CN111733176B - 一种生产蛇麻酮用工程大肠杆菌的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种生产蛇麻酮用工程大肠杆菌的构建方法及其应用。本发明的构建方法包括以下步骤：以大肠杆菌为出发菌株，将源于大肠杆菌的异戊二烯焦磷酸异构酶进化后的基因和来源于啤酒花的异戊二烯基转移酶进化后的基因构建到载体质粒中，得第一个表达载体；将来源于啤酒花的间苯三酚合酶进化后的基因、胞质辅酶A连接酶进化后的基因和异戊二烯基转移酶进化后的基因片段构建到另外一个载体质粒中，得第二个表达载体；将表达载体转入大肠杆菌，得生产蛇麻酮用工程大肠杆菌；本发明还给出利用上述工程大肠杆菌生物法合成蛇麻酮的方法。本发明的合成方法操作简单，流程短，成本低，摆脱了对啤酒花原料的依赖，实现清洁生产，避免了溶剂的大量消耗。

Description

一种生产蛇麻酮用工程大肠杆菌的构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及蛇麻酮的技术领域，特别是指一种生产蛇麻酮用工程大肠杆菌的构建方法及其在生产蛇麻酮中的应用。

背景技术

啤酒花(Humulus lupulus)，别名酒花、蛇麻花、酵母花，音译又称“忽布”，雌雄异株，是啤酒酿造过程中必不可少的苦味剂，并且，常作为药用植物一直应用于传统医学。蛇麻酮是啤酒花中重要的次级代谢产物之一，有着抗菌消炎、镇静催眠和抗肿瘤等药理作用。

目前，现有技术中主要是采用化学方法从啤酒花中提取蛇麻酮，例如：中国专利CN104447264A于2015年3月25日公开了一种从啤酒花中提取分离蛇麻酮的方法，并给出了这种提取方法包括以下步骤：a、将啤酒花压缩物装入亚临界超声萃取器中，将R134a混合溶剂通入萃取器中，被萃取物质中的有效成分溶解在液态或亚临界状态的R134a混合溶剂中，滤液泵入分离器中；b、调节温度和压力使R134a混合溶剂中R134a由液态转化为气态，与提取液分开，含甲醇的提取液经浓缩蒸发器浓缩得酒花浸膏，进入析晶工段；c、取一定量的酒花浸膏置于反应釜中，加入水，搅拌，室温下静置，抽滤，收集不溶物；d、将不溶物加入水，搅拌，室温下静置，抽滤；e、搅拌抽滤，收集不溶物，即得蛇麻酮粗品；用正己烷对蛇麻酮粗品进行重结晶，得白色针态蛇麻酮精品。

这种蛇麻酮的提取方法工艺流程长，分离纯化步骤复杂，成本高，经济性差；而且，这种蛇麻酮的提取方法还需要耗费大量的溶剂，容易导致溶剂残留物，残留的溶剂对蛇麻酮会产生有害的影响；另外，这种蛇麻酮的提取方法还在原料上大大依赖啤酒花的供应，由于啤酒花生长缓慢，这就限制了蛇麻酮的大规模生产；其次，啤酒花生长过程中由于气候和地理上的差异还会导致蛇麻酮浓度产生较大波动。

发明内容

本发明的目的是提供一种生产蛇麻酮用工程大肠杆菌的构建方法及其在生产蛇麻酮中的应用，旨在解决现有技术中采用化学法从啤酒花中提取蛇麻酮的方法存在流程长、操作复杂、对原料依赖性强、成本高和有溶剂残留的问题。

为了解决上述技术问题，本发明的主要技术方案是这样实现的：

在一个方面，本发明的一种生产蛇麻酮用工程大肠杆菌的构建方法，包括以下步骤：1)以pTrcHis2B为出发质粒，将源于工程大肠杆菌的异戊二烯焦磷酸异构酶进化后的基因和来源于啤酒花的异戊二烯基转移酶进化后的基因构建到载体质粒pTrcHis2B中，得表达载体pTrcHis2B-idi-pt1，异戊二烯焦磷酸异构酶进化后的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，异戊二烯基转移酶进化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；2)以pACYCDuet-1为出发质粒，将来源于啤酒花的间苯三酚合酶进化后的基因、胞质辅酶A连接酶进化后的基因和异戊二烯基转移酶进化后的基因片段构建到载体质粒pACYCDuet-1中，得表达载体pACYCDuet-1-ccl2-vps-pt2，间苯三酚合酶进化后的基因的核苷酸序列如SEQID NO:3所示，胞质辅酶A连接酶进化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，异戊二烯基转移酶进化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；3)将步骤1)所得的表达载体pTrcHis2B-idi-pt1和步骤2)所得的表达载体pACYCDuet-1-ccl2-vps-pt2转入工程大肠杆菌BL21(DE3)-Trc-low，得生产蛇麻酮用工程大肠杆菌。

本发明的生产蛇麻酮用工程大肠杆菌的构建方法从实验室已有的工程大肠杆菌BL21(DE3)-Trc-low菌株出发，运用基因重组技术，将源于大肠杆菌自身的异戊二烯焦磷酸异构酶进化后的基因(idi)和来源于啤酒花毛状腺体的异戊二烯基转移酶进化后的基因(pt1)构建到载体质粒pTrcHis2B中；将来源于啤酒花毛状腺体的间苯三酚合酶进化后的基因(vps)、胞质辅酶A连接酶进化后的基因(ccl2)和另一个异戊二烯基转移酶进化后的基因(pt2)片段构建到载体质粒pACYCDuet-1中；然后，将两个质粒转入原有的大肠杆菌工程菌中，从而在目标菌株中构建了一条完整的蛇麻酮全生物合成途径。与其它表达系统(如酵母，原生虫等细胞)相比，大肠杆菌具有许多优势，例如：遗传背景清楚、培养方法简单、繁殖速度快、抗污染能力强以及目的基因表达水平高，而且，此种方法无论是培养制备还是分离纯化，流程短，成本低，不受原料限制，操作简便易行。

