CN111662919A - 一种生产葎草酮用工程大肠杆菌的构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种生产葎草酮用工程大肠杆菌的构建方法及其应用。本发明的构建方法包括：以工程大肠杆菌为出发菌株，将源于工程大肠杆菌的异戊二烯焦磷酸异构酶进化后的基因和来源于啤酒花的异戊二烯基转移酶进化后的基因以及单加氧酶基因构建到载体质粒中，得第一表达载体；将来源于啤酒花的戊二酮合酶进化后的基因、胞质辅酶A连接酶进化后的基因和异戊二烯基转移酶进化后的基因片段构建到另外一个载体质粒中，得第二表达载体；将表达载体转入工程大肠杆菌，得生产葎草酮用工程大肠杆菌；本发明还给出利用上述工程大肠杆菌生物法合成葎草酮的方法。本发明的合成方法步骤少，纯度高，质量稳定，摆脱了对啤酒花原料的依赖，避免了溶剂的大量消耗。

Description

一种生产葎草酮用工程大肠杆菌的构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及葎草酮的技术领域，特别是指一种生产葎草酮用工程大肠杆菌的构建方法及其在生产葎草酮中的应用。
背景技术
葎草酮属于啤酒花中的一种苦味酸，为α-酸中的一种，是啤酒酿造过程中苦味的直接前体来源，即为啤酒中提供主要苦味的iso-α-酸的前体。α-酸是软树脂的一部分，由具有可变酰基侧链的二戊二酰化间苯三酚衍生物组成。葎草酮是一种啤酒花腺体中分离出来的间苯三酚衍生物，它的英文名称为humulone，结构具有天然产物共性，相对复杂，有较多碳分子组成，C21H30O5是葎草酮的化学分子式，具体的分子量为362.466，网络上可查到的葎草酮的CAS号为26472-41-3。
葎草酮是一种微黄色的低熔点结晶性物质，在碱和有机溶剂中容易溶解，但是，在水中几乎不溶解。葎草酮和其它苦味酸及其它烯丙基化的聚酮化合物主要存在于啤酒花腺中，啤酒花腺是存在于啤酒花球果和叶上的腺毛状体。腺毛状体通常具有很少或没有光合活性，并且，通常仅包含一些高度活跃的生物合成途径，然而，啤酒花中葎草酮的生产在腺体中进行。
目前，葎草酮的生产现状为在啤酒花植物中提取，这种提取方法需要经过很多步骤和耗费大量的有机试剂，并且，这种提取方法所得到的葎草酮纯度不高，葎草酮中常混合有合葎草酮和共葎草酮，甚至有少量的β-苦味酸；另外，这种葎草酮的提取方法还在原料上大大依赖啤酒花的供应，由于啤酒花生长缓慢，这就限制了葎草酮的大规模生产；其次，啤酒花生长过程中由于气候和地理上的差异还会导致葎草酮浓度产生较大波动。
发明内容
本发明提出一种生产葎草酮用工程大肠杆菌的构建方法及其在生产葎草酮中的应用，旨在解决现有技术中从啤酒花中提取葎草酮的方法存在操作步骤多、有机溶剂消耗量大、纯度低、对原料依赖性强和不同批次产品质量不稳定的问题。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是这样实现的：
在一个方面，本发明的一种生产葎草酮用工程大肠杆菌的构建方法，包括以下步骤：1)以pTrcHis2B为出发质粒，将源于工程大肠杆菌的异戊二烯焦磷酸异构酶进化后的基因和来源于啤酒花的异戊二烯基转移酶进化后的基因以及单加氧酶基因构建到载体质粒pTrcHis2B中，得表达载体pTrcHis2B-idi-pt1-monooxygenase，异戊二烯焦磷酸异构酶进化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，异戊二烯基转移酶进化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，单加氧酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；2)以pACYCDuet-1为出发质粒，将来源于啤酒花的戊二酮合酶进化后的基因、胞质辅酶A连接酶进化后的基因和异戊二烯基转移酶进化后的基因片段构建到载体质粒pACYCDuet-1中，得表达载体pACYCDuet-1-vps-ccl2-pt2，戊二酮合酶进化后的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示，胞质辅酶A连接酶进化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，异戊二烯基转移酶进化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；3)将步骤1)所得的表达载体pTrcHis2B-idi-pt1-monooxygenase和步骤2)所得的表达载体pACYCDuet-1-vps-ccl2-pt2转入工程大肠杆菌BL21(DE3)-Trc-low，得生产葎草酮用工程大肠杆菌。
本发明的生产葎草酮用工程大肠杆菌的构建方法从实验室已有的工程大肠杆菌BL21(DE3)-Trc-low菌株出发，运用基因重组技术，将源于大肠杆菌自身的异戊二烯焦磷酸异构酶进化后的基因(idi)和来源于啤酒花毛状腺体的异戊二烯基转移酶进化后的基因(pt1)以及单加氧酶基因(monooxygenase)构建到载体质粒pTrcHis2B中；将来源于啤酒花毛状腺体的戊二酮合酶进化后的基因(vps)，胞质辅酶A连接酶进化后的基因(ccl2)和另一个异戊二烯基转移酶进化后的基因(pt2)片段构建到载体质粒pACYCDuet-1中；然后，将两个质粒转入原有的大肠杆菌工程菌中，从而在目标菌株中构建了一条完整的葎草酮全生物合成途径。与其它表达系统(如酵母，原生虫等细胞)相比，大肠杆菌具有许多优势，例如：遗传背景清楚、培养方法简单、繁殖速度快、抗污染能力强以及目的基因表达水平高，而且，此种方法无论是培养制备还是分离纯化，操作步骤少，流程短，操作简便易行。
在另一个方面，本发明的一种生产葎草酮用工程大肠杆菌，所述生产葎草酮用工程大肠杆菌是根据上面所述的生产葎草酮用工程大肠杆菌的构建方法得到的工程大肠杆菌。
本发明的这种工程大肠杆菌可以直接用于合成葎草酮，从而为葎草酮的合成技术提供了一种全新的合成方法，这是一种生物合成方法；这种葎草酮的合成方法可以避免啤酒花原料的限制，实现了化学合成难以实现的生物活性的保留，利用工程菌株中制备葎草酮的选择性比天然产物法高，产物仅含葎草酮，不含葎草酮衍生物，纯度高，产品质量稳定，也不会出现因为啤酒花生长过程中由于气候和地理上的差异而导致葎草酮浓度产生较大波动的现象。
