TW202217005A - 發酵生產胍基乙酸之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明關於經轉形為能夠生產胍基乙酸(GAA)之微生物,以及關於使用此種微生物來發酵生產GAA之方法。本發明亦關於發酵生產肌酸之方法。

Description

發酵生產胍基乙酸之方法
本發明關於經轉形為能夠生產胍基乙酸(GAA)之微生物,以及關於用於使用此種微生物來發酵生產GAA之方法。本發明亦關於發酵生產肌酸之方法。
GAA是一種用作為動物飼料添加劑的有機化合物(US2011257075 A1)。GAA是肌酸的天然前驅物(例如Humm等人,Biochem. J. (1997) 322, 771-776)。因此,GAA的補充提供生物體內的肌酸的最佳供應。 本發明關於一種使用工業原料(例如氨、銨鹽和葡萄糖或含糖受質)為起始材料,藉由發酵程序生產GAA之方法。在生物系統中,GAA和L-鳥胺酸是從精胺酸和甘胺酸作為起始材料,在L-精胺酸:甘胺酸-甲脒基轉移酶(AGAT;EC 2.1.4.1)的催化作用下來形成,其為肌酸生物合成的第一步:
Figure 02_image001
Guthmiller等人(J Biol Chem. 1994 Jul 1;269(26): 17556-60)藉由選殖和在大腸桿菌( E. coli)中異源表現該酵素,來表徵大鼠腎臟AGAT。Muenchhoff等人(FEBS Journal 277 (2010) 3844-3860)報導亦藉由選殖和在大腸桿菌中異源表現該酵素而首次表徵來自原核生物的AGAT。Sosio等人(Cell Chemical Biology 25, 540-549, May 17, 2018)闡明鏈黴菌屬中假尿苷黴素(pseudouridimycin)的生物合成路徑。他們將L-精胺酸與甘胺酸藉由PumN(一種L-精胺酸:甘胺酸-甲脒基轉移酶(AGAT))所催化的反應形成的GAA和L-鳥胺酸,描述為一個中間反應。 從文獻中也已知,在微生物中,特別是細菌中,用於增加GAA合成中的起始材料之一(即L-精胺酸)生產的數種方法。Park等人提供麩胺酸棒狀桿菌( C. glutamicum)用於生產L-精胺酸的代謝工程之概述(NATURE COMMUNICATIONS | DOI: 10.1038/ncomms5618)。他們提出隨機誘變和篩選已能生產L-精胺酸的麩胺酸棒狀桿菌菌株的L-精胺酸生產者,例如ATCC 21831(Nakayama及Yoshida 1974, US3849250 A),以及基於全系統代謝分析的逐步合理代謝工程,使整個菌株工程步驟中的L-精胺酸產量逐漸增加。Yim等人(J Ind Microbiol Biotechnol (2011) 38:1911-1920)可顯示,藉由破壞麩胺酸棒狀桿菌( C. glutamicum)中的染色體 argR基因來去活化 argR基因(編碼控制L-精胺酸生物合成途徑的中心抑制子蛋白質ArgR),產生經改善之精胺酸生產菌株。Ginesy等人(Microbial Cell Factories (2015) 14:29)報導成功的大腸桿菌工程,以供增強之精胺酸生產。其中,他們提出刪除 argR抑制子基因。 Suga等人(US20070031946 A1)已報導一種使用遺傳重組菌株之方法,其中抑制精胺酸生物合成操縱組 argR表現的基因被去活化。特別地,控制精胺酸操縱組的 argR的刪除,已被認為是精胺酸生產的重要因素。 Fan Wenchao揭示一種藉由非致病性微生物(諸如麩胺酸棒狀桿菌)發酵生產肌酸之方法(CN106065411 A)。該微生物具有以下生物轉化功能:葡萄糖轉化為L-麩胺酸;L-麩胺酸轉化為N-乙醯基-L-麩胺酸;N-乙醯基-L-麩胺酸轉化為N-乙醯基-L-麩胺酸半醛;N-乙醯基-L-麩胺酸半醛轉化為N-乙醯基-L-鳥胺酸;N-乙醯基-L-鳥胺酸轉化為L-鳥胺酸;L-鳥胺酸轉化為L-瓜胺酸;L-瓜胺酸轉化為精胺基琥珀酸(arginino-succinic acid);精胺基琥珀酸轉化為L-精胺酸;L-精胺酸轉化為胍基乙酸;最後,胍基乙酸轉化為肌酸。Fan Wenchao提出,該微生物過量表現一種或多種選自由下列者所組成之群組:N-乙醯基麩胺酸-合成酶、N-乙醯基鳥胺酸-δ-胺基轉移酶、N-乙醯基鳥胺酸酶、鳥胺酸-胺甲醯基轉移酶、精胺基琥珀酸合成酶、甘胺酸甲脒基-轉移酶(EC: 2.1. 4.1)、和胍基乙酸N-甲基轉移酶(EC: 2.1.1.2)。該微生物較佳的是過量表現甘胺酸甲脒基轉移酶(L-精胺酸:甘胺酸甲脒基轉移酶)和胍基乙酸N-甲基轉移酶。 至於GAA生物合成的第二種起始原料,理想的是增加甘胺酸的供應,以改善微生物的GAA生物合成,這些微生物天然具備編碼具有L-精胺酸:甘胺酸甲脒基轉移酶(AGAT)功能的蛋白質的同源基因,或已具備編碼具有L-精胺酸:甘胺酸甲脒基轉移酶(AGAT)功能的蛋白質的異源基因。 所謂的乙醛酸旁路途徑(glyoxylate shunt pathway),其自然存在於微生物中,諸如大腸桿菌或麩胺酸棒狀桿菌,是三碳酸(TCA)循環(克氏循環)的副反應,且包括藉由異檸檬酸裂解酶從異檸檬酸形成乙醛酸和琥珀酸,且藉由蘋果酸合成酶從乙醛酸和乙醯CoA形成蘋果酸(Salusjärvi等人,Applied Microbiology and Biotechnology (2019) 103:2525-2535)。 乙醛酸可作為起始材料,在存有諸如胺基酸之胺基供體和乙醛酸轉胺酶下形成甘胺酸。 在試圖改善麩胺酸棒狀桿菌的乙醇酸的生產中,Zahoor等人(Journal of Biotechnology 192 (2014) 366-375)藉由刪除蘋果酸合成酶基因 aceB,達成增加乙醛酸前驅物的供應。 乙醛酸轉胺酶催化胺基酸的胺基轉移到乙醛酸。這種轉移的產物是甘胺酸和相對應的α-酮酸。 已知有幾種乙醛酸胺基轉移酶,就胺基供體而言,它們的受質特異性各異(參見例如Kameya等人,FEBS Journal 277 (2010) 1876-1885;Liepman及Olsen,Plant Physiol. Vol. 131, 2003, 215-227;Sakuraba等人,JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Aug. 2004, p. 5513-5518;Takada及Noguchi,Biochem. J. (1985) 231, 157-163)。由於這些乙醛酸胺基轉移酶大部分能夠使用不同的胺基酸作為胺基供體,因此它們通常以不同的EC編號來註解。然而,所有這些胺基轉移酶的共同點是它們使用乙醛酸作為受體分子,或者,在逆反應情況中,使用甘胺酸作為供體分子。 具有乙醛酸胺基轉移酶功能的蛋白質的實例如下: 甘胺酸轉胺酶(EC 2.6.1.4)催化下列反應: L-麩胺酸+乙醛酸<=> α-酮戊二酸+甘胺酸。 甘胺酸:草醯乙酸轉胺酶(EC 2.6.1.35)催化下列反應: L-天門冬胺酸+乙醛酸<=>草醯乙酸+甘胺酸。 丙胺酸:乙醛酸轉胺酶(EC 2.6.1.44)催化下列反應: L-丙胺酸+乙醛酸<=>丙酮酸+甘胺酸。 絲胺酸:乙醛酸轉胺酶(EC 2.6.1.45)催化下列反應: L-絲胺酸+乙醛酸<=>3-羥基丙酮酸+甘胺酸。 甲硫胺酸:乙醛酸轉胺酶(EC 2.6.1.73)催化下列反應: L-甲硫胺酸+乙醛酸<=>4-(甲基氫硫基)-2-酮基丁酸+甘胺酸。 芳香族胺基酸:乙醛酸轉胺酶(EC 2.6.1.60)催化下列反應: 芳香族胺基酸+乙醛酸<=>芳香族酮酸+甘胺酸。 犬尿胺酸:乙醛酸轉胺酶(EC 2.6.1.63)催化下列反應: 犬尿胺酸+乙醛酸<=>4-(2-胺基苯基)-2,4-二酮基丁酸+甘胺酸。 (S)-脲基-甘胺酸:乙醛酸轉胺酶(EC 2.6.1.112)催化下列反應: (S)-脲基-甘胺酸+乙醛酸<=>N-胺甲醯基-2-酮基-甘胺酸+甘胺酸。
本發明所涉及的問題是欲提供一種經轉形為能夠生產胍基乙酸(GAA)之微生物,特別是一種具有經改善之提供甘胺酸作為GAA生物合成起始材料的能力之微生物,以及提供用於使用此種微生物來發酵生產GAA之方法。 藉由一種微生物,其包含至少一個編碼具有L-精胺酸:甘胺酸甲脒基轉移酶功能的蛋白質之基因,且其中,相較於野生型微生物中個別的活性,具有蘋果酸合成酶功能之蛋白質的活性降低,來解決該問題。 具有蘋果酸合成酶功能之蛋白質的活性可用以下方式降低:藉由將蛋白質突變為具有比野生型蛋白質更低的酵素活性的蛋白質;藉由將編碼具有蘋果酸合成酶功能之酵素的基因表現減弱(相較於野生型微生物中個別基因之表現);藉由降低轉譯的效率,例如藉由將ATG起始密碼子改變為GTG,藉由在mRNA的5'非轉譯區引入二級結構或藉由減弱密碼子的使用;或藉由刪除編碼具有蘋果酸合成酶功能之酵素的基因。 較佳的是,根據本發明之微生物中,相較於野生型微生物中個別基因之表現,編碼具有蘋果酸合成酶功能之蛋白質的基因之表現係減弱,或編碼具有蘋果酸合成酶功能之蛋白質的基因經刪除。 在一進一步實施態樣中,本發明之微生物,相較於野生型微生物中個別的酵素活性,進一步包含具有乙醛酸胺基轉移酶功能之酵素活性增加。 根據本發明之微生物較佳的是包含至少一個編碼具有乙醛酸胺基轉移酶酵素活性的蛋白質之基因。 在本發明之微生物中,至少一個編碼具有乙醛酸胺基轉移酶酵素活性的蛋白質之基因是同源性或異源性。 在本發明之一進一步實施態樣中,在本發明之微生物中,至少一個編碼具有乙醛酸胺基轉移酶酵素活性的蛋白質之基因是過度表現。 較佳的是,本發明之微生物,相較於野生型微生物的能力,具有經增加之生產L-精胺酸的能力。 在本發明的背景下,具有經增加之生產L-精胺酸的能力的微生物是指生產L-精胺酸超過自身需要的微生物。此種生產L-精胺酸的微生物的實例是例如麩胺酸棒狀桿菌ATCC 21831或Park等人(NATURE COMMUNICATIONS | DOI: 10.1038/ncomms5618)或Ginesy等人(Microbial Cell Factories (2015) 14:29)所揭示者。 在一具體實施態樣中,相較於野生型微生物中個別的酵素活性,該微生物具有胺甲醯基磷酸合成酶(EC 6.3.4.16)功能之酵素活性增加。 相較於野生型微生物中個別的酵素活性,根據本發明之微生物中的具有精胺基琥珀酸解離酶(argininosuccinate lyase)(E.C. 4.3.2.1)功能之酵素活性可為經增加。 又,根據本發明之微生物中,相較於野生型微生物中個別的酵素活性,具有鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(EC 2.1.3.3)功能之酵素活性可為經增加。 根據本發明之微生物中,相較於野生型微生物中個別的酵素,具有精胺基琥珀酸合成酶(E.C. 6.3.4.5)功能之酵素活性可為經增加。 微生物中經增加之酵素活性可例如藉由對應的內源性基因的突變來達成。增加酵素活性的進一步措施可為穩定編碼該等酵素的mRNA。上述酵素的經增加之活性亦可藉由過度表現編碼個別酵素的基因來達成。 根據本發明之微生物較佳的是亦包含至少一個或多個過度表現的基因,這些基因選自由下列所組成之群組:編碼具有鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(EC 2.1.3.3)功能之蛋白質的基因(例如 argF/argF2/argI)、編碼具有精胺基琥珀酸合成酶(E.C. 6.3.4.5)功能之蛋白質的基因(例如 argG)、以及編碼具有精胺基琥珀酸解離酶(E.C. 4.3.2.1)功能之蛋白質的基因(例如 argH)。 此外,在根據本發明之微生物中,精胺酸操縱組( argCJBDFR)可為經過度表現。 或者,在根據本發明之微生物中,編碼精胺酸反應抑制子蛋白質ArgR的 argR基因可為經減弱或經刪除。 在本發明之一進一步實施態樣且視需要除了上述修飾中,在根據本發明之微生物中,至少一或多個編碼L-精胺酸生物合成路徑的酵素基因係過度表現,該基因包含 gdh argJ argBargC及/或 argD,分別編碼麩胺酸去氫酶、鳥胺酸乙醯基轉移酶、乙醯基麩胺酸激酶、乙醯基麩胺醯基磷酸還原酶及乙醯基鳥胺酸胺基轉移酶。 表1顯示不同菌種(即大腸桿菌、麩胺酸棒狀桿菌和戀臭假單胞菌( P. putida))中參與或有助於精胺酸生物合成的酵素的不同名稱。
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基因的過度表現通常是藉由增加基因的拷貝數和/或藉由將基因與強啟動子功能連接和/或藉由增強核糖體結合位點和/或藉由起始密碼子或整個基因的密碼子使用最佳化或包含上述方法的選擇的組合或所有的組合來達成。 在本發明之微生物之本發明之一進一步實施態樣中,編碼具有L-精胺酸:甘胺酸甲脒基轉移酶功能的蛋白質之該基因是異源性。 異源性基因是指該基因業經插入到天然不具有該基因的宿主生物體中。在宿主中插入異源性基因是藉由重組DNA技術進行。經歷DNA重組技術的微生物被稱為基因轉殖微生物、基因改造微生物或重組微生物。 異源性蛋白是指在微生物中非天然存在的蛋白質。 同源性或內源性基因是指包括其功能本身在內的基因或基因的核苷酸序列在微生物中天然存在或在微生物中為"原態(native)"。 同源或原態蛋白質是指在微生物中天然存在的蛋白質。 具有L-精胺酸:甘胺酸甲脒基轉移酶(AGAT)功能的蛋白質屬於甲脒基轉移酶家族。甲脒基轉移酶家族包含甘胺酸(EC:2.1.4.1)和肌胺(inosamine)(EC:2.1.4.2)甲脒基轉移酶,分別參與肌酸和鏈黴素的生物合成的酵素。此家族亦包括精胺酸去亞胺酶(arginine deiminase),EC:3.5.3.6。這些酵素催化的反應是:精胺酸+H2O<=>瓜胺酸+NH3。在此家族中亦發現是鏈球菌屬的抗腫瘤醣蛋白。具有L-精胺酸:甘胺酸-甲脒基轉移酶(AGAT)活性的酵素或蛋白質亦經描述擁有屬於PFAM家族的保守域:Amidinotransf (PF02274) (Marchler-Bauer A等人(2017),"CDD/SPARCLE: functional classification of proteins via subfamily domain architectures.", Nucleic Acids Res. 45(D1):D200-D203),在以下公開發表中也有描述:Pissowotzki K等人,Mol Gen Genet 1991;231:113-123 (PUBMED:1661369 EPMC:1661369);D'Hooghe I等人,J Bacteriol 1997;179: 7403-7409 (PUBMED:9393705 EPMC:9393705);Kanaoka M等人,Jpn J Cancer Res 1987;78:1409-1414 (PUBMED: 3123442 EPMC:3123442)。 在本發明之微生物中,編碼具有L-精胺酸:甘胺酸甲脒基轉移酶功能的蛋白質之該基因可進一步係過度表現。基因的過度表現通常是藉由增加基因的拷貝數和/或藉由將基因與強啟動子功能連接和/或藉由增強核糖體結合位點和/或藉由起始密碼子或整個基因的密碼子使用最佳化或包含上述方法的選擇或所有的組合來達成。 在本發明之微生物中,具有L-精胺酸:甘胺酸甲脒基轉移酶功能之蛋白質可包含與根據SEQ ID NO: 11的胺基酸序列至少有80%的同源性、較佳的是至少90%的同源性的胺基酸序列。在本發明之一進一步實施態樣中,L-精胺酸:甘胺酸甲脒基轉移酶的胺基酸序列與根據SEQ ID NO: 11的胺基酸序列相同。 在本發明之一具體實施態樣中,根據本發明之微生物中,具有乙醛酸胺基轉移酶的酵素活性的該蛋白質包含與根據SEQ ID NO: 2、根據SEQ ID NO: 5或根據SEQ ID NO: 8的胺基酸序列至少有80%的同源性的胺基酸序列。 本發明之微生物可屬於棒狀桿菌屬,較佳的是麩胺酸棒狀桿菌( C. glutamicum),或屬於腸桿菌屬,較佳的是大腸桿菌( E. coli),或屬於假單胞菌屬,較佳的是戀臭假單胞菌 (P. putida)。 在微生物中、特別是在本發明之微生物中的蛋白質的經增加之酵素活性,相較於野生型微生物中的個別活性,可例如藉由蛋白質的突變、特別是藉由賦予蛋白質反饋抗性的突變(例如針對經酵素催化之反應的產物)來達成,或者,相較於野生型微生物中的個別基因的表現,藉由經增加之編碼具有酵素活性的蛋白質之基因的表現來達成。 在微生物中、特別是在本發明之微生物中的基因的經增加之表現或過度表現,相較於野生型微生物中的個別活性,可藉由增加基因的拷貝數及/或藉由調節因子之強化來達成,例如藉由將基因與強啟動子功能連接和/或藉由增強核糖體結合位點和/或藉由起始密碼子或整個基因的密碼子使用最佳化。正向影響基因表現的此種調節因子之強化,可例如藉由修飾結構基因上游的啟動子序列以增加啟動子效用、或藉由將該啟動子完全替換為更有效或所謂的強啟動子來達成。啟動子位於基因的上游。啟動子是由約40至50個鹼基對組成的DNA序列,它構成RNA聚合酶全酶的結合位點和轉錄起始點,據此可影響受控多核苷酸或基因的表現強度。一般來說,可藉由選擇強啟動子來達成細菌中基因的過度表現或表現增加,例如藉由將原啟動子替換為強、原態(最初分配在其他基因)啟動子,或藉由將給定的、原態的啟動子的某些區域(例如其所謂的-10和-35區域)修飾成共通序列,例如像是M. Patek等人(Microbial Biotechnology 6 (2013), 103-117)針對麩胺酸棒狀桿菌所教示者。"強"啟動子的實例是超氧化物歧化酶( sod)啟動子("Psod";Z. Wang等人,Eng. Life Sci. 2015, 15, 73-82)。"功能連接(functional linkage)"理解為意指啟動子與基因的順序排列,從而導致基因的轉錄。 遺傳密碼是簡併性,這意指某些胺基酸可由許多不同的三聯密碼子來編碼。術語"密碼子使用(codon usage)"係指觀察到某些生物體通常不會以相同的頻率針對某種胺基酸使用每一種可能的密碼子。相反地,生物體通常會顯示對特定的密碼子的某些偏好,這意指這些密碼子在某生物體經轉錄之基因的編碼序列中較常出現。如果對其未來宿主是陌生(即來自不同物種)的某種基因應於未來宿主生物體中表現,則該基因的編碼序列應就該未來宿主生物體的密碼子使用來調整(即密碼子使用最佳化)。 上述問題進一步藉由用於發酵生產胍基乙酸(GAA)之方法來解決,該方法包含下列步驟:a) 在適合的條件下,在適合的培養基中培養根據如上述所定義之本發明之微生物,以及b) 在該培養基中累積GAA,以形成含有GAA之發酵液。 本發明之方法可進一步包含從發酵液單離GAA的步驟。 根據本發明之方法可進一步包含將含有GAA之發酵液乾燥和/或造粒的步驟。 本發明進一步關注如上所定義之微生物,其進一步包含編碼具有胍基乙酸N-甲基轉移酶(EC: 2.1.1.2)活性的酵素之基因。較佳的是,編碼具有胍基乙酸N-甲基轉移酶活性的酵素之該基因係過度表現。 本發明亦關注一種用於發酵生產肌酸之方法,其包含下列步驟:a) 在適合的條件下,在適合的培養基中,培養如本發明之包含編碼具有胍基乙酸N-甲基轉移酶活性的酵素之基因之微生物,以及b) 在該培養基中累積肌酸,以形成含有肌酸之發酵液。 較佳的是,該方法進一步包含從含有肌酸之發酵液單離肌酸。肌酸可藉由等電點法和/或離子交換法從發酵液萃取。或者,肌酸可藉由在水中再結晶的方法進一步純化。
實驗章節 A) 材料及方法 化學品來自康黴素鏈黴菌( Streptomyces kanamyceticus)之康黴素溶液是購自Sigma Aldrich (St. Louis, USA, Cat. no. K0254)。IPTG(異丙基 β-D-1-硫代半乳哌喃糖苷)是購自Carl-Roth (Karlsruhe, Germany, Cat. no. 2316.4.)。如果沒有特別說明,所有其他化學品都是分析級純度,購自Merck (Darmstadt, Germany)、Sigma Aldrich (St. Louis, USA)或Carl-Roth (Karlsruhe, Germany)。 用於細胞增生之培養如果沒有特別說明,培養/培育程序按以下方式進行: a.   使用來自Merck (Darmstadt, Germany; Cat. no. 110285)的LB培養液(MILLER),在液體培養基中培養大腸桿菌菌株。液體培養物(每100 ml艾氏錐形燒瓶裝10 ml液體培養物,具有3個檔版)在來自Infors GmbH (Bottmingen, Switzerland)的Infors HT Multitron標準震盪培養箱中以30℃和200 rpm的速度培養。 b.   使用來自Merck (Darmstadt, Germany, Cat. no. 110283)的LB瓊脂(MILLER),用於在瓊脂平板上培養大腸桿菌菌株。瓊脂平板是在來自VWR (Radnor, USA)的INCU-Line®迷你培養箱中於30°C下培養。 c.    使用來自Merck (Darmstadt, Germany, Cat. no. 110493)腦心浸出培養液(BHI),在液體培養基中培養麩胺酸棒狀桿菌菌株。液體培養物(每100 ml艾氏錐形燒瓶裝10 ml液體培養物,具有3個檔板)在來自Infors GmbH (Bottmingen, Switzerland)的Infors HT Multitron標準震盪培養箱中以30℃和200 rpm的速度培養。 d.   使用來自Merck (Darmstadt, Germany, Cat. no. 113825)的腦心瓊脂(BHI-agar),用於在瓊脂平板上培養麩胺酸棒狀桿菌菌株。瓊脂平板是在具有Kelvitron®溫度控制器的Heraeus Instruments (Hanau, Germany)的孵化器中於30°C下培養。 e.    為了在電穿孔後培養麩胺酸棒狀桿菌,BHI-瓊脂(Merck, Darmstadt, Germany, Cat. no. 113825)係補充以134 g/l的山梨醇(Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe, Germany)、2.5 g/l的酵母萃取物(Oxoid/ThermoFisher Scientific, Waltham, USA, Cat. no. LP0021)和25 mg/l的康黴素。瓊脂平板是在具有Kelvitron®溫度控制器的Heraeus Instruments (Hanau, Germany)的孵化器中於30°C下培養。 判定細菌懸浮液的光學密度a.   搖瓶培養物中細菌懸浮液的光學密度是在 600 nm (OD600)下使用來自Eppendorf AG (Hamburg, Germany)的BioPhotometer來判定。 b.   在Wouter Duetz (WDS)微型發酵系統 (24孔盤)中所產生的細菌懸浮液的光學密度是在 660 nm (OD660)下以來自Tecan Group AG (Männedorf, Switzerland)的GENios™讀盤儀來判定。 離心a.   最大體積為2 ml的細菌懸浮液是使用Eppendorf 5417 R實驗台式離心機於1.5 ml或2 ml反應管(例如Eppendorf Tubes® 3810X)中離心(5 min.,在13.000 rpm下)。 b.   最大體積為50 ml的細菌懸浮液是使用Eppendorf 5810 R實驗台式離心機於15 ml或50 ml離心管(例如FalconTM 50 ml錐形離心管)中在4.000 rpm下離心10 min.。 DNA 單離根據製造商的說明書,質體DNA是使用來自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep Kit (Hilden, Germany, Cat. No. 27106),從大腸桿菌細胞單離出。 聚合酶連鎖反應 (PCR)使用校正(高保真)式聚合酶進行PCR,擴增所欲之DNA片段,用於桑格氏定序(Sanger sequencing)或DNA組裝。非校正式聚合酶套組用於直接從大腸桿菌或麩胺酸棒狀桿菌菌落判定存有或未有所欲之DNA片段。 a.   根據製造商的說明書,來自New England BioLabs Inc.的Phusion® 高保真DNA聚合酶套組(Phusion Kit) (Ipswich, USA, Cat. No. M0530)用於對選定的DNA區域的模板正確擴增(template-correct amplification)(見表2)。
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b.   來自Qiagen (Hilden, Germany, Cat. No.201203) 的Taq PCR核心套組(Taq Kit)是用以擴增所欲之DNA片段,以確認其存在。該套組是根據製造商的說明書來使用(見表3)。
Figure 02_image009
c.    根據製造商的說明書,使用來自Takara Bio Inc (Takara Bio Europe S.A.S., Saint-Germain-en-Laye, France, Cat. No. RR350A/B)的SapphireAmp® Fast PCR Master Mix (Sapphire Mix)作為替代,以確認從大腸桿菌或麩胺酸棒狀桿菌菌落所取得的細胞中存在所欲之DNA片段(見表4)。
Figure 02_image011
