CN113481119B - 一种提高磷利用率的复合微生物菌剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了巨大芽孢杆菌联合地衣芽孢杆菌在降解无机磷中的应用，公开了一种提高磷利用率的复合微生物菌剂，由巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植酸酶，以及矿源黄腐酸/矿源黄腐酸钾组成，其中，巨大芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的活菌数比例为1:3～5，优选1:4。本发明通过实验研究发现，巨大芽孢杆菌联合地衣芽孢杆菌对无机磷的降解效果非常突出。将巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌制成微生物菌剂、复合微生物菌剂，施用于土壤中，有利于土壤中无机磷肥料的降解，提高作物、果蔬等对磷的利用率，促进磷元素的吸收，减少磷元素的固化。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高磷利用率的复合微生物菌剂，属于微生物菌剂技术领域。
背景技术
磷肥在农业种植中占有非常重要的地位，对庄稼的收成有着决定性的作用。但磷肥的利用率较低，一般只有10%～25%，主要原因是磷肥的有效成分极易在土壤中转换成难溶状态且被固定，不利于农作物的吸收。因此，如何提高磷肥的利用率，是亟需解决的问题。
为使磷肥发挥更好的功效，传统的做法主要有：提高施肥量，集中施肥，分层施肥，将磷肥与有机肥混合施用等。但这些做法均不能从根本上提高磷肥的利用率，且存在种种弊端，比如：提高施肥量会使土壤中的有效率含量超标，造成肥料的浪费，且影响作物对其它营养元素的吸收；集中施肥、分层施肥需要耗费大量的人力和时间。
近年来，微生物肥料是研究热点之一，有大量的文献报道，如：CN 107056535 A公开了一种复合微生物肥料，其中包括发酵蘑菇渣、腐植酸、腐熟鸡粪和复合微生物菌剂。复合微生物菌剂由深红螺菌和巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、侧芽孢杆菌以及沼泽红假单胞菌中的3～6种组成。本发明的复合微生物肥料可促进植物的光合作用，优化产物中的营养物质组成，微生物可解磷解钾，提高土壤肥力，提高土壤微生物活性，促进作物养分积累，改善产品品质。添加发酵蘑菇渣、腐植酸和腐熟鸡粪既可为微生物的生长提供肥料，还可改善土壤理化性状，促进土壤团粒结构的形成，增强土壤透气和保水蓄肥的能力，提高肥料利用率，保护环境。如：CN 112136835 A公开了一种可以提高农作物抗逆能力的复合微生物菌剂，其中，由以下重量份的原料制成：复合微生物菌，微量元素，干燥剂，硅藻土；本发明所述的微生物种类搭配合理，采用了多粘芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、绿色木霉菌、巨大芽孢杆菌、植物乳杆菌和地衣芽孢杆菌的组合，互补性强，在使用后复合菌剂能够迅速的繁殖，形成优势种群，从而刺激作物生长发育，提高作物增强作物的抗逆性，增强作物抗寒耐旱和抵御病虫害的能力，可固氮、解磷、解钾，增加土壤养分、改良土壤结构、提高化肥利用率，增产增收。如：CN 109400378 A公开了提高作物土壤有效磷、钾的复合微生物菌剂及制备方法，具体包括五种土壤有益菌及三种增效剂，其中地衣芽孢杆菌（TMQD04），巨大芽孢杆菌（TMQJ05），胶冻样芽孢杆菌（TMQJ03）、沼泽红假单胞菌（TMQZ08）、干酪乳杆菌（TMQR01），按有效活菌数比例为0.8～1：0.8～1：2.5～3：1.0～1.2：4的比例搭配，保证活菌数≥30亿/ml；并搭配有机酸、水溶性氨基酸、γ-聚谷氨酸等增效剂，分解土壤中的固态磷钾，提高土壤中的有效磷钾，以达到解磷解钾，提高光合利用率，促进植物结实，提高作物抗病性，减少农资投入的效果。这些文献报道所用的微生物各有特色，所起到的功效也各有侧重点，未发现专门用于提高磷肥利用率的的微生物制剂，因此，选择何种微生物进行搭配以有效提高磷利用率仍有待探索。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种可有效提高磷利用率的复合微生物菌剂。
