CN109234216A - 一种生产鲨烯的基因工程菌及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生产鲨烯的基因工程菌及其方法。该基因工程菌为大肠杆菌(Escherichia coli)中表达鲨烯合酶基因、5‑磷酸脱氧木酮糖合酶基因、异戊烯基二磷酸异构酶基因以及法尼基焦磷酸合酶基因的基因工程菌；所述鲨烯合酶基因来源于解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。该基因工程菌异源表达解脂耶氏酵母中的鲨烯合酶，与此同时，过表达大肠杆菌内源基因dxs、idi和ispA的组合；为鲨烯合酶基因的产业化生产提供了新思路。

Description

一种生产鲨烯的基因工程菌及其方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种生产鲨烯的基因工程菌及其方法。
背景技术
萜类化合物，又称类异戊二烯，具有异戊二烯单元组成的基本骨架，是自然界分布广泛、种类最多的一类天然化合物。因其具有重要生物学和社会学功能，越来越多的萜类化合物被用作药物、营养制品、生物燃料、香料、化妆品和食品添加剂等。其中三萜类化合物鲨烯由于其潜在的药用前景，自1906年从鲨鱼肝油中发现以来一直受到人们的关注。在人、动物、植物和微生物中均发现了鲨烯的存在，鲨烯是合成多种生物活性化合物的普遍前体，例如甾醇类、胆固醇和多种萜类化合物。鲨烯由于其独特的物理化学性质作为营养品和预防治疗药物对人类的健康和生活产生多种有益的作用，例如：作为营养保健品在日常饮食中服用鲨烯，可以减少血液中胆固醇含量，预防冠心病，降低患癌症的风险，增强化疗药物的抗肿瘤作用以及提高免疫系统的有效性；由于温和的抗氧化性能鲨烯作为保湿剂和润肤剂广泛应用于化妆品行业，鲨烯还能保护皮肤免受短波长辐射；在制药和医疗方面，以鲨烯为基础的乳状液可以有效的用于疫苗和药物传递，由于降低了活性成分的释放率而改善细胞对活性成分的吸收。鲨烯的生物相容性使其可以用于治疗皮肤的细菌和真菌感染。
自然界中发现深海鲨鱼的肝脏中鲨烯含量最多，最高达到80％(w/w)。鲨鱼肝油是鲨烯最丰富的天然来源，但是由于持续性有机污染物对海洋环境的影响，鲨鱼的密集捕捞以及国际社会对海洋动物保护的关注，在过去二十年里鱼肝油进出口急剧下降使其来源受到限制。鲨烯还能从植物中获取，例如：橄榄油、苋菜籽油和棕榈脂肪酸，但是这些植物来源的鲨烯不能满足制药和工业所需。微生物也是一个非常有价值的鲨烯来源，然而一些微生物鲨烯产量过低或者基因工程改造困难，并且不具有人类安全使用史，这些微生物不适合鲨烯的大规模工业化生产。酿酒酵母和大肠杆菌是最常用的微生物细胞工厂，具有生长快速周期短、安全性好、遗传背景清楚、成本低以及易于操作等优点，能够被快速的改造成鲨烯生物合成的细胞工厂。酿酒酵母含有合成三萜类化合物(麦角固醇)所需的所有基因，是合成鲨烯的一个很好的基因工程宿主，然而新导入的其它三萜途径如鲨烯合成途径将与麦角固醇合成途径发生竞争和交叉反应。由于内源性的麦角固醇途径是酿酒酵母生存所必须而不能完全删除，残留的麦角固醇合成途径将影响鲨烯合成途径中基因的异源表达，导致鲨烯实际产量和生产力下降，因此完全缺少三萜类合成途径的宿主更具有吸引力。大肠杆菌不合成内源性三萜类化合物，生物合成的鲨烯能够稳定的在大肠杆菌内积累而不会被消耗或者转化成其它不需要的化合物，因此大肠杆菌是鲨烯生物合成的理想基因工程宿主。