d.   所有的寡核苷酸引子都是由Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Germany)使用McBride及Caruthers (1983)所述的亞磷醯胺法(phosphoramidite method)來合成。 e.    作為PCR模板,使用適當稀釋的單離質體DNA溶液或從液體培養物中分離的總DNA或細菌菌落中含有的總DNA (菌落PCR)。對於所述的菌落PCR,模板的製備方法,是用牙籤從瓊脂平板上的菌落取出細胞材料,並將細胞材料直接放入PCR反應管中。在來自SEVERIN Elektrogeräte GmbH (Sundern, Germany)的Mikrowave & Grill型微波爐中用800 W加熱細胞材料10秒鐘,並接著將PCR試劑加入PCR反應管中的模板。 f.    所有PCR反應均在來自Eppendorf AG (Hamburg, Germany)的Mastercycler或Mastercycler nexus gradient型PCR循環器中進行。 DNA 之限制酶消化對於限制酶消化,使用"FastDigest限制性內切酶 (FD)"(ThermoFisher Scientific, Waltham, USA)或來自New England BioLabs Inc. (Ipswich, USA)的限制性內切酶。反應是根據製造商手冊的說明進行。 判定 DNA 片段大小a.   小的DNA片段(<1000 bps)的大小通常使用來自Qiagen (Hilden, Germany)的QIAxcel,藉由自動化毛細管電泳判定。 b.   如果DNA片段需要被單離或如果DNA片段 > 1000 bps,則藉由TAE瓊脂糖凝膠電泳分離DNA,並用GelRed®核酸凝膠染色劑(Biotium, Inc., Fremont, Canada)染色。經染色之DNA在302 nm下來觀察。 PCR 擴增片段和限制性片段的純化根據製造商的說明書,使用來自Qiagen公司的QIAquick PCR純化套組 (Hilden, Germany; Cat. No. 28106),將PCR擴增片段和限制性片段清理。用30 µl 10 mM Tris*HCl (pH 8.5)沖提DNA。 判定 DNA 濃度DNA濃度是使用來自PEQLAB Biotechnologie GmbH (2015年起,為VWR品牌 (Erlangen, Germany))的NanoDrop分光光度計ND-1000測量。 組裝選殖質體載體係使用"NEBuilder HiFi DNA組裝選殖套組"組裝,該套組購自New England BioLabs Inc. (Ipswich, USA, Cat. No. E5520)。含有線性載體和至少一個DNA插入物的反應混合物在50℃下培育60 min。每個轉形實驗使用0.5 µl的組裝混合物。 大腸桿菌的化學轉形對於質體選殖,根據製造商的實驗操作程序,將化學勝任型的"NEB® Stable Competent E. coli(High Efficiency)" (New England BioLabs Inc., Ipswich, USA, Cat. No. C3040)轉形。在增補以25 mg/l的康黴素的LB瓊脂上選擇經成功轉形的細胞。 麩胺酸棒狀桿菌的轉形如Ruan等人(2015)所述,以質體DNA的麩胺酸棒狀桿菌轉形是使用"Gene Pulser Xcell"(Bio-Rad Laboratories GmbH, Feldkirchen, Germany),經由電穿孔來進行。電穿孔是在1 mm的電穿孔光析管(Bio-Rad Laboratories GmbH, Feldkirchen, Germany)中、1.8 kV下及固定時間常數設定5 ms來進行。經轉形之細胞是在含有134 g/l的山梨糖醇、2.5 g/l酵母萃取物和25 mg/l的康黴素的BHI瓊脂上來選擇。 判定核苷酸序列DNA分子的核苷酸序列是由Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Germany)藉由循環定序來判定,使用Sanger等人的雙去氧鏈終止法(Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74, 5463 - 5467, 1977)。來自Scientific & Educational Software (Denver, USA)的Clonemanager Professional 9軟體用以可視化和評估序列。 大腸桿菌及麩胺酸棒狀桿菌的甘油保存菌種為了長期儲存大腸桿菌和麩胺酸棒狀桿菌株,製備甘油保存菌種。選定的大腸桿菌選殖株在增補2 g/l 葡萄糖的10 ml LB培養基中來培養。選定的麩胺酸棒狀桿菌選殖株在增補2 g/l 葡萄糖的10 ml 二倍濃縮BHI培養基中來培養。生長含有質體的大腸桿菌和麩胺酸棒狀桿菌菌株的培養基增補以25 mg/l的康黴素。培養基裝在具有3個檔板的100ml 艾氏錐形燒瓶中。將其接種取自菌落的接種環細胞。培養物接著在30℃和200 rpm下培養18 h。培養結束後,將1.2 ml的85% (v/v) 的無菌甘油加入培養物中。接著將所獲得的含甘油的細胞懸浮液等分為每份2 ml,並儲存在-80℃。 毫升規模培養中的 GAA 生產使用根據Duetz(2007)之毫升規模培養系統,以評估菌株的GAA生產。為此目的,使用來自EnzyScreen BV (Heemstede, Netherlands, Cat. no. CR1424)的24孔深孔微量盤(24孔WDS盤),每孔裝有2.5 ml培養基。 菌株的預培養是在10 ml種菌培養基(SM)中來完成。培養基裝在具有3個檔板的100ml 艾氏錐形燒瓶中。接種100 µl的甘油保存菌種培養物,且培養物在30℃和200 rpm下培養24 h。種菌培養基(SM)的組成顯示在表5中。
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在上述培育期後,判定預培養物的光學密度OD600。從預培養物取樣接種2.5 ml的生產培養基(PM)至OD600為0.1所需的體積,離心(8000 g離心1 min)並丟棄上清液。接著將細胞重懸浮在100 µl的生產培養基中。 主培養物是藉由將24孔WDS盤的含有2.4 ml 生產培養基(PM)各孔接種100 µl的來自預培養的重懸浮細胞而開始。生產培養基(PM)的組成顯示在表6中。
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主培養物在來自Infors GmbH (Bottmingen, Switzerland)的Infors HT Multitron標準震盪培養箱中以30℃和300 rpm培養72 h,直到完全消耗葡萄糖。懸浮液中的葡萄糖濃度用來自LifeScan (Johnson & Johnson Medical GmbH, Neuss, Germany)的OneTouch Vita®血糖儀來分析。 培養後,將培養懸浮液轉移到深孔微量盤。一部分培養懸浮液經適當稀釋以測量OD660。另一部分培養懸浮液經離心,且上清液中的GAA濃度依下文所述來分析。 判定酵母菌蛋白腖 FM902 中的 L- 精胺酸和甘胺酸含量由於酵母萃取物FM902 (Angel Yeast Co.,LTD, Hubei, P.R.China)含有各種胜肽和胺基酸,其L-精胺酸和甘胺酸的含量測定如下。 針對測量游離胺基酸,將1 g的酵母萃取物溶於20 ml的水中以製備樣本。將該溶液加水至總體積為25 ml,充分混合並使用0.2 µM的尼龍針筒過濾器過濾。 為了測量總胺基酸(游離胺基酸加上結合於胜肽中的胺基酸),樣本是藉由將1 g酵母萃取物溶解在10 ml的6M HCl中並在110℃下培養24 h來製備。接著,加水至總體積為25 ml。將溶液充分混合,且用0.2 µM的尼龍針筒過濾器過濾。 使用來自SYKAM Vertriebs GmbH (Fürstenfeldbruck, Germany)的SYKAM S433胺基酸分析儀,藉由離子交換層析術判定樣本中L-精胺酸和甘胺酸的濃度。作為固相,使用來自SYKAM的球形聚苯乙烯系陽離子交換劑(Peek LCA N04/Na,尺寸150 x 4.6 mm)。取決於L-胺基酸,分離是在等度運作中進行,使用緩衝液A和B的混合物來沖提,或使用該等緩衝液來梯度沖提。作為緩衝液A,使用20 l中含有263 g的檸檬酸三鈉、120 g的檸檬酸、1100 ml的甲醇、100 ml的37%HCl和2 ml的辛酸(最終pH為3.5)的水溶液。作為緩衝液B,使用20 l中含有392 g的檸檬酸三鈉、100 g的硼酸和2 ml的辛酸(最終pH為10.2)的水溶液。游離胺基酸是透過管柱後衍生用茚三酮著色,並在570 nm下光度偵測。 表7顯示在酵母萃取物FM902(Angel Yeast Co.,LTD, Hubei, P.R.China)中所判定的游離和總L-精胺酸和甘胺酸的含量,以及在生產培養基(PM)中的所獲得量。
Figure 02_image017
GAA 的定量樣本是以來自Agilent的分析系統來分析,該系統由HPLC "Infinity 1260"偶接質量分析儀"Triple Quad 6420" (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, USA)組成。層析分離是在Atlantis HILIC氧化矽管柱、4.6X250mm、5 μm (Waters Corporation, Milford, USA)上、35℃下來完成。流動相A是伴有10 mM甲酸銨的水和0.2%甲酸。流動相B是90%乙腈和10%水的混合物,10 mM的甲酸銨加入該混合物。HPLC系統從100%的B開始,接以線性梯度22 min及0.6 mL/min的恆定流速,至66%的B。質量分析儀在ESI正離子化模式下運作。為了偵測GAA,m/z值是使用MRM碎片化[M+H]+118 - 76來監測。GAA的定量極限(LOQ)固定在7 ppm。 B) 實驗結果 實施例 1 :選殖編碼來自阿拉伯芥的乙醛酸胺基轉移酶的基因 GGT1阿拉伯芥的基因GGT1 (Genbank登錄號NM_102180,SEQ ID No:1)編碼麩胺酸:乙醛酸胺基轉移酶(Genbank登錄號NP_564192,SEQ ID NO:2)。該蛋白質已顯示催化反應為乙醛酸+L-丙胺酸 = 甘胺酸+丙酮酸(EC 2.6.1.44)、2-側氧基戊二酸+L-丙胺酸 = L-麩胺酸+丙酮酸(EC 2.6.1.2)、和2-側氧基戊二酸+甘胺酸=乙醛酸+L-麩胺酸(EC 2.6.1.4;Liepman AH, Olsen LJ., Plant Physiol. 2003 Jan;131(1):215-27. doi: 10.1104/pp.011460)。 使用軟體工具"Codon Optimization Tool"(Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, Iowa, USA),將GGT1蛋白的胺基酸序列轉譯回針對麩胺酸棒狀桿菌的密碼子使用而最佳化的DNA序列。在開讀框的上游直接加入夏因-達爾加諾序列(AGGAAAGGAGAGGATTG; Shi, 2018),並在所得序列的兩端擴展出用於後續次選殖的模體。所得的DNA序列AtGGT1_opt_RBS (SEQ ID NO:3)從Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Germany)訂購用於基因合成,其以賦予安比西林抗性的選殖質體(名稱定為pEX-A258-AtGGT1_opt_RBS)的一部分交付。 實施例 2 :選殖編碼來自阿拉伯芥的乙醛酸胺基轉移酶的基因 GGT2阿拉伯芥的基因AOAT2 (同義詞:GGT2) (Genbank登錄號NM_001036185,SEQ ID NO:4)編碼丙胺酸-2-側氧基戊二酸胺基轉移酶2(Genbank登錄號NP_001031262,SEQ ID NO:5)。該蛋白質已顯示催化反應為乙醛酸+L-丙胺酸 =甘胺酸+丙酮酸(EC 2.6.1.44)、2-側氧基戊二酸+L-丙胺酸=L-麩胺酸+丙酮酸(EC 2.6.1.2)、和2-側氧基戊二酸+甘胺酸=乙醛酸+L-麩胺酸(EC 2.6.1.4;Liepman AH, Olsen LJ., Plant Physiol. 2003 Jan;131(1):215-27. doi: 10.1104/pp.011460)。 使用軟體工具"Codon Optimization Tool"(Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, Iowa, USA),將GGT2蛋白的胺基酸序列轉譯回針對麩胺酸棒狀桿菌的密碼子使用而最佳化的DNA序列。在開讀框的上游直接加入夏因-達爾加諾序列(AGGAAAGGAGAGGATTG; Shi, 2018),並在所得序列的兩端擴展出用於後續次選殖的模體。所得的DNA序列AtGGT2_opt_RBS (SEQ ID NO:6)從Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Germany)訂購用於基因合成,其以賦予安比西林抗性的選殖質體(名稱定為pEX-A258-AtGGT2_opt_RBS)的一部分交付。 實施例 3 :選殖編碼來自濱海熱球菌的乙醛酸胺基轉移酶的基因 agt 濱海熱球菌( Thermococcus litoralis)的基因 agt(Genbank登錄號AB033996, SEQ ID NO:7)編碼丙胺酸:乙醛酸胺基轉移酶(Genbank登錄號BAB40321, SEQ ID NO:8)。該蛋白質已顯示催化反應為乙醛酸+L-丙胺酸= 甘胺酸+丙酮酸 (EC 2.6.1.44)及乙醛酸+L-絲胺酸=甘胺酸+3-羥基丙酮酸 (EC 2.6.1.45;Sakuraba, 2004)。 使用軟體工具"Codon Optimization Tool"(Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, Iowa, USA),將Agt蛋白的胺基酸序列轉譯回針對麩胺酸棒狀桿菌的密碼子使用而最佳化的DNA序列。在開讀框的上游直接加入夏因-達爾加諾序列(AGGAAAGGAGAGGATTG; Shi, 2018),並在所得序列的兩端擴展出用於後續次選殖的模體。所得的DNA序列 (SEQ ID NO:9)從Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Germany)訂購用於基因合成,其以賦予安比西林抗性的選殖質體(名稱定為pEX-A258-AGT_Tl_opt_RBS)的一部分交付。 實施例 4 :選殖來自產代謝物莫雷阿氏菌 ( Moorea producens) 的編碼 L- 精胺酸:甘胺酸甲脒基轉移酶 (AGAT, EC 2.1.4.1) 之基因 AGAT_Mp產代謝物莫雷阿氏菌是一種絲狀的藍綠菌。產代謝物莫雷阿氏菌菌株PAL-8-15-08-1的基因體由Leao等人發表(Leao T, Castelão G, Korobeynikov A, Monroe EA, Podell S, Glukhov E, Allen EE, Gerwick WH, Gerwick L, Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Mar 21;114(12):3198-3203. doi: 10.1073/pnas.1618556114;Genbank登錄號CP017599.1)。它含有開讀框,推定為編碼L-精胺酸:甘胺酸甲脒基轉移酶(AGAT,EC 2.1.4.1;SEQ ID NO:10中顯示的locus_tag BJP34_00300)。SEQ ID NO:11顯示衍生的胺基酸序列(Genbank登錄號WP_070390602)。 使用軟體工具"GeneOptimizer"(Geneart/ThermoFisher Scientific, Waltham, USA),將此胺基酸序列轉譯回針對麩胺酸棒狀桿菌的密碼子使用而最佳化的DNA序列。它的末端用組裝選殖的序列及在開讀框的上游5個鹼基對加入夏因-達爾加諾序列(AGGA)來擴展。所得的DNA序列 (SEQ ID NO:12)從Invitrogen/Geneart (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)訂購用於基因合成,其以選殖質體(名稱定為pMA-T_AGAT_Mp)的一部分交付。 實施例 5 :將 AGAT_Mp 複殖至表現質體 pEC-XK99E 大腸桿菌-麩胺酸棒狀桿菌穿梭質體pEC-XK99E (Genbank登錄號AY219682)使用限制性內切酶SmaI來消化。末端磷酸是使用"FastAP熱敏性鹼性磷酸酶"(Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)來移除。DNA接著以"QIAquick PCR Purification Kit" (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)來純化。 選殖質體pMA-T_AGAT_Mp以MluI+AatII來消化,且所得的片段用"Fast DNA End Repair Kit" (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)來平端化。藉由瓊脂糖凝膠電泳(在TAE緩衝液中的0.8%的瓊脂糖)將它們分離,且切出與"AGAT_Mp "對應的條帶(1174 bp)。其DNA是使用"QIAquick Gel Extraction Kit" (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)來純化。 AGAT_Mp片段和線性化的pEC-XK99E是使用"Ready-To-Go T4 DNA連接酶"(GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Germany)來連接。將連接產物轉形至"NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency)" (New England Biolabs, Ipswich, USA),且細胞是生長在含有25 mg/l康黴素的LB瓊脂上。藉由限制性酶消化和DNA定序鑑定適當的選殖株。所得的質體名為pEC-XK99E_AGAT_Mp。 實施例 6 :將乙醛酸胺基轉移酶基因複殖至表現質體 pEC-XK99E_AGAT_Mp 質體pEC-XK99E_AGAT_Mp是使用限制性內切酶BamHI來消化,且末端磷酸是使用"FastAP熱敏性鹼性磷酸酶"(Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)來移除。接著,經消化之DNA以"QIAquick Gel Extraction Kit"(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)來純化。 選殖質體pEX-A258-AtGGT1_opt_RBS、pEX-A258-AtGGT2_opt_RBS和pEX-A258-AGT_Tl_opt_RBS各用BamHI和BsaI消化。經切割之質體是使用"QIAquick PCR Purification Kit"(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)來純化。 經消化之pEC-XK99E_AGAT_Mp是使用"Ready-To-Go T4 DNA ligase"(GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Germany)各與經消化之選殖質體連接。將連接產物轉形至"NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency)" (New England Biolabs, Ipswich, USA),且細胞是生長在含有25 mg/l康黴素的LB瓊脂上。藉由限制性酶消化和DNA定序鑑定適當的選殖株。 所得的質體顯示在表8中。它們提供AGAT_Mp基因和各自的乙醛酸胺基轉移酶,其結構類似於強IPTG誘導trc啟動子控制下的操縱組。
Figure 02_image019
實施例 7 :在 ATCC13032 中的 carAB 操縱組上游染色體插入 sod 啟動子為了改善L-精胺酸的生產,強 sod-啟動子係插入至ATCC13032的基因體中的 carAB操縱組的上游。因此,質體pK18mobsacB_Psod-carAB被構建如下。pK18mobsacB (Schäfer, 1994)是用EcoRI+HindIII切割,並從瓊脂糖凝膠切出經線性化之載體DNA(5670 bp)。DNA是使用"QIAquick PCR Purification Kit"(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)來萃取。 為了構建插入物,三個DNA片段是藉由PCR用以下引子對(以ATCC13032的基因體DNA為模板)來產出: PsodcarAB-LA-F (SEQ ID NO:13)+PsodcarAB-LA-R (SEQ ID NO:14) =左同源臂(1025 bp) PsodcarAB-F (SEQ ID NO:15)+PsodcarAB-R (SEQ ID NO:16) =sod-啟動子 (250 bps) PsodcarAB-RA-F SEQ ID NO:17)+PsodcarAB-RA-R (SEQ ID NO:18) =右同源臂(944 bp) 產物DNA是使用"QIAquick PCR Purification Kit" (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)來純化。接著,經線形化之質體及PCR產物係使用"NEBuilder HiFi DNA組裝選殖套組"(New England BioLabs Inc., Ipswich, USA, Cat. No. E5520)組裝。適當的質體選殖株是藉由限制性消化和DNA定序來鑑定。 所得的質體pK18mobsacB_Psod-carAB是接著藉由電穿孔轉形至ATCC13032中。染色體整合(由第一次重組事件產生)是藉由增補有134 g/l的山梨糖醇、2.5 g/l酵母萃取物和25 mg/l的康黴素的BHI瓊脂上平板培養來選擇。瓊脂平板在33℃下培養48 h。 將單個菌落轉移到新鮮的瓊脂平板上(含25 mg/l的康黴素)並在33℃下培養24 h。這些選殖株的液體培養物在置於具有3個檔板的100ml 艾氏錐形燒瓶中的10 ml的BHI培養基中,在33℃下培養24 h。為了分離出遇到第二次重組事件的選殖株,從每個液體培養物中取等分試樣,經適當稀釋並在增補以10%蔗糖的BHI瓊脂上平板培養(通常是100至200 µl)。這些瓊脂平板在33℃下培養48 h。接著,生長在含蔗糖瓊脂平板上的菌落檢驗康黴素敏感性。為此,用牙籤從菌落移取細胞物質,並將其轉移到含有25 mg/l康黴素的BHI瓊脂和含有10%蔗糖的BHI瓊脂上。瓊脂平板在33℃下培養60 h。經證明對康黴素敏感且對蔗糖有抗性的選殖株是藉由PCR和DNA定序來檢驗 sod啟動子之適當整合。所得的菌株名為ATCC13032_Psod-carAB。 實施例 8 :染色體刪除麩胺酸棒狀桿菌 ATCC13032 中的基因 aceB (NCgl2247) 為了減少乙醛酸到L-蘋果酸的代謝通量,刪除ATCC13032菌株中編碼蘋果酸合成酶(EC 2.3.3.9)的基因aceB(NCgl2247)。 因此,質體pK18mobsacB_DaceB被構建如下。使用XbaI切割質體pK18mobsacB (Schäfer, 1994),且經線性化之載體DNA(5721 bp)是使用"QIAquick Gel Extraction Kit"(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)來純化。 為了構建插入物,二個DNA片段是藉由PCR用以下引子對(以ATCC13032的基因體DNA為模板)來產出: 1f-aceB-D2_vec (SEQ ID NO:19)+1r-aceB-D2_aceB (SEQ ID NO:20) =左同源臂(1065 bp) 2f-aceB-D2_aceB (SEQ ID NO:21)+2r-aceB_D2_Vec (SEQ ID NO:22) =左同源臂(1080 bp) 產物DNA是使用"QIAquick PCR Purification Kit" (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)來純化。 接著,經線形化之質體及PCR產物係使用"NEBuilder HiFi DNA組裝選殖套組"(New England BioLabs Inc., Ipswich, USA, Cat. No. E5520)組裝。所得的刪除載體名為pK18mobsacB_DaceB。它藉由限制性酶消化和DNA定序來驗證。 為了刪除aceB基因,pK18mobsacB_DaceB藉由電穿孔轉形至ATCC13032中。染色體整合(由第一次重組事件產生)是藉由增補有134 g/l的山梨糖醇、2.5 g/l酵母萃取物和25 mg/l的康黴素的BHI瓊脂上平板培養來選擇。瓊脂平板在33℃下培養48 h。 將單個菌落轉移到新鮮的瓊脂平板上(含25 mg/l的康黴素)並在33℃下培養24 h。這些選殖株的液體培養物在置於具有3個檔板的100ml 艾氏錐形燒瓶中的10 ml的BHI培養基中,在33℃下培養24 h。為了分離出遇到第二次重組事件的選殖株,從每個液體培養物中取等分試樣,經適當稀釋並在增補以10%蔗糖的BHI瓊脂上平板培養(通常是100至200 µl)。這些瓊脂平板在33℃下培養48小時。接著檢查在含有糖的瓊脂平板上生長的菌落對康黴素的敏感性。為此,用牙籤從菌落移取細胞物質,並將其轉移到含有25 mg/l康黴素的BHI瓊脂和含有10%蔗糖的BHI瓊脂上。瓊脂平板在33℃下培養60 h。經證明對康黴素敏感且對蔗糖有抗性的選殖株是藉由PCR和DNA定序來檢驗sod啟動子之適當整合。所得的菌株名為ATCC13032_DaceB。 實施例 9 :染色體刪除麩胺酸棒狀桿菌 ATCC13032_Psod-carAB 中的基因 aceB (NCgl2247) 為了減少乙醛酸到L-蘋果酸的代謝通量, ATCC13032_Psod-carAB菌株中編碼蘋果酸合成酶(EC 2.3.3.9)的基因 aceB(NCgl2247)將被刪除。 為了刪除 aceB基因,pK18mobsacB_DaceB藉由電穿孔轉形至ATCC13032_Psod-carAB中。染色體整合(由第一次重組事件產生)是藉由增補有134 g/l的山梨糖醇、2.5 g/l酵母萃取物和25 mg/l的康黴素的BHI瓊脂上平板培養來選擇。瓊脂平板在33℃下培養48 h。 將單個菌落轉移到新鮮的瓊脂平板上(含25 mg/l的康黴素)並在33℃下培養24 h。這些選殖株的液體培養物在置於具有3個檔板的100ml 艾氏錐形燒瓶中的10 ml的BHI培養基中,在33℃下培養24 h。為了分離出遇到第二次重組事件的選殖株,從每個液體培養物中取等分試樣,經適當稀釋並在增補以10%蔗糖的BHI瓊脂上平板培養(通常是100至200 µl)。這些瓊脂平板在33℃下培養48小時。接著檢查在含有糖的瓊脂平板上生長的菌落對康黴素的敏感性。為此,用牙籤從菌落移取細胞物質,並將其轉移到含有25 mg/l康黴素的BHI瓊脂和含有10%蔗糖的BHI瓊脂上。瓊脂平板在33℃下培養60 h。經證明對康黴素敏感且對蔗糖有抗性的選殖株是藉由PCR和DNA定序來檢驗sod啟動子之適當整合。所得的菌株名為ATCC13032_Psod-carAB_DaceB。