在另一个方面，本发明的一种生产蛇麻酮用工程大肠杆菌，所述生产蛇麻酮用工程大肠杆菌是根据上面所述的生产蛇麻酮用工程大肠杆菌的构建方法得到的工程大肠杆菌。

本发明的这种工程大肠杆菌可以直接用于合成蛇麻酮，从而为蛇麻酮的合成技术提供了一种全新的合成方法，这是一种生物合成方法，这种蛇麻酮的合成方法可以避免啤酒花原料的限制，实现了化学合成难以实现的生物活性的保留，利用工程菌株中制备蛇麻酮的选择性比天然产物法高，产物仅含蛇麻酮，不含蛇麻酮衍生物。

在再一个方面，本发明的一种工程大肠杆菌在生物法合成蛇麻酮中的应用，包括以下步骤：取根据上面所述的生产蛇麻酮用工程大肠杆菌的构建方法得到的工程大肠杆菌，发酵，离心过滤，冷冻干燥，提取纯化，得蛇麻酮。

本发明从实验室已有的工程菌株出发，利用代谢工程技术，将蛇麻酮合成途径的关键酶基因通过载体导入至工程大肠杆菌菌株中，构建了全生物合成蛇麻酮的发酵菌株；所得工程大肠杆菌通过发酵、离心过滤、冷冻干燥和提取纯化而得蛇麻酮，这是一种全新的蛇麻酮合成方法；本发明的蛇麻酮合成方法操作简单，流程短，成本低，摆脱了对啤酒花原料的依赖，可以实现大规模生产，避免了溶剂的大量消耗，充分保留了蛇麻酮的生物活性，选择性高，所得产物中仅含蛇麻酮，不含蛇麻酮衍生物，蛇麻酮的纯度好，质量稳定。

作为一种优选的实施方案，所述发酵为摇瓶发酵，所述摇瓶发酵的具体步骤为：将工程大肠杆菌的菌株活化后制备种子液，按照10-15％接种量进行接种，采用10％的氢氧化钠调节pH值为中性，37℃，220r/min振荡培养，培养12h，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，继续振荡培养，每隔12h取样，测定OD值，并调节pH值，培养周期为90h。本发明的发酵过程为摇瓶发酵，摇瓶发酵通常是在恒温振荡器上进行，在摇瓶发酵过程中还添加了诱导剂，促进了发酵反应的快速进行。

作为一种优选的实施方案，所述发酵过程中，接种之后，首先，添加7.5mL/L甲羟戊酸和5mL/L亮氨酸，振荡培养12h，加入诱导剂，继续振荡培养12h，添加酵母膏补充液5g/L、甜菜碱补充液1g/L和亮氨酸5mL/L，再继续振荡培养12h，再添加亮氨酸5mL/L；所述甲羟戊酸是将甲羟戊酸内酯采用1M NaOH调节pH为7.0，121℃高压蒸汽灭菌25min；所述亮氨酸是将0.525g/L白氨酸溶于30mL vRO水中，0.22μm的无菌滤膜过滤，-20℃保存；所述酵母膏补充液是将2g酵母膏溶解于10mL纯水中，121℃高压蒸汽灭菌25min；所述甜菜碱补充液是将0.5g甜菜碱溶解于5mL纯水中，121℃高压蒸汽灭菌25min。本发明在摇瓶发酵过程中通过额外添加亮氨酸和甲羟戊酸可以增加蛇麻酮的产量，菌体密度OD600从4.70提高到了14.00，增加了约198％。

作为一种优选的实施方案，所述摇瓶发酵过程中，发酵培养基为：Na₂HPO₄·12H₂O30g/L，KH₂PO₄ 6g/L，NH₄Cl 2g/L，NaCl 1g/L，葡萄糖4g/L，柠檬酸1g/L，酵母膏2g/L，氨苄青霉素0.15g/L，氯霉素0.1g/L，其余为水，115℃高压蒸汽灭菌30min。本发明的这种发酵培养基生物相容性好，使用方便，培育效果好。

作为一种优选的实施方案，所述离心过滤时，离心转速为10000-50000r/min，离心温度为5℃以下，离心时间为15-30min。本发明经过发酵后的菌体在超速离心机中进行离心过滤，离心过程中通常采用纯水和醇对菌体进行冲洗。

作为一种优选的实施方案，所述冷冻干燥时，真空度为10Pa，干燥温度为-80℃，干燥时间为12h。本发明采用低温冷冻干燥的方式对菌体进行干燥，干燥温度低，干燥效率高，充分保证了蛇麻酮的生物活性。

作为一种优选的实施方案，所述提取纯化的具体步骤为：添加正己烷，在80-90℃下，回流6-9h，干燥。本发明中冷冻干燥后的菌体采用正己烷回流提纯，并采用旋转蒸发仪进行干燥除溶剂，从而得到纯化后的蛇麻酮。

在还一个方面，本发明的一种蛇麻酮，所述蛇麻酮是根据上面任意一项所述的工程大肠杆菌在生物法合成蛇麻酮中的应用中得到的蛇麻酮。本发明的蛇麻酮在合成过程中摆脱了对啤酒花原料的依赖，可以实现大规模生产，避免了溶剂的大量消耗，充分保留了蛇麻酮的生物活性，选择性高，纯度好，质量稳定。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明从实验室已有的工程菌株出发，利用代谢工程技术，将蛇麻酮合成途径的关键酶基因通过载体导入至工程大肠杆菌菌株中，构建了全生物合成蛇麻酮的发酵菌株；所得菌株通过发酵、离心过滤、冷冻干燥和提取纯化而得到蛇麻酮，这是一种全新的蛇麻酮生物合成方法；本发明的蛇麻酮合成方法操作简单，流程短，成本低，摆脱了对啤酒花原料的依赖，可以实现大规模生产，避免了溶剂的大量消耗，充分保留了蛇麻酮的生物活性，选择性高，所得产物中仅含蛇麻酮，不含蛇麻酮衍生物，蛇麻酮的纯度好，质量稳定。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例三所得蛇麻酮的紫外吸收光谱图；