大肠杆菌本身不能合成鲨烯，但是具有萜类前体生物合成的MEP途径,能够少量合成前体IPP和DMAPP。导入波赛链霉菌藿烷类生物合成基因簇中的三个基因hopA、hopB(编码鲨烯/八氢番茄红素合酶)和hopD(编码法尼基二磷酸合酶)，使得大肠杆菌合成了4.1mg/l鲨烯，再过表达MEP途径中的dxs和idi基因可以使鲨烯产量达到11.8mg/l[Ghimire GP,LeeHC and Sohng JK.Improved squalene production via modulation of themethylerythritol 4-phosphate pathway and heterologous expression of genesfrom Streptomyces peucetius ATCC 27952in Escherichia coli[J].Appl EnvironMicrobiol,2009,75(22):7291–7293.]。除此之外，在大肠杆菌中导入来源于嗜热蓝细菌聚球藻和人类的鲨烯合酶基因，分别产鲨烯3.5mg/l和4.2mg/l，实验中还导入了酿酒酵母的鲨烯合酶基因，发现导入这三种不同来源鲨烯合酶基因的大肠杆菌其鲨烯产量变化不大，说明鲨烯合酶的细胞活性不是鲨烯合成的限制因素。接着在导入鲨烯合酶基因的基础上再导入嵌合MVA途径，其中5个基因来源于酿酒酵母，另外3个基因为大肠杆菌内源性基因，最终大肠杆菌鲨烯产量达到230mg/l[Drozdikova E,Garaiova M,Csaky Z,etal.Production of squalene by lactose-fermenting yeast Kluyveromyces lactiswith reduced squalene epoxidase activity[J].Lett Appl Microbiol,2015,61(1):77-849]。王华明等用印度人参鲨烯合酶在大肠杆菌中只合成微量鲨烯(王华明、郭小飞、李伟涛.一种角鲨烯生产方法[P].中国专利，103266137B，2014-09-17)。在大肠杆菌生物合成萜类过程中，萜类化合物生物合成的前体途径MEP途径对于萜类化合物的生物合成具有重要的作用，Jiangfeng wang等在大肠杆菌中通过过表达MEP途径基因dxs2(来源于阿维链霉菌)、ispD(来源于大肠杆菌)、ispF(来源于大肠杆菌)和idi(枯草芽孢杆菌)使番茄红素和紫穗槐二烯分别提高了16.5倍和15.5倍(Jianfeng Wang,Zhiqiang Xiong,Shiyuan Li,etal.Exploiting exogenous MEP pathway genes to improve the downstreamisoprenoid pathway effects and enhance isoprenoid production in Escherichiacoli[J].Process Biochemistry,2014,50(1):24-32.)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中的鲨烯发酵局限于使用嗜热蓝细菌聚球藻、人类以及酿酒酵母等物种内的鲨烯合酶基因于大肠杆菌中进行表达，以及大肠杆菌过表达的内源基因的组合固定等缺陷，提供一种生产鲨烯的基因工程菌及其方法。该基因工程菌异源表达解脂耶氏酵母中的鲨烯合酶，与此同时，过表达大肠杆菌内源基因dxs、idi和ispA的组合；为鲨烯合酶基因的产业化生产提供了新思路。
大肠杆菌细胞内因缺乏鲨烯合酶，因此大肠杆菌自身不能够生物合成鲨烯。为了在大肠杆菌中生物合成鲨烯，首先克隆来源于解脂耶氏酵母和枯草芽孢杆菌的的鲨烯合酶基因YSS和KSS，发现只有来源于解脂耶氏酵母的YSS能够产鲨烯，而来源于枯草芽孢杆菌的KSS不能够产鲨烯。进一步通过过表达SS及过表达来自于大肠杆菌的MEP途径关键酶基因dxs、idi和ispA，获得产10.83mg鲨烯。因此，通过合成生物学技术和方法利用解脂耶氏酵母的鲨烯合酶基因YSS在大肠杆菌中构建和优化鲨烯生物合成通路生物合成鲨烯具有很大的潜力。
本发明解决上述技术问题的技术方案之一是：一种生产鲨烯的基因工程菌，其为大肠杆菌(Escherichia coli)中表达鲨烯合酶基因、5-磷酸脱氧木酮糖合酶基因、异戊烯基二磷酸异构酶基因以及法尼基焦磷酸合酶基因的基因工程菌；所述鲨烯合酶基因来源于解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。所述解脂耶氏酵母优选为解脂耶氏酵母ATCC20362；所述鲨烯合酶基因的核苷酸序列优选如Gene ID:2906604所示。