Figure 02_image021
實施例 10 :以各種表現載體的麩胺酸棒狀桿菌菌株的轉形藉由電穿孔將下列麩胺酸棒狀桿菌菌株用質體來轉形(表10)。用25 mg/l的康黴素篩選含有質體的細胞。 ˙   -麩胺酸棒狀桿菌 ATCC13032:常用的野生型菌株(Kinoshita等人,J. Gen. Appl. Microbiol. 1957; 3(3): 193-205) ˙   麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032_DaceB:ATCC13032中,由於aceB基因的染色體刪除,蘋果酸合成酶的活性降低 ˙   -麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032_Psod-carAB_DaceB:ATCC13032中,由於 aceB基因的染色體刪除,蘋果酸合成酶的活性降低,且由於carAB上游的強sod啟動子的染色體整合,生產L-精胺酸的能力增加
Figure 02_image023
實施例 11 :蘋果酸合成酶的活性減少對 GAA 生產的影響。為了評估蘋果酸合成酶的酵素活性減少對GAA生產的影響,菌株ATCC13032/pEC-XK99E、ATCC13032/pEC-XK99E_AGAT_Mp、及ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp在Wouter Duetz系統中培養,且判定所得到的GAA效價(titer)。生產培養基(PM)含有40 g/l的D-葡萄糖和1.90 g/l的L-精胺酸,但沒有另外的甘胺酸。
Figure 02_image025
如表11所示,菌株ATCC13032/pEC-XK99E沒有生產可偵測到的GAA量。 菌株ATCC13032/pEC-XK99E_AGAT_Mp具有編碼來自產代謝物莫雷阿氏菌的AGAT的多核苷酸,生產122 mg/L的GAA。 菌株ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp具有編碼來自產代謝物莫雷阿氏菌的AGAT的多核苷酸,以及經刪除之aceB基因,生產155 mg/L的GAA。 結論是,在酵素AGAT活性存在下,蘋果酸合成酶的酵素活性的減少改善GAA的生產。 實施例 12 :蘋果酸合成酶的活性減少併以乙醛酸胺基轉移酶的活性增加對 GAA 生產的影響。為了評估蘋果酸合成酶的酵素活性減少併以乙醛酸胺基轉移酶的活性增加對GAA生產的影響,菌株 ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT1、 ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT2、及 ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AGT_Tl在Wouter Duetz系統中培養,且判定所得到的GAA效價(titer)。生產培養基(PM)含有40 g/l的D-葡萄糖和1.90 g/l的L-精胺酸,但沒有另外的甘胺酸。
Figure 02_image027
如表12所示,菌株ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp具有編碼來自產代謝物莫雷阿氏菌的AGAT的多核苷酸,以及經刪除之 aceB基因,生產155 mg/L的GAA。 菌株ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT1、ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT2、及 ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AGT_Tl亦具有編碼來自產代謝物莫雷阿氏菌的AGAT的多核苷酸以及經刪除之 aceB基因。此外,各菌株具有編碼乙醛酸胺基轉移酶的多核苷酸。這些菌株分別生產236 mg/l、242 mg/l、和180 mg/l的GAA。 結論是,在酵素AGAT活性存在下,蘋果酸合成酶活性降低及乙醛酸胺基轉移酶活性增加的組合改善GAA的生產。 實施例 13 :蘋果酸合成酶的活性減少併以生產 L- 精胺酸的能力增加對 GAA 生產的影響。為了評估蘋果酸合成酶的酵素活性減少合併生產L-精胺酸的能力增加對GAA生產的影響,菌株ATCC13032_DaceB/ pEC-XK99E_AGAT_Mp及ATCC13032_Psod-carAB_DaceB/ pEC-XK99E_AGAT_Mp在Wouter Duetz系統中培養,且判定所得到的GAA效價(titer)。由於在染色體基因 carAcarB的上游插入強sod啟動子,後者菌株具有經改善之生產L-精胺酸的能力。生產培養基(PM)含有40 g/l的D-葡萄糖和1.90 g/l的L-精胺酸,但沒有另外的甘胺酸。
Figure 02_image029
如表13所示,菌株ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp具有編碼來自產代謝物莫雷阿氏菌的AGAT的多核苷酸,以及經刪除之 aceB基因,生產155 mg/L的GAA。 菌株ATCC13032_Psod-carAB_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp亦具有編碼來自產代謝物莫雷阿氏菌的AGAT的多核苷酸,以及經刪除之aceB基因。此外,其具有增加的生產L-精胺酸的能力。此菌株生產243 mg/l的GAA。 結論是,在酵素AGAT活性存在下,蘋果酸合成酶活性降低以及生產L-精胺酸的能力增加的組合,改善GAA的生產。 實施例 14 :蘋果酸合成酶活性降低、乙醛酸胺基轉移酶活性增加、以及生產 L- 精胺酸的能力增加對 GAA 生產的組合影響。為了評估蘋果酸合成酶活性降低、乙醛酸胺基轉移酶活性增加、以及生產L-精胺酸的能力增加對GAA生產的組合影響,菌株ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT1、ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT2、 ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AGT_Tl、 ATCC13032_Psod-carAB_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT1、ATCC13032_Psod-carAB_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT2、及ATCC13032_Psod-carAB_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AGT_Tl在Wouter Duetz系統中培養,且判定所得到的GAA效價(titer)。由於在染色體基因carA和carB的上游插入強sod啟動子,後三個菌株具有經改善之生產L-精胺酸的能力。生產培養基(PM)含有40 g/l的D-葡萄糖和1.90 g/l的L-精胺酸,但沒有另外的甘胺酸。
Figure 02_image031
如表14所示,菌株ATCC13032_DaceB/ pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT1、ATCC13032_DaceB/ pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT2、及ATCC13032_DaceB/ pEC-XK99E_AGAT_Mp_AGT_Tl具有編碼來自產代謝物莫雷阿氏菌的AGAT的多核苷酸、經刪除之aceB基因、以及編碼乙醛酸胺基轉移酶的多核苷酸,分別生產236 mg/l、242 mg/l、和180 mg/l的GAA。 菌株ATCC13032_Psod-carAB_DaceB/ pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT1、ATCC13032_Psod-carAB_DaceB/ pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT2、及 ATCC13032_Psod-carAB_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AGT_Tl亦具有編碼來自產代謝物莫雷阿氏菌的AGAT的多核苷酸、經刪除之aceB基因、以及編碼乙醛酸胺基轉移酶的多核苷酸。此外,它們具有增加的生產L-精胺酸的能力。這些菌株分別生產362 mg/l、354 mg/l、和331 mg/l的GAA。 結論是,酵素AGAT活性、蘋果酸合成酶活性降低、乙醛酸胺基轉移酶合成酶活性增加、以及生產L-精胺酸的能力增加的組合改善GAA生產。
                         【序 列 表】
          <![CDATA[<110>  德商贏創運營有限公司(Evonik Operations GmbH)]]>
          <![CDATA[<120>  發酵生產胍基乙酸之方法]]>
          <![CDATA[<130>  202000177]]>
          <![CDATA[<140>  TW110124747]]>
          <![CDATA[<141>  2021-07-06]]>
          <![CDATA[<150>  EP20184966.8]]>
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          ctcttcgtct ggaatctcca ccacattttt attctcttca aaaattatct gcttctattt       60
          ttataattaa gcaagaacgg tcttcgtagc ataaaaacga gacacggata tagagatatc      120
          gtgaattgac ttttgtctga caaatcctct tcgtcaattt cagtggctct gctgcttcct      180
          ttgttgtgaa gccacataga ttagattgag gaatgatcca aactcatgtc atacacacat      240
          ttgtaatctg ctacacaaaa tacttttaaa atcacacaca ctaatatttt aactctcccc      300
          actctttgcc ttgcccttgg ctctagaacc gaacgtgact ctccagatag acttttggag      360
          tcacaacatt gagtttgaag aggagggaag aagtgagcta gggattggtt cagagtgaac      420
          ataa atg gct ctc aag gca tta gac tac gat act ctg aat gaa aac gtc       469
               Met Ala Leu Lys Ala Leu Asp Tyr Asp Thr Leu Asn Glu Asn Val          
               1               5                   10                  15           
          aag aag tgt cag tat gcc gta aga ggt gaa ctt tat ctc cga gct tct        517
          Lys Lys Cys Gln Tyr Ala Val Arg Gly Glu Leu Tyr Leu Arg Ala Ser           
                          20                  25                  30                
          gag ctg cag aaa gaa ggc aaa aag att att ttc aca aac gtt ggg aac        565
          Glu Leu Gln Lys Glu Gly Lys Lys Ile Ile Phe Thr Asn Val Gly Asn           
                      35                  40                  45                    
          cct cat gct tta gga cag aag cca ttg aca ttt cct cgc cag gtg gtt        613
          Pro His Ala Leu Gly Gln Lys Pro Leu Thr Phe Pro Arg Gln Val Val           
                  50                  55                  60                        
          gcg ctt tgc caa gct ccg ttt cta cta gat gac cca aat gtt gga atg        661
          Ala Leu Cys Gln Ala Pro Phe Leu Leu Asp Asp Pro Asn Val Gly Met           
              65                  70                  75                            
          cta ttt cca gct gat gct att gca aga gct aaa cat tat ctt tcc ttg        709
          Leu Phe Pro Ala Asp Ala Ile Ala Arg Ala Lys His Tyr Leu Ser Leu           
          80                  85                  90                  95            
          act tca ggc ggt tta ggt gct tac agt gat tca aga ggc ctt cca gga        757
          Thr Ser Gly Gly Leu Gly Ala Tyr Ser Asp Ser Arg Gly Leu Pro Gly           
                          100                 105                 110               
          gtt agg aaa gag gtt gct gag ttc att caa cgg cgt gat ggg tat cca        805
          Val Arg Lys Glu Val Ala Glu Phe Ile Gln Arg Arg Asp Gly Tyr Pro           
                      115                 120                 125                   
          agt gac cca gaa ctc atc ttt ctc act gat gga gct agc aaa ggt gtg        853
          Ser Asp Pro Glu Leu Ile Phe Leu Thr Asp Gly Ala Ser Lys Gly Val           
                  130                 135                 140                       
          atg caa atc ttg aat tgt gtt ata cgc ggt aat gga gat ggg att cta        901
          Met Gln Ile Leu Asn Cys Val Ile Arg Gly Asn Gly Asp Gly Ile Leu           
              145                 150                 155                           
          gtt ccg gtt cca cag tat cca ctt tac tca gct acc ata tca ctg tta        949
          Val Pro Val Pro Gln Tyr Pro Leu Tyr Ser Ala Thr Ile Ser Leu Leu           
          160                 165                 170                 175           
          ggt ggt act ctt gtt cct tac tat ctt gat gag tct gaa aac tgg gga        997
          Gly Gly Thr Leu Val Pro Tyr Tyr Leu Asp Glu Ser Glu Asn Trp Gly           
                          180                 185                 190               
          ctt gat gtt gct aac ctt cga caa tcc gtt gct cag gct cgt tct caa       1045
          Leu Asp Val Ala Asn Leu Arg Gln Ser Val Ala Gln Ala Arg Ser Gln           
                      195                 200                 205                   
          ggg ata aca gta agg gca atg gtg atc att aac cct ggg aac cca act       1093
          Gly Ile Thr Val Arg Ala Met Val Ile Ile Asn Pro Gly Asn Pro Thr           
                  210                 215                 220                       
          ggc cag tgt cta agc gaa gct aac ata aga gag ata ttg aag ttc tgt       1141
          Gly Gln Cys Leu Ser Glu Ala Asn Ile Arg Glu Ile Leu Lys Phe Cys           
              225                 230                 235                           
          tat aac gag aaa ctg gtt ctt ctg gga gac gag gtt tat cag cag aac       1189
          Tyr Asn Glu Lys Leu Val Leu Leu Gly Asp Glu Val Tyr Gln Gln Asn           
          240                 245                 250                 255           
          ata tac cag gat gag cgt ccc ttt atc agc tcc aag aag gtt ttg atg       1237
          Ile Tyr Gln Asp Glu Arg Pro Phe Ile Ser Ser Lys Lys Val Leu Met           
                          260                 265                 270               
          gaa atg ggt tcg ccg ttc agc aag gaa gtt cag ctt gta tct ttt cac       1285
          Glu Met Gly Ser Pro Phe Ser Lys Glu Val Gln Leu Val Ser Phe His           
                      275                 280                 285                   
          aca gtc tct aaa gga tat tgg ggt gaa tgt gga cag cga ggt gga tac       1333
          Thr Val Ser Lys Gly Tyr Trp Gly Glu Cys Gly Gln Arg Gly Gly Tyr           
                  290                 295                 300                       
          ttt gag atg acc aac ctc cct cca agg gtt gtt gag gag ata tac aag       1381
          Phe Glu Met Thr Asn Leu Pro Pro Arg Val Val Glu Glu Ile Tyr Lys           
              305                 310                 315                           
          gtt gca tca att gcc ctc agc cct aat gtc tct gcg caa atc ttt atg       1429
          Val Ala Ser Ile Ala Leu Ser Pro Asn Val Ser Ala Gln Ile Phe Met           
