪-1,4-二乙磺酸）于以上盐溶液中，用50% （w/w） KOH 溶液调节pH至6.8，加入15g琼脂粉，在121℃下高压蒸汽灭菌20min，冷却至50℃。

溶液三：100mL 15× KB培养基（蛋白胨3.2g，K2HPO4 0.115g，MgSO4·7H2O 0.15 g，丙三醇1.5g）与70mL含有2 g葡萄糖、2 g甘露醇、439 mg MgSO47H2O、11 mg CaCl2、1.17mg MnSO4H2O、1.4mg H3BO3、0.04mg CuSO45H2O、1.2mg ZnSO47H2O、1.0mg Na2MoO42H2O的溶液混合，在121℃下高压蒸汽灭菌20min，冷却至50℃。

溶液四：30mL 10%的酪蛋白氨基酸溶液，过滤除菌。

结果显示，鞘氨醇单胞菌（Shingomonas sp.）pp01平板上的菌落周围能产生较明显的橙色圈，证明该菌能够分泌铁载体，促进植物对铁的吸收（图1 b）。

固氮能力检测

    根据参考文献（张振粉，牧草内生枯草芽孢杆菌的功能多样性及16S rDNA鉴定[D], 2010, 兰州,甘肃农业大学）所述，用阿须贝氏（Ashby）培养基测定鞘氨醇单胞菌（Shingomonas sp.）pp01的固氮能力。将活化好的菌株接种到阿须贝培养基中，每个菌株3次重复，以接种无菌水为对照，在28℃下恒温培养，在第3天及第7天观察其生长状况，其明显浑浊的为阳性。

结果显示，鞘氨醇单胞菌（Shingomonas sp.）pp01培养管菌液明显浑浊，说明鞘氨醇单胞菌（Shingomonas sp.）pp01具有较强固氮能力（图1 c）。

实施例4：

 鞘氨醇单胞菌pp01对植物促生作用的试验：

    为保证实验材料的均一性，本发明的下述实验均以杂交狼尾草种子为实验对象。

杂交狼尾草种子的消毒过程为：用质量浓度为70%的酒精5分钟，无菌水冲洗3-5次，质量浓度为10%的双氧水浸泡30min，无菌水冲洗5次；

杂交狼尾草种子的催芽：消毒后的种子然后置于1/2 MS 培养基，25℃，暗培养48小时催芽；

杂交狼尾草幼芽的移植：将催芽的棉花种子播种于装有50g灭菌蛭石（121℃,2h）的温室盆钵中，每盆5棵苗，每个处理设置5盆重复；

杂交狼尾草苗的侵染：苗长至10天左右，用鞘氨醇单胞菌pp01发酵原液灌根侵染，具体操作为：向每盆杂交狼尾草苗基部加入50mL鞘氨醇单胞菌pp01发酵原液，3天后开始盐胁迫处理，即向每盆杂交狼尾草苗基部浇50mL 6㎎/mL的NaCl溶液（无菌水配置），将上述无菌水代替发酵菌液，其余处理相同，作为空白对照。

杂交狼尾草苗的培养：将上述实验组与对照组放置在28℃，光照培养（光循环：16小时光照，8小时黑暗），光照强度：10000Ix，20天后测量苗高并称鲜重。

试验结果表明该菌株对胁迫下的杂交狼尾草苗具有明显的促生长作用（图2），实验组的杂交狼尾草苗生长状态明显好于对照组，实验组株高比对照增长42.4％（图3），鲜重及干重比对照增长101.1％（图4），138.6％（图5）。

实施例5：

鞘氨醇单胞菌pp01在植物体内的定殖能力鉴定：

    取实施例1中所述的灌根侵染鞘氨醇单胞菌pp01 3天的杂交狼尾草苗的根，经表面消毒，石英砂研磨，加无菌水混匀，100μL涂布于LB固体培养基上，30℃，培养48h，观察菌落生长情况，并随机挑取3个单克隆，摇菌，经16SrDNA测序对菌株进行分子鉴定，以未侵染的杂交狼尾草苗根作为对照。

接种验证试验证明灌根处理三天，该巨大芽孢杆菌pp02就能够在植物体内定殖，侵染效率为4.9cfu/g植物根鲜重。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种内生鞘氨醇单胞菌pp01（Sphingomonas sp. pp01），于2014年7月4号在中国微生物保藏中心保藏，保藏号CGMCC 9414。

2.根据权利要求1所述的一种内生鞘氨醇单胞菌pp01，其特征在于，所述内生鞘氨醇单胞菌来源于象草。

3.根据权利要求1所述的一种内生鞘氨醇单胞菌pp01，其特征在于，所述象草内生菌鞘氨醇单胞菌 pp01，是按如下方法从象草中分离培养得到的：

    （1）取自江苏省农科院试验田的象草苏牧2号，取根部经表面消毒杀灭供试材料表面微生物，加适量石英砂研磨，加无菌水混匀，涂布于LB固体培养基上，30℃培养 48h；

（2）挑取单菌落在LB固体培养基上反复划线纯化，直到得到纯系菌株为止；

（3）将纯系菌株接种于LB液体培养基中，30℃培养18h，取菌液加入质量浓度为50%的甘油中，混合后置于-70℃冰柜中冷冻保存；

（4）将所得的纯系菌株，通过侵染杂交狼尾草苗验证其促生长活性后，鉴定，并保存菌种，其中一株分离纯化所得的内生细菌命名为pp01。

4.权利要求1所述的一种内生鞘氨醇单胞菌pp01在促进植物生长中的应用。

5.根据权利要求4所述的一种内生鞘氨醇单胞菌pp01在促进植物生长中的应用，其特征在于，所述内生鞘氨醇单胞菌pp01能促进盐胁迫条件下植物的生长。

6.根据权利要求4或5所述的一种内生鞘氨醇单胞菌pp01在促进植物生长中的应用，其特征在于，所述植物为杂交狼尾草。

7.根据权利要求6所述的一种内生鞘氨醇单胞菌pp01在促进植物生长中的应用，其特征在于，所述内生鞘氨醇单胞菌pp01在促进植物生长中的应用，通过以下方法验证：

将杂交狼尾草种子消毒，置于1/2 MS 培养基，25℃暗培养48小时催芽，将催芽后的种子播种于装满蛭石的盆钵中，苗长至10天左右，用pp01发酵原液灌根，侵染3天后，开始并每隔四天浇6㎎/mL盐水，20天后测量苗高并称鲜重。

8.根据权利要求1所述的一种内生鞘氨醇单胞菌pp01，其特征在于，所述内生鞘氨醇单胞菌pp01能在植物体内定殖。

9.根据权利要求6所述的一种内生鞘氨醇单胞菌pp01，其特征在于，所述内生鞘氨醇单胞菌pp01能在象草或杂交狼尾草体内定殖。

10.权利要求1所述的一种内生鞘氨醇单胞菌pp01，其特征在于，所述鞘氨醇单胞菌pp01能够分泌植物生长激素吲哚乙酸，具有有固氮能力，并能够产铁载体。