较佳地，所述5-磷酸脱氧木酮糖合酶基因、所述异戊烯基二磷酸异构酶基因以及所述法尼基焦磷酸合酶基因优选来源于大肠杆菌，以避免异源表达产量低以及菌体扩增困难等缺点。较佳地来源于大肠杆菌(Escherichia coli)K12 MG1655。
其中，可以将鲨烯合酶基因、5-磷酸脱氧木酮糖合酶基因、异戊烯基二磷酸异构酶基因和法尼基焦磷酸合酶基因克隆到同一个载体上进行表达，也可以克隆到一个以上的载体上进行表达。
为兼顾成本、制备效率以及各个基因更好地发挥作用和终产物的表达量，较佳地，将至少1个鲨烯合酶基因克隆到表达载体1，所述表达载体1的骨架优选为质粒pACYDuet-1，每个鲨烯合酶基因具有一个启动子，所述启动子优选为T7启动子；将5-磷酸脱氧木酮糖合酶基因、异戊烯基二磷酸异构酶基因和法尼基焦磷酸合酶基因克隆到表达载体2，所述表达载体2的骨架，优选为质粒pRSFDuet-1，所述5-磷酸脱氧木酮糖合酶基因带有1个启动子；而异戊烯基二磷酸异构酶基因和法尼基焦磷酸合酶基因串联表达，带有共同的启动子；所述启动子优选为T7启动子。
本发明解决上述技术问题的技术方案之二是：一种上述基因工程菌的制备方法，所述方法包括下列步骤：
1)构建含有鲨烯合酶的表达载体1以及含有5-磷酸脱氧木酮糖合酶基因、异戊烯基二磷酸异构酶基因和法尼基焦磷酸合酶基因的表达载体2；
2)以大肠杆菌(Escherichia coli)为宿主菌株，用步骤1)得到的表达载体1和表达载体2同时进行转化，获得重组表达鲨烯的大肠杆菌基因工程菌。
较佳地，本发明所述大肠杆菌优选BL21(DE3)菌株。
本发明解决上述技术问题的技术方案之三是：一种鲨烯的制备方法，其包括将上述的基因工程菌发酵，从发酵液中获得鲨烯。
本发明解决上述技术问题的技术方案之四是：一种含有本发明上述5-磷酸脱氧木酮糖合酶基因、异戊烯基二磷酸异构酶基因和法尼基焦磷酸合酶基因的表达载体；所述表达载体的骨架优选质粒pRSFDuet-1。
如上所述，所述5-磷酸脱氧木酮糖合酶基因、所述异戊烯基二磷酸异构酶基因以及所述法尼基焦磷酸合酶基因较佳地来源于大肠杆菌；更佳地为大肠杆菌(Escherichiacoli)K12 MG1655。
所述5-磷酸脱氧木酮糖合酶基因可以带有1个启动子；而异戊烯基二磷酸异构酶基因和法尼基焦磷酸合酶基因串联表达，带有共同的启动子；所述启动子优选为T7启动子。
本发明解决上述技术问题的技术方案之五是：一种包含上述基因工程菌中的鲨烯合酶基因的表达载体；所述表达载体的骨架优选为质粒pACYDuet-1。较佳地，所述表达载体含有至少两个鲨烯合酶基因；更佳地，每个鲨烯合酶基因具有一个启动子，所述启动子优选为T7启动子
应了解，本发明“表达载体1”和“表达载体2”中的“1”和“2”均无实际意义，仅为区分相同的术语。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
与现有方法相比，本发明创造型地在大肠杆菌菌体内异源表达解脂耶氏酵母中的鲨烯合酶，与此同时，过表达大肠杆菌内源基因dxs、idi和ispA的组合；外源基因与内源基因高效配合，提高鲨烯合酶的产量，为鲨烯合酶基因的产业化生产提供了新思路。
附图说明
图1为质粒构建示意图。
图2为YSS基因PCR电泳图。
图3为YSS基因和pACYDuet-1质粒双酶切电泳图。
图4为质粒pACY1菌液PCR验证电泳图。
图5为解脂耶氏酵母YSS菌液PCR扩增电泳。
图6为2YSS基因和pACY1质粒双酶切电泳图。
图7为pACY3质粒电泳图。
图8为pACY3质粒双酶切电泳图。
图9为dxs基因PCR克隆电泳图。
图10为idi、ispA和idi-ispA基因PCR克隆电泳图。
图11为pRSFDuet-11T7dxs质粒电泳图。
图12为pRSFDuet-11T7dxs质粒双酶切电泳图。
图13为质粒pRSFDuet-11T7dxs-2T7idi-ispA菌液PCR验证idi-ispA电泳图。