          320                 325                 330                 335           
          ggt ttg atg gtt aat cct cca aag cct gga gac att tca tat gac cag       1477
          Gly Leu Met Val Asn Pro Pro Lys Pro Gly Asp Ile Ser Tyr Asp Gln           
                          340                 345                 350               
          ttc gcc cgt gaa agc aag ggg att ctt gaa tct ttg aga aga aga gca       1525
          Phe Ala Arg Glu Ser Lys Gly Ile Leu Glu Ser Leu Arg Arg Arg Ala           
                      355                 360                 365                   
          agg ctc atg aca gat gga ttc aac agc tgc aaa aac gtc gtg tgc aat       1573
          Arg Leu Met Thr Asp Gly Phe Asn Ser Cys Lys Asn Val Val Cys Asn           
                  370                 375                 380                       
          ttc aca gaa ggt gca atg tat tcg ttt cct caa ata cgg tta cca acg       1621
          Phe Thr Glu Gly Ala Met Tyr Ser Phe Pro Gln Ile Arg Leu Pro Thr           
              385                 390                 395                           
          gga gct ctc caa gct gca aaa caa gct gga aaa gtg cca gac gtt ttc       1669
          Gly Ala Leu Gln Ala Ala Lys Gln Ala Gly Lys Val Pro Asp Val Phe           
          400                 405                 410                 415           
          tac tgt ctc aag ctc tta gaa gcc aca gga atc tcc aca gta cct ggc       1717
          Tyr Cys Leu Lys Leu Leu Glu Ala Thr Gly Ile Ser Thr Val Pro Gly           
                          420                 425                 430               
          tct gga ttt gga cag aaa gaa ggt gtg ttc cat ctg agg aca aca atc       1765
          Ser Gly Phe Gly Gln Lys Glu Gly Val Phe His Leu Arg Thr Thr Ile           
                      435                 440                 445                   
          ctg cca gca gaa gat gag atg ccg gag atc atg gat agc ttc aag aag       1813
          Leu Pro Ala Glu Asp Glu Met Pro Glu Ile Met Asp Ser Phe Lys Lys           
                  450                 455                 460                       
          ttc aac gac gag ttc atg act cag tat gat aat aac ttt ggt tat tcg       1861
          Phe Asn Asp Glu Phe Met Thr Gln Tyr Asp Asn Asn Phe Gly Tyr Ser           
              465                 470                 475                           
          aaa atg tga ttacttcttc ttctgaacga ctattgtgtt ctgctacact               1910
          Lys Met                                                                   
          480                                                                       
          ctttaaagct aaatctctgt agtacactct ttctctttgc cctattctat aaaccatatc     1970
          tctctctttg tgtctctttt ttttgggtgt aaactctctc ttgtgtctct atttctattt     2030
          tcaattggaa actgattaag atcttttctc aatgaaatga agtttaggcc atagattatt     2090
          ttttttaatc aacggtgata gccttttttt agtgtggcaa tgtgaaattt gtaattatgc     2150
          taattatatt aaagaaaata ataataatcc atgtcctagt ttgtttttga ttatg          2205
          <![CDATA[<210>  2]]>
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  阿拉伯芥]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          Met Ala Leu Lys Ala Leu Asp Tyr Asp Thr Leu Asn Glu Asn Val Lys 
          1               5                   10                  15      
          Lys Cys Gln Tyr Ala Val Arg Gly Glu Leu Tyr Leu Arg Ala Ser Glu 
                      20                  25                  30          
          Leu Gln Lys Glu Gly Lys Lys Ile Ile Phe Thr Asn Val Gly Asn Pro 
                  35                  40                  45              
          His Ala Leu Gly Gln Lys Pro Leu Thr Phe Pro Arg Gln Val Val Ala 
              50                  55                  60                  
          Leu Cys Gln Ala Pro Phe Leu Leu Asp Asp Pro Asn Val Gly Met Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Pro Ala Asp Ala Ile Ala Arg Ala Lys His Tyr Leu Ser Leu Thr 
                          85                  90                  95      
          Ser Gly Gly Leu Gly Ala Tyr Ser Asp Ser Arg Gly Leu Pro Gly Val 
                      100                 105                 110         
          Arg Lys Glu Val Ala Glu Phe Ile Gln Arg Arg Asp Gly Tyr Pro Ser 
                  115                 120                 125             
          Asp Pro Glu Leu Ile Phe Leu Thr Asp Gly Ala Ser Lys Gly Val Met 
              130                 135                 140                 
          Gln Ile Leu Asn Cys Val Ile Arg Gly Asn Gly Asp Gly Ile Leu Val 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Val Pro Gln Tyr Pro Leu Tyr Ser Ala Thr Ile Ser Leu Leu Gly 
                          165                 170                 175     
          Gly Thr Leu Val Pro Tyr Tyr Leu Asp Glu Ser Glu Asn Trp Gly Leu 
                      180                 185                 190         
          Asp Val Ala Asn Leu Arg Gln Ser Val Ala Gln Ala Arg Ser Gln Gly 
                  195                 200                 205             
          Ile Thr Val Arg Ala Met Val Ile Ile Asn Pro Gly Asn Pro Thr Gly 
              210                 215                 220                 
          Gln Cys Leu Ser Glu Ala Asn Ile Arg Glu Ile Leu Lys Phe Cys Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Asn Glu Lys Leu Val Leu Leu Gly Asp Glu Val Tyr Gln Gln Asn Ile 
                          245                 250                 255     
          Tyr Gln Asp Glu Arg Pro Phe Ile Ser Ser Lys Lys Val Leu Met Glu 
                      260                 265                 270         
          Met Gly Ser Pro Phe Ser Lys Glu Val Gln Leu Val Ser Phe His Thr 
                  275                 280                 285             
          Val Ser Lys Gly Tyr Trp Gly Glu Cys Gly Gln Arg Gly Gly Tyr Phe 
              290                 295                 300                 
          Glu Met Thr Asn Leu Pro Pro Arg Val Val Glu Glu Ile Tyr Lys Val 
          305                 310                 315                 320 
          Ala Ser Ile Ala Leu Ser Pro Asn Val Ser Ala Gln Ile Phe Met Gly 
                          325                 330                 335     
          Leu Met Val Asn Pro Pro Lys Pro Gly Asp Ile Ser Tyr Asp Gln Phe 
                      340                 345                 350         
          Ala Arg Glu Ser Lys Gly Ile Leu Glu Ser Leu Arg Arg Arg Ala Arg 
                  355                 360                 365             
          Leu Met Thr Asp Gly Phe Asn Ser Cys Lys Asn Val Val Cys Asn Phe 
              370                 375                 380                 
          Thr Glu Gly Ala Met Tyr Ser Phe Pro Gln Ile Arg Leu Pro Thr Gly 
          385                 390                 395                 400 
          Ala Leu Gln Ala Ala Lys Gln Ala Gly Lys Val Pro Asp Val Phe Tyr 
                          405                 410                 415     
          Cys Leu Lys Leu Leu Glu Ala Thr Gly Ile Ser Thr Val Pro Gly Ser 
                      420                 425                 430         
          Gly Phe Gly Gln Lys Glu Gly Val Phe His Leu Arg Thr Thr Ile Leu 
                  435                 440                 445             
          Pro Ala Glu Asp Glu Met Pro Glu Ile Met Asp Ser Phe Lys Lys Phe 
              450                 455                 460                 
          Asn Asp Glu Phe Met Thr Gln Tyr Asp Asn Asn Phe Gly Tyr Ser Lys 
          465                 470                 475                 480 
          Met 
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  1560]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  合成 DNA]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          ggtctcccaa gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccgacgtc aggaaaggag       60
          aggattgatg gcgctgaagg ccctcgatta cgacacgctg aatgagaacg tcaaaaaatg      120
          ccaatatgct gtgcggggcg agttgtatct tcgtgcctcc gagctgcaaa aagagggcaa      180
          aaagattatt ttcaccaacg taggaaatcc tcacgccttg ggccagaagc cacttacgtt      240
          cccgcggcaa gttgttgcgc tttgccaagc accattcctg ctggatgatc ctaacgtagg      300
          tatgttgttc ccggctgacg cgattgcccg ggctaagcat tacctgtctc tgacttcggg      360
          tggtcttggc gcttactcgg attcacgcgg cttgccaggt gtccggaaag aggtggctga      420
          gtttattcaa cggcgggacg gctacccatc agaccctgaa ctcatctttc ttacggatgg      480
          tgcttctaaa ggtgtaatgc aaattctcaa ctgtgtgatt cgcggtaatg gagatggtat      540
          ccttgtcccg gtcccacagt atccactgta ctccgcgact atttctcttc tcggcggaac      600
          gctggttccg tattatttgg acgaatcgga gaattggggc ctcgacgtag ccaaccttcg      660
          tcagagcgtc gcacaggcgc gttcacaagg catcactgtc cgggcgatgg ttattattaa      720
          cccgggaaac ccgactggac aatgcttgag cgaagcaaat attcgtgaga tccttaaatt      780
          ttgctacaac gagaagctgg tactcctcgg agatgaggtt taccaacaaa acatttatca      840
          ggatgaacgg ccttttatct cgtcaaagaa ggtactgatg gagatgggtt ctcctttcag      900
          caaagaagta cagctggtca gcttccatac tgtctctaag ggttattggg gtgaatgtgg      960
          ccagcgcggc ggctacttcg aaatgactaa cctcccccct cgcgtcgtgg aagagatcta     1020
          taaggttgca tctattgctt tgtcgcccaa cgtatcggcc cagatcttta tgggactgat     1080
          ggtaaacccc cctaaacctg gagacattag ctacgaccag ttcgcgcgtg aatctaaggg     1140
          tatccttgaa tcccttcgtc gccgcgcgcg tctgatgact gacggattca attcatgtaa     1200
          gaacgtagta tgcaacttca cggaaggcgc gatgtactct ttcccccaga tccgtcttcc     1260
          aaccggtgca ctccaggctg ctaagcaggc gggaaaggtg cccgatgtgt tttattgtct     1320
          caaattgttg gaggcgaccg gcatctccac tgttccaggc agcggctttg gacagaagga     1380
          gggagttttt catctgcgta cgactatcct tcctgccgag gatgagatgc ctgaaattat     1440
          ggattctttc aagaagttta acgacgagtt catgactcaa tatgacaata atttcggata     1500
          ctccaaaatg taataaggat ccccgggtac cgagctcgaa ttcactggcc gtcggagacc     1560
          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<211>  1817]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  阿拉伯芥]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  CDS]]>
          <![CDATA[<222>  (148)..(1593)]]>
          <![CDATA[<223>  GGT2]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          ataaaaaacc aatctttatg atcgactcaa taagtcaaat cttgttgtgt taagtgaaat       60
          ctatagtagt gaaagggtct ccacttagct gtttgagggg aagtgaggaa tcattttgct      120
          tttagctttg aaaagtaaat cctggaa atg tct ctc aag gcg tta gac tac gag      174
                                        Met Ser Leu Lys Ala Leu Asp Tyr Glu         
                                        1               5                           
          tcc ttg aat gaa aac gtg aag aat tgt cag tat gca gtc aga ggt gaa        222
          Ser Leu Asn Glu Asn Val Lys Asn Cys Gln Tyr Ala Val Arg Gly Glu           
          10                  15                  20                  25            
          ctt tat ctt cgt gct tct gag ctt cag aaa gaa ggc aaa aag att att        270