图2为现有化学法从啤酒花中提取的蛇麻酮的紫外吸收光谱图；

图3为市售分析纯蛇麻酮的紫外吸收光谱图；

图4为本发明实施例三所得蛇麻酮的高效液相图谱；

图5为现有化学法从啤酒花中提取的蛇麻酮的高效液相图谱；

图6为市售分析纯蛇麻酮的高效液相图谱；

图7为本发明实施例三所得蛇麻酮的氢谱图；

图8为现有化学法从啤酒花中提取的蛇麻酮的氢谱图；

图9为市售分析纯蛇麻酮的氢谱图；

图10为本发明实施例三所得蛇麻酮的LC-MS图谱；

图11为市售分析纯蛇麻酮的LC-MS图谱。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的一种生产蛇麻酮用工程大肠杆菌的构建方法，包括以下步骤：

1)以pTrcHis2B为出发质粒，将源于工程大肠杆菌的异戊二烯焦磷酸异构酶进化后的基因和来源于啤酒花的异戊二烯基转移酶进化后的基因构建到载体质粒pTrcHis2B中，得表达载体pTrcHis2B-idi-pt1，异戊二烯焦磷酸异构酶进化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，异戊二烯基转移酶进化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

2)以pACYCDuet-1为出发质粒，将来源于啤酒花的间苯三酚合酶进化后的基因、胞质辅酶A连接酶进化后的基因和异戊二烯基转移酶进化后的基因片段构建到载体质粒pACYCDuet-1中，得表达载体pACYCDuet-1-ccl2-vps-pt2，间苯三酚合酶进化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，胞质辅酶A连接酶进化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，异戊二烯基转移酶进化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

3)将步骤1)所得的表达载体pTrcHis2B-idi-pt1和步骤2)所得的表达载体pACYCDuet-1-ccl2-vps-pt2转入工程大肠杆菌BL21(DE3)-Trc-low，得生产蛇麻酮用工程大肠杆菌。

本发明的一种生产蛇麻酮用工程大肠杆菌，所述生产蛇麻酮用工程大肠杆菌是根据上面所述的生产蛇麻酮用工程大肠杆菌的构建方法得到的工程大肠杆菌。

本发明的一种工程大肠杆菌在生物法合成蛇麻酮中的应用，包括以下步骤：取根据上面所述的生产蛇麻酮用工程大肠杆菌的构建方法得到的工程大肠杆菌，发酵，离心过滤，冷冻干燥，提取纯化，得蛇麻酮。

优选地，所述发酵为摇瓶发酵，所述摇瓶发酵的具体步骤为：将工程大肠杆菌的菌株活化后制备种子液，按照10-15％接种量进行接种，采用10％的氢氧化钠调节pH值为中性，37℃，220r/min振荡培养，培养12h，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，继续振荡培养，每隔12h取样，测定OD值，并调节pH值，培养周期为90h。

进一步地，所述发酵过程中，接种之后，首先，添加7.5mL/L甲羟戊酸和5mL/L亮氨酸，振荡培养12h，加入诱导剂，继续振荡培养12h，添加酵母膏补充液5g/L、甜菜碱补充液1g/L和亮氨酸5mL/L，再继续振荡培养12h，再添加亮氨酸5mL/L；所述甲羟戊酸是将甲羟戊酸内酯采用1M NaOH调节pH为7.0，121℃高压蒸汽灭菌25min；所述亮氨酸是将0.525g/L白氨酸溶于30mL RO水中，0.22μm的无菌滤膜过滤，-20℃保存；所述酵母膏补充液是将2g酵母膏溶解于10mL纯水中，121℃高压蒸汽灭菌25min；所述甜菜碱补充液是将0.5g甜菜碱溶解于5mL纯水中，121℃高压蒸汽灭菌25min。

具体地，所述摇瓶发酵过程中，发酵培养基为：Na₂HPO₄·12H₂O 30g/L，KH₂PO₄ 6g/L，NH₄Cl 2g/L，NaCl 1g/L，葡萄糖4g/L，柠檬酸1g/L，酵母膏2g/L，氨苄青霉素0.15g/L，氯霉素0.1g/L，其余为水，115℃高压蒸汽灭菌30min。

优选地，所述离心过滤时，离心转速为10000-50000r/min，离心温度为5℃以下，离心时间为15-30min。

优选地，所述冷冻干燥时，真空度为10Pa，干燥温度为-80℃，干燥时间为12h。

优选地，所述提取纯化的具体步骤为：添加正己烷，在80-90℃下，回流6-9h，干燥。

本发明的一种蛇麻酮，所述蛇麻酮是根据上面任意一项所述的工程大肠杆菌在生物法合成蛇麻酮中的应用中得到的蛇麻酮。

实施例一

本发明的一种生产蛇麻酮用工程大肠杆菌的构建方法，包括以下步骤：

S1感受态细胞的制备

1)菌种纯化：超净工作台紫外灭菌30min，-80℃冰箱取出实验室冻存的BL21-Trc-low菌株放到冰盒上解冻；超净工作台内灭过菌的移液枪蘸取甘油管中的菌种在LB固体培养基上划线，倒置于37℃恒温培养箱中过夜培养(一般12-14h)；