图14为枯草芽孢杆菌KSS菌液PCR扩增电泳图。
图15为KSS基因和pACYDuet-1质粒双酶切电泳图。
图16为质粒pACY2菌液PCR验证KSS电泳图。
图17为鲨烯标准品和样品的HPLC图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
2×Taq Master Mix(Dye Plus)购自诺唯赞生物科技有限公司；
大肠杆菌BL21(DE3)、DH5α感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司；
所使用的酶：NdeI、KpnI、BamHI、HindIII、SacI、PstI、XhoI、T4连接酶以及Max DNA polymerase均购自大连宝生物有限公司(TaKaRa,Dalian,China)；
卡那霉素以及氯霉素均购自上海生工生物工程股份有限公司；
DNA回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司；
测序公司为上海睿迪生物科技有限公司。
缩写：
SS：鲨烯合酶；YSS：解脂耶氏酵母鲨烯合酶；KSS：枯草芽孢杆菌鲨烯合酶；MEP:2C-甲基4-磷酸-4-D-赤藓糖醇；dxs:5-磷酸脱氧木酮糖合酶；idi：异戊烯基二磷酸异构酶；ispA：法尼基焦磷酸合酶；IPP：异戊烯基焦磷酸；DMAPP：焦磷酸二甲基丙酯；FPP：法尼基焦磷酸。
实施例1重组菌株pACYCDuet-1YSS BL21(DE3)构建
1、质粒pACY1(pACYCDuet-11T7SS)构建
1.1、解脂耶氏酵母ATCC 20362(购自北京中原公司上海分公司)鲨烯合酶(YSS)基因克隆
以解脂耶氏酵母菌液为模板，根据载体pACYDuet-1(购自Novagen)第一个多克隆位点设计引物，然后PCR扩增YSS基因(图2)，Gene ID:2906604，再利用胶回收试剂盒回收目的基因片段。质粒构建示意图如图1所示。
扩增引物序列如下(详见SEQ ID NO.1和2)：
YSS上：CGGGATCCGATGGGAAAACTCATCGAACTG
YSS下：CCCAAGCTTCTAATCTCTCAGAGGAAACATCTTAGAGTCG。
1.2、表达载体构建--pACY1载体构建
将胶回收后的YSS基因与载体pACYCDuet-1分别用BamHI和HindIII进行双酶切(酶切后片段的电泳结果如图3所示)，载体与外源片段按摩尔比1:5的比例，4℃过夜连接或16℃连接4-6h，连接产物转化大肠杆菌DH5α，然后涂布含有30μg/mL氯霉素的LB固体平板上，挑取转化子，菌液PCR筛选阳性克隆，进行PCR验证(图4)，并测序验证，测序结果与预期碱基序列完全匹配。得到质粒pACY1。
2、重组菌株YSS1构建
将质粒pACY1转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含有30μg/mL氯霉素的LB固体平板上，通过PCR筛选阳性克隆，由此获得重组菌株YSS1。
实施例2重组菌株YSS3(pACYCDuet-11T7YSS-2T7YSS BL21(DE3))构建
1、解脂耶氏酵母鲨烯合酶(YSS)基因克隆
1.1、设计引物从解脂耶氏酵母细胞中通过菌液PCR扩增鲨烯合酶基因(YSS)(图5)，Gene ID:2906604，再利用胶回收试剂盒回收目的基因片段，扩增引物序列如下(详见SEQ ID NO.3和4)：
2YSS上：GGAATTCCATATGGGAAAACTCATCGAACTGC
2YSS下：GGGGTACCCTAATCTCTCAGAGGAAACATCTTAGAGTC。
1.2、pACY3(pACYCDuet-11T7YSS-2T7YSS)表达载体构建
将胶回收后的YSS基因与载体pACY1分别用NdeI和KpnI进行双酶切(酶切后片段的电泳结果如图6所示)，载体与外源片段按摩尔比1:5的比例，4℃过夜连接或16℃连接4-6h，连接产物转化大肠杆菌DH5α，然后涂布含有30μg/mL氯霉素的LB固体平板上，挑转化子，提质粒(电泳结果如图7所示)，再进行双酶切和测序验证(图8)，测序结果与预期碱基序列完全匹配。质粒构建示意图如图1所示。得到质粒pACY3。