          Leu Tyr Leu Arg Ala Ser Glu Leu Gln Lys Glu Gly Lys Lys Ile Ile           
                          30                  35                  40                
          ttc aca aat gtt gga aac cct cat gct tta gga cag aaa cct ctg act        318
          Phe Thr Asn Val Gly Asn Pro His Ala Leu Gly Gln Lys Pro Leu Thr           
                      45                  50                  55                    
          ttt cct cgt cag gtg gtt tct tta tgc caa gca cca ttt ctg tta gat        366
          Phe Pro Arg Gln Val Val Ser Leu Cys Gln Ala Pro Phe Leu Leu Asp           
                  60                  65                  70                        
          gat cca aat gtt ggt atg ata ttc cca gca gat gct att gca aga gct        414
          Asp Pro Asn Val Gly Met Ile Phe Pro Ala Asp Ala Ile Ala Arg Ala           
              75                  80                  85                            
          aag cat tat ctt tcc ttg act tct ggt ggt ctt ggt gct tac agt gac        462
          Lys His Tyr Leu Ser Leu Thr Ser Gly Gly Leu Gly Ala Tyr Ser Asp           
          90                  95                  100                 105           
          tca aga ggt ctt ccg gga gtt cgg aaa gaa gtc gct gag ttc att gaa        510
          Ser Arg Gly Leu Pro Gly Val Arg Lys Glu Val Ala Glu Phe Ile Glu           
                          110                 115                 120               
          cgg cgt gat gga tat cca agc gat cca gaa ctc ata ttt cta act gat        558
          Arg Arg Asp Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Glu Leu Ile Phe Leu Thr Asp           
                      125                 130                 135                   
          gga gcg agc aaa ggt gtg atg caa atc ttg aat tgt gtc ata cgc ggt        606
          Gly Ala Ser Lys Gly Val Met Gln Ile Leu Asn Cys Val Ile Arg Gly           
                  140                 145                 150                       
          cag aaa gac gga att ctg gtt cca gtt cca cag tat cca ctc tac tcg        654
          Gln Lys Asp Gly Ile Leu Val Pro Val Pro Gln Tyr Pro Leu Tyr Ser           
              155                 160                 165                           
          gct act ata tct ctg tta ggt ggt act ctt gtt cct tac tat ctt gaa        702
          Ala Thr Ile Ser Leu Leu Gly Gly Thr Leu Val Pro Tyr Tyr Leu Glu           
          170                 175                 180                 185           
          gag tct gaa aac tgg gga ctt gat gtt aac aac ctt cgc caa tct gtt        750
          Glu Ser Glu Asn Trp Gly Leu Asp Val Asn Asn Leu Arg Gln Ser Val           
                          190                 195                 200               
          gct caa gct cgc tct caa gga ata aca gta agg gca atg gtg att att        798
          Ala Gln Ala Arg Ser Gln Gly Ile Thr Val Arg Ala Met Val Ile Ile           
                      205                 210                 215                   
          aac ccc gga aac cca act ggc cag tgt ctt agc gaa gct aac ata aga        846
          Asn Pro Gly Asn Pro Thr Gly Gln Cys Leu Ser Glu Ala Asn Ile Arg           
                  220                 225                 230                       
          gag ata cta cgg ttc tgt tgt gat gag aga tta gtt ctt ctc gga gac        894
          Glu Ile Leu Arg Phe Cys Cys Asp Glu Arg Leu Val Leu Leu Gly Asp           
              235                 240                 245                           
          gaa gtg tat cag caa aat ata tac caa gat gaa cgt ccc ttt atc agt        942
          Glu Val Tyr Gln Gln Asn Ile Tyr Gln Asp Glu Arg Pro Phe Ile Ser           
          250                 255                 260                 265           
          tcc aag aag gtt ttg atg gat atg gga gca ccg atc agc aag gaa gtt        990
          Ser Lys Lys Val Leu Met Asp Met Gly Ala Pro Ile Ser Lys Glu Val           
                          270                 275                 280               
          cag ctc ata tct ttc cac acc gtt tcc aaa gga tac tgg ggc gaa tgt       1038
          Gln Leu Ile Ser Phe His Thr Val Ser Lys Gly Tyr Trp Gly Glu Cys           
                      285                 290                 295                   
          ggg caa cgg gga ggt tac ttt gag atg aca aat atc cct ccc agg acc       1086
          Gly Gln Arg Gly Gly Tyr Phe Glu Met Thr Asn Ile Pro Pro Arg Thr           
                  300                 305                 310                       
          gtt gag gag ata tac aag gtg gcc tct ata gct ctc agc ccc aac gtc       1134
          Val Glu Glu Ile Tyr Lys Val Ala Ser Ile Ala Leu Ser Pro Asn Val           
              315                 320                 325                           
          tct gcg cag ata ttt atg ggt tta atg gtt agc cca cca aag cct gga       1182
          Ser Ala Gln Ile Phe Met Gly Leu Met Val Ser Pro Pro Lys Pro Gly           
          330                 335                 340                 345           
          gac att tca tat gac caa ttc gtt cgt gag agc aag gga ata cta gaa       1230
          Asp Ile Ser Tyr Asp Gln Phe Val Arg Glu Ser Lys Gly Ile Leu Glu           
                          350                 355                 360               
          tca ctg aga aga aga gca agg atg atg act gat gga ttc aac agc tgc       1278
          Ser Leu Arg Arg Arg Ala Arg Met Met Thr Asp Gly Phe Asn Ser Cys           
                      365                 370                 375                   
          aaa aac gtc gtc tgt aat ttc aca gaa ggt gct atg tat tca ttc cct       1326
          Lys Asn Val Val Cys Asn Phe Thr Glu Gly Ala Met Tyr Ser Phe Pro           
                  380                 385                 390                       
          caa ata aag ttg ccg tcg aaa gca atc caa gca gca aaa caa gcc gga       1374
          Gln Ile Lys Leu Pro Ser Lys Ala Ile Gln Ala Ala Lys Gln Ala Gly           
              395                 400                 405                           
          aaa gtc cct gac gtt ttc tac tgc ctt aag ctc tta gaa gcc aca gga       1422
          Lys Val Pro Asp Val Phe Tyr Cys Leu Lys Leu Leu Glu Ala Thr Gly           
          410                 415                 420                 425           
          atc tcc aca gtt cca ggc tct gga ttt gga caa aaa gaa ggg gtg ttt       1470
          Ile Ser Thr Val Pro Gly Ser Gly Phe Gly Gln Lys Glu Gly Val Phe           
                          430                 435                 440               
          cat tta agg aca aca att ctg cca gca gaa gaa gaa atg cca gag att       1518
          His Leu Arg Thr Thr Ile Leu Pro Ala Glu Glu Glu Met Pro Glu Ile           
                      445                 450                 455                   
          atg gac agt ttc aaa aag ttc aat gat gag ttt atg tct cag tac gct       1566
          Met Asp Ser Phe Lys Lys Phe Asn Asp Glu Phe Met Ser Gln Tyr Ala           
                  460                 465                 470                       
          gat aac ttt ggt tac tcc aga atg tga aaaagaaagg acttagagtc             1613
          Asp Asn Phe Gly Tyr Ser Arg Met                                           
              475                 480                                               
          agagtcagag atcacttctt cttctttcac gacattatta ttgtctattc acactcttaa     1673
          aaagcaataa gtactggtcc tactctgtgt caaactcttc ttggtgctct taaaaccttt     1733
          gtatctattg ttaccaattt gtgtgactca cacacacaca cacacaaatc tctaatgttc     1793
          aattatatgg taaatggttt attt                                            1817
          <![CDATA[<210>  5]]>
          <![CDATA[<211>  481]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  阿拉伯芥]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          Met Ser Leu Lys Ala Leu Asp Tyr Glu Ser Leu Asn Glu Asn Val Lys 
          1               5                   10                  15      
          Asn Cys Gln Tyr Ala Val Arg Gly Glu Leu Tyr Leu Arg Ala Ser Glu 
                      20                  25                  30          
          Leu Gln Lys Glu Gly Lys Lys Ile Ile Phe Thr Asn Val Gly Asn Pro 
                  35                  40                  45              
          His Ala Leu Gly Gln Lys Pro Leu Thr Phe Pro Arg Gln Val Val Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Cys Gln Ala Pro Phe Leu Leu Asp Asp Pro Asn Val Gly Met Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Pro Ala Asp Ala Ile Ala Arg Ala Lys His Tyr Leu Ser Leu Thr 
                          85                  90                  95      
          Ser Gly Gly Leu Gly Ala Tyr Ser Asp Ser Arg Gly Leu Pro Gly Val 
                      100                 105                 110         
          Arg Lys Glu Val Ala Glu Phe Ile Glu Arg Arg Asp Gly Tyr Pro Ser 
                  115                 120                 125             
          Asp Pro Glu Leu Ile Phe Leu Thr Asp Gly Ala Ser Lys Gly Val Met 
              130                 135                 140                 
          Gln Ile Leu Asn Cys Val Ile Arg Gly Gln Lys Asp Gly Ile Leu Val 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Val Pro Gln Tyr Pro Leu Tyr Ser Ala Thr Ile Ser Leu Leu Gly 
                          165                 170                 175     
          Gly Thr Leu Val Pro Tyr Tyr Leu Glu Glu Ser Glu Asn Trp Gly Leu 
                      180                 185                 190         
          Asp Val Asn Asn Leu Arg Gln Ser Val Ala Gln Ala Arg Ser Gln Gly 
                  195                 200                 205             
          Ile Thr Val Arg Ala Met Val Ile Ile Asn Pro Gly Asn Pro Thr Gly 
              210                 215                 220                 
          Gln Cys Leu Ser Glu Ala Asn Ile Arg Glu Ile Leu Arg Phe Cys Cys 
          225                 230                 235                 240 
          Asp Glu Arg Leu Val Leu Leu Gly Asp Glu Val Tyr Gln Gln Asn Ile 
                          245                 250                 255     
          Tyr Gln Asp Glu Arg Pro Phe Ile Ser Ser Lys Lys Val Leu Met Asp 
                      260                 265                 270         
          Met Gly Ala Pro Ile Ser Lys Glu Val Gln Leu Ile Ser Phe His Thr 
                  275                 280                 285             
          Val Ser Lys Gly Tyr Trp Gly Glu Cys Gly Gln Arg Gly Gly Tyr Phe 
              290                 295                 300                 
          Glu Met Thr Asn Ile Pro Pro Arg Thr Val Glu Glu Ile Tyr Lys Val 
          305                 310                 315                 320 
          Ala Ser Ile Ala Leu Ser Pro Asn Val Ser Ala Gln Ile Phe Met Gly 
                          325                 330                 335     
          Leu Met Val Ser Pro Pro Lys Pro Gly Asp Ile Ser Tyr Asp Gln Phe 
                      340                 345                 350         
          Val Arg Glu Ser Lys Gly Ile Leu Glu Ser Leu Arg Arg Arg Ala Arg 