本发明是通过以下技术方案实现的：
巨大芽孢杆菌联合地衣芽孢杆菌在降解无机磷中的应用，或：在降解含无机磷的肥料中的无机磷的应用，所述巨大芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的活菌数比例为1:3～5，优选1:4。
进一步地，所述巨大芽孢杆菌来源于中国微生物菌种保藏中心，编号为ACCC10011，是他人保藏的，本发明通过正常商业途径购买得到（购自中国农业科学院）。
进一步地，所述地衣芽孢杆菌来源于中国微生物菌种保藏中心，编号为ACCC19747，是他人保藏的，本发明通过正常商业途径购买得到（购自中国农业科学院）。
进一步地，所述无机磷为磷酸钙。
进一步地，所述含无机磷的肥料的组分组成为：各组分按重量百分数计，葡萄糖1％，硫酸铵0.08％，七水硫酸镁0.03％，氯化钠0.05％，氯化钾0.005％，七水硫酸铁0.005％，七水硫酸锰0.0003％，磷酸钙0.5％，余量为水，pH 7.5～7.8。
一种用于降解无机磷/含无机磷的肥料中的无机磷的微生物菌剂，由巨大芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌组成，巨大芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的活菌数比例为1:3～5，优选1:4。
进一步地，所述巨大芽孢杆菌和/或地衣芽孢杆菌以菌培养物的形式存在。
进一步地，所述菌培养物为菌液。
进一步地，所述用于降解无机磷/含无机磷的肥料中的无机磷的微生物菌剂，由体积比为1:1的巨大芽孢杆菌菌液和地衣芽孢杆菌菌液组成，所述巨大芽孢杆菌菌液/地衣芽孢杆菌菌液是通过以下方法制备得到的：在基础培养基上接种巨大芽孢杆菌/地衣芽孢杆菌，在37℃、220转/min的条件下培养18小时，即得。
进一步地，所述基础培养基的组分组成为：酵母粉1％，氯化钠0.5％，蛋白胨1％，余量为水，按重量份计。
一种提高磷利用率的复合微生物菌剂（用于降解无机磷/含无机磷的肥料中的无机磷的复合微生物菌剂），由巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植酸酶，以及矿源黄腐酸/矿源黄腐酸钾组成，其中，巨大芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的活菌数比例为1:3～5，优选1:4。
进一步地，所述巨大芽孢杆菌和/或地衣芽孢杆菌以菌培养物的形式存在。
进一步地，所述菌培养物为菌液。
进一步地，由45～55份的巨大芽孢杆菌菌液、30～40份的地衣芽孢杆菌菌液、5～10份的植酸酶，以及5～10份的矿源黄腐酸/矿源黄腐酸钾组成，按重量份计；其中，巨大芽孢杆菌菌液中，巨大芽孢杆菌的有效活菌数为2×107～1×109/g；地衣芽孢杆菌菌液中，地衣芽孢杆菌的有效活菌数为2×107～3×1010/g。
进一步地，所述植酸酶的活性大于150000U，全水溶。
进一步地，所述矿源黄腐酸/矿源黄腐酸钾中，腐殖酸≥60％（重量百分数），全水溶。
所述高磷利用率的复合微生物菌剂的制备方法为：将巨大芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液、植酸酶和矿源黄腐酸混合，混匀，即得。
本发明通过实验研究，意外地发现，巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌在特定配比时，对无机磷的降解效果非常突出，明显优于单独的巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、以及其它配比关系。基于此研究结果，可以合理预期，将巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌制成微生物菌剂、复合微生物菌剂，施用于土壤中，有利于土壤中无机磷肥料的降解，提高作物、果蔬等对磷的利用率，促进磷元素的吸收，减少磷元素的固化。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
图1：显微镜下各菌株的培养结果示意。