2、重组菌株YSS3构建
将质粒pACY3转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布与含有30μg/mL氯霉素的LB固体平板上，通过PCR筛选阳性克隆，由此获得重组菌株YSS3。
实施例3重组菌株YSS4(pACY3 pRSF1 BL21(DE3))构建
1、基因克隆
1.1、dxs基因克隆
以大肠杆菌E.coli K12 MG1655(购自武汉淼灵生物科技有限公司)菌液为模板，根据载体pRSFDuet-1(购自Novagen)第一个多克隆位点设计引物，然后PCR扩增dxs基因，Gene ID:945060，再利用胶回收试剂盒回收目的基因片段(图9)。质粒构建示意图如图1所示。
扩增引物序列如下(详见SEQ ID NO.5和6)：
dxs上：CGAGCTCGATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCGACCC
dxs下：AACTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGATTTTG。
1.2、idi基因克隆
以大肠杆菌E.coli K12 MG1655菌液为模板，上游引物根据载体pRSFDuet-1第二个多克隆位点设计，下游引物带有载体pRSFDuet-1第二个多克隆位点的RBS序列和ispA基因的13个碱基的同源臂，然后PCR扩增dxs基因，Gene ID:949020，再利用胶回收试剂盒回收目的基因片段(图10)。
扩增引物序列如下(详见SEQ ID NO.7和8)：
idi上：GGGGTACCATGCAAACGGAACACGTCATTTTATTGAATGC
idi下：CGGAAAGTCCATGGTATATCTCCTTTTATTTAAGCTGGGTA
AATGCAG。
1.3、ispA基因克隆
以大肠杆菌E.coli K12 MG1655菌液为模板，上游引物带有载体pRSFDuet-1第一个多克隆位点的RBS序列和ispA基因的13个碱基的同源臂，根据载体pRSFDuet-1第一个多克隆位点设计，下游引物根据载体pRSFDuet-1第一个多克隆位点设计，然后PCR扩增ispA基因，Gene ID:945064，再利用胶回收试剂盒回收目的基因片段(图10)。
扩增引物序列如下(详见SEQ ID NO.9和10)：
ispA上：CAGCTTAAATAAAAGGAGATATACCATGGACTTTCCGCAGCAACTC
ispA下：CCGCTCGAGTTATTTATTACGCTGGATGATGTAGTCCGC。
1.4、idi-ispA基因克隆
将克隆到的idi和ispA基因为模板，根据载体pRSFDuet-1第一个多克隆位点设计引物，然后利用重叠PCR技术扩增idi-ispA基因片段，再利用胶回收试剂盒回收目的基因片段(图10)。
扩增引物序列为：
idi上：GGGGTACCATGCAAACGGAACACGTCATTTTATTGAATGC
ispA下：CCGCTCGAGTTATTTATTACGCTGGATGATGTAGTCCGC。
注：在引物的设计中，点下划线序列代表同源臂；虚拟下划线序列代表RBS序列；下划线序列代表酶切位点。
2、载体的构建
2.1、pRSFDuet-11T7dxs载体构建
将胶回收后的dxs基因与载体pRSFDuet-1分别用SacI和PstI进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1:5的比例，4℃过夜连接或16℃连接4-6h，连接产物转化大肠杆菌DH5α，然后涂布含有100μg/mL卡那霉素的LB固体平板上，挑转化子，提质粒(电泳结果如图11所示)，再进行双酶切(酶切后片段的电泳结果如图12所示)和测序验证，测序结果与预期碱基序列完全匹配。得到载体pRSFDuet-11T7dxs。