LB固体培养基：10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，15g/L琼脂粉，5g/L酵母膏，15g/L琼脂粉，121℃，高压灭菌25min；待温度降到50-60℃左右，倒板；

LB液体培养基：10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母膏，15g/L琼脂粉，121℃，高压灭菌25min；

2)单克隆培养：取两个50mL离心管，分别加入25mL LB液体培养基，从培养完成的固体培养基上挑选2个生长适宜的单菌落，分别转接进去；恒温摇床中，37℃，220转，过夜培养；等菌液OD600达到0.35以上，但不超过0.5；

3)将实验所需的5mL、1.5mL离心管和1mL、100μL移液枪枪头提前放入无菌密封袋里预冷30min左右(-20℃)；

4)超净工作台中，将菌液分装到预冷好的离心管，冷冻离心机4℃，4000转，离心5min，尽量除尽上清液；

5)再次回到超净工作台，每个离心管中加入100μL于4℃冰箱低温保存的SolutionA，轻轻吹吸，使沉淀的菌体悬浮在SolutionA中(一定要轻，禁止剧烈震荡)，4000转，离心5min，尽量除尽上清液；

6)每个离心管中加入100μL于4℃冰箱低温保存的SolutionB，轻轻吹吸再次使沉淀悬浮于SolutionB中，写好名称日期，-80℃冰箱中超低温冻藏。

S2质粒pTrcHis2B-idi-pt1和pACYCDuet-1-ccl2-vps-pt2的转化

1)打开超净工作台紫外灭菌30min，关紫外开通风，从-80℃超低温冰箱中取出上述方法制备的感受态细胞和由Genscript公司合成的表达载体pTrcHis2B-idi-pt1和pACYCDuet-1-ccl2-vps-pt2放到冰盒上冰浴融化；

2)在超净工作台内用10μL移液枪分别移取3μL的pTrcHis2B-idi-pt1和pACYCDuet-1-ccl2-vps-pt2到经冰浴融化的感受态细胞中，轻轻混匀，再在冰盒上冰浴30min；

3)提前设置恒温水浴锅42℃，用浮片将冰浴静置30min的感受态细胞放进恒温水浴锅热激45s，然后，快速转移到冰盒上继续冰浴5min(这个过程不要晃动感受态细胞)，关闭水浴锅；

4)在超净工作台中用1mL移液枪移取0.9mL LB液体培养基到上一步的离心管中，轻晃混匀后，放到37℃220转的恒温振荡器中培养一个小时以上使菌体复苏；

5)先在超净工作台中，将LB-Amp-Chl双抗平板提前预热，取100μL上一步培养的菌液涂板，均匀涂干，写好名称日期，倒置于37℃的恒温培养箱中，过夜培养(12h以上)。

实施例二

本发明的一种工程大肠杆菌在生物法合成蛇麻酮中的应用，包括以下步骤：

S1制备发酵种子液

A、一级种子

1)在超净工作台中，取两个灭过菌的50mL离心管，分别加入7.3μL Chl，10μL Amp混匀，用10μL移液枪枪头从实施例一培养好的平板上分别蘸取两个不同的生长良好的单克隆菌落，放进离心管吹打；

2)37℃220转的恒温振荡器中，培养过夜，至明显浑浊；

B、二级种子

1)超净工作台中，取提前备好的LB 100mL专用培养基，加入73μL Chl，100μL Amp混匀；比较两个一级种子，择优接种，接种量为5mL；

2)37℃220转的恒温振荡器中，培养过夜(12h以上)；

C、摇瓶发酵

1)取M9培养基，加入150μL Amp母液和140μL Chl母液，再转接上述培养好的二级种子，接种量为10mL，用10％的NaOH将菌体培养液调至pH为中性；

M9培养基为：Na₂HPO₄·12H₂O 30g/L，KH₂PO₄ 6g/L，NH₄Cl 2g/L，NaCl 1g/L，葡萄糖4g/L，柠檬酸1g/L，酵母膏2g/L，115℃高压蒸汽灭菌30min。

2)37℃的恒温振荡器220转培养12h；

3)12h以后，加入诱导剂IPTG，继续恒温震荡培养，每隔12h取样，测OD值以及调节pH值；

S2菌体离心

1)将发酵得到的菌液收集到250mL的离心杯里，超速离心机设置5℃以下，10000转以上，15-30min，弃上清液；

2)加入与菌液相同体积的纯水，重复上述离心条件洗菌体；

3)水洗一遍，醇洗两遍，再水洗一遍；

4)将菌体放入冷冻室预先冷冻；

S3冷冻干燥

1)打开冷冻干燥机，打开制冷，等温度降到0℃以下，将冷冻处理过的菌体收集到培养皿中，保鲜膜封口扎孔(培养皿接触面积大，封膜是为了避免菌体损失)，把左下角蓝色的充气阀拧紧，打开真空机和真空泵，开始冻干；

2)待菌体变成无水粉末，拧开充气阀，等真空计到9000，关泵取出菌体；

S4菌体纯化

1)称量菌体，用玻璃棒碾碎，装入钉好的滤纸包中，密封；

2)安装索氏提取器，架在调整参数为90℃的恒温油浴锅上，加入150ml的正己烷，滤纸包放进回流腔，回流提取6-9h；回流反应结束后，收集回流提取液，转移到预先称重的洁净旋蒸瓶中，旋转蒸发仪72℃旋蒸，得蛇麻酮。

实施例三

在实施例二的基础上，改变摇瓶发酵的参数，在摇瓶发酵过程中，接种之后，首先，添加7.5mL/L甲羟戊酸和5mL/L亮氨酸，振荡培养12h，加入诱导剂，继续振荡培养12h，添加酵母膏补充液5g/L、甜菜碱补充液1g/L和亮氨酸5mL/L，再继续振荡培养12h，再添加亮氨酸5mL/L。