图2：巨大芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌混合培养解磷检测结果示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实验1 菌株解磷效果的考察
本实验对现有的9株农用芽孢杆菌（包括：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌，甲基营养型芽孢杆菌）的解磷效果进行了初步考察，具体如下。
（一）培养基
无机磷培养基：葡萄糖1％，硫酸铵0.08％，七水硫酸镁0.03％，氯化钠0.05％，氯化钾0.005％，七水硫酸铁0.005％，七水硫酸锰0.0003％，磷酸钙0.5％，三氯化铁0.01％（只胶冻样加），补足蒸馏水，pH 7.5～7.8。
基础培养基：酵母粉1％，氯化钠0.5％，蛋白胨1％。
基础培养基（胶冻样）：蔗糖0.5%，Na2HPO4 0.2%，MgSO4 0.05%，CaCO3 0.01%，FeCl30.01%，pH7.5～8.0。
（二）实验过程
分别在基础培养基上接种各菌株后在37℃、220转/min的条件下培养18小时（在100*16倍放大条件下观察，每隔视野中存在15～40个单菌，可以进行转接），用100*16倍显微镜观察无杂菌（如图1所示），且菌落形态一致后接入无机磷培养基中，接种量为2％（体积比），150ml三角瓶装液50ml，然后调整培养温度为30℃，转速为200转/min，根据实验设置的检测间隔时间进行取样检测。
检测室收集不同天数的培养液，在5000r/min的转速下进行离心收集上清液，用比色法检测可溶性磷的含量及变化。结果如表1所示。
表1 单菌培养解磷检测记录表（单位：μg/ml）
| 第0 H | 第24H | 第48H | 第72H | 第96H | 第120H | 第144H | |
| 空白 | 0.79 | 0.80 | 0.81 | 0.80 | 0.80 | 0.83 | 0.81 |
| 枯草 | 0.79 | 3.2 | 3.5 | 4.7 | 4.9 | 4.8 | 4.7 |
| 地衣 | 0.79 | 8.6 | 17.5 | 18.3 | 18.1 | 17.9 | 17.5 |
| 巨大 | 0.79 | 5.8 | 13.5 | 18.6 | 23.2 | 35.7 | 33.8 |
| 苏云金 | 0.79 | 2.8 | 3.1 | 3.3 | 3.1 | 3.1 | 3.2 |
| 多粘 | 0.79 | 2.4 | 2.8 | 2.9 | 2.9 | 2.7 | 2.8 |
| 侧孢 | 0.79 | 3.0 | 6.1 | 6.9 | 6.8 | 6.8 | 6.7 |
| 解淀粉 | 0.79 | 2.3 | 5.8 | 6.1 | 7.7 | 7.9 | 7.8 |
| 甲基营养型 | 0.79 | 1.8 | 2.5 | 2.7 | 2.8 | 2.9 | 2.9 |
| 胶冻样 | 0.79 | 3.5 | 4.2 | 7.8 | 10.6 | 12.3 | 12.5 |
通过检测及数据分析发现：解磷效果最强的是巨大芽孢杆菌，其次是地衣芽孢杆菌，这两种菌的效果远远超出其它六种菌。在72小时时地衣芽孢杆菌与巨大芽孢杆菌解磷量相当，在72小时之前地衣芽孢杆菌优于巨大芽孢杆菌，72小时后随着时间推移巨大芽孢杆菌解磷效率远远大于地衣芽孢杆菌。
然后，设计实验将巨大芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌混合培养（二者接种比例1:1，即接种量为0.5 ml：0.5 ml，接种对数期有效芽孢杆菌活菌数为：地衣2×108/0.5 ml，巨大0.5×108/0.5 ml，即地衣：巨大=4:1）同时接入无机磷培养基中，并检测水溶性磷含量，具体操作同上。结果如表2、图2所示。
表2 混合培养解磷检测记录表（单位：μg/ml）
| 第0 H | 第24H | 第48H | 第72H | 第96H | 第120H | 第144H | |
| 巨大 | 0.79 | 5.8 | 13.5 | 18.6 | 23.2 | 35.7 | 33.8 |