2.2、pRSF1(pRSFDuet-11T7dxs-2T7idi-ispA)载体构建
将基因片段idi-ispA与载体pRSFDuet-11T7dxs分别用KpnI和XhoI进行双酶切，回收后的酶切片段按摩尔比1:5的比例，4℃过夜连接或16℃连接4-6h，连接产物转化大肠杆菌DH5α，然后涂布含有100μg/mL卡那霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆(图13)，测序验证，测序结果与预期碱基序列完全匹配。得到载体pRSF1(pRSFDuet-11T7dxs-2T7idi-ispA)，即质粒pRSF1。
3、重组菌株YSS4(pACY3pRSF1 BL21(DE3))构建
将实施例3中的质粒pACY3与质粒pRSF1同时转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布与含有100μg/mL卡那霉素和30μg/mL氯霉素的LB固体平板上，通过PCR筛选阳性克隆，由此获得重组菌株YSS4。
实施例4重组菌株发酵
1.1、培养基：
7.5g/L K2HPO4·3H2O，1.92g/L柠檬酸，0.3g/L ferric ammonium citrate，2.92g/L(NH4)2SO4，20g/L葡萄糖，9g/L牛肉提取物，0.48g/L MgSO4，10mL微量元素溶液.微量元素溶液包括(每升)：10g FeSO4·7H2O、5.25g ZnSO4·7H2O、3.0g CuSO4·5H2O、0.5gMnSO4·4H2O、0.23g Na2B4O7·10H2O、2.0g CaCL2和0.1g(NH4)6Mo7O24。
1.2、培养条件：从-80℃冰箱中分别拿出以上实施例中构建的各重组菌株，分别接种，37℃培养过夜。将培养好的菌液以1％的接种量接种于20mL/250mL摇瓶中，37℃培养至OD600＝0.6～0.9，用0.5mM IPTG诱导，30℃、180r/min培养48h。
1.3、提取：将培养好的菌液倒入50mL离心管中，加10mL正己烷，颠倒混匀三次，离心，将正己烷层用吸管吸入10mL离心管，吹干；上述过程共操作三次。正己烷萃取后，离心，将上清液倒掉，加入5mL丙酮，超声30min，涡旋混匀，离心，取上清液丙酮加入吹干正己烷的10mL离心管中，以上操作进行三次。在带有提取物的离心管中加入5mL丙酮，涡旋，超声10min，8000r/min离心5min，上清液分次加入2mL离心管中吹干，上述操作进行三次，获得粗提物。
2、HPLC定量检测
2.1、HPLC条件
色谱柱：XB-C18(4.6×250mm，5μm)；流动相：乙腈-水(98：2)；流速：1mL/min；进样量：20μL；柱温：40℃；检测波长：210nm。
2.2、结果
发酵粗提物经HPLC检测，结果如图17所示，其中，色谱图鲨烯标准品1和YSS1样品2色谱图的目标色谱峰保留时间一致，都为23.35min，说明菌株YSS1发酵物中含有鲨烯，进一步说明导入YSS1菌株中的YSS基因在大肠杆菌中能够生物合成鲨烯的产量为0.072mg/L。菌株YSS3和菌株YSS4的鲨烯产量分别是0.15mg/L和10.83mg/L，分别是菌株YSS1的2倍和150倍。
对比例重组菌株YSS2构建
1、质粒pACY2(pACYCDuet-11T7KSS)构建
1.1、枯草芽孢杆菌ATCC 10719(购自ATCC)鲨烯合酶(KSS)基因克隆
以枯草芽孢杆菌菌液为模板，根据载体pACYDuet-1第一个多克隆位点设计引物，然后PCR扩增KSS基因(电泳结果如图14所示)，Gene ID:936353，再利用胶回收试剂盒回收目的基因片段。质粒构建示意图如图1所示。
扩增引物序列如下(详见SEQ ID NO.11和12)：
KSS上：CGGGATCCGATGGGAAAACTCATCGAACTG
KSS下：CCCAAGCTTCTAATCTCTCAGAGGAAACATCTTAGAGTCG。
1.2、表达载体构建--pACY2载体构建