在再一个方面，本发明的一种工程大肠杆菌在生物法合成葎草酮中的应用，包括以下步骤：取根据上面所述的生产葎草酮用工程大肠杆菌的构建方法得到的工程大肠杆菌，发酵，离心过滤，冷冻干燥，提取纯化，得葎草酮。
本发明从实验室已有的工程菌株出发，利用代谢工程技术，将葎草酮合成途径的关键酶基因通过载体导入至工程大肠杆菌菌株中，构建了全生物合成葎草酮的发酵菌株；所得工程大肠杆菌通过发酵、离心过滤、冷冻干燥和提取纯化而得葎草酮，这是一种全新的葎草酮合成方法；本发明的葎草酮合成方法操作步骤少，流程短，简单易控，成本低，摆脱了对啤酒花原料的依赖，可以实现大规模生产，避免了溶剂的大量消耗，充分保留了葎草酮的生物活性，选择性高，所得产物中仅含葎草酮，不含葎草酮衍生物，纯度好，产品质量稳定，也不会出现因为啤酒花生长过程中由于气候和地理上的差异而导致葎草酮浓度产生较大波动的现象。
作为一种优选的实施方案，所述发酵为摇瓶发酵，所述摇瓶发酵的具体步骤为：将工程大肠杆菌的菌株活化后制备种子液，按照3～5％接种量进行接种，37℃，220r/min振荡培养，培养12h；加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷，诱导剂的添加量为0.2～0.6mL/L，继续振荡培养；每隔12h取样，测定OD值和pH值，发酵液呈现酸性时，采用10％的氢氧化钠调节发酵液的pH值，使其为7.0；当OD值不再上涨并且pH至呈现碱性时结束发酵，得发酵液。本发明的发酵过程为摇瓶发酵，摇瓶发酵通常是在恒温振荡器上进行，在摇瓶发酵过程中还添加了诱导剂，诱导剂IPTG作为菌株发酵过程中的一种重要的诱导酶蛋白表达的发酵添加物，提供了催化产物合成的酶，也在一定程度上影响着菌株的发酵水平；诱导剂通常在在发酵开始12～20h加入到发酵液中。
作为一种优选的实施方案，所述发酵过程中，首先，向发酵培养基，添加2mL/L硫酸镁母液和1mL/L微量元素母液；接着，添加0.7mL/L氨苄青霉素母液和0.7mL/L氯霉素母液；最后，添加7.5mL/L甲羟戊酸和15mL/L亮氨酸母液；所述硫酸镁母液的浓度为0.24g/L，所述微量元素母液由以下组分组成为：四水合钼酸铵3.7g/L、七水合硫酸锌2.9g/L、硼酸24.7g/L、五水合硫酸铜2.5g/L、四水合氯化锰15.8g/L；所述亮氨酸母液的浓度为17.5g/L，所述氯霉素母液的浓度为34mg/L，所述氨苄青霉素母液的浓度为100mg/L。本发明在发酵培养基中还添加了硫酸镁、微量元素、氨苄青霉素和氯霉素，发酵过程中添加亮氨酸和甲羟戊酸可以增加葎草酮的产量。
本发明中，甲羟戊酸选用的是纯物质，未经过稀释，将甲羟戊酸内酯采用1M NaOH调节pH为7.0，121℃高压蒸汽灭菌25min，配制而成；亮氨酸母液是将0.525g亮氨酸溶于30mL灭过菌的UP水中，采用灭过菌的枪头轻搅使亮氨酸溶化，0.22μm的无菌滤膜过滤，短时间内使用贮藏于4℃，若要保存较长时间贮藏于-20℃；硫酸镁母液的配制方法是将硫酸镁溶解于RO水中，高压蒸汽灭菌，121℃灭菌25min，或115℃灭菌30min，于4℃贮藏；微量元素母液是将各组分溶解于RO水中，0.22μm的无菌滤膜过滤，于4℃贮藏；氯霉素母液是在氯霉素溶液配制完毕之后，再采用0.22μm孔径大小的无菌滤膜过滤，于-20℃贮藏；氨苄青霉素母液是在氨苄青霉素配制完毕之后，再采用0.22μm孔径大小的无菌滤膜过滤，于-20℃贮藏。
作为一种优选的实施方案，所述摇瓶发酵过程中，发酵培养基为：(NH2)4SO41g/L，K2HPO4·3H2O 3g/L，KCl 1.7g/L，柠檬酸钠1g/L，甜菜碱1g/L，葡萄糖20g/L，柠檬酸1g/L，酵母膏5～10g/L；115℃高压蒸汽灭菌30min；所述甲羟戊酸和所述亮氨酸母液是在诱导剂加入后再添加到发酵液中的，所述甲羟戊酸分3批添加至发酵液中。本发明发酵培养基中的酵母膏作为菌株发酵过程中的一种重要底物，可以提供菌株生长繁殖的氮资源，也在一定程度上影响着菌株的发酵；本发明的菌株生长速度快，长势好。
作为一种优选的实施方案，所述离心过滤时，离心转速为5000～10000r/min，离心温度为20℃以下，离心时间为15～30min。本发明经过发酵后的菌体在超速离心机中进行离心过滤，离心过程中通常采用纯水和醇对菌体进行冲洗。
作为一种优选的实施方案，所述冷冻干燥时，真空度为10Pa，干燥温度为-20～-60℃，干燥时间为12～36h。本发明中发酵完成后的发酵液经过离心过滤，倒掉上清液，保留菌体沉淀；并从离心瓶中转移出菌体，在冷冻干燥机中进行干燥，采用低温冷冻干燥的方式对菌体进行干燥，干燥温度低，干燥效率高，充分保证了葎草酮的生物活性。
作为一种优选的实施方案，所述提取纯化方法包括超声波萃取法、试剂浸取法萃取、热抽提、磁力搅拌萃取中的任意一种或几种。本发明中提取纯化方法有很多种，常见的为超声波萃取法、试剂浸取法萃取、热抽提、磁力搅拌萃取，萃取后的溶液倒入旋蒸瓶，在二氯甲烷和正己烷溶液作用下，于40℃旋蒸，得产物；将产物采用甲醇溶解，并用0.45μm孔径大小的滤膜过滤，得葎草酮。
在还一个方面，本发明的一种葎草酮，所述葎草酮是根据上面任意一项所述的工程大肠杆菌在生物法合成葎草酮中的应用中得到的葎草酮。本发明的葎草酮在合成过程中摆脱了对啤酒花原料的依赖，可以实现大规模生产，避免了溶剂的大量消耗，充分保留了葎草酮的生物活性，选择性高，纯度好，质量稳定，也不会出现因为啤酒花生长过程中由于气候和地理上的差异而导致葎草酮浓度产生较大波动的现象。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明从实验室已有的工程菌株出发，利用代谢工程技术，将葎草酮合成途径的关键酶基因通过载体导入至工程大肠杆菌菌株中，构建了全生物合成葎草酮的发酵菌株；所得菌株通过发酵、离心过滤、冷冻干燥和纯化而得到葎草酮，这是一种全新的葎草酮生物合成方法；本发明的葎草酮合成方法操作操作步骤少，流程短，简单易控，成本低，摆脱了对啤酒花原料的依赖，可以实现大规模生产，避免了溶剂的大量消耗，充分保留了葎草酮的生物活性，选择性高，所得产物中仅含葎草酮，不含葎草酮衍生物，葎草酮的纯度好，产品质量稳定，也不会出现因为啤酒花生长过程中由于气候和地理上的差异而导致葎草酮浓度产生较大波动的现象。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例三所得葎草酮的紫外吸收光谱图；