甲羟戊酸是将甲羟戊酸内酯采用1M NaOH调节pH为7.0，121℃高压蒸汽灭菌25min；

亮氨酸是将0.525g L-白氨酸溶于30mL RO水中，0.22μm的无菌滤膜过滤，-20℃保存；

酵母膏补充液是将2g酵母膏溶解于10mL纯水中，121℃高压蒸汽灭菌25min；

甜菜碱补充液是将0.5g甜菜碱溶解于5mL纯水中，121℃高压蒸汽灭菌25min。

经测定，实施例三的菌体密度OD600从实施例二的4.70提高到了14.00，增加了约198％。

实验1

将实施例三所得的蛇麻酮(简称实验样)、利用啤酒花为原料采用现有化学提取法制备的蛇麻酮(简称对照样)和市售的分析纯蛇麻酮(简称空白样)分别置于岛津公司生产的ZF-1型号的紫外光谱仪上进行UV法扫描全波长，在中档灵敏度下，扫描狭缝宽度为2.00m×2.00m，扫描方式为反射。

由附图1-附图3可以看出，分析纯蛇麻酮(简称空白样)的紫外吸收光谱图非常干净，没有杂质峰，其最大吸收波长分别为λ_max209 nm和255nm。在255nm处的吸收峰就是蛇麻酮的吸收峰；本发明实施例三所得的蛇麻酮(简称实验样)的紫外吸收光谱图与分析纯蛇麻酮(简称空白样)的紫外吸收光谱图非常一致，也非常干净，没有杂质峰；然而，对照样的紫外吸收光谱图较本发明实施例三所得的蛇麻酮(简称实验样)的紫外吸收光谱图多出很多杂质峰，这些杂质中的芳香环推测是来自PIVP或者啤酒花颗粒的其它多酚物质。

实验2

将实施例三所得的蛇麻酮(简称实验样)、利用啤酒花为原料采用现有化学提取法制备的蛇麻酮(简称对照样)和市售的分析纯蛇麻酮(简称空白样)分别置于岛津公司生产的LC-16型号的液相色谱仪上进行液相色谱分析，色谱条件为：分析纯的甲醇分别溶解对照样和实验样各10mg，色谱柱Symmetry C18(4.6×150mm 5μm)，流动相V_甲醇:V_水＝85:15，H₃PO₄调pH值至3.5，流速1.0mL/min，检测波长315nm，进样量20μL，柱温室温。

由附图4-附图6可以看出，分析纯蛇麻酮(简称空白样)的高效液相色谱图于9-10min左右出峰；本发明实施例三所得的蛇麻酮(简称实验样)和对照样的高效液相色谱图均在此时间和位置范围内出峰；然而，对照样的高效液相色谱图相对杂乱，这说明对照样中杂质多，对照样的纯度低。

实验3

将实施例三所得的蛇麻酮(简称实验样)、利用啤酒花为原料采用现有化学提取法制备的蛇麻酮(简称对照样)和市售的分析纯蛇麻酮(简称空白样)分别转移到干净的核磁管里，并采用MEOD溶解，置于Bruker公司生产的Bruker AV-500MHZ型号的核磁共振仪上进行核磁分析。

由附图7-附图9可以看出，分析纯蛇麻酮(简称空白样)的氢谱图：

0.9616-0.9783ppm：-CH₃，C29、C30，C15、C28；1.5621-1.5902ppm：-CH₂-，C18、C19；1.6909-1.7530ppm：-CH₂-，C12，C8；2.5668-2.6445ppm：-CH-，C9；2.8472-2.8645ppm：-CH₂，C20、C24；3.1075-3.1249ppm：-CH-，C13；3.3188-3.3352ppm：-CH₃，C22、C23、C26、C27；4.8774ppm：水峰。

对比分析研究显示，本发明实施例三所得的蛇麻酮(简称实验样)的氢谱图和对照样的氢谱图均成功检测到了蛇麻酮的特征官能团。因此，本发明中成功分离出了蛇麻酮。

实验4

将实施例三所得的蛇麻酮(简称实验样)和市售的分析纯蛇麻酮分别置于Waters公司生产的Waters UPLC-Q/TOF Xevo G2-XS型号的液相色谱与质谱联用仪上进行液质分析，利用啤酒花为原料采用现有化学提取法制备的蛇麻酮即对照样由于成分复杂并且纯度较低，在此不做MS分析。

由附图10-附图11可以看出，分析纯蛇麻酮(简称空白样)的LC-MS图谱中，准分子离子峰为m/z＝414.5，就是目标产物蛇麻酮的分子量；本发明实施例三所得的蛇麻酮(简称实验样)的LC-MS图谱中，还出现其它两个主要的离子峰，分别为m/z：302，233；对应的分子式分别为：C₁₈H₂₂O₄，C₁₃H₁₃O₄。302对应的结构是蛇麻酮1和2处键断裂失去一个异戊二烯基和一个异丙基的物质A，反应过程如式I；233则是在物质A的基础上再失去一个异戊二烯基。表征结果与理论值一致，证实了产物中异戊二烯基的存在。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明从实验室已有的工程菌株出发，利用代谢工程技术，将蛇麻酮合成途径的关键酶基因通过载体导入至工程大肠杆菌菌株中，构建了全生物合成蛇麻酮的发酵菌株；所得菌株通过发酵、离心过滤、冷冻干燥和提取纯化而得到蛇麻酮，这是一种全新的蛇麻酮生物合成方法；本发明的蛇麻酮合成方法操作简单，流程短，成本低，摆脱了对啤酒花原料的依赖，可以实现大规模生产，避免了溶剂的大量消耗，充分保留了蛇麻酮的生物活性，选择性高，所得产物中仅含蛇麻酮，不含蛇麻酮衍生物，蛇麻酮的纯度好，质量稳定。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 青岛科技大学