将胶回收后的KSS基因与载体pACYCDuet-1分别用BamHI和HindIII进行双酶切(图15)，载体与外源片段按摩尔比1:5的比例，4℃过夜连接或16℃连接4-6h，连接产物转化大肠杆菌DH5α，然后涂布含有30μg/mL氯霉素的LB固体平板上，挑取转化子，菌液PCR筛选阳性克隆(图16)，并测序验证，测序结果与预期碱基序列完全匹配。得到质粒pACY2。
2、重组菌株YSS2构建
将质粒pACY2转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布与含有30μg/mL氯霉素的LB固体平板上，通过PCR筛选阳性克隆，由此获得重组菌株YSS2。
3、重组菌株发酵同实施例4。
4、HPLC定量检测同实施例4。
发酵粗提物经HPLC检测，结果如图17所示：样品YSS2的色谱图在23.35min并没有出现相应的色谱峰，说明菌株YSS2发酵物中没有鲨烯，导入YSS2菌株中的KSS基因不能生物合成鲨烯。
<110> 上海医药工业研究院,中国医药工业研究总院
<120> 一种生产鲨烯的基因工程菌及其方法
<130> P1710656C
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物YSS上
<400> 1
cgggatccga tgggaaaact catcgaactg 30
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物YSS下
<400> 2
cccaagcttc taatctctca gaggaaacat cttagagtcg 40
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物2YSS上
<400> 3
ggaattccat atgggaaaac tcatcgaact gc 32
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物2YSS下
<400> 4
ggggtaccct aatctctcag aggaaacatc ttagagtc 38
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物dxs上
<400> 5
cgagctcgat gagttttgat attgccaaat acccgaccc 39
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物dxs下
<400> 6
aactgcagtt atgccagcca ggccttgatt ttg 33
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物idi上
<400> 7
ggggtaccat gcaaacggaa cacgtcattt tattgaatgc 40
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物idi下
<400> 8
cggaaagtcc atggtatatc tccttttatt taagctgggt a 41
<210> 9
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物ispA上
<400> 9
cagcttaaat aaaaggagat ataccatgga ctttccgcag caactc 46
<210> 10
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物ispA下
<400> 10
ccgctcgagt tatttattac gctggatgat gtagtccgc 39
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物KSS上
<400> 11
cgggatccga tgggaaaact catcgaactg 30