图2为本发明实施例三所得葎草酮的高效液相图谱；
图3为本发明实施例三所得葎草酮的液相质谱图；
图4为本发明实施例三所得葎草酮的氢谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的一种生产葎草酮用工程大肠杆菌的构建方法，包括以下步骤：
1)以pTrcHis2B为出发质粒，将源于工程大肠杆菌的异戊二烯焦磷酸异构酶进化后的基因和来源于啤酒花的异戊二烯基转移酶进化后的基因以及单加氧酶基因构建到载体质粒pTrcHis2B中，得表达载体pTrcHis2B-idi-pt1-monooxygenase，异戊二烯焦磷酸异构酶进化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，异戊二烯基转移酶进化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，单加氧酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
2)以pACYCDuet-1为出发质粒，将来源于啤酒花的戊二酮合酶进化后的基因、胞质辅酶A连接酶进化后的基因和异戊二烯基转移酶进化后的基因片段构建到载体质粒pACYCDuet-1中，得表达载体pACYCDuet-1-vps-ccl2-pt2，戊二酮合酶进化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，胞质辅酶A连接酶进化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，异戊二烯基转移酶进化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
3)将步骤1)所得的表达载体pTrcHis2B-idi-pt1-monooxygenase和步骤2)所得的表达载体pACYCDuet-1-vps-ccl2-pt2转入工程大肠杆菌BL21(DE3)-Trc-low，得生产葎草酮用工程大肠杆菌。
本发明的一种生产葎草酮用工程大肠杆菌，所述生产葎草酮用工程大肠杆菌是根据上面所述的生产葎草酮用工程大肠杆菌的构建方法得到的工程大肠杆菌。
本发明的一种工程大肠杆菌在生物法合成葎草酮中的应用，包括以下步骤：取根据上面所述的生产葎草酮用工程大肠杆菌的构建方法得到的工程大肠杆菌，发酵，离心过滤，冷冻干燥，提取纯化，得葎草酮。
优选地，所述发酵为摇瓶发酵，所述摇瓶发酵的具体步骤为：将工程大肠杆菌的菌株活化后制备种子液，按照3～5％接种量进行接种，37℃，220r/min振荡培养，培养12h；加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷，诱导剂的添加量为0.2～0.6mL/L，继续振荡培养；每隔12h取样，测定OD值和pH值，发酵液呈现酸性时，采用10％的氢氧化钠调节发酵液的pH值，使其为7.0；当OD值不再上涨并且pH至呈现碱性时结束发酵，得发酵液。
进一步地，所述发酵过程中，首先，向发酵培养基，添加2mL/L硫酸镁母液和1mL/L微量元素母液；接着，添加0.7mL/L氨苄青霉素母液和0.7mL/L氯霉素母液；最后，添加7.5mL/L甲羟戊酸和15mL/L亮氨酸母液；所述硫酸镁母液的浓度为0.24g/L，所述微量元素母液由以下组分组成为：四水合钼酸铵3.7g/L、七水合硫酸锌2.9g/L、硼酸24.7g/L、五水合硫酸铜2.5g/L、四水合氯化锰15.8g/L；所述亮氨酸母液的浓度为17.5g/L，所述氯霉素母液的浓度为34mg/L，所述氨苄青霉素母液的浓度为100mg/L。
具体地，所述摇瓶发酵过程中，发酵培养基为：(NH2)4SO4 1g/L，K2HPO4·3H2O 3g/L，KCl 1.7g/L，柠檬酸钠1g/L，甜菜碱1g/L，葡萄糖20g/L，柠檬酸1g/L，酵母膏5～10g/L；115℃高压蒸汽灭菌30min；所述甲羟戊酸和所述亮氨酸母液是在诱导剂加入后再添加到发酵液中的，所述甲羟戊酸分3批添加至发酵液中。
再优选地，所述离心过滤时，离心转速为5000～10000r/min，离心温度为20℃以下，离心时间为15～30min。
更优选地，所述冷冻干燥时，真空度为10Pa，干燥温度为-20～-60℃，干燥时间为12～36h。
进一步优选地，所述提取纯化方法包括超声波萃取法、试剂浸取法萃取、热抽提、磁力搅拌萃取中的任意一种或几种。
本发明的一种葎草酮，所述葎草酮是根据上面任意一项所述的工程大肠杆菌在生物法合成葎草酮中的应用中得到的葎草酮。
实施例一
本发明的一种生产葎草酮用工程大肠杆菌的构建方法，包括以下步骤：
S1感受态细胞的制备
工程菌株的构建需要有可以吸纳周围环境中的DNA分子的感受态细胞，感受态细胞的制备方法如下：
a.首先，需要从-80℃超低温冰箱中取出保存的BL21(DE3)-Trc-low菌株，将装有BL21(DE3)-Trc-low菌株的甘油管放置于冰上稍微解冻，有少量溶化的菌液后，在超净台中进行操作，用灭菌好的10μL枪头或接种环划线到无抗性的LB固体平板上，在隔水式恒温培养箱于37℃培养约12～14h(BL21(DE3)-Trc-low菌株对比普通大肠杆菌，生长繁殖相对较慢)，以活化BL21(DE3)-Trc-low菌株；
b.使用安装了无菌枪头的移液枪从培养菌株的固体平板上挑取合适的单菌落，挑取两个单菌落分别接种到两个50mL离心管中，每个离心管中装有10mL LB液体培养基，恒温振荡器设定37℃的温度和220rpm的转速，以适应BL21(DE3)-Trc-low菌株生长，培养BL21(DE3)-Trc-low菌株约5h，测得OD600在0.35～0.5，放置冰中停止培养即可；
c.该步骤在超净工作台操作，采用在-20℃预冷好的移液器枪头，每次吸取1mL菌液分装于灭好菌的1.5mL EP管，共分装到了八个预冷好的1.5mL EP管中，分装好后于冷冻离心机离心5min，离心的温度为4℃，转速为4000rpm，离心后去掉上清液，保留菌体；
d.该步骤在超净工作台操作，向c步骤中离心后得到的八个装有菌体的EP管中分别加入100μL预冷的Solution A，轻轻用手指弹动EP管使得沉淀悬浮，或可用移液枪缓慢吸打菌体使其悬浮，过程中禁止剧烈的震荡，再在冷冻离心机离心于4℃，转速4000rpm离心5min，去掉上清液，保留沉淀；