<120> 一种生产蛇麻酮用工程大肠杆菌的构建方法及其应用

<130> 2020

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 864

<212> DNA

<213> 人工序列(SEQ ID NO:1)

<400> 1

actgccgaca acaatagtat gccccatggt gcagtatcta gttacgccaa attagtgcaa 60

aaccaaacac ctgaagacat tttggaagag tttcctgaaa ttattccatt acaacaaaga 120

cctaataccc gatctagtga gacgtcaaat gacgaaagcg gagaaacatg tttttctggt 180

catgatgagg agcaaattaa gttaatgaat gaaaattgta ttgttttgga ttgggacgat 240

aatgctattg gtgccggtac caagaaagtt tgtcatttaa tggaaaatat tgaaaagggt 300

ttactacatc gtgcattctc cgtctttatt ttcaatgaac aaggtgaatt acttttacaa 360

caaagagcca ctgaaaaaat aactttccct gatctttgga ctaacacatg ctgctctcat 420

ccactatgta ttgatgacga attaggtttg aagggtaagc tagacgataa gattaagggc 480

gctattactg cggcggtgag aaaactagat catgaattag gtattccaga agatgaaact 540

aagacaaggg gtaagtttca ctttttaaac agaatccatt acatggcacc aagcaatgaa 600

ccatggggtg aacatgaaat tgattacatc ctattttata agatcaacgc taaagaaaac 660

ttgactgtca acccaaacgt caatgaagtt agagacttca aatgggtttc accaaatgat 720

ttgaaaacta tgtttgctga cccaagttac aagtttacgc cttggtttaa gattatttgc 780

gagaattact tattcaactg gtgggagcaa ttagatgacc tttctgaagt ggaaaatgac 840

aggcaaattc atagaatgct ataa 864

<210> 2

<211> 1245

<212> DNA

<213> 人工序列(SEQ ID NO:2)

<400> 2

atggagctct cttcagtttc tagcttttca cttggaacta atccatttat atcaattccc 60

cataataata ataataatct caaggtctca tcttactgtt gtaaaagcaa gagcagagta 120

atcaattcca caaactcaaa gcattgctcc cccaacaaca acaacaacaa caacacctct 180

aacaagacaa cacatcttct tgggttgtac ggacagagca gatgcttatt aaaaccttta 240

tcaattttca gctgcaagga ccaaagggga aattcaatta gggcttctgc acaaattgaa 300

gatcgacctc ctgaatctgg aaatctttcg gcacttacaa atgttaaaga ctttgtaagt 360

gtatgttggg agtatgtacg accatacaca gcaaaaggag ttattatatg ctctagttgt 420

ttatttggaa gagaattgtt ggagaaccca aatctattta gttggcctct aatttttagg 480

gcactcttgg gaatgttggc tatactaggc tcttgttttt atacagctgg catcaatcaa 540

atttttgata tggatattga caggataaac aaaccagatt taccactggt ttcagggcgt 600

atttcagtgg aatcagcttg gttattgaca ttaagtcctg caataattgg cttcatattg 660

attcttaaat tgaactcagg accactcctt acttctctat actgtttggc cattttgagt 720

gggactatct attctgttcc tccatttaga tggaagaaga atcccattac agcatttctt 780

tgtattctta tgattcatgc aggcttaaac ttttctgtat attatgcctc tagagcagca 840

cttggacttg catttgtatg gagcccttca ttttccttca tcactgcctt tattacattt 900

atgactctaa cgttggcttc ctccaaagat ctttctgaca taaatggaga tcgcaagttt 960

ggtgttgaaa cctttgcaac caagcttggt gcaaaaaaca ttacattact tggcacagga 1020

cttctcctcc taaactatgt agcagctata tctactgcca ttatatggcc taaggctttc 1080

aagagtaaca taatgctgct ttctcatgca atcttagcat tttccttatt cttccaggct 1140

cgagagttgg atcgaacgaa ctacactccg gaagcgtgca aaagcttcta tgaattcatc 1200

tggatactct tctctgcgga atacgttgta tatctgttca tttag 1245

<210> 3

<211> 1829

<212> DNA

<213> 人工序列(SEQ ID NO:3)

<400> 3

agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa 60

ttcccctcta gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atataccatg gataactata 120