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物KSS下
<400> 12
cccaagcttc taatctctca gaggaaacat cttagagtcg 40

Claims (10)

1.一种生产鲨烯的基因工程菌，其特征在于，其为大肠杆菌(Escherichia coli)中表达鲨烯合酶基因、5-磷酸脱氧木酮糖合酶基因、异戊烯基二磷酸异构酶基因以及法尼基焦磷酸合酶基因的基因工程菌；所述鲨烯合酶基因来源于解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，其携带含有所述鲨烯合酶的表达载体1以及含有5-磷酸脱氧木酮糖合酶基因、异戊烯基二磷酸异构酶基因和法尼基焦磷酸合酶基因的表达载体2；较佳地，所述表达载体1含有至少两个鲨烯合酶基因；更佳地，每个鲨烯合酶基因具有一个启动子，所述启动子优选为T7启动子。
3.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述5-磷酸脱氧木酮糖合酶基因带有1个启动子；而异戊烯基二磷酸异构酶基因和法尼基焦磷酸合酶基因串联表达，带有共同的启动子；所述启动子优选为T7启动子。
4.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述表达载体1的骨架是质粒pACYDuet-1；和/或，所述表达载体2的骨架是质粒pRSFDuet-1；较佳地，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。
5.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述解脂耶氏酵母为解脂耶氏酵母ATCC 20362，所述鲨烯合酶基因的核苷酸序列如Gene ID:2906604所示。
6.如权利要求1～5任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述5-磷酸脱氧木酮糖合酶基因、所述异戊烯基二磷酸异构酶基因以及所述法尼基焦磷酸合酶基因来源于大肠杆菌；较佳地为大肠杆菌(Escherichia coli)K12 MG1655。
7.一种如权利要求1～6任一项所述基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：
1)构建含有鲨烯合酶的表达载体1以及含有5-磷酸脱氧木酮糖合酶基因、异戊烯基二磷酸异构酶基因和法尼基焦磷酸合酶基因的表达载体2；
2)以大肠杆菌(Escherichia coli)为宿主菌株，用步骤1)得到的表达载体1和表达载体2同时进行转化，获得重组表达鲨烯的大肠杆菌基因工程菌。
8.一种鲨烯的制备方法，其特征在于，包括将权利要求1～6任一项所述的基因工程菌发酵，从发酵液中获得鲨烯。
9.一种含有5-磷酸脱氧木酮糖合酶基因、异戊烯基二磷酸异构酶基因和法尼基焦磷酸合酶基因的表达载体；所述表达载体的骨架优选质粒pRSFDuet-1；所述5-磷酸脱氧木酮糖合酶基因、所述异戊烯基二磷酸异构酶基因以及所述法尼基焦磷酸合酶基因来源于大肠杆菌；较佳地为大肠杆菌(Escherichia coli)K12MG1655；和/或所述5-磷酸脱氧木酮糖合酶基因带有1个启动子；而异戊烯基二磷酸异构酶基因和法尼基焦磷酸合酶基因串联表达，带有共同的启动子；所述启动子优选为T7启动子。
10.一种包含鲨烯合酶基因的表达载体，其特征在于，所述鲨烯合酶基因来源于解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)ATCC 20362；所述表达载体的骨架优选为质粒pACYDuet-1；和/或所述表达载体含有至少两个鲨烯合酶基因；较佳地，每个鲨烯合酶基因具有一个启动子，所述启动子优选为T7启动子。
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