                  355                 360                 365             
          Met Met Thr Asp Gly Phe Asn Ser Cys Lys Asn Val Val Cys Asn Phe 
              370                 375                 380                 
          Thr Glu Gly Ala Met Tyr Ser Phe Pro Gln Ile Lys Leu Pro Ser Lys 
          385                 390                 395                 400 
          Ala Ile Gln Ala Ala Lys Gln Ala Gly Lys Val Pro Asp Val Phe Tyr 
                          405                 410                 415     
          Cys Leu Lys Leu Leu Glu Ala Thr Gly Ile Ser Thr Val Pro Gly Ser 
                      420                 425                 430         
          Gly Phe Gly Gln Lys Glu Gly Val Phe His Leu Arg Thr Thr Ile Leu 
                  435                 440                 445             
          Pro Ala Glu Glu Glu Met Pro Glu Ile Met Asp Ser Phe Lys Lys Phe 
              450                 455                 460                 
          Asn Asp Glu Phe Met Ser Gln Tyr Ala Asp Asn Phe Gly Tyr Ser Arg 
          465                 470                 475                 480 
          Met 
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  1560]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  合成 DNA]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          ggtctcccaa gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccgacgtc aggaaaggag       60
          aggattgatg tccctcaagg ctttggacta cgaatctttg aacgaaaacg ttaaaaattg      120
          tcagtatgcg gtccggggtg aactctatct gcgtgcttcc gagttgcaaa aagagggtaa      180
          aaaaatcatt tttactaacg tcggaaaccc acacgcattg ggacagaagc cacttacctt      240
          tccacggcaa gttgtgtcgc tctgtcaggc tccttttttg ttggacgacc ccaacgtagg      300
          tatgatcttt ccggcagatg ccatcgcccg ggcgaagcat tatttgtcac ttacctcggg      360
          tggactcgga gcatattctg attcgcgggg actcccaggt gtacgtaaag aagtcgccga      420
          gttcattgaa cgccgtgatg gctacccctc cgatccggaa ctcatttttc ttacggacgg      480
          agcgtcgaaa ggagttatgc aaattctcaa ctgtgtgatt cgcggccaga aggatggtat      540
          tctggtgcca gttccgcaat accctctgta ttccgcaact atttcgctcc tcggtggaac      600
          gcttgtcccc tattatttgg aggagtccga gaattggggc ctcgacgtaa ataatctgcg      660
          gcaatccgtt gctcaggccc ggtcgcaggg aattactgtt cgtgcgatgg tcatcatcaa      720
          tcccggcaac ccgactggac aatgcctgtc cgaggctaac attcgcgaga ttctccgttt      780
          ttgctgtgac gaacggttgg ttttgcttgg agatgaagtt tatcaacaaa atatttatca      840
          ggacgagcgg ccattcatca gctcaaagaa ggtattgatg gatatgggcg ctccaattag      900
          caaggaggtc cagcttatct catttcacac tgtttcgaag ggctactggg gcgaatgcgg      960
          tcagcggggt ggttacttcg aaatgacgaa tatcccccca cgtaccgtgg aagagattta     1020
          taaggttgcc tcgattgcac tttcgccaaa cgtatccgcg cagattttta tgggcctgat     1080
          ggtatctccc ccaaagcccg gtgacatttc ctacgatcaa ttcgtgcggg aatcaaaagg     1140
          aattcttgaa tcattgcgcc ggcgcgcccg tatgatgact gatggcttca atagctgcaa     1200
          aaacgttgta tgcaacttta ccgagggtgc aatgtattct ttccctcaga ttaagctccc     1260
          ttcgaaggct atccaggcgg cgaagcaagc gggaaaagtg ccagatgtct tttactgcct     1320
          caaactgctg gaagcgaccg gaatctccac ggtcccgggc tctggattcg gccaaaagga     1380
          aggagtattt catctccgga ctaccattct gccggccgag gaagaaatgc cagagatcat     1440
          ggacagcttc aaaaaattca atgacgaatt tatgtcgcag tatgccgata acttcggcta     1500
          ttcgcggatg taataaggat ccccgggtac cgagctcgaa ttcactggcc gtcggagacc     1560
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  2406]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  濱海熱球菌(Thermococcus litoralis)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  CDS]]>
          <![CDATA[<222>  (196)..(1419)]]>
          <![CDATA[<223>  AGT]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          tctagaagca ctccccgtgg aggtgccttc ggatctttcc agagttctat ttcatagaat       60
          ttctcaatca tcttaattcc attttccgga atttgtcgtg ttataaacac cttgggcttc      120
          atggtatttc cccttctaag ataatggtca aaacgtataa atatctttat gaagattagt      180
          taatggtgat gttga atg gat tac aca aaa tac cta gcc gga agg gcg aat       231
                           Met Asp Tyr Thr Lys Tyr Leu Ala Gly Arg Ala Asn          
                           1               5                   10                   
          tgg att aag ggc tca gct ttg gct gat gtg atg aaa aag gct tca gaa        279
          Trp Ile Lys Gly Ser Ala Leu Ala Asp Val Met Lys Lys Ala Ser Glu           
                  15                  20                  25                        
          ctc caa aag aaa ggg gta aag cta att tct ctc gca gct gga gat cca        327
          Leu Gln Lys Lys Gly Val Lys Leu Ile Ser Leu Ala Ala Gly Asp Pro           
              30                  35                  40                            
          gat ccg gag tta att cca aga gct gtt ctt ggg gaa ata gca aaa gaa        375
          Asp Pro Glu Leu Ile Pro Arg Ala Val Leu Gly Glu Ile Ala Lys Glu           
          45                  50                  55                  60            
          gtt ctt gaa aag gaa cca aaa tcc gtt atg tat act ccg gca aat gga        423
          Val Leu Glu Lys Glu Pro Lys Ser Val Met Tyr Thr Pro Ala Asn Gly           
                          65                  70                  75                
          atc ccg gag ctt agg gaa gag ctg gca gca ttc ttg aaa aaa tac gac        471
          Ile Pro Glu Leu Arg Glu Glu Leu Ala Ala Phe Leu Lys Lys Tyr Asp           
                      80                  85                  90                    
          cat tta gaa gtt tct cca gaa aac att gtt att aca ata gga gga acg        519
          His Leu Glu Val Ser Pro Glu Asn Ile Val Ile Thr Ile Gly Gly Thr           
                  95                  100                 105                       
          gga gca ttg gat ctt ctt gga agg gtt ttg ata gac cct gga gat gtc        567
          Gly Ala Leu Asp Leu Leu Gly Arg Val Leu Ile Asp Pro Gly Asp Val           
              110                 115                 120                           
          gtg ata aca gag aac cca tcg tac ata aac aca tta ttg gca ttt gaa        615
          Val Ile Thr Glu Asn Pro Ser Tyr Ile Asn Thr Leu Leu Ala Phe Glu           
          125                 130                 135                 140           
          cag ttg gga gcc aaa att gag ggg gtt cca gtt gat aac gat ggg atg        663
          Gln Leu Gly Ala Lys Ile Glu Gly Val Pro Val Asp Asn Asp Gly Met           
                          145                 150                 155               
          agg gtt gat ctg ttg gag gag aaa ata aag gag ctt aaa gct aaa gga        711
          Arg Val Asp Leu Leu Glu Glu Lys Ile Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly           
                      160                 165                 170                   
          cag aaa gtt aag ctg atc tac acc atc ccg act ggt cag aat cca atg        759
          Gln Lys Val Lys Leu Ile Tyr Thr Ile Pro Thr Gly Gln Asn Pro Met           
                  175                 180                 185                       
          ggc gtc act atg agc atg gaa cgg aga aag gca cta ctt gag att gcc        807
          Gly Val Thr Met Ser Met Glu Arg Arg Lys Ala Leu Leu Glu Ile Ala           
              190                 195                 200                           
          tct aaa tac gac ctc cta ata att gag gac act gct tat aat ttc atg        855
          Ser Lys Tyr Asp Leu Leu Ile Ile Glu Asp Thr Ala Tyr Asn Phe Met           
          205                 210                 215                 220           
          aga tat gaa gga ggg gat ata gtc ccc tta aag gct ttg gac aat gaa        903
          Arg Tyr Glu Gly Gly Asp Ile Val Pro Leu Lys Ala Leu Asp Asn Glu           
                          225                 230                 235               
          gga aga gtt atc gtg gcg gga acg ctc agc aaa gtc ctt gga aca gga        951
          Gly Arg Val Ile Val Ala Gly Thr Leu Ser Lys Val Leu Gly Thr Gly           
                      240                 245                 250                   
          ttc aga att gga tgg ata ata gca gag gga gaa atc ctc aaa aaa gtt        999
          Phe Arg Ile Gly Trp Ile Ile Ala Glu Gly Glu Ile Leu Lys Lys Val           
                  255                 260                 265                       
          ctc atg cag aaa cag cca att gac ttc tgt gct cca gct att tcc caa       1047
          Leu Met Gln Lys Gln Pro Ile Asp Phe Cys Ala Pro Ala Ile Ser Gln           
              270                 275                 280                           
          tac att gcc cta gaa tac tta aag agg ggc tat ttt gag aag tat cac       1095
          Tyr Ile Ala Leu Glu Tyr Leu Lys Arg Gly Tyr Phe Glu Lys Tyr His           
          285                 290                 295                 300           
          ttg gaa gga gca ctg ctc ggt tat aaa gag aag agg gac atc atg ctg       1143
          Leu Glu Gly Ala Leu Leu Gly Tyr Lys Glu Lys Arg Asp Ile Met Leu           
                          305                 310                 315               
          aag gct ctt gaa aat cac ttg cca aat gca gaa ttt aca aag cca ata       1191
          Lys Ala Leu Glu Asn His Leu Pro Asn Ala Glu Phe Thr Lys Pro Ile           
                      320                 325                 330                   
          gcg gga atg ttt gtt atg ttt ttc ctt cca gag gga gca gat ggc atc       1239
          Ala Gly Met Phe Val Met Phe Phe Leu Pro Glu Gly Ala Asp Gly Ile           
                  335                 340                 345                       
          tca ttt gcc aac gag ctc atg gaa agg gag gga gtt gtg gta gtt cca       1287
          Ser Phe Ala Asn Glu Leu Met Glu Arg Glu Gly Val Val Val Val Pro           
              350                 355                 360                           
          gga aag cct ttc tac aca gac gag tct gga aag aat gct ata agg ctt       1335
          Gly Lys Pro Phe Tyr Thr Asp Glu Ser Gly Lys Asn Ala Ile Arg Leu           
          365                 370                 375                 380           
          aac ttc tca agg cca agc aag gaa gaa att cca ata gga atc aag aaa       1383
          Asn Phe Ser Arg Pro Ser Lys Glu Glu Ile Pro Ile Gly Ile Lys Lys           
                          385                 390                 395               
          ctt gct aag ctt tat aag gaa aag ttt ggc gag tga attctttgtt            1429
          Leu Ala Lys Leu Tyr Lys Glu Lys Phe Gly Glu                               
                      400                 405                                       
          tttacatttt cttctgggcc atcacattct cgatggagag aaggttagtt tgtttttaat     1489
          gcactcagaa aagttctttt tggtgcgggg gcggggattt gaaccccgga acccctacgg     1549
          gacgggaccc tcaatcccgc gcctttgacc aggctcggca acccccgcaa gagcgccgtt     1609
          tatttgtctt cttagtttgt ttataaattt ttctgtcccc tttaaccggg gcgtgtttat     1669