gaaggctcca cactccggtt gctctctgcg ttgccagtcc acctgcgcca cccaccacat 180

catggaagtc aatggagggc ttagttcagt gctctgcaaa tcatgttcct ctctctccca 240

ttaccttctt ggagcgttct tccaaggctt acagagacaa cacctctctt gtctatggct 300

ctgtcagata cacttgggcc caaactcacc atcgctgtct caagctagct tctgctctca 360

caacccactt gggaatttca ccaggggatg tggtggctac cttctcttac aacctaccag 420

aaatctacga gcttcatttt gcagtcccaa tggctggtgg gattctctgt acactcaacg 480

ctcgcaacga ctcggccatg gtgtcgacgc tgctagcaca ctcggaagcc aaactcatct 540

ttgtggaacc ccagttactg gaaacggctc gggcagctct tgatcttctc gcccaaaagg 600

acataaagcc tccaactttg gtcttactaa ccgattcgga aagcttcact tcaagctcat 660

acgatcacta taatcatctg ttggccaatg ggtctgatga cttcgaaata agacggccta 720

agaacgaatg ggatcccatc agcataaact acacctcagg caccactgca cgccccaaag 780

ctgtcgttta cagccaccgt ggggcatatc tgaactccat agccacagtt ttgcttcacg 840

ggatggggac aacgtctgtt tatctttggt cagtgcccat gtttcattgc aacggctggt 900

gttttccatg gggggctgca gctcagggcg ccaccaacat atgcataaga aaagtctctc 960

ccaaagccat ttttgacaac atacatttgc ataaggttac acactttgga gctgcaccaa 1020

ctgtcttgaa catgattgtg aactcgccgg aaggcaacct tcacaccccg cttccccaca 1080

aggtggaggt catgacagga ggttcaccgc caccgcccaa ggtcattgcg aggatggaag 1140

agatggggtt tcaagtgaat cacatttatg gcctcacgga aacttgtggt cctgctgcta 1200

attgtgtatg caaacctgaa tgggatgcac tgcagccaga ggaacggtat gccttgaaag 1260

ctcgtcaagg attaaaccat ctggcgatgg aggagatgga cgtgagagac ccggtgacca 1320

tggaaagtgt tagggccgat ggtgcaacga ttggtgaggt tatgttcaga ggaaacactg 1380

tgatgagtgg ctactttaaa gacttgaagg cgaccgagga ggctttcgag ggaggttggt 1440

ttcgtagtgg ggatcttggt gtgaaacatg aggatggtta tattcaactt aaggatcgga 1500

agaaggatgt ggtgatatca ggaggggaga atatcagtac agttgaagtt gagactgtgt 1560

tgtatagcca cgaagcagtg ctcgaggctg ctgtggtggc gcgccctgat aagctttggg 1620

gggagacgcc ttgtgctttt gtgacactta aggagggatt tgataatgat gtaagtgctg 1680

accaaattat caaattctgt agagatcgtt tgccccatta catggctccc aagacagtag 1740

tgtttgaaga gttaccaaag acttcaacag gaaagataca gaagtatatt ctgaaagaaa 1800

aagcaatggc catgggcagc ctttcttga 1829

<210> 4

<211> 1472

<212> DNA

<213> 人工序列(SEQ ID NO:4)

<400> 4

agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa 60

ttcccctcta gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atataccatg tttcacagta 120

ctactagcta tatatatatc aggtaatggc gtccgtaact gtagagcaaa tccgaaaggc 180

tcagcgagct gaaggtccgg ccaccatcct cgccattggc accgccgttc ctgccaactg 240

tttcaaccaa gctgattttc ccgactacta ctttcgtgtc accaaaagtg aacacatgac 300

tgatctcaaa aagaagttcc aacgaatgtg tgaaaaatcc actataaaaa agcgttactt 360

gcacttgacc gaagagcatc tgaagcagaa cccacatctg tgcgagtaca atgcaccatc 420

tctgaacaca cgccaagaca tgttggtggt tgaagttccc aagcttggga aggaggctgc 480

aatcaatgcc atcaaagaat ggggccaacc caagtccaag atcacccatc tcatcttctg 540

caccggctcc tccatcgaca tgccaggagc cgattaccaa tgcgccaagc ttctcggcct 600

ccgaccctcg gtgaagcgag tgatgctgta tcaactcggc tgttatgccg gtggaaaagt 660

tcttcgcata gccaaggaca tagcagagaa caacaagggc gctagagttc tcattgtgtg 720

ctctgagatc acagcttgta tctttcgcgg gccctcggag aaacatttgg attgcttggt 780

ggggcaatct ctgttcggag acggggcatc ttcggtcatc gttggtgccg accctgatgc 840

ctcggtaggc gagcggccga tcttcgagtt ggtttcagct gcgcagacga ttttgcctaa 900

ctcggatgga gccatagccg ggcacgtaac ggaagccggg ctgacatttc acttgctgag 960

ggacgtgcca gggttgatct cccaaaacat tgagaagagc ttgattgagg ccttcactcc 1020

gattgggatt aatgactgga acaacatatt ctggattgca catcccggtg gacctgccat 1080

tctggacgag atagaggcca agctcgagct gaagaaggag aagatgaagg cgtctcgtga 1140

aatgctgagc gagtatggga acatgtcatg tgcaagcgtt ttcttcatag tagatgagat 1200

gaggaaacag tcgtcgaagg aagggaagtc taccaccgga gatggactgg agtggggcgc 1260

tctcttcggg tttggaccgg gtctgacggt ggagacggtg gtcttgcaca gcgtgcccac 1320

aaacgtctaa tgaataattt gttatcgcta gcttgtcaaa tcaagcttta ctatgtattg 1380

tggtcgttaa ttagtttata ctttgatgtt gatcaataat tatatacctc atctaataaa 1440

atgatcaaat atatttttat ataaaaaaat ag 1472

<210> 5

<211> 1227

<212> DNA

<213> 人工序列(SEQ ID NO:5)