e.该步骤在超净工作台操作，向c步骤中离心后得到的八个装有Solution A处理后的菌体沉淀的EP管中分别加入100μL预冷的Solution B，轻轻用手指弹动EP管使得沉淀悬浮，或可用移液枪缓慢吸打菌体使其悬浮，过程中禁止剧烈的震荡；
f.经过上述步骤，BL21(DE3)-Trc-low感受态细胞就制备好了，制备好的感受态细胞可直接用于转化，或保藏于-80℃，有效期可保存一年以上，需避免反复冻存，记为感受态细胞DH5a。
S2表达载体重组质粒的提取
工程菌株的构建过程中，重组好的表达载体导入BL21(DE3)-Trc-low感受态细胞中以进行工程菌株构建，重组质粒的提取方法如下：
a.将上述方法提取的保存于-80℃的感受态细胞DH5a取出，在冰盒上进行化冻，稍微溶化后，在超净台中用移液枪枪头或接种环接种菌株于相应抗性的固体平板上，含pACYCDuet-1-CCL2-VPS-PT2质粒的感受态细胞DH5a接种于氯霉素抗性的固体平板，含pTrcHis 2B-IDI-PT1-Monooxygenase质粒的感受态细胞DH5a接种于氨苄青霉素抗性的固体平板以活化菌株，再在隔水式恒温培养箱于37℃培养约14h(含有重组质粒的大肠杆菌菌株生长繁殖相对较慢)，以活化菌株；
b.分别挑取两个活化好的步骤a中得到的菌株，分别加入含有相应抗性的5mL LB液体培养基的50mL离心管中，恒温振荡器设定37℃的温度和220rpm的转速，以适应菌株生长；
c.分别取4mL菌液于两个5mL的EP管中，在12000rpm离心1min，去上清，得到沉淀菌体；
d.再按照E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I提供的质粒提取说明书进行操作，最后，提纯得到重组质粒DNA分子，每个EP管中分别加入50μl无菌水，离心1min，得到重组质粒溶液，保存于-20℃冰箱中，以备后用；
S3表达载体的转化
在表达载体的转化过程中，需要将两个重组质粒pACYCDuet-1-CCL2-VPS-PT2和pTrcHis2B-IDI-PT1-Monooxygenase转化到BL21(DE3)-Trc-low感受态细胞中，具体的转化步骤如下：
a.将保存于-20℃冰箱的重组质粒pACYCDuet-1-CCL2-VPS-PT2和pTrcHis2B-IDI-PT1-Monooxygenase以及保藏于-80℃的BL21(DE3)-Trc-low感受态细胞取出，置于冰盒中化冻，大约1～1.5h；
b.该步骤在超净台中操作，分别用10μL移液枪取两种重组质粒各3μL加入到BL21(DE3)-Trc-low感受态细胞中，采用枪头轻轻搅拌，以使得重组质粒和感受态细胞充分接触，然后，在冰盒上放置30min；
c.打开水浴锅，设置温度为42℃，将b步骤中在冰盒上放置了30min的感受态细胞，放入温度为42℃的水浴锅中，热激45s，以促进重组质粒进入BL21(DE3)-Trc-low感受态细胞中，热激完成后，在冰盒上放置5min；
d.c步骤完成后，在构建好的BL21(DE3)-Trc-low工程菌株中加入0.9mL的LB液体培养基，于设定37℃的温度和220rpm的转速的恒温振荡器中，培养约1h，使得细菌复苏；
e.关于d步骤中得到的菌体，若浓度不够，可以在低速下离心取出800μL的上清液，再吹打悬浮菌体沉淀，最后，吸取100μL进行涂布，或者不离心直接用涂布棒涂板，再在37℃的温度和220rpm的转速的隔水式恒温培养箱中，过夜培养。
实施例二
本发明的一种工程大肠杆菌在生物法合成葎草酮中的应用，包括以下步骤：
S1 Trc-low工程菌株发酵实验
Trc-low工程菌株发酵实验随着pACYCDuet-1-CCL2-VPS-PT2质粒和pTrcHis 2B-IDI-PT1-Monooxygenase质粒的转化成功而开始，转化后的菌株在带有氯霉素和氨苄青霉素抗性的平板上生长出单菌落，大概需要经过14～16h的生长时间，接下来Trc-low工程菌株发酵实验的步骤具体如下：
(1)一级种子液的制备
该操作在超净台中进行，首先，从装有灭过菌的LB液体培养基的锥形瓶中吸取10mL LB液体于50mL灭好菌的干燥的离心管中，再加入7μL氯霉素和7μL氨苄青霉素，轻轻晃动以均匀混合抗生素和培养基，最后，采用10μL移液枪枪头或接种环在固体平板上，挑取BL21(DE3)-Trc-low工程菌株单菌落接种到培养基中，于37℃，220rpm条件下，在恒温振荡器中过夜培养；
(2)二级种子液的制备
该操作在超净台中进行，首先，向已经灭过菌并且温度已经冷却至60℃以下的装于250mL锥形瓶的100mL LB液体培养基中加入50μL的氯霉素和70μL氨苄青霉素，轻轻晃动，以均匀混合抗生素和培养基，最后，采用5mL移液枪移取一级种子液5mL加入到LB培养基中，于37℃，220rpm条件下，在恒温振荡器中，培养约12h；
(3)摇瓶发酵生产葎草酮
200mL发酵培养基的配制：分为三个组分：a.0.2g硫酸铵，0.6g三水合磷酸氢二钾，0.38g氯化钾，0.2g柠檬酸钠，0.2g甜菜碱，98mL纯水；b.0.2g柠檬酸，4g葡萄糖，50mL纯水；c.1g酵母膏，50mL纯水；配制完三个组分后一起在115℃灭菌30min，待各组分冷却后，将b和c组分加入a组分中，发酵培养基配制完成；
发酵培养基混合好之后，进行接种，在超净台中吸取10mL二级种子液加入发酵培养基，12h后加入100μL配制好的IPTG诱导剂；接下来，每隔12h，测一次pH值和OD值；当pH值偏酸性时，需要补充10％的氢氧化钠溶液，使其pH值为7.0；当OD值不再上涨并且pH值呈碱性时，结束发酵，得到发酵液；
(4)葎草酮的离心过滤
发酵完成后的发酵液，进行离心过滤，离心过滤的转速为10000rpm，离心温度为4℃，离心时间为20min；离心过滤完毕之后，倒掉上清液，保留菌体沉淀，从离心瓶中转移出菌体；
(5)葎草酮的冷冻干燥
将从离心瓶中转移出的菌体，在冷冻干燥机中进行冷冻干燥，冷冻干燥时，真空度为10Pa，干燥温度为-40℃，干燥时间为26h；
(6)葎草酮的提取纯化
称取冻干后的菌体粉末，采用超声波萃取法进行提取纯化，装入裁剪后已经装订好的滤纸，用无水乙醇中浸泡10min，之后放入平底烧瓶加入相应体积的二氯甲烷，每1g菌体加入约150mL二氯甲烷，先用保鲜膜封住平底烧瓶的口，再在烧瓶外面包裹上铝箔纸，或直接用纸箱子盖住超声波，在设置了97％power的超声波中超声30min，超声结束后，取出滤纸包裹的菌体，剩下萃取溶液；