          agtaaccttt attagggttt ttgctgaatt ctttcaggtg gttgtcgtga tccccagatg     1729
          ggatcacaaa ctcaaagacc ctgaaagcgt ggcattcata atcctcgacg ttttagcaga     1789
          cttcgaatca gaaggaaagc tgaagaacct gccaaaaatc caaaaaattt ccagtaaaaa     1849
          caatactggc aatactcctc tttaaacaat actacaacct acccctcaga gacgcccagc     1909
          actacggcag aaaattcttc ggagcaaaca ttcactactc aaccctccac aactgggaga     1969
          aaaagctgaa cctcgaagaa ctgacaaacc acctcctgaa aaaactccag aaattaccct     2029
          acgccagcac tcaagcagac tcaaccatta tcacaaataa aaaaaggaca gaatagaagt     2089
          tcaggcaata acgagaatcc tgccgggttt actgtatccg gttgctgtga agatcacaac     2149
          ttctgagaac gagctgattg aactcctgcc ggagggttct gggaattttt atgctgatgg     2209
          ggcttatgat tcaaagaaag ttctgaacac tgtggtggaa aagggttatc ggccgattgt     2269
          taagaaaact aagaaccctc caggtggttt tggtagtaag aagagagata gagtgttttc     2329
          tgaagaagag tacaggcata ggaatcctca tgaggggttc tggggtgcgt ttacaacgtg     2389
          gtttggcagt aggatcc                                                    2406
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  407]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  濱海熱球菌(Thermococcus litoralis)]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          Met Asp Tyr Thr Lys Tyr Leu Ala Gly Arg Ala Asn Trp Ile Lys Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Leu Ala Asp Val Met Lys Lys Ala Ser Glu Leu Gln Lys Lys 
                      20                  25                  30          
          Gly Val Lys Leu Ile Ser Leu Ala Ala Gly Asp Pro Asp Pro Glu Leu 
                  35                  40                  45              
          Ile Pro Arg Ala Val Leu Gly Glu Ile Ala Lys Glu Val Leu Glu Lys 
              50                  55                  60                  
          Glu Pro Lys Ser Val Met Tyr Thr Pro Ala Asn Gly Ile Pro Glu Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Glu Glu Leu Ala Ala Phe Leu Lys Lys Tyr Asp His Leu Glu Val 
                          85                  90                  95      
          Ser Pro Glu Asn Ile Val Ile Thr Ile Gly Gly Thr Gly Ala Leu Asp 
                      100                 105                 110         
          Leu Leu Gly Arg Val Leu Ile Asp Pro Gly Asp Val Val Ile Thr Glu 
                  115                 120                 125             
          Asn Pro Ser Tyr Ile Asn Thr Leu Leu Ala Phe Glu Gln Leu Gly Ala 
              130                 135                 140                 
          Lys Ile Glu Gly Val Pro Val Asp Asn Asp Gly Met Arg Val Asp Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Glu Glu Lys Ile Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly Gln Lys Val Lys 
                          165                 170                 175     
          Leu Ile Tyr Thr Ile Pro Thr Gly Gln Asn Pro Met Gly Val Thr Met 
                      180                 185                 190         
          Ser Met Glu Arg Arg Lys Ala Leu Leu Glu Ile Ala Ser Lys Tyr Asp 
                  195                 200                 205             
          Leu Leu Ile Ile Glu Asp Thr Ala Tyr Asn Phe Met Arg Tyr Glu Gly 
              210                 215                 220                 
          Gly Asp Ile Val Pro Leu Lys Ala Leu Asp Asn Glu Gly Arg Val Ile 
          225                 230                 235                 240 
          Val Ala Gly Thr Leu Ser Lys Val Leu Gly Thr Gly Phe Arg Ile Gly 
                          245                 250                 255     
          Trp Ile Ile Ala Glu Gly Glu Ile Leu Lys Lys Val Leu Met Gln Lys 
                      260                 265                 270         
          Gln Pro Ile Asp Phe Cys Ala Pro Ala Ile Ser Gln Tyr Ile Ala Leu 
                  275                 280                 285             
          Glu Tyr Leu Lys Arg Gly Tyr Phe Glu Lys Tyr His Leu Glu Gly Ala 
              290                 295                 300                 
          Leu Leu Gly Tyr Lys Glu Lys Arg Asp Ile Met Leu Lys Ala Leu Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Asn His Leu Pro Asn Ala Glu Phe Thr Lys Pro Ile Ala Gly Met Phe 
                          325                 330                 335     
          Val Met Phe Phe Leu Pro Glu Gly Ala Asp Gly Ile Ser Phe Ala Asn 
                      340                 345                 350         
          Glu Leu Met Glu Arg Glu Gly Val Val Val Val Pro Gly Lys Pro Phe 
                  355                 360                 365             
          Tyr Thr Asp Glu Ser Gly Lys Asn Ala Ile Arg Leu Asn Phe Ser Arg 
              370                 375                 380                 
          Pro Ser Lys Glu Glu Ile Pro Ile Gly Ile Lys Lys Leu Ala Lys Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Tyr Lys Glu Lys Phe Gly Glu 
                          405         
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  1338]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  合成 DNA]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          ggtctcccaa gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccgacgtc aggaaaggag       60
          aggattgatg gactatacca aatatcttgc gggccgggct aattggatta agggctctgc      120
          actcgcggac gtaatgaaaa aagcatccga attgcagaaa aagggcgtca aacttatttc      180
          gctcgccgcc ggtgatcctg accccgaact gattccccgt gcagtgttgg gcgagattgc      240
          aaaggaggtc ctcgaaaaag aacctaagtc ggtaatgtac actcccgcca acggcattcc      300
          ggagcttcgg gaggagttgg ccgcttttct caagaagtat gaccaccttg aagtgtctcc      360
          tgagaacatc gtcatcacca ttggcggtac tggtgcactc gatctgcttg gacgtgtact      420
          gatcgatcct ggcgacgtag tcatcacgga aaatccatcg tacattaaca ccctcctcgc      480
          tttcgaacaa ctcggagcaa aaattgaggg agtaccggtg gataacgacg gcatgcgggt      540
          tgaccttctg gaagagaaga tcaaagagtt gaaggctaag ggtcaaaaag tgaaactgat      600
          ttatacgatt ccaaccggac aaaatccaat gggtgtaacg atgtcaatgg aacggcgtaa      660
          ggcgttgctg gagatcgcct caaaatacga tttgctgatc attgaggaca ctgcgtacaa      720
          cttcatgcgg tacgaaggtg gtgatattgt cccgctcaag gcgttggata atgagggacg      780
          tgtgatcgtg gccggaaccc tttcaaaggt actcggcact ggttttcgta ttggctggat      840
          tatcgccgaa ggcgagattt tgaagaaggt tctcatgcag aaacaaccta tcgatttctg      900
          cgcgcccgcg atttcgcagt atattgcgct cgaatatctg aagcgtggat acttcgagaa      960
          gtaccacctt gagggtgcat tgttgggata taaggagaaa cgcgacatca tgctgaaggc     1020
          ccttgagaat catctcccga acgcagaatt caccaagccc atcgcgggta tgttcgtcat     1080
          gttcttcctg ccagaaggtg cggacggcat ctcctttgcg aacgagctca tggagcgcga     1140
          gggcgtagtc gttgtccccg gaaaaccttt ctacactgac gaatccggta aaaacgccat     1200
          tcggctgaat ttctcccgcc cttcaaaaga agagattccc attggaatta aaaaacttgc     1260
          taaactgtat aaagaaaaat tcggtgagta ataaggatcc ccgggtaccg agctcgaatt     1320
          cactggccgt cggagacc                                                   1338
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  1146]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  產代謝物莫雷阿氏菌(Moorea producens)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  CDS]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(1143)]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          atg tcg gaa aaa att gtt aat tcc tgg aat gaa tgg gat gaa ttg gaa         48
          Met Ser Glu Lys Ile Val Asn Ser Trp Asn Glu Trp Asp Glu Leu Glu           
          1               5                   10                  15                
          gaa atg gtg gta gga att gca gac tat gct agc ttt gaa cca aaa gaa         96
          Glu Met Val Val Gly Ile Ala Asp Tyr Ala Ser Phe Glu Pro Lys Glu           
                      20                  25                  30                    
          cca ggg aat cat ccg aaa tta aga aat caa aat tta gcg gaa atc att        144
          Pro Gly Asn His Pro Lys Leu Arg Asn Gln Asn Leu Ala Glu Ile Ile           
                  35                  40                  45                        
          cct ttc ccc agt gga cct aaa gac cct aaa gtc ctt gaa aaa gct aat        192
          Pro Phe Pro Ser Gly Pro Lys Asp Pro Lys Val Leu Glu Lys Ala Asn           
              50                  55                  60                            
          gaa gaa tta aat gga ctg gct tat tta tta aaa gac cac gat gtg ata        240
          Glu Glu Leu Asn Gly Leu Ala Tyr Leu Leu Lys Asp His Asp Val Ile           
          65                  70                  75                  80            
          gta aga aga ccc gaa aaa att gat ttt act aaa tct cta aaa aca cct        288
          Val Arg Arg Pro Glu Lys Ile Asp Phe Thr Lys Ser Leu Lys Thr Pro           
                          85                  90                  95                
          tac ttt gaa gtt gca aat caa tac tgt gga gtc tgt cct cgg gat gtc        336
          Tyr Phe Glu Val Ala Asn Gln Tyr Cys Gly Val Cys Pro Arg Asp Val           
                      100                 105                 110                   
          atg att acc ttt ggg aat gaa atc atg gaa gcg act atg tcg aag aga        384
          Met Ile Thr Phe Gly Asn Glu Ile Met Glu Ala Thr Met Ser Lys Arg           
                  115                 120                 125                       
          gct aga ttt ttt gaa tac tta cct tac cgg aaa ttg gtc tat gaa tat        432
          Ala Arg Phe Phe Glu Tyr Leu Pro Tyr Arg Lys Leu Val Tyr Glu Tyr           
              130                 135                 140                           
          tgg aat aaa gac gag cat atg att tgg aat gct gcg cct aaa ccg act        480
          Trp Asn Lys Asp Glu His Met Ile Trp Asn Ala Ala Pro Lys Pro Thr           
          145                 150                 155                 160           
          atg cag gat agt atg tat cta gag aat ttc tgg gag ctg tct tta gaa        528
          Met Gln Asp Ser Met Tyr Leu Glu Asn Phe Trp Glu Leu Ser Leu Glu           
                          165                 170                 175               
          gaa cga ttt aag cgt atg cat gat ttt gaa ttt tgt att aca caa gat        576
          Glu Arg Phe Lys Arg Met His Asp Phe Glu Phe Cys Ile Thr Gln Asp           
                      180                 185                 190                   
          gaa gta att ttt gat gcg gct gac tgt agc aga tta gga aag gat ata        624
          Glu Val Ile Phe Asp Ala Ala Asp Cys Ser Arg Leu Gly Lys Asp Ile           
                  195                 200                 205                       
          tta gtt cag gaa tcg atg aca aca aat aga aca gga att cgg tgg tta        672
          Leu Val Gln Glu Ser Met Thr Thr Asn Arg Thr Gly Ile Arg Trp Leu           
              210                 215                 220                           
          aaa aag cac cta gaa cca aga gga ttt cgg gtt cac cct gtt cat ttt        720