<400> 5

atggagctct catcagcttg taatctttca cttaaaccta attattatta ttatccaact 60

tcattattcc caagtaataa tagttataat aatctcaagg cctcatctta ttaccaaaca 120

cagagaccta tcaaatgttg tagttattct ccttcaaaat attgctccac caagaagttg 180

cagacaacac atctacttgg gctctatgca aaacacaaat gcttgaaacc tttttcaatc 240

ggtcatcttc caaggccaaa ttcccttacg gcttggtctc atcaaagtga atttcctagt 300

acaatagtta ccaaaggttc aaattttgga catgcttcgt ggaaattcgt aaggcccatt 360

ccatttgtag cagtatctat catatgcact tctttgtttg gagcagagct gttaaagaac 420

ccaaatctat ttagctggca attgatgttt gatgcattcc aaggcttagt ggttatatta 480

ctataccata tttacataaa tggcctcaat cagatttacg atttggaaag tgacaggata 540

aacaaaccag atttaccact agctgcagag gaaatgtcag ttaaatcagc ttggttcttg 600

acaatattta gtgcagtagc cagcttacta ttgatgatta agttgaagtg tggactattc 660

cttacttgta tgtactgttg ttatcttgtg attggggcta tgtattctgt tcctcccttt 720

agatggaaga tgaatacttt tacatcaact ctctggaact tttcggaaat aggtatcggt 780

ataaattttc tgatcaacta tgctagcaga gctactcttg gacttccatt tcagtggagg 840

cctccattta ctttcatcat tggctttgtt tcaactttaa gtattatctt gagcatccta 900

aaagatgttc ctgatgtaga aggtgacaag aaggttggca tgtcaacgtt accagtaata 960

tttggtgcta gaaccatagt attagttggt tctggatttt ttctcctaaa ttatgtagct 1020

gctattggtg ttgccattat gtggcctcag gctttcaagg gttacataat gattcctgct 1080

catgcaatct ttgcatctgc cttaatcttc aagacttggt tgttggacaa agcaaattac 1140

gctaaggagg ccagtgacag ctactatcac ttcctgtggt ttctaatgat tgcggaatac 1200

attttgtatc ctttcatctc tacctaa 1227

Claims (9)

1.一种生产蛇麻酮用工程大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）以pTrcHis2B为出发质粒，将源于工程大肠杆菌的异戊二烯焦磷酸异构酶进化后的基因和来源于啤酒花的异戊二烯基转移酶进化后的基因构建到载体质粒pTrcHis2B中，得表达载体pTrcHis2B-idi-pt1，异戊二烯焦磷酸异构酶进化后的基因的核苷酸序列如SEQID NO:1所示，异戊二烯基转移酶进化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

2）以pACYCDuet-1为出发质粒，将来源于啤酒花的间苯三酚合酶进化后的基因、胞质辅酶A连接酶进化后的基因和异戊二烯基转移酶进化后的基因片段构建到载体质粒pACYCDuet-1中，得表达载体pACYCDuet-1-ccl2-vps-pt2，间苯三酚合酶进化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，胞质辅酶A连接酶进化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，异戊二烯基转移酶进化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

3）将步骤1）所得的表达载体pTrcHis2B-idi-pt1和步骤2）所得的表达载体pACYCDuet-1-ccl2-vps-pt2转入工程大肠杆菌BL21(DE3)-Trc-low，得生产蛇麻酮用工程大肠杆菌。

2.一种生产蛇麻酮用工程大肠杆菌，其特征在于：

所述生产蛇麻酮用工程大肠杆菌是根据权利要求1所述的生产蛇麻酮用工程大肠杆菌的构建方法得到的工程大肠杆菌。

3.一种工程大肠杆菌在生物法合成蛇麻酮中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

取根据权利要求1所述的生产蛇麻酮用工程大肠杆菌的构建方法得到的工程大肠杆菌，发酵，离心过滤，冷冻干燥，提取纯化，得蛇麻酮。

4.根据权利要求3所述的工程大肠杆菌在生物法合成蛇麻酮中的应用，其特征在于：

所述发酵为摇瓶发酵，所述摇瓶发酵的具体步骤为：

将工程大肠杆菌的菌株活化后制备种子液，按照10-15%接种量进行接种，采用10%的氢氧化钠调节pH值为中性，37 ℃，220 r/min振荡培养，培养12 h，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷，继续振荡培养，每隔12 h取样，测定OD值，并调节pH值，培养周期为90 h。

5.根据权利要求4所述的工程大肠杆菌在生物法合成蛇麻酮中的应用，其特征在于：

所述发酵过程中，接种之后，首先，添加7.5 mL/L甲羟戊酸和5 mL/L亮氨酸，振荡培养12 h，加入诱导剂，继续振荡培养12 h，添加酵母膏补充液5 g/L、甜菜碱补充液1 g/L和亮氨酸5 mL/L，再继续振荡培养12 h，再添加亮氨酸5 mL/L；

所述甲羟戊酸是将甲羟戊酸内酯采用1 M NaOH调节pH为7.0，121 ℃高压蒸汽灭菌25min；

所述亮氨酸是将0.525 g/L白氨酸溶于30 mL RO水中，0.22 μm的无菌滤膜过滤，-20℃保存；

所述酵母膏补充液是将2 g酵母膏溶解于10 mL纯水中，121 ℃高压蒸汽灭菌25min；

所述甜菜碱补充液是将0.5 g甜菜碱溶解于5 mL纯水中，121 ℃高压蒸汽灭菌25 min。

6.根据权利要求4或5所述的工程大肠杆菌在生物法合成蛇麻酮中的应用，其特征在于：

所述摇瓶发酵过程中，发酵培养基为：Na₂HPO₄·12H₂O 30 g/L，KH₂PO₄ 6 g/L，NH₄Cl 2g/L，NaCl 1 g/L，葡萄糖 4 g/L，柠檬酸 1 g/L，酵母膏2 g/L，氨苄青霉素0.15 g/ L，氯霉素0.1 g/L，其余为水，115℃高压蒸汽灭菌30min。

7.根据权利要求3所述的工程大肠杆菌在生物法合成蛇麻酮中的应用，其特征在于：

所述离心过滤时，离心转速为10000-50000 r/min，离心温度为5 ℃以下，离心时间为15-30 min。

8.根据权利要求3所述的工程大肠杆菌在生物法合成蛇麻酮中的应用，其特征在于：

所述冷冻干燥时，真空度为10 Pa，干燥温度为-80 ℃，干燥时间为12 h。

9.根据权利要求3所述的工程大肠杆菌在生物法合成蛇麻酮中的应用，其特征在于：

所述提取纯化的具体步骤为：添加正己烷，在80-90 ℃下，回流6-9 h，干燥。

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