| 地衣 | 0.79 | 8.6 | 17.5 | 18.3 | 18.1 | 17.9 | 17.5 |
| 混合 | 0.79 | 10.3 | 20.2 | 28.6 | 30.4 | 38.4 | 35.5 |
通过巨大芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合培养，发现比单菌培养时整体的解磷效果在高峰期要别高出7.5％和55.4％（对应表2中，混合培养的120小时对标巨大的120小时，混合的72小时对标地衣的72小时数据），效果更加突出。并且在72小时内达到28.6μg/ml，比单菌培养达到该浓度的时间缩短24～40小时，实现了阶梯化的效果，起到了协同作用，解决了单一地衣芽孢杆菌在整个周期分解效率的不足与巨大芽孢杆菌前期分解率较低的问题。
通过分析单菌培养解磷实验结果，计划研究巨大芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的混合培养，由于他们的生长周期存在差异，所以研究了不同的接种量对于解磷的影响，如表3所示，以下比例均为地衣：巨大，总接种量为2％。
表3 混合培养解磷检测记录表（单位：μg/ml）
| 第0 H | 第24H | 第48H | 第72H | 第96H | 第120H | 第144H | |
| 巨大 | 0.79 | 5.8 | 13.5 | 18.6 | 23.2 | 35.7 | 33.8 |
| 地衣 | 0.79 | 8.6 | 17.5 | 18.3 | 18.1 | 17.9 | 17.5 |
| 1:1 | 0.79 | 10.3 | 20.2 | 28.6 | 30.4 | 38.4 | 35.5 |
| 2:1 | 0.79 | 8.7 | 17.6 | 18.4 | 20.6 | 23.8 | 32.3 |
| 3:1 | 0.79 | 8.5 | 17.9 | 18.6 | 19.8 | 22.6 | 30.5 |
| 1:2 | 0.79 | 6.6 | 14.3 | 16.2 | 24.5 | 35.8 | 34.9 |
| 1:3 | 0.79 | 6.0 | 13.8 | 17.8 | 24.1 | 36.0 | 34.1 |
在整个实验中发现，随着接种的地衣芽孢杆菌的接种量变大，在超过72小时后其解磷效果并没有太大的突破，均小于巨大单菌及1:1的接种量最终解磷效果。在巨大芽孢杆菌接种量不断变大的过程中，在96小时之前的解磷效率较低，只比巨大单菌稍高，比第一单菌最终的解磷效果与1:1的接种量相当，因此，本发明确定最佳的接种比例为1:1。
实验2 复合微生物菌剂的研究
通过以上实验，初步确定复合微生物菌剂中所采用的菌种为巨大芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌，通过查阅资料，发现植酸酶具有良好的解磷效果，随后进一步验证加入植酸酶的解磷效果（考虑到农业投入成本的问题，本实验采取的验证效果只在0-25U范围内，是结合市场对于产品的价格接受度以及成本的投入的一个综合考量值）。
分别在上述实验的无机磷培养基中加入过滤除菌的植酸酶（肌醇6-磷酸水解酶），加入量分别为0、5、10、15、20、25U植酸酶，30℃处理24小时，结果如下表4所示。
表4 植酸酶解磷检测记录表（单位：μg/ml）
| 0 | 5 | 15 | 20 | 25 | |
| 空白 | 0.79 | 0.80 | 0.81 | 0.80 | 0.80 |
| 植酸酶 | 0.79 | 22.5 | 24.8 | 25.2 | 25.6 |
通过实验发现在植酸酶浓度为0～25U的范围内能够有效地分解磷酸盐，并且在15～20U时达到最大值
同时将植酸酶溶解后过滤除菌，选取15U 的添加量，添加至灭菌完成的无机磷培养基中，与巨大芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌同时培养，并检测可溶性磷的变化，结果如表5所示。
表5 混合培养解磷检测记录表（单位：μg/ml）
| 第0 H | 第24H | 第48H | 第72H | 第96H | 第120H | 第144H | |