最后，将所得溶液倒入旋蒸瓶，二氯甲烷在40℃旋蒸，最后得到研究所需的产物，采用甲醇溶解，并用0.45μm孔径大小的滤膜过滤，准备进行鉴定；
经测定，摇瓶发酵至72h时，菌体的OD600值上升到了最高峰，OD600为11.45，此时，发酵液的pH值大于7.0，发酵结束；
本实施例所得样品的重量为0.0102g，占菌体干重的1.42％(wt％)，产物产量为0.051g/L。
实施例三
在实施例二的基础上，改变摇瓶发酵的参数，在摇瓶发酵过程中，发酵培养基为：(NH2)4SO4 1g/L，K2HPO4·3H2O 3g/L，KCl 1.7g/L，柠檬酸钠1g/L，甜菜碱1g/L，葡萄糖20g/L，柠檬酸1g/L，酵母膏10g/L；115℃高压蒸汽灭菌30min；
首先，向发酵培养基，添加2mL/L硫酸镁母液和1mL/L微量元素母液；接着，添加0.7mL/L氨苄青霉素母液和0.7mL/L氯霉素母液；最后，添加7.5mL/L甲羟戊酸和15mL/L亮氨酸母液，甲羟戊酸和亮氨酸母液是在诱导剂加入后再添加到发酵液中的，甲羟戊酸分3批添加至发酵液中；
硫酸镁母液的浓度为0.24g/L，微量元素母液由以下组分组成为：四水合钼酸铵3.7g/L、七水合硫酸锌2.9g/L、硼酸24.7g/L、五水合硫酸铜2.5g/L、四水合氯化锰15.8g/L；亮氨酸母液的浓度为17.5g/L，氯霉素母液的浓度为34mg/L，氨苄青霉素母液的浓度为100mg/L；
本实施例中，甲羟戊酸的用量为1.5mL，分三次加入，酵母膏的用量为2.0g；
经测定，摇瓶发酵至72h时，菌体的OD600值上升到了最高峰，OD600为14.60，此时，发酵液的pH值大于7.0，发酵结束；
本实施例所得样品的重量为0.0135g，占菌体干重的1.70％(wt％)，产物产量为0.0675g/L。
实验1
将实施例三所得的葎草酮置于岛津公司生产的ZF-1型号的紫外光谱仪上进行UV法扫描全波长，在中档灵敏度下，扫描狭缝宽度为2.00m×2.00m，扫描方式为反射。
由附图1可以看出，本发明实施例三所得葎草酮的紫外吸收光谱图非常干净，没有杂质峰，其最大吸收波长分别为209nm和255nm，在255nm处的吸收峰就是葎草酮的吸收峰，而209nm处的吸收峰是甲醇吸收峰；这说明本发明的方法所得的葎草酮纯度高。
实验2
将实施例三所得的葎草酮置于岛津公司生产的LC-16型号的液相色谱-质谱仪上进行液相色谱和质谱分析，色谱条件为：分析纯甲醇溶解样品10mg，色谱柱Symmetry C18(4.6×150mm 5μm)，流动相V甲醇：V水：V磷酸＝80：20：0.25，流速1.0mL/min，检测波长255nm，进样量20μL，柱温室温。
由附图2可以看出，本发明实施例三所得葎草酮的高效液相色谱质谱图于11.20min左右出峰，该高效液相色谱质谱图在2.50min左右出现的峰值是流动相中的磷酸成分；因此，本发明实施例三所得葎草酮的高效液相色谱图非常干净，这说明本发明所得的葎草酮中杂质少，纯度高。
由附图3可以看出，液相质谱分析主要是检测样品的分子量，在检测中采用正离子检测，测量的分子量结果中多加了一个H+，即分子量多加了1；经测定，实验样的分子量为363.2261，空白样葎草酮的分子量为362.2171，相差-0.009，小数点后精确到第四位，最后一位误差在10之内，匹配上了葎草酮的分子量。
实验3
将实施例三所得的葎草酮转移到干净的核磁管里，并采用MEOD溶解，置于Bruker公司生产的Bruker AV-500MHZ型号的核磁共振仪上进行核磁分析。
由附图4可以看出，本发明实施例三所得的葎草酮的氢谱图：
TMS：0.01ppm；CDCl3：7.255ppm；-CH3：d&i：1.25ppm；k：1.135ppm；e：1.363ppm(这三组峰有稍微的重合，没有完全分开)；4’&5’：0.974ppm(积分为一个氢的六倍)；-CH2：a：4.09～4.14ppm；f：2.050ppm；2’：2.309ppm；-CH：b：5.339ppm；g：5.101ppm；3’：1.671ppm；
Figure BDA0002524919520000141
式(I)中，峰的标记是根据Goese的文章中，描述的各个氢的位移位置来标的。由附图4可以看出，本发明实施例三所得葎草酮的氢谱图成功检测到了葎草酮的特征官能团。因此，本发明成功分离出了葎草酮。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明从实验室已有的工程菌株出发，利用代谢工程技术，将葎草酮合成途径的关键酶基因通过载体导入至工程大肠杆菌菌株中，构建了全生物合成葎草酮的发酵菌株；所得菌株通过发酵、离心过滤、冷冻干燥和纯化而得到葎草酮，这是一种全新的葎草酮生物合成方法；本发明的葎草酮合成方法操作操作步骤少，流程短，简单易控，成本低，摆脱了对啤酒花原料的依赖，可以实现大规模生产，避免了溶剂的大量消耗，充分保留了葎草酮的生物活性，选择性高，所得产物中仅含葎草酮，不含葎草酮衍生物，葎草酮的纯度好，产品质量稳定，也不会出现因为啤酒花生长过程中由于气候和地理上的差异而导致葎草酮浓度产生较大波动的现象。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 青岛科技大学
<120> 一种生产葎草酮用工程大肠杆菌的构建方法及其应用
<130> 2020
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 864
<212> DNA
<213> 人工序列(SEQ ID NO:1)
<400> 1
actgccgaca acaatagtat gccccatggt gcagtatcta gttacgccaa attagtgcaa 60
aaccaaacac ctgaagacat tttggaagag tttcctgaaa ttattccatt acaacaaaga 120
cctaataccc gatctagtga gacgtcaaat gacgaaagcg gagaaacatg tttttctggt 180
catgatgagg agcaaattaa gttaatgaat gaaaattgta ttgttttgga ttgggacgat 240