          Lys Lys His Leu Glu Pro Arg Gly Phe Arg Val His Pro Val His Phe           
          225                 230                 235                 240           
          ccc ctt gat ttt ttc ccc tca cac att gac tgt acg ttt gtt cct ttg        768
          Pro Leu Asp Phe Phe Pro Ser His Ile Asp Cys Thr Phe Val Pro Leu           
                          245                 250                 255               
          cga cca ggt ctt att ttg aca aac cct gaa aga cct ata cgg gaa gag        816
          Arg Pro Gly Leu Ile Leu Thr Asn Pro Glu Arg Pro Ile Arg Glu Glu           
                      260                 265                 270                   
          gag gag aag att ttt aaa gag aat ggc tgg gag ttg atc aca gtt cct        864
          Glu Glu Lys Ile Phe Lys Glu Asn Gly Trp Glu Leu Ile Thr Val Pro           
                  275                 280                 285                       
          caa ccg act tgc tcg aat gat gaa atg cca atg ttt tgc cag tcc agt        912
          Gln Pro Thr Cys Ser Asn Asp Glu Met Pro Met Phe Cys Gln Ser Ser           
              290                 295                 300                           
          aag tgg ttg tca atg aat gtt ctg agt ata tca ccg aca aag gtt atc        960
          Lys Trp Leu Ser Met Asn Val Leu Ser Ile Ser Pro Thr Lys Val Ile           
          305                 310                 315                 320           
          tgt gag gaa aga gaa aaa cct ctc caa gaa ttg ttg gat aag cat gga       1008
          Cys Glu Glu Arg Glu Lys Pro Leu Gln Glu Leu Leu Asp Lys His Gly           
                          325                 330                 335               
          ttt gag gtt ttt cct tta ccc ttt aga cat gtc ttt gaa ttt ggg ggg       1056
          Phe Glu Val Phe Pro Leu Pro Phe Arg His Val Phe Glu Phe Gly Gly           
                      340                 345                 350                   
          tct ttt cat tgt gca act tgg gat att cgc cga aaa ggt gag tgt gaa       1104
          Ser Phe His Cys Ala Thr Trp Asp Ile Arg Arg Lys Gly Glu Cys Glu           
                  355                 360                 365                       
          gat tat tta cca aat tta aac tat caa ccg att tgt ggt taa               1146
          Asp Tyr Leu Pro Asn Leu Asn Tyr Gln Pro Ile Cys Gly                       
              370                 375                 380                           
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  381]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  產代謝物莫雷阿氏菌(Moorea producens)]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          Met Ser Glu Lys Ile Val Asn Ser Trp Asn Glu Trp Asp Glu Leu Glu 
          1               5                   10                  15      
          Glu Met Val Val Gly Ile Ala Asp Tyr Ala Ser Phe Glu Pro Lys Glu 
                      20                  25                  30          
          Pro Gly Asn His Pro Lys Leu Arg Asn Gln Asn Leu Ala Glu Ile Ile 
                  35                  40                  45              
          Pro Phe Pro Ser Gly Pro Lys Asp Pro Lys Val Leu Glu Lys Ala Asn 
              50                  55                  60                  
          Glu Glu Leu Asn Gly Leu Ala Tyr Leu Leu Lys Asp His Asp Val Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Val Arg Arg Pro Glu Lys Ile Asp Phe Thr Lys Ser Leu Lys Thr Pro 
                          85                  90                  95      
          Tyr Phe Glu Val Ala Asn Gln Tyr Cys Gly Val Cys Pro Arg Asp Val 
                      100                 105                 110         
          Met Ile Thr Phe Gly Asn Glu Ile Met Glu Ala Thr Met Ser Lys Arg 
                  115                 120                 125             
          Ala Arg Phe Phe Glu Tyr Leu Pro Tyr Arg Lys Leu Val Tyr Glu Tyr 
              130                 135                 140                 
          Trp Asn Lys Asp Glu His Met Ile Trp Asn Ala Ala Pro Lys Pro Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Met Gln Asp Ser Met Tyr Leu Glu Asn Phe Trp Glu Leu Ser Leu Glu 
                          165                 170                 175     
          Glu Arg Phe Lys Arg Met His Asp Phe Glu Phe Cys Ile Thr Gln Asp 
                      180                 185                 190         
          Glu Val Ile Phe Asp Ala Ala Asp Cys Ser Arg Leu Gly Lys Asp Ile 
                  195                 200                 205             
          Leu Val Gln Glu Ser Met Thr Thr Asn Arg Thr Gly Ile Arg Trp Leu 
              210                 215                 220                 
          Lys Lys His Leu Glu Pro Arg Gly Phe Arg Val His Pro Val His Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Leu Asp Phe Phe Pro Ser His Ile Asp Cys Thr Phe Val Pro Leu 
                          245                 250                 255     
          Arg Pro Gly Leu Ile Leu Thr Asn Pro Glu Arg Pro Ile Arg Glu Glu 
                      260                 265                 270         
          Glu Glu Lys Ile Phe Lys Glu Asn Gly Trp Glu Leu Ile Thr Val Pro 
                  275                 280                 285             
          Gln Pro Thr Cys Ser Asn Asp Glu Met Pro Met Phe Cys Gln Ser Ser 
              290                 295                 300                 
          Lys Trp Leu Ser Met Asn Val Leu Ser Ile Ser Pro Thr Lys Val Ile 
          305                 310                 315                 320 
          Cys Glu Glu Arg Glu Lys Pro Leu Gln Glu Leu Leu Asp Lys His Gly 
                          325                 330                 335     
          Phe Glu Val Phe Pro Leu Pro Phe Arg His Val Phe Glu Phe Gly Gly 
                      340                 345                 350         
          Ser Phe His Cys Ala Thr Trp Asp Ile Arg Arg Lys Gly Glu Cys Glu 
                  355                 360                 365             
          Asp Tyr Leu Pro Asn Leu Asn Tyr Gln Pro Ile Cys Gly 
              370                 375                 380     
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  1248]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  合成 DNA]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          cgtctctgtg gataactgag cggataagtt cctagtacgc gtgcgagcag gaagaacatg       60
          agcgagaaaa ttgtgaacag ctggaatgaa tgggatgaac tggaagaaat ggttgttggt      120
          attgcagatt atgcaagctt tgaaccgaaa gaaccgggta atcatccgaa actgcgtaat      180
          cagaatctgg cagaaattat tccgtttccg agcggtccga aagatccgaa agttctggaa      240
          aaagcaaatg aagaactgaa tggtctggcc tatctgctga aagatcatga tgttattgtt      300
          cgccgtccgg aaaaaatcga ctttaccaaa agcctgaaaa ccccgtattt cgaagttgcc      360
          aatcagtatt gtggtgtttg tccgcgtgat gttatgatta cctttggcaa cgaaattatg      420
          gaagccacca tgagcaaacg tgcccgtttt tttgaatatc tgccgtatcg taaactggtg      480
          tatgagtatt ggaacaaaga tgagcatatg atctggaatg cagcaccgaa accgaccatg      540
          caggatagca tgtatctgga aaacttttgg gaactgagcc tggaagaacg ttttaaacgt      600
          atgcacgatt ttgagttttg catcacccag gatgaagtga tttttgatgc agcagattgt      660
          agccgtctgg gtaaagatat tctggttcaa gaaagcatga ccaccaatcg taccggtatt      720
          cgttggctga aaaaacatct ggaaccgcgt ggttttcgtg ttcatccggt tcattttccg      780
          ctggattttt ttccgagcca tattgattgt acctttgttc cgctgcgtcc gggtctgatt      840
          ctgaccaatc cggaacgtcc gattcgtgaa gaagaagaga aaatcttcaa agagaatggc      900
          tgggagctga ttaccgttcc gcagccgacc tgtagcaatg atgaaatgcc gatgttttgt      960
          cagagcagca aatggctgag catgaatgtt ctgagcatta gcccgaccaa agttatttgt     1020
          gaagaacgtg aaaaaccgct gcaagaactg ctggataaac atggttttga agtgtttccg     1080
          ctgccgtttc gtcatgtttt tgaatttggt ggtagctttc attgtgccac ctgggatatt     1140
          cgtcgtaaag gtgaatgtga agattatctg ccgaatctga attatcagcc gatttgtggt     1200
          taataagacg tccgcgaggg ccgtgttgcc ggtttcttca gagagacg                  1248
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  46]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          ggaaacagct atgacatgat tacgcggtta tcgcggaatc cgtatg                      46
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          ttaagcgttt tgtgcaactc cgtct                                             25
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  50]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          agacggagtt gcacaaaacg cttaaaccct acttagctgc caattattcc                  50
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  50]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          ggtaggtggt ggtgtcttta ctcatgggta aaaaatcctt tcgtaggttt                  50
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          atgagtaaag acaccaccac ctacc                                             25
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  46]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
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Claims (28)

  1. 一種微生物,其包含至少一個編碼具有L-精胺酸:甘胺酸甲脒基轉移酶功能的蛋白質之基因,且其中,相較於野生型微生物中個別的活性,具有蘋果酸合成酶功能之蛋白質的活性降低。
  2. 如請求項1之微生物,其中,相較於野生型微生物中個別基因之表現,編碼具有蘋果酸合成酶功能之蛋白質的基因之表現係減弱,或其中編碼具有蘋果酸合成酶功能之蛋白質的基因經刪除。
  3. 如請求項1或請求項2之微生物,其相較於野生型微生物中個別的酵素活性,進一步包含具有乙醛酸胺基轉移酶功能之酵素活性增加。
  4. 如請求項1至3中任一項之微生物,其包含至少一個編碼具有乙醛酸胺基轉移酶酵素活性的蛋白質之基因係過度表現。
  5. 如前述請求項中任一項之微生物,其中,相較於野生型微生物的能力,該微生物具有經增加之生產L-精胺酸的能力。
  6. 如請求項5之微生物,其中,相較於野生型微生物中個別的酵素活性,該微生物具有具胺甲醯基磷酸合成酶功能之酵素活性增加。
  7. 如請求項5或6之微生物,其中,相較於野生型微生物中個別的酵素活性,該微生物進一步包含具有活性增加的精胺基琥珀酸解離酶(argininosuccinate lyase)功能之酵素。
  8. 如請求項5至7中任一項之微生物,其中,相較於野生型微生物中個別的酵素活性,該微生物進一步包含具有活性增加的鳥胺酸胺甲醯基轉移酶功能之酵素。
  9. 如請求項5至8中任一項之微生物,其中,相較於野生型微生物中個別的酵素活性,該微生物進一步包含具有活性增加的精胺基琥珀酸合成酶功能之酵素。
  10. 如請求項5至9中任一項之微生物,其中該酵素的活性增加是藉由過度表現編碼個別酵素的基因來達成。
  11. 如請求項5至10中任一項之微生物,其中該精胺酸操縱組( argCJBDFR)係過度表現。
  12. 如請求項5至10中任一項之微生物,其中,相較於野生型微生物中 argR基因之表現,該編碼精胺酸反應抑制子蛋白質ArgR的 argR基因之表現係減弱,或者其中該 argR基因經刪除。
  13. 如請求項5至10或12中任一項之微生物,其中至少一或多個編碼L-精胺酸生物合成路徑的酵素基因係過度表現,該基因包含 gdh argJ argBargC及/或 argD,分別編碼麩胺酸去氫酶、鳥胺酸乙醯基轉移酶、乙醯基麩胺酸激酶、乙醯基麩胺醯基磷酸還原酶及乙醯基鳥胺酸胺基轉移酶。
  14. 如前述請求項中任一項之微生物,其中編碼具有L-精胺酸:甘胺酸甲脒基轉移酶功能的蛋白質之該基因是異源性。
  15. 如前述請求項中任一項之微生物,其中編碼具有L-精胺酸:甘胺酸甲脒基轉移酶功能的蛋白質之該基因係過度表現。
  16. 如前述請求項中任一項之微生物,其中具有乙醛酸胺基轉移酶的酵素活性的該蛋白質包含與根據SEQ ID NO: 2、根據SEQ ID NO: 5或根據SEQ ID NO: 8的胺基酸序列至少有80%的同源性的胺基酸序列。
  17. 如前述請求項中任一項之微生物,其中具有L-精胺酸:甘胺酸甲脒基轉移酶功能的該蛋白質包含與根據SEQ ID NO: 11的胺基酸序列至少有80%的同源性的胺基酸序列。
  18. 如前述請求項中任一項之微生物,其中該微生物屬於棒狀桿菌屬、屬於腸桿菌屬或屬於假單胞菌屬。
  19. 如請求項18之微生物,其中該微生物是麩胺酸棒狀桿菌( Corynebacterium glutamicum)。
  20. 如請求項18之微生物,其中該微生物係大腸桿菌。
  21. 如請求項18之微生物,其中該微生物係戀臭假單胞菌( Pseudomonas putida)。
  22. 一種用於發酵生產胍基乙酸(GAA)之方法,其包含下列步驟:a) 在適合的條件下,在適合的培養基中培養如前述請求項中任一項所定義之微生物,以及b) 在該培養基中累積GAA,以形成含有GAA之發酵液。
  23. 如請求項22之方法,其進一步包含從該含有GAA之發酵液單離GAA。
  24. 如請求項22或23之方法,其進一步包含將該含有GAA之發酵液乾燥及/或造粒。
  25. 如請求項1至21中任一項之微生物,其進一步包含編碼具有胍基乙酸N-甲基轉移酶活性的酵素之基因。
  26. 如請求項25之微生物,其中編碼具有胍基乙酸N-甲基轉移酶活性的酵素之該基因係過度表現。
  27. 一種用於發酵生產肌酸之方法,其包含下列步驟:a) 在適合的條件下,在適合的培養基中培養如請求項25或26所定義之微生物,以及b) 在該培養基中累積肌酸,以形成含有肌酸之發酵液。
  28. 如請求項27之方法,其進一步包含從該含有肌酸之發酵液單離肌酸。
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