| 混合 | 0.79 | 10.3 | 20.2 | 28.6 | 30.4 | 38.4 | 35.5 |
| 混合+植酸酶 | 0.79 | 31.3 | 40.6 | 47.3 | 49.8 | 58.9 | 57.6 |
根据检测结果，添加植酸酶的产品比混合培养的溶磷效果在120小时时增加53.4％，效果突出。
最终，确定微生物菌剂的原料为：巨大芽孢杆菌+地衣芽孢杆菌+植酸酶，并添加黄腐酸（从植物生理的原理上，黄腐酸能够刺激植物根系的快速生长，而植物的根系生长对于磷的需求非常之大，为了加速对分解的磷元素进行吸收利用，防止二次固化，本发明添加黄腐酸钾），以促进根系的发育，促进磷元素的吸收，减少磷元素的固化。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
Claims (7)
1.巨大芽孢杆菌联合地衣芽孢杆菌在降解无机磷中的应用，其特征在于，巨大芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的活菌数比例为1:4；
所述巨大芽孢杆菌来源于中国微生物菌种保藏中心，编号为ACCC10011；
所述地衣芽孢杆菌来源于中国微生物菌种保藏中心，编号为ACCC19747；
还包括植酸酶，植酸酶的添加比例为15-20μg/ml。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，具体为在降解含无机磷的肥料中的无机磷的应用；
所述含无机磷的肥料的组分组成为：按重量百分数计，葡萄糖1％，硫酸铵0.08％，七水硫酸镁0.03％，氯化钠0.05％，氯化钾0.005％，七水硫酸铁0.005％，七水硫酸锰0.0003％，磷酸钙0.5％，余量为水，pH 7.5～7.8。
3.一种用于降解无机磷的微生物菌剂，其特征在于，由巨大芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌组成，巨大芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的活菌数比例为1:4；
所述巨大芽孢杆菌来源于中国微生物菌种保藏中心，编号为ACCC10011；
所述地衣芽孢杆菌来源于中国微生物菌种保藏中心，编号为ACCC19747；
还包括植酸酶，植酸酶的添加比例为15-20μg/ml。
4.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，具体为用于降解含无机磷的肥料中的无机磷的微生物菌剂。
5.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述巨大芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌以菌液的形式存在。
6.根据权利要求5所述的微生物菌剂，其特征在于，由体积比为1:1的巨大芽孢杆菌菌液和地衣芽孢杆菌菌液组成，所述巨大芽孢杆菌菌液/地衣芽孢杆菌菌液是通过以下方法制备得到的：在基础培养基上接种巨大芽孢杆菌/地衣芽孢杆菌，在37℃、220转/min的条件下培养18小时，即得。
7.一种提高磷利用率的复合微生物菌剂，其特征在于，由巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植酸酶，以及矿源黄腐酸/矿源黄腐酸钾组成，其中，巨大芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的活菌数比例为1:4；
所述巨大芽孢杆菌来源于中国微生物菌种保藏中心，编号为ACCC10011；
所述地衣芽孢杆菌来源于中国微生物菌种保藏中心，编号为ACCC19747；
所述植酸酶的活性大于150000U，添加比例为15-20μg/ml；
所述矿源黄腐酸/矿源黄腐酸钾中，腐殖酸≥60％。
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Legal Events
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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