aatgctattg gtgccggtac caagaaagtt tgtcatttaa tggaaaatat tgaaaagggt 300
ttactacatc gtgcattctc cgtctttatt ttcaatgaac aaggtgaatt acttttacaa 360
caaagagcca ctgaaaaaat aactttccct gatctttgga ctaacacatg ctgctctcat 420
ccactatgta ttgatgacga attaggtttg aagggtaagc tagacgataa gattaagggc 480
gctattactg cggcggtgag aaaactagat catgaattag gtattccaga agatgaaact 540
aagacaaggg gtaagtttca ctttttaaac agaatccatt acatggcacc aagcaatgaa 600
ccatggggtg aacatgaaat tgattacatc ctattttata agatcaacgc taaagaaaac 660
ttgactgtca acccaaacgt caatgaagtt agagacttca aatgggtttc accaaatgat 720
ttgaaaacta tgtttgctga cccaagttac aagtttacgc cttggtttaa gattatttgc 780
gagaattact tattcaactg gtgggagcaa ttagatgacc tttctgaagt ggaaaatgac 840
aggcaaattc atagaatgct ataa 864
<210> 2
<211> 1317
<212> DNA
<213> 人工序列(SEQ ID NO:2)
<400> 2
aatattctga aatgagtaat acgactcact atatatatat taatgtatcg attaaataag 60
gaggaataaa ccatggagct ctcttcagtt tctagctttt cacttggaac taatccattt 120
atatcaattc cccataataa taataataat ctcaaggtct catcttactg ttgtaaaagc 180
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<210> 3
<211> 1437
<212> DNA
<213> 人工序列(SEQ ID NO:3)
<400> 3
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gaggaataaa ccatggccac agcaacagct tattccttct tctcatcacc agtttttgtg 120
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<211> 1459
<212> DNA
<213> 人工序列(SEQ ID NO:4)
<400> 4
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gctgattttc ccgactacta ctttcgtgtc accaaaagtg aacacatgac tgatctcaaa 300
aagaagttcc aacgaatgtg tgaaaaatcc actataaaaa agcgttactt gcacttgacc 360
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acagcttgta tctttcgcgg gccctcggag aaacatttgg attgcttggt ggggcaatct 780
ctgttcggag acggggcatc ttcggtcatc gttggtgccg accctgatgc ctcggtaggc 840
gagcggccga tcttcgagtt ggtttcagct gcgcagacga ttttgcctaa ctcggatgga 900
gccatagccg ggcacgtaac ggaagccggg ctgacatttc acttgctgag ggacgtgcca 960
gggttgatct cccaaaacat tgagaagagc ttgattgagg ccttcactcc gattgggatt 1020
aatgactgga acaacatatt ctggattgca catcccggtg gacctgccat tctggacgag 1080
atagaggcca agctcgagct gaagaaggag aagatgaagg cgtctcgtga aatgctgagc 1140
gagtatggga acatgtcatg tgcaagcgtt ttcttcatag tagatgagat gaggaaacag 1200
tcgtcgaagg aagggaagtc taccaccgga gatggactgg agtggggcgc tctcttcggg 1260
tttggaccgg gtctgacggt ggagacggtg gtcttgcaca gcgtgcccac aaacgtctaa 1320
tgaataattt gttatcgcta gcttgtcaaa tcaagcttta ctatgtattg tggtcgttaa 1380
ttagtttata ctttgatgtt gatcaataat tatatacctc atctaataaa atgatcaaat 1440
atatttttat ataaaaaaa 1459
<210> 5
<211> 1722
<212> DNA
<213> 人工序列(SEQ ID NO:5)
<400> 5
atggataact atagaaggct ccacactccg gttgctctct gcgttgccag tccacctgcg 60
ccacccacca catcatggaa gtcaatggag ggcttagttc agtgctctgc aaatcatgtt 120
cctctctctc ccattacctt cttggagcgt tcttccaagg cttacagaga caacacctct 180
cttgtctatg gctctgtcag atacacttgg gcccaaactc accatcgctg tctcaagcta 240
gcttctgctc tcacaaccca cttgggaatt tcaccagggg atgtggtggc taccttctct 300
tacaacctac cagaaatcta cgagcttcat tttgcagtcc caatggctgg tgggattctc 360
tgtacactca acgctcgcaa cgactcggcc atggtgtcga cgctgctagc acactcggaa 420
gccaaactca tctttgtgga accccagtta ctggaaacgg ctcgggcagc tcttgatctt 480
ctcgcccaaa aggacataaa gcctccaact ttggtcttac taaccgattc ggaaagcttc 540
acttcaagct catacgatca ctataatcat ctgttggcca atgggtctga tgacttcgaa 600
ataagacggc ctaagaacga atgggatccc atcagcataa actacacctc aggcaccact 660
gcacgcccca aagctgtcgt ttacagccac cgtggggcat atctgaactc catagccaca 720
gttttgcttc acgggatggg gacaacgtct gtttatcttt ggtcagtgcc catgtttcat 780
tgcaacggct ggtgttttcc atggggggct gcagctcagg gcgccaccaa catatgcata 840
agaaaagtct ctcccaaagc catttttgac aacatacatt tgcataaggt tacacacttt 900
ggagctgcac caactgtctt gaacatgatt gtgaactcgc cggaaggcaa ccttcacacc 960
ccgcttcccc acaaggtgga ggtcatgaca ggaggttcac cgccaccgcc caaggtcatt 1020
gcgaggatgg aagagatggg gtttcaagtg aatcacattt atggcctcac ggaaacttgt 1080
ggtcctgctg ctaattgtgt atgcaaacct gaatgggatg cactgcagcc agaggaacgg 1140
tatgccttga aagctcgtca aggattaaac catctggcga tggaggagat ggacgtgaga 1200
gacccggtga ccatggaaag tgttagggcc gatggtgcaa cgattggtga ggttatgttc 1260
agaggaaaca ctgtgatgag tggctacttt aaagacttga aggcgaccga ggaggctttc 1320
gagggaggtt ggtttcgtag tggggatctt ggtgtgaaac atgaggatgg ttatattcaa 1380
cttaaggatc ggaagaagga tgtggtgata tcaggagggg agaatatcag tacagttgaa 1440
gttgagactg tgttgtatag ccacgaagca gtgctcgagg ctgctgtggt ggcgcgccct 1500
gataagcttt ggggggagac gccttgtgct tttgtgacac ttaaggaggg atttgataat 1560
gatgtaagtg ctgaccaaat tatcaaattc tgtagagatc gtttgcccca ttacatggct 1620
cccaagacag tagtgtttga agagttacca aagacttcaa caggaaagat acagaagtat 1680
attctgaaag aaaaagcaat ggccatgggc agcctttctt ga 1722
<210> 6
<211> 1227
<212> DNA
<213> 人工序列(SEQ ID NO:6)
<400> 6
atggagctct catcagcttg taatctttca cttaaaccta attattatta ttatccaact 60
tcattattcc caagtaataa tagttataat aatctcaagg cctcatctta ttaccaaaca 120
cagagaccta tcaaatgttg tagttattct ccttcaaaat attgctccac caagaagttg 180
cagacaacac atctacttgg gctctatgca aaacacaaat gcttgaaacc tttttcaatc 240
ggtcatcttc caaggccaaa ttcccttacg gcttggtctc atcaaagtga atttcctagt 300
acaatagtta ccaaaggttc aaattttgga catgcttcgt ggaaattcgt aaggcccatt 360
ccatttgtag cagtatctat catatgcact tctttgtttg gagcagagct gttaaagaac 420
ccaaatctat ttagctggca attgatgttt gatgcattcc aaggcttagt ggttatatta 480
ctataccata tttacataaa tggcctcaat cagatttacg atttggaaag tgacaggata 540
aacaaaccag atttaccact agctgcagag gaaatgtcag ttaaatcagc ttggttcttg 600
acaatattta gtgcagtagc cagcttacta ttgatgatta agttgaagtg tggactattc 660
cttacttgta tgtactgttg ttatcttgtg attggggcta tgtattctgt tcctcccttt 720
agatggaaga tgaatacttt tacatcaact ctctggaact tttcggaaat aggtatcggt 780
ataaattttc tgatcaacta tgctagcaga gctactcttg gacttccatt tcagtggagg 840
cctccattta ctttcatcat tggctttgtt tcaactttaa gtattatctt gagcatccta 900
aaagatgttc ctgatgtaga aggtgacaag aaggttggca tgtcaacgtt accagtaata 960
tttggtgcta gaaccatagt attagttggt tctggatttt ttctcctaaa ttatgtagct 1020
gctattggtg ttgccattat gtggcctcag gctttcaagg gttacataat gattcctgct 1080
catgcaatct ttgcatctgc cttaatcttc aagacttggt tgttggacaa agcaaattac 1140
gctaaggagg ccagtgacag ctactatcac ttcctgtggt ttctaatgat tgcggaatac 1200
attttgtatc ctttcatctc tacctaa 1227

Claims (10)

1.一种生产葎草酮用工程大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以pTrcHis2B为出发质粒，将源于工程大肠杆菌的异戊二烯焦磷酸异构酶进化后的基因和来源于啤酒花的异戊二烯基转移酶进化后的基因以及单加氧酶基因构建到载体质粒pTrcHis2B中，得表达载体pTrcHis2B-idi-pt1-monooxygenase，异戊二烯焦磷酸异构酶进化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，异戊二烯基转移酶进化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，单加氧酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
2)以pACYCDuet-1为出发质粒，将来源于啤酒花的戊二酮合酶进化后的基因、胞质辅酶A连接酶进化后的基因和异戊二烯基转移酶进化后的基因片段构建到载体质粒pACYCDuet-1中，得表达载体pACYCDuet-1-vps-ccl2-pt2，戊二酮合酶进化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，胞质辅酶A连接酶进化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，异戊二烯基转移酶进化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
3)将步骤1)所得的表达载体pTrcHis2B-idi-pt1-monooxygenase和步骤2)所得的表达载体pACYCDuet-1-vps-ccl2-pt2转入工程大肠杆菌BL21(DE3)-Trc-low，得生产葎草酮用工程大肠杆菌。
2.一种生产葎草酮用工程大肠杆菌，其特征在于：
所述生产葎草酮用工程大肠杆菌是根据权利要求1所述的生产葎草酮用工程大肠杆菌的构建方法得到的工程大肠杆菌。
3.一种工程大肠杆菌在生物法合成葎草酮中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
取根据权利要求1所述的生产葎草酮用工程大肠杆菌的构建方法得到的工程大肠杆菌，发酵，离心过滤，冷冻干燥，提取纯化，得葎草酮。
4.根据权利要求3所述的工程大肠杆菌在生物法合成葎草酮中的应用，其特征在于：
所述发酵为摇瓶发酵，所述摇瓶发酵的具体步骤为：
将工程大肠杆菌的菌株活化后制备种子液，按照3～5％接种量进行接种，37℃，220r/min振荡培养，培养12h；加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷，诱导剂的添加量为0.2～0.6mL/L，继续振荡培养；每隔12h取样，测定OD值和pH值，发酵液呈现酸性时，采用10％的氢氧化钠调节发酵液的pH值，使其为7.0；当OD值不再上涨并且pH至呈现碱性时结束发酵，得发酵液。
5.根据权利要求4所述的工程大肠杆菌在生物法合成葎草酮中的应用，其特征在于：
所述发酵过程中，首先，向发酵培养基，添加2mL/L硫酸镁母液和1mL/L微量元素母液；接着，添加0.7mL/L氨苄青霉素母液和0.7mL/L氯霉素母液；最后，添加7.5mL/L甲羟戊酸和15mL/L亮氨酸母液；
所述硫酸镁母液的浓度为0.24g/L，所述微量元素母液由以下组分组成为：四水合钼酸铵3.7g/L、七水合硫酸锌2.9g/L、硼酸24.7g/L、五水合硫酸铜2.5g/L、四水合氯化锰15.8g/L；
所述亮氨酸母液的浓度为17.5g/L，所述氯霉素母液的浓度为34mg/L，所述氨苄青霉素母液的浓度为100mg/L。
6.根据权利要求4或5所述的工程大肠杆菌在生物法合成葎草酮中的应用，其特征在于：
所述摇瓶发酵过程中，发酵培养基为：(NH2)4SO4 1g/L，K2HPO4·3H2O 3g/L，KCl 1.7g/L，柠檬酸钠1g/L，甜菜碱1g/L，葡萄糖20g/L，柠檬酸1g/L，酵母膏5～10g/L；115℃高压蒸汽灭菌30min；
所述甲羟戊酸和所述亮氨酸母液是在诱导剂加入后再添加到发酵液中的，所述甲羟戊酸分3批添加至发酵液中。
7.根据权利要求3所述的工程大肠杆菌在生物法合成葎草酮中的应用，其特征在于：
所述离心过滤时，离心转速为5000～10000r/min，离心温度为20℃以下，离心时间为15～30min。
8.根据权利要求3所述的工程大肠杆菌在生物法合成葎草酮中的应用，其特征在于：
所述冷冻干燥时，真空度为10Pa，干燥温度为-20～-60℃，干燥时间为12～36h。
9.根据权利要求3所述的工程大肠杆菌在生物法合成葎草酮中的应用，其特征在于：
所述提取纯化方法包括超声波萃取法、试剂浸取法萃取、热抽提、磁力搅拌萃取中的任意一种或几种。
10.一种葎草酮，其特征在于：
所述葎草酮是根据权利要求3～9中任意一项所述的工程大肠杆菌在生物法合成葎草酮中的应用中得到的葎草酮。
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